CN112831843A - 一种一锅法On-DNA铃木反应方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种一锅法On‑DNA铃木反应的方法，该方法在硼酸酯、亚硝酸酯和自由基引发剂存在下，将胺基化合物转换成硼酸酯化合物，然后与On‑DNA芳基卤代化合物在钯催化剂下“一锅法”得到On‑DNA产物。本发明方法收率高，反应条件温和，能够通过胺基化合物大规模引入硼酸合成模块，特别是不易分离纯化的硼酸模块，适合使用多孔板进行的DNA编码化合物库的合成。
Description
技术领域
本发明属于编码化合物库技术领域，具体涉及一种DNA编码化合物库构建中由On-DNA 芳基卤代化合物通过“一锅法”Suzuki碳碳偶联反应得到On-DNA产物的方法。
背景技术
在药物研发，尤其是新药研发中，针对生物靶标的高通量筛选是快速获得先导化合物的主要手段之一。然而，基于单个分子的传统高通量筛选所需时间长、设备投入巨大、库化合物数量有限(数百万)，且化合物库的建成需要数十年的积累，限制了先导化合物的发现效率与可能性。近年来出现的DNA编码化合物库技术(WO2005058479、WO2018166532、CN103882532)，结合了组合化学和分子生物学技术，在分子水平上将每个化合物加上一个DNA标签，并能在极短的时间内合成高达亿级的化合物库，成为下一代化合物库筛选技术的趋势，并开始在制药行业广泛应用，产生了诸多积极的效果(Accounts of ChemicalResearch, 2014,47,1247-1255)。
DNA编码化合物库通过组合化学快速产生巨型化合物库，并且能高通量地筛选出先导化合物，使得先导化合物的筛选变得前所未有的快捷和高效。构建DNA编码化合物库的挑战之一就是需要在DNA上高收率地合成具有化学多样性的小分子。由于DNA需要在一定的条件下(溶剂、pH、温度、离子浓度)才能维持稳定，同时应用于DNA编码化合物库构建的 On-DNA反应还需要有较高的产率。因此DNA上进行的化学反应(简称On-DNA反应)的试剂种类、反应种类、反应条件直接影响到DNA编码化合物库的丰富度和可选择性。从而开发能够与DNA兼容的化学反应也成为目前DNA编码化合物库技术的长期探索和研究方向，也直接影响了DNA编码化合物库的应用及商业价值。
Suzuki反应是一种重要的碳碳偶联反应，也有报道其在DNA编码化合物库构建中的应用。然而常用的Suzuki反应需要以硼酸或硼酸酯化合物为原料，而目前市售的硼酸或硼酸酯化合物数量有限，限制了其应用时构建的DNA编码化合物库的多样性。并且部分硼酸/硼酸酯化合物是不易分离纯化的，通过传统方法不能引入到DNA编码化合物库中。因此希望开发一种新的适用于大批量多孔板的On-DNA Suzuki反应方法，能够“一锅法”将胺基化合物转化为硼酸/硼酸酯化合物，并且在不分离纯化的条件下继续On-DNA Suzuki碳碳偶联反应，从而增加DNA编码化合物库的多样性，进一步提升DNA编码化合物库技术的应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种“一锅法”On-DNA Suzuki反应的方法，该方法反应条件温和、后处理简单，适合DNA编码化合物库的生产，能显著提高化合物库分子的多样性。
本发明提供了一种由On-DNA芳基卤代化合物通过“一锅法”Suzuki碳碳偶联反应得到 On-DNA产物的方法，所述方法在硼酸酯、亚硝酸酯和自由基引发剂存在下，将胺基化合物转换成硼酸酯化合物，然后与On-DNA芳基卤代化合物在钯催化剂下得到On-DNA产物；其中胺基化合物的结构式为R1-NH2，On-DNA芳基卤代化合物的结构式为DNA-Ar-X；所述 On-DNA产物的结构式为DNA-Ar-R1；
其中，结构式中DNA包含由人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链，该核苷酸链通过一个或多个化学键或基团与Ar相连；所述DNA的长度为10～200个碱基。
其中，结构式中的DNA与Ar通过一个化学键或多个化学键或基团连接；一个化学键时，是指结构式中的DNA与Ar直接相连；多个化学键或基团时，指结构式中的DNA与Ar之间间隔多个化学键相连，比如，DNA与Ar之间通过一个亚甲基(-CH2-)相连，即通过两个化学键连接；或DNA与Ar之间通过一个羰基(-CO-)连接DNA的氨基，也是通过两个化学键连接；或DNA与Ar通过一个亚甲基羰基(-CH2CO-)连接DNA的氨基，即通过三个连续的化学键连接。
Ar选自取代的芳环或芳杂环；所述取代的取代基选自分子量1000以下与芳环或芳杂环直接相连的基团；
R1选自分子量1000以下与氨基氮原子直接相连的基团；
X选自氯、溴、碘。
进一步地，所述硼酸酯选自双联频哪醇硼酸酯；所述亚硝酸酯选自亚硝酸叔丁酯；所述自由基引发剂选自过氧化苯甲酰。
作为优选：所述Ar选自以下基团：
R2为氢、卤素、烷基、取代烷基、烷氧基中的任意一种或多种的随机组合，Ar上可以有一个或多个R2基团，X为O、S、NH或烷基取代的亚氨基中的任意一种；
所述烷基为C1-C12的直链或支链烷基；所述烷氧基为C1-C12的直链或支链烷氧基；
取代烷基的取代基的数量为一个或多个，取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、羧基、苯基中的一种或多种。
作为优选：所述R1选自烷基、取代烷基、5～10元芳基、取代5～10元芳基、5-10元芳杂环基、取代5-10元芳杂环基；其中，所述烷基为C1～C20烷基或C3～C8环烷基；取代烷基的取代基的数量为一个或多个；取代烷基的取代基是相互独立的选自羟基、卤素、羧基、硝基、C1～C20烷氧基、卤代苯基、苯基、烷基苯基、5-10元芳杂环基中的一种或多种；取代5～10 元芳基的取代基的数量为一个或多个，取代5～10元芳基的取代基是相互独立的选自羟基、卤素、氰基、硝基、羧基、C1～C20烷氧基、C1～C20烷氧基羰基、C1～C20烷基、C3～C8环烷基、 C1～C20烷基酰基、三氟甲基、5-10元芳杂环基、-OR、-NHC(O)R中的一种或多种；取代 5-10元芳杂环基的取代基的数量为一个或多个，取代5-10元芳杂环基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、C1～C20烷氧基、C1～C20烷基、二氟甲基、三氟甲基中的一种或多种；
所述的R选自C3～C8环烷基、5-10元芳杂环基、5～10元芳基。
更进一步地，所述的胺基化合物选自
On-DNA芳基卤代化合物选自
本发明提供的“一锅法”On-DNA Suzuki反应的方法，所述反应的反应步骤为：胺基化合物与双联频哪醇硼酸酯、过氧化苯甲酰、亚硝酸叔丁酯，在10℃～100℃下反应0.5-24小时后，再加入On-DNA芳基卤代化合物和钯催化剂，在10℃～100℃下反应0.5-24小时。
进一步地，所述方法在得到硼酸酯化合物后不经过分离纯化，直接与On-DNA芳基卤代化合物进行偶联反应。
进一步地，所述钯催化剂选自四三苯基磷钯、POPd、ssPhos-Pd-G2；优选地，所述钯催化剂为四三苯基磷钯。
进一步地，所述方法中胺基化合物转换成硼酸酯化合物的反应在溶剂中进行，溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、二甲亚砜；优选地，所述溶剂为乙腈。
进一步地，所述方法中硼酸酯化合物与On-DNA芳基卤代化合物的反应在溶剂中进行，溶剂为水、甲醇、乙醇、乙腈、二甲亚砜、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中任意一种或几种的含水混合溶剂；优选地，所述反应溶剂含有乙腈、水。
更进一步地，所述方法中硼酸酯化合物与On-DNA芳基卤代化合物反应时还需要加入碱和配体；优选地，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸铯；更优选地，所述碱选自氢氧化钾。优选地，所述配体选自2-(二环己基膦)-2',6'-二甲氧基联苯-3'-磺酸钠。
进一步地，所述方法中On-DNA芳基卤代化合物的摩尔当量为1，摩尔浓度为0.5-5mM，胺基化合物的摩尔当量为1-100，双联频哪醇硼酸酯的摩尔当量为1-100、亚硝酸叔丁酯的摩尔当量为10-100，过氧化苯甲酰的摩尔当量为0.1-10，钯催化剂的摩尔当量为0.1-2.5；碱的摩尔当量为：50-300；配体的摩尔当量为：0.1-2.5。
进一步地，所述方法的加料顺序为先加入胺基化合物、双联频哪醇硼酸酯、过氧化苯甲酰，再加入亚硝酸叔丁酯，然后加入On-DNA芳基卤代化合物和碱、钯催化剂、配体。
进一步地，上述方法用于批量的多孔板操作。
进一步地，上述方法用于多孔板的DNA编码化合物库的合成。
本发明方法可以实现通过胺基化合物大规模引入硼酸合成模块，特别是不易分离纯化的硼酸模块，将On-DNA芳基卤代化合物“一锅法”Suzuki碳碳偶联得到On-DNA产物。本发明方法收率高，产物单一，操作简单，且适合大规模多孔板操作。
关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中基团或者术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该基团或者术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。
“取代”是指分子中的氢原子被其它不同的原子或分子所替换。
碳氢基团中碳原子含量的最小值和最大值通过前缀表示，例如，前缀(Ca～Cb)烷基表明任何含“a”至“b”个碳原子的烷基。因此，例如，C1～C12烷基是指包含1～12个碳原子的直链或支链的烷基。
烷基是指烷烃分子中直链或支链的烃基，例如甲基-CH3、乙基-CH2CH3、亚甲基-CH2-；烷基基团也可以是其他基团的一部分，所述其他基团例如为C1～C6烷氧基，C1～C6烷基氨基。
环烷基：是指具有多个碳原子且没有环杂原子，且具有单个环或多个环(包括稠合、桥连和螺环体系)的饱和或部分饱和的环状基团。
所述卤素为氟、氯、溴或碘。
烷氧基是指烷基与氧原子连接形成取代基，例如甲氧基为-OCH3。
卤代苯基是指苯基上的H被卤素取代而形成的基团。
烷基苯基是指苯基上的H被烷基取代而形成的基团。
芳基是指不含杂原子，由C原子构成的芳香性单一环状或多个环状基团。
芳杂环基是指多个C、O、S、N等原子构成具有芳香性的单一环状或多个环状基团。
POPd为二氢二氯二(二-叔丁基亚膦酰-Kp)钯酸(2-)，CAS号：391683-95-7。
ssPhos-Pd-G2为氯(钠-2-二环己基膦-2'，6'-二甲氧基-1,1'-联苯-3'-磺酸盐)[2-(2'-氨基-1,1' -联苯)]钯(II)，CAS号：2375242-78-5。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明：
图1：实施例3中化合物7的LC-MS谱图和MS谱图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整清楚的描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
本发明中
或DNA-NH2是单链或双链DNA与接头基团形成的带有-NH2接头的DNA结构，例如WO2005058479中“compound1”的DNA-NH2结构。也例如下述的DNA结构：
其中，A为腺嘌呤，T为胸腺嘧啶，C为胞嘧啶，G为鸟嘌呤。
ACN:乙腈。DMA：二甲基乙酰胺(Dimethylacetamide)。HATU：2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。DIPEA：N,N-二异丙基乙胺。BBS buffer：硼酸盐缓冲溶液。B2pin2：双联硼酸频那醇酯。BPO：过氧化苯甲酰。t-BuONO:亚硝酸叔丁酯。KOH：氢氧化钾。POPd：二氢二氯二(二-叔丁基亚膦酰-KP)钯酸(2-)。配体：2'-二环己基-2,6- 二甲氧基-3-磺酸-1,1'-联苯水合物钠盐。DDTC：二乙基二硫代胺基甲酸钠。
实施例1、7种On-DNA芳基卤化合物的合成
将DNA-NH2溶解到250mM,pH＝9.4的硼酸缓冲液中，配制成1mM浓度溶液(20μL，20nmol)，酸芳卤(1μmol，50当量，200mM DMA溶液)、HATU(1μmol，50当量，400mM DMA溶液)、DIPEA(1μmol，50当量，400mM DMA溶液)分别放置于-20℃冰箱中降温5 分钟后混合，将该混合物用涡旋振荡充分混匀，然后放置于4℃冰箱中保存5分钟；将上述混合物加入到DNA原料的溶液中，混合均匀，室温过夜。
乙醇沉淀标准操作后处理。乙醇沉淀标准操作：向溶液中加入总体积10％的5M的氯化钠溶液，然后继续加入总体积的3倍的无水乙醇，振荡均匀后，将反应置于干冰中冷冻2小时，之后在12000rpm的转速下离心半个小时，倒掉上清液。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液。
实施例2、On-DNA联芳基化合物4的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.11μmol，11当量，0.092μL)，向溶液中依次加入BPO(0.002μmol，0.2当量，0.01μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.1μmol， 10当量，0.08μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.15μmol，15当量，0.12μL，1.25M ACN 溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量，10 μL)，向溶液中依次加入上述混合液(100nmol，10当量，0.302μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)，将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335μL， 20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5 mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5432.0，实测分子量为5435.8，转化率为62.83％。
实施例3、On-DNA联芳基化合物7的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.11μmol，11当量，0.092μL)，向溶液中依次加入BPO(0.002μmol，0.2当量，0.01μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.1μmol， 10当量，0.08μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.15μmol，15当量，0.12μL，1.25M ACN 溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(100nmol，10当量，0.302μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)，将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335μL， 20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5419.1，实测分子量为5422.8，转化率为62.52％。
实施例4、On-DNA联芳基化合物10的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.11μmol,11当量，0.092μL)，向溶液中依次加入BPO(0.02μmol，0.2当量，0.01μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.1μmol， 10当量，0.08μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.15μmol，15当量，0.12μL，1.25M ACN 溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(100nmol，10当量，0.302μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)，将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5405.9，实测分子量为5409.5，转化率为56.62％。
实施例5、On-DNA联芳基化合物13的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.11μmol,11当量，0.092μL)，向溶液中依次加入BPO(0.002μmol，0.2当量，0.01μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.1μmol，10当量，0.08μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.15μmol，15当量，0.12μL，1.25M ACN 溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(100nmol，10当量，0.302μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)。将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5395.1，实测分子量为5398.8，转化率为56.24％。
实施例6、On-DNA联芳基化合物16的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.22μmol,11当量，0.184μL)，向溶液中依次加入BPO(0.004μmol，0.2当量，0.02μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.2μmol， 10当量，0.16μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.3μmol，15当量，0.24μL，1.25M ACN 溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(200nmol，20当量，0.604μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)。将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5414.1，实测分子量为5417.3，转化率为49.80％。
实施例7、On-DNA联芳基化合物19的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.11μmol,11当量，0.092μL)，向溶液中依次加入BPO(0.002μmol，0.2当量，0.01μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.1μmol， 10当量，0.08μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.15μmol，15当量，0.12μL，1.25M ACN 溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(100nmol，10当量，0.302μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)。将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5420.2，实测分子量为5424.0，转化率为50.99％。
实施例8、On-DNA联芳基化合物22的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.22μmol,11当量，0.184μL)，向溶液中依次加入BPO(0.004μmol，0.2当量，0.02μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.2 μmol，10当量，0.16μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.3μmol，15当量，0.24μL，1.25 M ACN溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(200nmol，20当量，0.604μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)，将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5378.1，实测分子量为5382.0，转化率为58.82％。
实施例9、On-DNA联芳基化合物25的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.11μmol,11当量，0.092μL)，向溶液中依次加入BPO(0.002μmol，0.2当量，0.01μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.1μmol， 10当量，0.08μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.15μmol，15当量，0.12μL，1.25M ACN 溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(100nmol，10当量，0.302μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)。将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5446.2，实测分子量为5449.6，转化率为46.52％。
实施例10、On-DNA联芳基化合物28的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.22μmol,11当量，0.184μL)，向溶液中依次加入BPO(0.004μmol，0.2当量，0.02μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.2μmol，10当量，0.16μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.3μmol，15当量，0.24μL，1.25M ACN 溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(200nmol，20当量，0.604μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)。将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5406.1，实测分子量为5409.5，转化率为50.05％。
实施例11、On-DNA联芳基化合物31的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.22μmol,11当量，0.184μL)，向溶液中依次加入BPO(0.004μmol，0.2当量，0.02μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.2 μmol，10当量，0.16μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.3μmol，15当量，0.24μL，1.25 M ACN溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(200nmol，20当量，0.604μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)。将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5441.1，实测分子量为5444.7，转化率为48.01％。
实施例12、On-DNA联芳基化合物34的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.11μmol,11当量，0.092μL)，向溶液中依次加入BPO(0.002μmol，0.2当量，0.01μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.1 μmol，10当量，0.08μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.15μmol，15当量，0.12μL，1.25 M ACN溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(100nmol，10当量，0.302μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)。将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5403.1，实测分子量为5406.5，转化率为46.63％。
实施例13、On-DNA联芳基化合物37的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.11μmol,11当量，0.092μL)，向溶液中依次加入BPO(0.002μmol，0.2当量，0.01μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.1μmol， 10当量，0.08μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.15μmol，15当量，0.12μL，1.25M ACN 溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(100nmol，10当量，0.303μL，330 mM ACN溶液)、KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)。将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5462.2，实测分子量为5465.7，转化率为45.86％。
实施例14、On-DNA联芳基化合物40的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.11μmol,11当量，0.092μL)，向溶液中依次加入BPO(0.002μmol，0.2当量，0.01μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.1μmol， 10当量，0.08μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.15μmol，15当量，0.12μL，1.25M ACN 溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(100nmol，10当量，0.302μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)。将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5466.1，实测分子量为5449.7，转化率为44.90％。
实施例15、On-DNA联芳基化合物43的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.11μmol,11当量，0.092μL)，向溶液中依次加入BPO(0.004μmol，0.2当量，0.02μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.1μmol， 10当量，0.08μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.15μmol，15当量，0.12μL，1.25M ACN 溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(100nmol，10当量，0.302μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)。将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5392.1，实测分子量为5395.6，转化率为43.07％。
实施例16、On-DNA联芳基化合物46的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.22μmol,11当量，0.184μL)，向溶液中依次加入BPO(0.004μmol，0.2当量，0.02μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.2μmol， 10当量，0.16μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.3μmol，15当量，0.24μL，1.25M ACN 溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(200nmol，20当量，0.604μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)。将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5457.1，实测分子量为5460.6，转化率为41.83％。
实施例17、On-DNA联芳基化合物49的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.22μmol,11当量，0.184μL)，向溶液中依次加入BPO(0.004μmol，0.2当量，0.02μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.2 μmol，10当量，0.16μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.3μmol，15当量，0.24μL，1.25 M ACN溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(200nmol，20当量，0.604μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)。将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5422.1，实测分子量为5425.7，转化率为36.39％。
实施例18、On-DNA联芳基化合物52的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.22μmol,11当量，0.184μL)，向溶液中依次加入BPO(0.004μmol，0.2当量，0.02μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.2 μmol，10当量，0.16μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.3μmol，15当量，0.24μL，1.25 M ACN溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量，10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(200nmol，20当量，0.604μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)。将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5408.0，实测分子量为5411.7，转化率为38.63％。
实施例19、On-DNA联芳基化合物55的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.22μmol,11当量，0.184μL)，向溶液中依次加入BPO(0.004μmol，0.2当量，0.02μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.2 μmol，10当量，0.16μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.3μmol，15当量，0.24μL，1.25 M ACN溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(200nmol，20当量，0.604μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)。将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5430.1，实测分子量为5433.9，转化率为41.87％。
实施例20、On-DNA联芳基化合物58的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.22μmol,11当量，0.184μL)，向溶液中依次加入BPO(0.004μmol，0.2当量，0.02μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.2μmol， 10当量，0.16μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.3μmol，15当量，0.24μL，1.25M ACN 溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(200nmol，20当量，0.604μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)。将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5483.2，实测分子量为5486.9，转化率为34.20％。
实施例21、On-DNA联芳基化合物61的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.22μmol,11当量，0.184μL)，向溶液中依次加入BPO(0.004μmol，0.2当量，0.02μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.2μmol， 10当量，0.16μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.3μmol，15当量，0.24μL，1.25M ACN 溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(200nmol，20当量，0.604μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)。将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5419.1，实测分子量为5422.6，转化率为34.50％。
实施例22、On-DNA联芳基化合物63的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.11μmol,11当量，0.092μL)，向溶液中依次加入BPO(0.002μmol，0.2当量，0.01μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.1μmol， 10当量，0.08μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.15μmol，15当量，0.12μL，1.25M ACN 溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(100nmol，10当量，0.302μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)。将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5432.1，实测分子量为5431.1，转化率为50.00％。
实施例23、On-DNA联芳基化合物64的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.11μmol,11当量，0.092μL)，向溶液中依次加入BPO(0.002μmol，0.2当量，0.01μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.1μmol，10当量，0.08μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.15μmol，15当量，0.12μL，1.25M ACN 溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(100nmol，10当量，0.302μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)。将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5378.2，实测分子量为5377.6，转化率为51.70％。
实施例24、On-DNA联芳基化合物66的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.11μmol,11当量，0.092μL)，向溶液中依次加入BPO(0.002μmol，0.2当量，0.01μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.1 μmol，10当量，0.08μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.15μmol，15当量，0.12μL，1.25 M ACN溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(100nmol，10当量，0.302μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)。将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5392.2，实测分子量为5391.6，转化率为38.00％。
实施例25、On-DNA联芳基化合物67的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.11μmol,11当量，0.092μL)，向溶液中依次加入BPO(0.002μmol，0.2当量，0.01μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.1μmol， 10当量，0.08μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.15μmol，15当量，0.12μL，1.25M ACN 溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(100nmol，10当量，0.302μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)。将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5446.2，实测分子量为5445.0，转化率为43.80％。
实施例26、On-DNA联芳基化合物69的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.11μmol，11当量，0.092μL)，向溶液中依次加入BPO(0.002μmol，0.2当量，0.01μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.1μmol， 10当量，0.08μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.15μmol，15当量，0.12μL，1.25M ACN 溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将on-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(100nmol，10当量，0.302μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)。将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5450.1，实测分子量为5450.2，转化率为58.30％。
实施例27、On-DNA联芳基化合物70的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.11μmol,11当量，0.092μL)，向溶液中依次加入BPO(0.002μmol，0.2当量，0.01μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.1 μmol，10当量，0.08μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.15μmol，15当量，0.12μL，1.25 M ACN溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(100nmol，10当量，0.302μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)。将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5396.2，实测分子量为5395.5，转化率为55.00％。
实施例28、On-DNA联芳基化合物72的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.11μmol,11当量，0.092μL)，向溶液中依次加入BPO(0.002μmol，0.2当量，0.01μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.1μmol， 10当量，0.08μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.15μmol，15当量，0.12μL，1.25M ACN 溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(100nmol，10当量，0.302μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)，将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5433.1，实测分子量为5432.3，转化率为56.79％。
实施例29、On-DNA联芳基化合物73的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.11μmol,11当量，0.092μL)，向溶液中依次加入BPO(0.002μmol，0.2当量，0.01μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.1μmol， 10当量，0.08μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.15μmol，15当量，0.12μL，1.25M ACN 溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(100nmol，10当量，0.302μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)。将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5379.2，实测分子量为5378.4，转化率为60.18％。
实施例30、On-DNA联芳基化合物75的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.11μmol,11当量，0.092μL)，向溶液中依次加入BPO(0.002μmol，0.2当量，0.01μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.1μmol， 10当量，0.08μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.15μmol，15当量，0.12μL，1.25M ACN 溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量， 10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(100nmol，10当量，0.302μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)。将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5418.3，实测分子量为5417.1，转化率为43.07％。
实施例31、On-DNA联芳基化合物77的合成
将B2pin2溶解于ACN中，配制成1.2M浓度溶液(0.11μmol,11当量，0.092μL)，向溶液中依次加入BPO(0.002μmol，0.2当量，0.01μL，0.2M ACN溶液)、芳香胺(0.1μmol， 10当量，0.08μL，1.25M ACN溶液)、t-BuONO(0.15μmol，15当量，0.12μL，1.25M ACN 溶液)，混合在1.5mL离心管中，震荡均匀后，25℃反应16小时，用于下一步反应。
将On-DNA芳基卤素原料溶于去离子水中配制成1mM浓度溶液(10nmol，1当量，10μL)，向溶液中依次加入上述混合液(100nmol，10当量，0.302μL，331mM ACN溶液)、 KOH(1500nmol，150当量，1.5μL，1M水溶液)。将POPd(6.7nmol，0.67当量，0.335 μL，20mM DMA溶液)与配体(13.3nmol，1.33当量，0.665μL，20mM DMA溶液)混合在1.5mL离心管中，混合均匀后加入到前述DNA溶液中，混合均匀，95℃反应2小时。反应完全后，向反应液中加入20倍当量的DDTC(100mM水溶液)以除去钯，用涡旋振荡充分混匀后于25℃静置30分钟。
除钯完毕后乙醇沉淀标准操作后处理。余下沉淀用去离子水溶解，得到On-DNA产物的溶液，通过酶标仪OD定量后，送LCMS监测，该化合物理论分子量为5428.3，实测分子量为5427.4，转化率为39.24％。
综上所述，本发明通过控制反应时的溶剂、温度、配比等条件，以芳基胺化合物为原料，在双联频哪醇硼酸酯、亚硝酸叔丁酯和催化量过氧化苯甲酰的作用下得到对应的芳基硼酸频哪醇酯，并“一锅法”与On-DNA芳基卤代化合物在钯催化剂、配体、碱下得到On-DNA联芳基化合物。该方法收率高，反应条件较为温和，操作简单，对不同取代的芳基胺有很好的普适性，能够通过芳胺化合物大规模的引入芳基硼酸频哪醇酯作为合成模块，能够高收率得到高多样性的DNA编码化合物库，适合使用多孔板进行的DNA编码化合物库的合成。
Claims (11)
1.一种“一锅法”On-DNA 铃木反应的方法，其特征在于：所述方法在硼酸酯、亚硝酸酯和自由基引发剂存在下，将胺基化合物转换成硼酸酯化合物，然后与On-DNA芳基卤代化合物在钯催化剂下得到On-DNA产物；其中胺基化合物的结构式为R1-NH2，On-DNA芳基卤代化合物的结构式为DNA-Ar-X；所述On-DNA产物的结构式为DNA-Ar-R1；
其中，结构式中DNA包含由人工修饰的和/或未修饰的核苷酸单体聚合得到的单链或双链的核苷酸链，该核苷酸链通过一个或多个化学键或基团与Ar相连；
Ar选自取代的芳环或芳杂环；所述取代的取代基选自分子量1000以下与芳环或芳杂环直接相连的基团；
R1选自分子量1000以下与氨基氮原子直接相连的基团；
X选自氯、溴、碘。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述硼酸酯选自双联频哪醇硼酸酯；所述亚硝酸酯选自亚硝酸叔丁酯；所述自由基引发剂选自过氧化苯甲酰。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述Ar选自以下基团：
R2为氢、卤素、烷基、取代烷基、烷氧基中的任意一种或多种的随机组合，Ar上可以有一个或多个R2基团，X为O、S、NH或烷基取代的亚氨基中的任意一种；
所述烷基为C1-C12的直链或支链烷基；所述烷氧基为C1-C12的直链或支链烷氧基；
取代烷基的取代基的数量为一个或多个，取代烷基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、羧基、苯基中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述R1选自烷基、取代烷基、5～10元芳基、取代5～10元芳基、5-10元芳杂环基、取代5-10元芳杂环基；其中，所述烷基为C1～C20烷基或C3～C8环烷基；取代烷基的取代基的数量为一个或多个；取代烷基的取代基是相互独立的选自羟基、卤素、羧基、硝基、C1～C20烷氧基、卤代苯基、苯基、烷基苯基、5-10元芳杂环基中的一种或多种；取代5～10元芳基的取代基的数量为一个或多个，取代5～10元芳基的取代基是相互独立的选自羟基、卤素、氰基、硝基、羧基、C1～C20烷氧基、C1～C20烷氧基羰基、C1～C20烷基、C3～C8环烷基、C1～C20烷基酰基、三氟甲基、5-10元芳杂环基、-OR、-NHC(O)R中的一种或多种；取代5-10元芳杂环基的取代基的数量为一个或多个，取代5-10元芳杂环基的取代基是相互独立的选自卤素、氰基、硝基、羧基、C1～C20烷氧基、C1～C20烷基、二氟甲基、三氟甲基中的一种或多种；
所述的R选自C3～C8环烷基、5-10元芳杂环基、5～10元芳基。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述反应的反应步骤为：胺基化合物与双联频哪醇硼酸酯、过氧化苯甲酰、亚硝酸叔丁酯，在10℃～100℃下反应0.5-24小时后，再加入On-DNA芳基卤代化合物和钯催化剂，在10℃～100℃下反应0.5-24小时。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述钯催化剂选自四三苯基磷钯、POPd、ssPhos-Pd-G2。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述硼酸酯化合物与On-DNA芳基卤代化合物的反应在溶剂中进行，溶剂为水、甲醇、乙醇、乙腈、二甲亚砜、无机盐缓冲液、有机酸缓冲液、有机碱缓冲液中任意一种或几种的含水混合溶剂；优选地，所述反应溶剂含有乙腈、水。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法中硼酸酯化合物与On-DNA芳基卤代化合物反应时还需要加入碱和配体；优选地，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸铯，所述配体选自2-(二环己基膦)-2',6'-二甲氧基联苯-3'-磺酸钠。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述方法中On-DNA芳基卤代化合物的摩尔当量为1，摩尔浓度为0.5-5mM，胺基化合物的摩尔当量为1-100，双联频哪醇硼酸酯的摩尔当量为1-100，亚硝酸叔丁酯的摩尔当量为10-100，过氧化苯甲酰的摩尔当量为0.1-10，钯催化剂的摩尔当量为0.1-2.5，碱的摩尔当量为50-300；配体的摩尔当量为0.1-2.5。
10.根据权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于：所述方法用于批量的多孔板操作。
11.根据权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于：所述方法用于多孔板的DNA编码化合物库的合成。
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