CN112433020A - 一种基于青砖茶的单糖组成的检测方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于青砖茶的单糖组成的检测方法及用途，包括青砖茶的单糖样品制备；a.青砖茶多糖的预处理；b.青砖茶多糖的酸水解；c.青砖茶单糖的衍生化；标准溶液和质控样品溶液制备；根据图谱中各单糖保留时间进行青砖茶的单糖样品的定性分析，根据图谱中各单糖峰面积大小进行青砖茶的单糖样品定量分析。本发明本发明的技术检测QDTPs中的单糖具有良好的准确性，为多糖的分析提供参考依据；因为单糖是多糖的组成部分，而多糖具有许多药理活性，对单糖的鉴定有助于青砖茶这个茶叶品种的质量控制，同时可鉴别真伪。

Description

一种基于青砖茶的单糖组成的检测方法及用途
技术领域
本发明涉及青砖茶多糖(QDTPs)，具体涉及一种基于青砖茶的单糖组成的检测方法及用途置。
背景技术
青砖茶(Qingzhuan Dark Tea,QDT)是一种主要产于中国长江流域鄂南和鄂西南地区的黑茶，其选用海拔600-1200米的高山茶树鲜叶为原料，经大大小小70多道工序加工而成，已有200多年历史。QDT与其他黑茶如茯砖茶、黑砖茶等相比较，可溶性糖类及一些色素类物质含量较多[1,2]。茶多糖(Tea polysaccharides,TPS)是茶叶中的有效成分之一，它是一种结合大量矿质元素可溶性糖蛋白，其分子量为1×104-5×104，是一种无毒副作用，在功能性食品或药物制品中有广泛的开发应用前景的物质[3-8]。目前已有许多研究表明，TPS具有抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶活性、改善胰岛素抵抗、增强糖耐受、降低血糖等功能，对如糖尿病，饮食性肥胖症等慢性代谢性疾病有着不俗的防治效果，可有效防治糖尿病的发生发展。
青砖茶多糖(QDTPs)是QDT防治糖尿病等代谢性疾病的有效成分，Cheng等人研究发现，QDT粗多糖具有抑制α-淀粉酶活性，Liu等人]研究发现，QDT水提物具有抑制α-葡萄糖苷酶活性。迄今为止，对于QDTPs的组成研究与同属黑茶类的茯砖茶、普洱茶等研究相比，还存在较大差距，本文将首次对青砖茶多糖中单糖组成和含量进行报道。
随着药物分析技术的不断进步，LC-MS/MS法越来越多的应用于植物中单糖的分析，为提高LC-MS/MS法检测单糖的专属性和灵敏度，常常需要对单糖进行衍生化处理。目前，应用最为广泛的衍生化处理方式是1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化，其具有反应条件温和、紫外检测灵敏度高且无中间产物生成等优良特性。Wu等人使用LC/ESI-MS技术，对衍生化后的羊栖菜多糖进行了单糖分析；Fan等人使用HPLC-MS/MS技术，对3个不同产地的桂花多糖进行柱前衍生化，检测其中单糖含量，也取得到了较好的效果。
发明内容
本发明是本研究通过优化PMP柱前衍生体条件和色谱分离条件，利用LC-MS/MS法对不同年份QDTPs中单糖的种类及含量进行测定，建立一种高效、灵敏的青砖茶单糖的PMP-LC-MS/MS方法。
本发明的技术方案是：
一种基于青砖茶的单糖组成的检测方法，
S1青砖茶的单糖样品制备；
a.青砖茶多糖的预处理；b.青砖茶多糖的酸水解；c.青砖茶单糖的衍生化；
S2标准溶液和质控样品溶液制备；
S3根据图谱中各单糖保留时间进行青砖茶的单糖样品的定性分析，根据图谱中各单糖峰面积大小进行青砖茶的单糖样品定量分析；
其中，色谱条件：
色谱柱：shim-pack VP-ODS228-34937-92，流动相A：82％-乙酸铵，流动相B：17％～19％-乙腈，流速：0.9mL/min等度洗脱，柱温：27℃，进样体积：2μL；
质谱条件：
离子源：电喷雾(electrospray ionization,ESI)，检测模式：正离子模式；
加热块温度：400℃；DL温度：250℃，扫描时间：0.5s，扫描模式：一级质谱Q3扫描、二级质谱产物离子扫描、多反应检测模式定量分析，电喷雾电压：3.5KV，
雾化气体：N2，雾化气流速：3.0L/min，干燥器流量：15.0L/min，碰撞气体：高纯氮气，碰撞气压力：230KPa。
进一步地，上述流动相B为18％-乙腈。
进一步地，上述青砖茶的单糖样品制备包括：
水提醇沉法提取青砖茶：称取20.00g干燥青砖茶粉末于圆底烧瓶中，由于青砖茶压制较紧，且原料面茶和里茶不一致，需磨碎处理，混匀，保证取样的均一性；料液比1:16加320mL水于95℃水域回流提取3.3h，冷却，4500r离心15min，取滤液；滤液用真空旋转蒸发仪于55℃下浓缩至滤液体积的1/5，冷却至室温，加无水乙醇使终浓度为75％，于4℃下静置12h，抽滤，取滤渣冷冻干燥，得粗提青砖茶多糖；
Sevage法除蛋白：Sevag试剂的配置为V正丁醇:V氯仿＝1:4，VSevag试剂添加量:V茶多糖溶液＝1:5，充分混匀，5000r/min离心20min,上层为多糖溶液，中间层为蛋白，下层为有机溶剂，取多糖溶液，此操作重复多次，直至肉眼可见中间层无蛋白为止；脱蛋白后多糖溶液用无水乙醇再次沉淀，离心收集沉淀，冷冻干燥，得粗多糖。
进一步地，上述青砖茶多糖的酸水解步骤包括：
柱前衍生化：
精密吸取柱前衍生化：精密吸取青砖茶单糖于离心管中，加入适量氨水，加0.5mol/L PMP甲醇溶液，涡旋3min充分混匀，于70℃水浴锅中避光反应30min,避光冷却至室温，加10％冰乙酸调节酸碱度至pH＝7.0；
去除残留PMP：
向溶液中加少量氯仿，涡旋3min充分混匀，静置分层，8000r离心10min，弃下层氯仿，用氯仿同法处理共3次，过0.22μm滤膜，稀释成不同浓度溶液待用。
进一步地，上述准溶液和质控样品溶液制备步骤包括：
精密称取10.0mg内标物GluA加蒸馏水配成1mg/mL的IS储备液；分别精密称取9种标准单糖(Man,Rib,Rha,GalUA,Glu,Gal,Xyl,Ara,Fuc)各10.0mg于容量瓶中，加蒸馏水定容至10mL,配成1mg/mL的混合标准单糖储备液；质控样品(QC)浓度分别为LQC 50μg/mL,MQC300μg/mL,HQC 750μg/mL；所有储备液均放在4℃保存。
上述任意一种检测方法在青砖茶上年份的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明的技术检测QDTPs中的单糖具有良好的准确性，为多糖的分析提供参考依据；因为单糖是多糖的组成部分，而多糖具有许多药理活性，对单糖的鉴定有助于青砖茶这个茶叶品种的质量控制，同时可鉴别真伪。
本发明的技术方案发现QDT中含有Man,Rib,Rha,GalUA,Glu,Gal,Xyl,Ara,Fuc 9种单糖，其中Glu,Gal,Ara,GalUA 4种单糖是QDTPs的主要组成成分占总糖的74％-86％,Rib和Fuc为首次在QDT中发现的单糖，并且11年QDTPs含量＞5年QDTPs含量＞2年QDTPs含量。
附图说明
图1中a.b为D-Rib，D-Xyl，L-Ara的一、二级质谱图；
图2中c.d为L-Rha，L-Fuc的一、二级质谱图；
图3中e.f为D-Man，D-Glu，D-Gal的一、二级质谱图；
图4中g.h为D-GalUA，D-GluA的一、二级质谱图；
图5是十种单糖的标准溶液的内标的色谱保留时间示意图；
图6是2年的QDT单糖样品的内标的色谱保留时间示意图；
图7是5年的QDT单糖样品的内标的色谱保留时间示意图；
图8是11年的QDT单糖样品的内标的色谱保留时间示意图；
图9是不同年份QDTPs样品中9种单糖含量高低示意图；
图10是柱温对单糖分离的影响示意图；
图11是有机相比对单糖分离的影响示意图；
图12是不同PMP浓度下衍生单糖的峰面积示意图；
图13盐酸浓度(A)的影响示意图；
图14是QDT单糖峰面积的水解温度(B)的影响示意图；
图15是QDT单糖峰面积的水解时间(C)的影响示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
1.材料与方法
1.1实验试剂和仪器
2年，5年，11年青砖茶(均购于湖北省赵李桥茶厂有限责任公司)，甘露糖(D-Man),核糖(D-Rib),鼠李糖(L-Rha),半乳糖醛酸(D-GalUA),葡萄糖醛酸(D-GluA),葡萄糖(D-Glu),半乳糖(D-Gal),木糖(D-Xyl),***糖(L-Ara),岩藻糖(L-Fuc)(≥99.0％，均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，盐酸，氨水，冰乙酸，氯仿，无水乙醇，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)(分析纯，均购于国药集团化学试剂有限公司)，乙腈，甲醇，乙酸铵(色谱纯，均购于美国Thermo Fisher公司)。
日本岛津LC-MS-8040液相色谱-三重四级杆质谱联用仪，LC-20ADXR二元梯度泵，SIL-20AC自动进样器，CTO-20AC柱温箱和CBM-20A***控制器，Z32 HK型离心机(LansunChina)，RE-52A型旋转蒸发仪(巩义市英峪予华仪器厂),Sevenexcellence型pH计、PL2002型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司),XW-80A型旋涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司),KQ-300VDV型双频数控超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司)。
1.2 LC-MS条件
1.2.1色谱条件：色谱柱：shim-pack VP-ODS228-34937-92(150×4.6×5)，流动相A：82％-乙酸铵(5mmol/L)，流动相B：18％-乙腈，流速：0.9mL/min等度洗脱，柱温：27℃，进样体积：2μL。
1.2.2质谱条件：离子源：电喷雾(electrospray ionization,ESI)，检测模式：正离子模式。加热块温度：400℃；DL温度：250℃，扫描时间：0.5s，扫描模式：一级质谱Q3扫描(质谱扫描范围m/z 100-600)、二级质谱产物离子扫描、多反应检测(multiple reactionmonition,MRM)模式定量分析，电喷雾电压：3.5KV，雾化气体：N2，雾化气流速：3.0L/min，干燥器流量：15.0L/min，碰撞气体：高纯氮气，碰撞气压力：230KPa。
Table 1
The precursor ion,product ion and MS parameters of derivedmonosaccharides in positive ion mode.
Figure BDA0002793835150000041
Figure BDA0002793835150000051
通过观察正离子模式下PMP标记的单糖质谱数据发现，单糖衍生物均显示出强烈的分子离子峰[M+2PMP-H2O+H]+,而单糖衍生物二级碎片离子峰均裂解出m/z 175.20[PMP+H]+的子离子，m/z 175.20的碎片离子是断裂一个PMP和一分子单糖结合的结果，并且具有一致的裂解规律[25,26]。4种不同定量离子对的一级质谱图和二级质谱图见Fig.1-4。
Fig.1-4，a.b为D-Rib，D-Xyl，L-Ara的一、二级质谱图；c.d为L-Rha，L-Fuc的一、二级质谱图；e.f为D-Man，D-Glu，D-Gal的一、二级质谱图；g.h为D-GalUA，D-GluA的一、二级质谱图。
Fig.1-4.The MS1 and MS2 of ten derived monosaccharides.a.b：The MS1 andMS2 of D-Rib，D-Xyl and L-Ara,respectively；c.d:The MS1 and MS2 of L-Rha and L-Fuc,respectively；e.f:The MS1 and MS2 of D-Man，D-Glu and D-Gal respectively；g.h:The MS1 and MS2 of D-GalUA and D-GluA,respectively.
1.3 QDT单糖样品制备
1.3.1 QDTPs的预处理
水提醇沉法提取TPS：称取20.00g干燥QDT粉末于圆底烧瓶中(过60目)，由于QDT压制较紧，且原料面茶和里茶不一致，需磨碎处理，混匀，保证取样的均一性；料液比1:16加320mL水于95℃水域回流提取3.3h，冷却，4500r离心15min，取滤液；滤液用真空旋转蒸发仪于55℃下浓缩至滤液体积的1/5，冷却至室温，加无水乙醇使终浓度为75％，于4℃下静置12h，抽滤，取滤渣冷冻干燥，得粗提QDTPs[27]。
Sevage法除蛋白：Sevag试剂的配置为V正丁醇:V氯仿＝1:4，VSevag试剂添加量:V茶多糖溶液＝1:5，充分混匀，5000r/min离心20min,上层为多糖溶液，中间层为蛋白，下层为有机溶剂，取多糖溶液，此操作重复多次，直至肉眼可见中间层无蛋白为止。脱蛋白后多糖溶液用无水乙醇再次沉淀(4℃、12h)，离心收集沉淀，冷冻干燥，得粗多糖。
1.3.2 QDTPs的酸水解
分别精密称取2年、5年、11年QDTPs各5mg于水解管中，加5mL HCL(2mol/L)，密封，90℃水浴锅中水解3h，冷却至室温，8000r离心10min取上清液，得QDTPs水解液[29]。
1.3.3 QDT单糖的衍生化
柱前衍生化：精密吸取QDT单糖500μL于离心管中，加氨水500μL，加0.5mol/L PMP甲醇溶液500μL，涡旋3min充分混匀，于70℃水浴锅中避光反应30min,避光冷却至室温，加10％冰乙酸调节酸碱度至pH＝7.0。
去除残留PMP：向溶液中加1mL氯仿，涡旋3min充分混匀，静置分层，8000r离心10min，弃下层氯仿，用氯仿同法处理共3次，过0.22μm滤膜，稀释成不同浓度溶液待用。
1.4标准溶液和质控样品溶液制备
精密称取10.0mg内标物(IS)GluA加10.0mL蒸馏水配成1mg/mL的IS储备液；分别精密称取9种标准单糖(Man,Rib,Rha,GalUA,Glu,Gal,Xyl,Ara,Fuc)各10.0mg于容量瓶中，加蒸馏水定容至10mL,配成1mg/mL的混合标准单糖储备液；质控样品(QC)浓度分别为LQC 50μg/mL,MQC 300μg/mL,HQC 750μg/mL。所有储备液均放在4℃保存。
1.5方法学验证
根据美国食品和药物管理局(FDA)的指导方针，对该方法的专属性，线性，最低定量下限(LLOQ)，准确度，精密度和稳定性进行验证。
1.5.1专属性
通过分析标准品、样品中单糖以及内标的色谱保留时间评估该方法的专属性。
1.5.2线性和最低定量下限(n＝3)
精密量取混合标准单糖储备液500μL于离心管中，进行柱前衍生化，得混合标准单糖的衍生化溶液，衍生化溶液用蒸馏水稀释成1000μg/mL、750μg/mL、600μg/mL、300μg/mL、50μg/mL、20μg/mL工作溶液200μL；同法制备IS衍生化溶液；向一系列工作溶液中加入浓度为1mg/mL IS衍生化溶液50μL，充分混匀，过0.22μm滤膜，进行液质检测，每个浓度平行测定3次求平均值，以系列浓度为横坐标，各单糖峰面积与内标物峰面积之比为纵坐标绘制标准曲线。检测最低定量下限(LLOQ)为标曲的最低浓度。
1.5.3精密度和准确度(n＝6)
在同一天和连续三天对QC(LQC、MQC和HQC)样品进行分析，用回收率表示准确度，相对标准偏差(RSD)表示精密度，评价该方法日内和日间精密度和准确度。
1.5.4稳定性(n＝6)
分别精密量取500μL储备液和IS储备液，衍生化，分析物和内标物按4:1充分混匀，过0.22μm滤膜，进行液质检测，通过3个QC样品(n＝6)分别在4℃下储存24h和48h进行分析，相对标准偏差(RSD)测定精密度，来评价分析物的稳定性。
1.6实验重复性考察
分别精密量取500μL QDTPs水解液和IS储备液，分别衍生化，分析物和内标物按4:1充分混匀，过0.22μm滤膜，进行液质检测，不同年份的QDT样品在较短时间内重复进样6次，计算RSD值以评价样品的可重复性。
1.7样品含量测定方法
取不同年份QDT样品对其进行预处理、酸水解和衍生化，样品和内标物按5:1充分混匀，过0.22μm滤膜，进行液质检测，不同年份的QDT样品分别进样6次，记录峰面积并计算其各单糖含量。
2.结果和讨论
2.1方法学结果
2.1.1专属性
Fig.4-8 A.B.C.D结果显示，本研究所优化的LC-MS/MS条件具有良好的专属性。Fig.5-8.Multiple reaction monitoring(MRM)mode of ten derived monosaccharides，1-Man,2-Rib,3-Rha,5-GalUA,6-Glu,7-Xyl,8-Gal,9-Ara,10-Fuc,4-GluA(IS).A：Standard solutions of ten derived monosaccharides.B.C.D:The derived QDTmonosaccharide samples of 2 years,5 years and 11 years.
2.1.2线性和最低定量下线
Table 2结果显示9种分析物在20.0～1000.0μg/mL范围内均具有良好的(R2＞0.9900)线性关系,且LLOQ为20μg/mL。
Table 2 The regression equation,linear range and LLOQ of nine derivedmonosaccharides(n＝3).
Figure BDA0002793835150000071
2.1.3精密度和准确度
Table 3实验结果显示，分析物日内精密度的RSD值为0.47-3.55％，回收率为85.3-113.6％；连续三天的精密度的RSD值为2.47-14.79％，回收率为85.6-114.6％。说明此仪器具有良好的精密度和准确度。
Table 3 Precision and accuracy of nine derived monosaccharides(n＝6).
Figure BDA0002793835150000081
2.1.4稳定性
Table 4结果显示，4℃条件下储存24h和48h后，分析物的RSD分别为0.28-9.71％和1.10-13.66％。说明在上述条件下，分析物性质稳定。
Table 4 The stability of nine derived monosaccharides(n＝6).
Figure BDA0002793835150000082
Figure BDA0002793835150000091
2.1.5重复性
Table 5结果显示，不同年份的QDTPs的RSD值均小于7.27％。说明在上述分析条件下，待分析物的重复性较好。
Table 5 The reproducibility of QDT monosaccharide samples indifferent years(n＝6).
Figure BDA0002793835150000092
2.2青砖茶样品中单糖含量结果
通过LC-MS/MS分析2年、5年、11年的QDTPs样品中单糖种类和含量发现：QDTPs中含有Man,Rib,Rha,GalUA,Glu,Gal,Xyl,Ara,Fuc 9种单糖，由Table 6对比不同年份青砖茶中各单糖的含量，2年、5年、11年中各单糖含量比分别为：Man:Rib:Rha:GalUA:Glu:Gal:Xyl:Ara:Fuc为0.20:0.15:0.13:0.35:1.02:0.50:0.12:0.43:0.11；0.28:0.25:0.19:0.71:1.58:1.30:0.24:0.94:0.23；0.87:0.32:0.52:2.70:4.60:4.10:0.33:2.84:0.27.其中Glu,Gal,Ara,GalUA 4种单糖是QDTPs的主要组成成分，Rib和Fuc是QDTPs中未被报道的两种单糖。另外，不同年份QDTPs样品中9种单糖含量高低为11年＞5年＞2年。
实验结果如图5-8所示：图5是未分开两种单糖图(7-Xyl,8-Gal,9-Ara)，图6、图7、图8是17％，18％和19％乙腈分离结果，图6、图7、图8是33％，34％和35％甲醇分离结果(7-Xyl,8-Gal,9-Ara分离)
Table 6 The contents of QDT monosaccharide samples in different years(n＝6).
Figure BDA0002793835150000093
Figure BDA0002793835150000101
Fig.9 The contents of QDT monosaccharide samples in different years(n＝6).*P＜0.05：The contents of monosaccharide was significantly different fromthat of 2 years.
2.3单糖分离液相条件优化
由于Xyl，Ara二者在PMP衍生化之后仍然表现出非常相似的色谱性质，为了使他们达到较好的分离效果(分离度大于1.5),我们在色谱条件优化时更换了不同色谱柱、改变流速、改变流动相比例、调节柱温箱温度。实验表明，柱温箱温度和流动相的比例对待测物分离度和保留时间影响最大，因此，我们对柱温箱温度和流动相的比例进行了优化。
2.3.1柱温箱温度的确定
水相为乙酸铵缓冲溶液(5mmol/L)，分别控制柱温箱温度为24℃，27℃，30℃，35℃，乙腈浓度为18％，流速：0.9mL/min,进样：2μL，分析待测物出峰情况。
以9种单糖中每两种单糖之间的最低分离度为标准进行分析，结果如Fig.5-8，表明：随着分析温度的升高，分析时间逐渐缩短，但分离度逐渐下降。在较短的分析时间内，分离度越大，分离效果越好。综合考虑，选取分析温度为27℃，在此温度下分析时间为59min，分离度大于1.5。
2.3.2流动相比例的确定
水相为乙酸铵缓冲溶液(5mmol/L)，分别控制流动相中乙腈的比例为16％，17％，18％，19％，柱温箱：27℃，流速：0.9mL/min,进样：2μL，分析待测物出峰情况。
以9种单糖中每两种单糖之间的最低分离度为标准进行分析，结果如Fig.11，所示：随着乙腈浓度的升高，分析时间逐渐缩短，但分离度也随之下降，当分离度足够大时，耗时为92min。在较短时间内，分离度越大分离效果越好，综合考虑，选取乙腈浓度为18％的条件，此浓度下分析时间为59min，分离度大于1.5。
结果表明：当温度为27℃，流速为0.9mL/min，流动相B为18％-乙腈，流动A为82％-乙酸铵(5mmol/L)时，9种单糖之间的分离度均大于1.5，表明在上述条件下，可以对9种单糖进行有效的分离。
Fig.10.The influence of column temperature on the separation ofmonosaccharides.
Fig.11.The influence of organic phase ratio on the separation ofmonosaccharides.
2.4 PMP条件优化
4个离心管中分别精密吸取储备液500μL，各加氨水500μL，分别加0.3mol/L,0.5mol/L,0.7mol/L,0.9mol/L PMP甲醇溶液500μL，涡旋3min使之充分混匀，于70℃水浴锅中避光反应30min,避光冷却至室温，加10％冰乙酸调节酸碱度至pH＝7.0，向溶液中加1mL氯仿，用涡旋仪充分混匀，静置，8000r离心10min，弃有机层，此操作重复3次，除去多余的PMP，过0.22μm滤膜，上样。
PMP甲醇溶液浓度对单糖的柱前衍生化至关重要，通过单因素试验发现(Fig.12)，PMP甲醇溶液浓度为0.5mol/L时，PMP甲醇溶液达到饱和状态，单糖衍生完全并且各单糖的峰面积最大；当PMP甲醇溶液浓度为0.3mol/L时，衍生不完全出现峰形不对称以及拖尾的现象并且各单糖的响应值较小；当PMP甲醇溶液浓度为0.7mol/L时，各单糖的峰面积与0.5mol/L相比均下降；当PMP甲醇溶液浓度为0.9mol/L时，出现PMP析出现象，导致实际浓度有所下降，各单糖的峰面积与0.5mol/L相比都有所下降。
结果表明：PMP甲醇溶液浓度为0.5mol/L时，表现出峰型对称，无拖尾现象以及各单糖的响应值较大，表明在此浓度下单糖衍生较为完全；
Fig.12 Peak area of derived monosaccharides at different PMPconcentrations(0.1mol/L,0.3mol/L,0.5mol/L,0.7mol/L and 0.9mol/L).
2.5酸水解条件优化
分别进行盐酸浓度、酸水解温度、反应时间的单因素试验。
2.5.1盐酸浓度的优化
分别向1mg/mL的QDTPs中加入1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mol/L的HCL溶液，在100℃条件下反应2h,取出冷却至室温，8000r离心10min取上清液，得QDTPs水解液，进行柱前衍生化后，过0.22μm滤膜，进样，记录峰面积。结果如Fig.15
2.5.2酸水解温度的优化
将1mg/mL的QDTPs溶解在2.0mol/L HCL溶液中，在100℃条件下，分别反应1，2，3，4，5h,取出冷却至室温，8000r离心10min取上清液，得QDTPs水解液，进行柱前衍生化后，过0.22μm滤膜，上样，记录峰面积。结果如Fig.7B
2.5.3反应时间的优化
将1mg/mL的QDTPs溶解在2.0mol/L HCL溶液中，分别在70，80，90，100，110℃条件下反应2h，取出冷却至室温，8000r离心10min取上清液，得QDTPs水解液，进行柱前衍生化后，过0.22μm滤膜，上样，记录峰面积。结果如Fig.13C
结果表明：在2mol/L HCL浓度，90℃温度条件下反应3h，各单糖的响应值较大，表明在上述条件下多糖水解较为完全；
Fig.13.The influence of hydrochloric acid concentration(A),
Fig.14.hydrolytic temperature(B)on the peak area of QDTmonosaccharides.
Fig.15.hydrolytic time(C)on the peak area of QDT monosaccharides.
2.6质谱条件优化
质谱设置为正离子模式下多重反应检测(MRM)并使用分析物优化各项参数，优化每种化合物的前体离子，相应的产物离子和碰撞诱导解离(CID)。对于D-Man，D-Glu，D-Gal,MS跃迁为m/z 511.40→175.20，对于D-Rib，D-Xyl，L-Ara，MS跃迁为m/z 481.36→175.20，对于L-Rha,L-Fuc,MS跃迁为m/z 495.20→175.20，对于D-GlaUA,D-GluA,MS跃迁为m/z525.40→175.20。遵循化合物的裂解规律，优化质谱条件，通过对照品筛选出子母离子的质荷比，MRM模式下最优的毛细管电压，毛细管出口电压，碰撞电压等参数。
4.结论
本研究通过优化多糖酸水解条件、衍生化试剂浓度和液质分析条件，建立了一种特异性强、灵敏度高的PMP-LC-MS/MS方法对2年、5年、11年QDT中的单糖进行定性定量分析。结果表明，QDT中含有Man,Rib,Rha,GalUA,Glu,Gal,Xyl,Ara,Fuc 9种单糖，其中Glu,Gal,Ara,GalUA 4种单糖是QDTPs的主要组成成分占总糖的74％-86％,Rib和Fuc为首次在QDT中发现的单糖，并且11年QDTPs含量＞5年QDTPs含量＞2年QDTPs含量。结果表明PMP-LC-MS/MS技术检测QDTPs中的单糖具有良好的准确性，为多糖的分析提供参考依据。
本研究中，均采用同一企业不同年份青砖样品为原料，保证了不同年份QDT品质的均一性，从而较好地规避了因原料不同而导致的生化成分差异。贮藏时间是影响QDT后发酵过程的最关键因素之一，适当的贮藏时间可使QDT滋味更为醇和，香气更加趋于饱满优雅，其品质风格突显，价值也较新茶提升；通过本研究发现，11年QDTPs含量高于5年高于2年，同一产地同一企业随着贮藏时间的延长其含量越来约高，那么不同企业不同产地随着贮藏时间的延长其多糖含量会发生怎样的变化，值得研究。
该方法测定结果准确，快速，高效，在对QDT中单糖组成和含量测定的同时，同样为其它中药植物中单糖的鉴别和定量提供依据；更有意义的是，本实验对QDT单糖质量控制方面提供可靠的实验数据，为后期青砖茶食品、饮料及相关功能保健产品的开发提供参考和借鉴。

Claims (6)

1.一种基于青砖茶的单糖组成的检测方法，其特征在于，
S1青砖茶的单糖样品制备；
a.青砖茶多糖的预处理；
b.青砖茶多糖的酸水解；
c.青砖茶单糖的衍生化；
S2标准溶液和质控样品溶液制备：
S3根据图谱中各单糖保留时间进行青砖茶的单糖样品的定性分析，根据图谱中各单糖峰面积大小进行青砖茶的单糖样品定量分析；
其中，色谱条件：
色谱柱：shim-pack VP-ODS228-34937-92，流动相A：82%-乙酸铵，流动相B：17%～19%-乙腈，流速：0.9 mL/min等度洗脱，柱温：27 ℃，进样体积：2 μL；
质谱条件：
离子源：电喷雾（electrospray ionization, ESI），检测模式：正离子模式；
加热块温度：400 ℃；DL温度：250 ℃，扫描时间：0.5 s，扫描模式：一级质谱Q3扫描、二级质谱产物离子扫描、多反应检测模式定量分析，电喷雾电压：3.5 KV，
雾化气体：N2，雾化气流速：3.0 L/min，干燥器流量：15.0 L/min，碰撞气体：高纯氮气，碰撞气压力：230 KPa。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相B为18%-乙腈。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述青砖茶的单糖样品制备包括：
水提醇沉法提取青砖茶：称取20.00 g干燥青砖茶粉末于圆底烧瓶中，由于青砖茶压制较紧，且原料面茶和里茶不一致，需磨碎处理，混匀，保证取样的均一性；料液比1:16加320mL水于95 ℃水域回流提取3.3 h，冷却，4500 r离心15 min，取滤液；滤液用真空旋转蒸发仪于55 ℃下浓缩至滤液体积的1/5，冷却至室温，加无水乙醇使终浓度为75 %，于4 ℃下静置12 h，抽滤，取滤渣冷冻干燥，得粗提青砖茶多糖；
Sevage法除蛋白：Sevag试剂的配置为V正丁醇:V氯仿=1:4，VSevag试剂添加量:V茶多糖溶液=1:5，充分混匀，5000 r/ min离心20 min,上层为多糖溶液，中间层为蛋白，下层为有机溶剂，取多糖溶液，此操作重复多次，直至肉眼可见中间层无蛋白为止；脱蛋白后多糖溶液用无水乙醇再次沉淀，离心收集沉淀，冷冻干燥，得粗多糖。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述青砖茶多糖的酸水解步骤包括：
柱前衍生化：
精密吸取柱前衍生化：精密吸取青砖茶单糖于离心管中，加入适量氨水，加0.5 mol/LPMP甲醇溶液，涡旋3 min充分混匀，于70 ℃水浴锅中避光反应30 min,避光冷却至室温，加10 % 冰乙酸调节酸碱度至pH=7.0；
去除残留PMP：
向溶液中加少量氯仿，涡旋3 min充分混匀，静置分层，8000 r离心10 min，弃下层氯仿，用氯仿同法处理共3次，过0.22 μm滤膜，稀释成不同浓度溶液待用。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述标准溶液和质控样品溶液制备步骤包括：
精密称取10.0 mg内标物GluA加蒸馏水配成1 mg/mL的IS储备液；分别精密称取9种标准单糖(Man, Rib, Rha, GalUA, Glu, Gal, Xyl, Ara, Fuc)各10.0 mg于容量瓶中，加蒸馏水定容至10 mL,配成1 mg/mL的混合标准单糖储备液；质控样品(QC)浓度分别为LQC 50μg/mL, MQC 300 μg/mL, HQC 750 μg/mL；所有储备液均放在4 ℃保存。
6.如上述1-5任意一种检测方法在青砖茶上年份的应用。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105044246A (zh) * 2015-09-01 2015-11-11 厦门大学 一种利用高效液相色谱分析木聚糖水解液的方法
CN105136951A (zh) * 2015-08-07 2015-12-09 华中农业大学 一种茶叶多糖单糖组成的快速定量方法
WO2018219258A1 (zh) * 2017-05-29 2018-12-06 青岛大学附属医院 血清游离甘露糖和葡萄糖的高效液相色谱检测
CN108982733A (zh) * 2018-05-31 2018-12-11 大连工业大学 一种分析多糖组成结构的方法
CN109187807A (zh) * 2018-10-22 2019-01-11 湖北科技学院 一种柱前衍生化hplc-ms/ms检测桂花中单糖含量的方法
CN109212103A (zh) * 2018-11-13 2019-01-15 湖北科技学院 一种高效提取测定贝母中多糖单糖组分的柱前衍生hplc方法
CN109613138A (zh) * 2018-12-28 2019-04-12 福建中医药大学 一种利用pmp-hplc-内标标准曲线法同时测定太子参中葡萄糖和半乳糖含量的方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105136951A (zh) * 2015-08-07 2015-12-09 华中农业大学 一种茶叶多糖单糖组成的快速定量方法
CN105044246A (zh) * 2015-09-01 2015-11-11 厦门大学 一种利用高效液相色谱分析木聚糖水解液的方法
WO2018219258A1 (zh) * 2017-05-29 2018-12-06 青岛大学附属医院 血清游离甘露糖和葡萄糖的高效液相色谱检测
CN108982733A (zh) * 2018-05-31 2018-12-11 大连工业大学 一种分析多糖组成结构的方法
CN109187807A (zh) * 2018-10-22 2019-01-11 湖北科技学院 一种柱前衍生化hplc-ms/ms检测桂花中单糖含量的方法
CN109212103A (zh) * 2018-11-13 2019-01-15 湖北科技学院 一种高效提取测定贝母中多糖单糖组分的柱前衍生hplc方法
CN109613138A (zh) * 2018-12-28 2019-04-12 福建中医药大学 一种利用pmp-hplc-内标标准曲线法同时测定太子参中葡萄糖和半乳糖含量的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIZENG CHENG等: "Distinct Changes of Metabolic Profile and Sensory Quality during Qingzhuan Tea Processing Revealed by LC-MS-Based Metabolomics", 《JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY》 *
杨新河等: "不同黑茶多糖的组成分析及其抗氧化活性", 《食品工业科技》 *

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