CN112176071A - 检测广州管圆线虫的引物和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测广州管圆线虫的引物和试剂盒。该检测广州管圆线虫的引物，包括如下至少一种引物对：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的第一引物对；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的第二引物对；SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的第三引物对。利用该引物对广州管圆线虫进行快速检测，不仅可以避免低感染中间宿主检测不出所导致的假阴性现象，而且可以排除因反应体系中存在抑制剂、PCR仪器故障、反应体系错误、聚合酶失活等原因造成的假阴性结果，因此可进一步提高检测结果的准确性。

Description

检测广州管圆线虫的引物和试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测广州管圆线虫的引物和试剂盒。
背景技术
广州管圆线虫(又称广东住血线虫，Angiostrongylus cantonensis)是一种可感染包括人类在内的众多哺乳动物的寄生虫。受感染的小鼠从病到死亡仅仅需要十五天时间。广州管圆线虫是一种呈世界性分布的***共患线虫病，广泛分布在世界各洲并且集中分布在亚太地区，在中国的云南、浙江、广东、福建等南部地区均有流行，尤其在中国广东的广州深圳等地区频繁出现感染事件。在国外，澳大利亚早在20世纪70年代就有血管强直性线虫病的报道。在欧洲许多国家岛屿地区，例如哥斯达黎加，委内瑞拉，厄瓜多尔，洪都拉斯，墨西哥，尼加拉瓜，巴西，危地马拉，哥伦比亚，加勒比岛屿和美国南部等，均发现广州管圆线虫感染水生动物等中间宿主和人类等哺乳动物，造成巨大的经济损失。
广州管圆线虫可引起人广州管圆线虫病，可导致嗜酸性脑膜炎等众多中枢神经***疾病，严重时出现认知障碍，精神错乱，嗜睡昏迷以及死亡。福寿螺、褐云玛瑙螺、藁杆双脐螺及蛞蝓均是广州管圆线虫的主要中间宿主，它引发的人畜寄生虫病每年造成巨大的经济损失。在中间宿主褐云玛瑙螺体内可达上千条的广州管圆线虫三期幼虫，这也是广州管圆线虫在全球传播的主要原因。与此同时，螺类等水生动物的寄生虫检测在寄生虫病的防控中尤为重要，广州管圆线虫中间宿主具体的检测方法包括病原学诊断法和分子生物学诊断法，如肺检法和胃蛋白酶消化法等；病原学检测检出率低，对于低度感染的中间宿主一般很难检查出来，导致较高的漏检率，而要检测低度感染的中间宿主则需要具有高灵敏度优势的实验室方法。
由于广州管圆线虫的形态鉴定存在操作复杂费时等缺陷，不少学者开始在免疫学、病理学和生理生化学等方面做了大量工作，对于广州管圆线虫的检测起到了积极的作用。但是，这些方法在检测过程中由于受到广州管圆线虫生长发育期、宿主和地理来源、实验条件等方面的限制，在实际应用过程中具有一定的局限性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测广州管圆线虫的引物和试剂盒，旨在解决现有广州管圆线虫检测繁琐，灵敏度低和成本高的技术问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明一方面提供一种检测广州管圆线虫的引物，包括如下至少一种引物对：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的第一引物对；
SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的第二引物对；
SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的第三引物对。
本发明提供的用于检测广州管圆线虫的引物以广州管圆线虫大亚基核糖体18sRNA基因为模板设计得到，利用该基因高保守高稳定区设计灵敏度高、特异性好的三对引物对，利用该引物对广州管圆线虫进行快速检测，不仅可以避免低感染中间宿主检测不出所导致的假阴性现象，而且可以排除因反应体系中存在抑制剂、PCR仪器故障、反应体系错误、聚合酶失活等原因造成的假阴性结果，进一步提高检测结果的准确性；因此，对防止广州管圆线虫的感染具有重大意义。
本发明另一方面提供一种检测广州管圆线虫的试剂盒，包括扩增所述广州管圆线虫的引物，所述引物包括如下至少一种引物对：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的第一引物对；
SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的第二引物对；
SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的第三引物对。
本发明提供的试剂盒含有用于检测广州管圆线虫的引物，该引物以广州管圆线虫大亚基核糖体18s RNA基因为模板设计得到，利用该基因高保守高稳定区设计灵敏度高、特异性好的三对引物对，利用该引物对广州管圆线虫进行快速检测，不仅可以避免低感染中间宿主检测不出所导致的假阴性现象，而且可以排除因反应体系中存在抑制剂、PCR仪器故障、反应体系错误、聚合酶失活等原因造成的假阴性结果，进一步提高检测结果的准确性；该试剂盒的检测过程操作简便，仅需一套普通的PCR仪即可进行检测，从线虫DNA的简易提取到检测结果的出现，全过程仅需1.5小时，适合疾病预防控制中心等各检疫检查站及研究机构等快速检测广州管圆线虫，对防止广州管圆线虫的感染具有重大意义。
附图说明
图1是本发明实施例中以广州管圆线虫基因DNA为模板，使用第一引物对、第二引物对和第三引物对的PCR扩增结果；泳道1和5为DL2000 DNA Marker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道2为使用第一引物对的扩增结果，扩增产物条带大小为422bp；泳道3为使用第二引物对的扩增结果，扩增产物条带大小为389bp；泳道4为使用第三引物对的扩增结果，扩增产物条带大小为424bp；
图2是本发明实施例中以广州管圆线虫基因DNA为模板，使用第一引物对进行特异性PCR检测的扩增结果；泳道1为DL2000 DNA Marker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道2-11依次为恶性疟原虫、弓形虫、隐孢子虫、鞭毛虫、旋毛虫、蛔虫、异尖线虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫、肝片吸虫的扩增结果；泳道12为阴性对照；泳道13为阳性对照，扩增产物条带大小为422bp；泳道14为空白对照；
图3是本发明实施例中以广州管圆线虫基因DNA为模板，使用第二引物对进行特异性PCR检测的扩增结果；泳道1为DL2000 DNA Marker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道2-11依次为恶性疟原虫、弓形虫、隐孢子虫、鞭毛虫、旋毛虫、蛔虫、异尖线虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫、肝片吸虫的扩增结果；泳道12为阴性对照；泳道13为阳性对照，扩增产物条带大小为389bp；泳道14为空白对照；
图4是本发明实施例中以广州管圆线虫基因DNA为模板，使用第三引物对进行特异性PCR检测的扩增结果；泳道1为DL2000 DNA Marker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道2-11依次为恶性疟原虫、弓形虫、隐孢子虫、鞭毛虫、旋毛虫、蛔虫、异尖线虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫、肝片吸虫的扩增结果；泳道12为阴性对照；泳道13为阳性对照，扩增产物条带大小为424bp；泳道14为空白对照；
图5是本发明实施例中以广州管圆线虫基因DNA为模板，使用第一引物对进行灵敏度检测的PCR扩增结果；泳道1为DL2000 DNA Marker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道2-8依次为20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、200fg、20fg的广州管圆线虫基因DNA模板浓度的扩增结果，扩增产物条带大小为422bp；泳道9为空白对照；
图6是本发明实施例中以广州管圆线虫基因DNA为模板，使用第二引物对进行灵敏度检测的PCR扩增结果；泳道1为DL2000 DNA Marker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道2-8依次为20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、200fg、20fg的广州管圆线虫基因DNA模板浓度的扩增结果，扩增产物条带大小为389bp；泳道9为空白对照；
图7是本发明实施例以广州管圆线虫基因DNA为模板，使用第三引物对进行灵敏度检测的PCR扩增结果；泳道1为DL2000 DNA Marker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道2-8依次为20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、200fg、20fg的广州管圆线虫基因DNA模板浓度的扩增结果，扩增产物条带大小为424bp；泳道9为空白对照；
图8是本发明实施例以实际生物样本DNA为模板，使用第二引物对的PCR扩增结果；泳道1和22为DL 2000 DNA Marker(2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)；泳道2-19分别为18份褐云玛瑙螺基因组DNA；泳道20为阴性对照；泳道21为阳性对照；
上述图中，空白对照为ddH2O，阳性对照为广州管圆线虫三期幼虫DNA，阴性对照为未感染广州管圆线虫的褐云玛瑙螺螺肉DNA。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一方面，本发明实施例提供了一种检测广州管圆线虫的引物，包括如下至少一种引物对：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的第一引物对；
SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的第二引物对；
SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的第三引物对。
具体地，
SEQ ID NO.1：5′-TGATGCTTGTGCGGTTTTC-3′；
SEQ ID NO.2：5′-GTTCCCTTGGCTGTGGTTT-3′；
SEQ ID NO.3：5′-ATTGATGCTTGTGCGGTTTT-3′；
SEQ ID NO.4：5′-GGGACAGTGGGAATCTCGT-3′；
SEQ ID NO.5：5′-ATTGATGCTTGTGCGGTTTT-3′；
SEQ ID NO.6：5′-GTTCCCTTGGCTGTGGTTT-3′。
为有效防控广州管圆线虫，现迫切需要特异性强、稳定性高、操作方便、高灵敏度的检测引物，而本发明实施例提供的用于检测广州管圆线虫的引物以广州管圆线虫大亚基核糖体18s RNA基因(如SEQ ID NO.7所示)为模板设计得到，利用该基因高保守高稳定区设计灵敏度高、特异性好的三对引物对，利用该引物对广州管圆线虫进行快速检测，不仅可以避免低感染中间宿主检测不出所导致的假阴性现象，而且可以排除因反应体系中存在抑制剂、PCR仪器故障、反应体系错误、聚合酶失活等原因造成的假阴性结果，进一步提高检测结果的准确性；因此，对防止广州管圆线虫的感染具有重大意义。
SEQ ID NO.7：
Figure BSA0000220459830000061
具体地，本发明实施例检测广州管圆线虫的引物由上述第一引物对、第二引物对和第三引物对组成。该引物用于扩增广州管圆线虫特异基因序列即SEQ ID NO.7所示的大亚基核糖体18s RNA基因。用上述引物对待测样品DNA进行扩增，若结果产生一条特异谱带(第一引物对谱带大小为422bp，第二引物对谱带大小为389bp，第三引物对谱带大小为424bp)，则该样品含有广州管圆线虫；若扩增结果没有出现谱带，则该样品中不含有广州管圆线虫。
进一步地，该引物检测褐云玛瑙螺感染的广州管圆线虫。本发明实施例根据广州管圆线虫18s大亚基核糖体RNA基因序列设计特异性强、合成率高的引物，通过优化引物浓度、退火温度等反应条件，建立了高灵敏度的褐云玛瑙螺感染广州管圆线虫的实验室PCR检测体系。
另一方面，本发明实施例还提供了一种检测广州管圆线虫的试剂盒，包括扩增所述广州管圆线虫的引物，所述引物包括如下至少一种引物对：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的第一引物对；
SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的第二引物对；
SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的第三引物对。
本发明实施例提供的试剂盒含有用于检测广州管圆线虫的引物，该引物以广州管圆线虫大亚基核糖体18s RNA基因为模板设计得到，利用该基因高保守高稳定区设计灵敏度高、特异性好的三对引物对，利用该引物对广州管圆线虫进行快速检测，不仅可以避免低感染中间宿主检测不出所导致的假阴性现象，而且可以排除因反应体系中存在抑制剂、PCR仪器故障、反应体系错误、聚合酶失活等原因造成的假阴性结果，进一步提高检测结果的准确性；该试剂盒的检测过程操作简便，仅需一套普通的PCR仪即可进行检测，从线虫DNA的简易提取到检测结果的出现，全过程仅需1.5小时，适合疾病预防控制中心等各检疫检查站及研究机构等快速检测广州管圆线虫，对防止广州管圆线虫的感染具有重大意义。
具体地，该试剂盒中的引物由第一引物对、第二引物对和第三引物对组成。本发明实施例提供的试剂盒：(1)检测结果准确性高。在检验过程中，比对了18个褐云玛瑙螺生物样本，该试剂盒对广州管圆线虫的检测准确性达100％。(2)稳定性好。通过样品检验，广州管圆线虫样本均能够稳定地扩增出特异谱带。(3)检测特异性好。三对引物对均检测不出除了广州管圆线虫DNA以外的其它寄生虫片段。(4)检测灵敏度高。三对引物对均可检测出广州管圆线虫中间宿主淡水螺等体内的线虫片段，引物灵敏度为目前报道的100倍。(5)检测方法安全。电泳过程用GOLDVIEW染料代替溴化乙锭(EB)染色，其灵敏度比EB高且无致癌作用，同时避免了EB对环境的污染与人体的损害。(6)检测结果易判读。用引物对对待测样品DNA进行扩增，若结果仅产生一条特异谱带，并无特异性杂带，则该样品含有广州管圆线虫；若扩增结果没有出现谱带，则该样品中不含有广州管圆线虫。(7)检测时间短。通过引物对和反应体系的优化，大大减短了扩增时间，全程仅需要1.5小时。(8)检测仪器简单。仅需普通PCR仪、离心机、电泳仪等，检测仪器价值约5万元。适用于在基层检疫检查站推广应用。
进一步地，该试剂盒还包括PCR反应液、阳性对照、阴性对照和空白对照。其中，PCR反应液包括Taq聚合酶、dNTP和PCR缓冲液；阳性对照为广州管圆线虫DNA；阴性对照为未感染广州管圆线虫的褐云玛瑙螺螺肉；空白对照为水。具体地，选择了包含Taq聚合酶、dNTP、PCR Buffer(含Mg2+和RNase free water)和电泳相关色素的Taq酶预混液，简化了操作过程，并且优化了PCR检测广州管圆线虫试剂体系(25ul)，该体系包括以下组分：12.5ul的2xPro Taq Master Mix，上下游引物(稀释浓度为10mM)各1ul，2ul DNA模板和8.5ulddH2O。
用本发明实施例提供的试剂盒中第一引物对、第二引物对、第三引物对对待测样品DNA进行扩增，若结果产生一条特异谱带，则该样品为广州管圆线虫；若扩增结果没有出现谱带，则该样品中不含有广州管圆线虫。
该试剂盒包括检测广州管圆线虫的特异性引物对和操作更加简单快速的PCR试剂，可以克服荧光PCR检测方法操作复杂，需要专业操作，且实验仪器成本高的缺陷。
本发明实施例先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。
下述实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例所用恶性疟原虫、弓形虫、隐孢子虫、鞭毛虫、旋毛虫、蛔虫、异尖线虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫、肝片吸虫来源于深圳市疾病预防控制中心和上海市疾病预防控制中心，广州管圆线虫感染性褐云玛瑙螺采集于深圳市南山区新屋村。所用虫体样本的采集地和主要中间宿主如表1所示。
表1
种类 采集地 主要中间宿主
广州管圆线虫 上海 螺类
恶性疟原虫 广东深圳 蚊类
弓形虫 广东深圳 猫科及哺乳动物
隐孢子虫 广东深圳 哺乳动物
鞭毛虫 广东深圳 昆虫及哺乳动物
旋毛虫 上海 哺乳动物
蛔虫 上海 无
异尖线虫 上海 鱼类及螺类
卫氏并殖吸虫 浙江永嘉 螺类
大片吸虫 广西南宁 螺类
肝片吸虫 广西南宁 螺类
实施例1
扩增引物设计
设计并合成了三组用于扩增广州管圆线虫特异基因序列的PCR扩增引物(第一引物、第二引物对、第三引物对；引物合成委托深圳百赛生物技术有限公司完成。引物合成后20,000xg(14,000rpm)离心3min使干粉状的引物沉于离心管底部，然后用灭菌蒸馏水制成100mM原液(储藏液)，再用超纯水稀释到10mM并分装，作为工作液。引物序列如下：
1.第一引物对
上游引物(F)：5′-TGATGCTTGTGCGGTTTTC-3′；
下游引物(F)：5′-GTTCCCTTGGCTGTGGTTT-3′。
2.第二引物对
上游引物(F)：5′-ATTGATGCTTGTGCGGTTTT-3′；
下游引物(R)：5′-GGGACAGTGGGAATCTCGT-3′。
3.第三引物对
上游引物(F)：5′-ATTGATGCTTGTGCGGTTTT-3′；
下游引物(R)：5′-GTTCCCTTGGCTGTGGTTT-3′。
实施例2
试剂盒组装，该试剂盒包括以下组分：
1)2xPro Taq Master Mix PCR反应液：Taq聚合酶、dNTP、PCR Buffer(含Mg2+和RNase free water)和电泳相关色素的Taq酶预混液。
2)阳性对照的制备：阳性对照DNA为广州管圆线虫基因组DNA，将感染了广州管圆线虫的褐云玛瑙螺螺肉打碎，用匀浆法沉淀显微镜下查找广州管圆线虫三期幼虫，用枪头吸出放入1.5ml离心管并使用双蒸水清洗，取广州管圆线虫提取基因组DNA并测定核酸浓度，用超纯水稀释至20ng/ul，分装至-20℃冷藏室保存。
3)试剂盒的组装：
按下述表2成分组装试剂盒(整个操作在无菌环境下进行)：
表2
Figure BSA0000220459830000101
Figure BSA0000220459830000111
另外，试剂盒还可以包括阴性对照(未感染广州管圆线虫的褐云玛瑙螺螺肉)和空白对照(ddH2O)。
实施例3
用试剂盒检测广州管圆线虫的方法如下：
1)提取待检样品，按QIAGEN组织DNA提取试剂盒说明书提取螺肉基因组DNA，所有试剂及溶液均由QIAGEN组织DNA提取试剂盒提供。
步骤1.取广州管圆线虫三期幼虫加入纯水吹打混匀，清洗虫体。取25mg的虫体组织用手术剪剪碎并放入1.5ml的微量离心管中，加入180ul buffer ATL，并作以标记。
步骤2.加入20ul蛋白酶K，涡旋混合均匀，加入200ul buffer AL涡旋使其充分混匀，56℃孵育10min使其溶解，然后加入200ul乙醇(96％-100％)，再次涡旋混合。
步骤3.移出步骤2中的混合物(包括沉淀物)至DNA纯化柱，该柱子放在2ml收集管中。6000xg(8000rpm)离心1min，收取管子，弃去滤液。
步骤4.将纯化柱放入2ml收集管中，加入500ul buffer AW1，6000xg(8000rpm)离心1min，收取管子，弃去滤液。
步骤5.重复步骤4操作，加入500ul buffer AW2，20,000xg(14,000rpm)离心3min，使纯化柱内膜干燥，收取管子，弃去滤液。
步骤6.向纯化柱移入2mL的微量离心管中，将50ul bufferAE滴入膜上，室温孵育1min，然后6000xg(8000rpm)离心1min，收集DNA并作以标记，-20℃冷藏室保存。
2)PCR扩增。PCR总反应体系为25ul(生物样品DNA的用量根据提取基因组DNA浓度决定，最后用ddH2O补足，阳性对照用量2ul)，反应参数如下述表3所示：
表3
组分 容量
2xPro Taq Master Mix反应液 12.5ul
10mM上游引物 1ul
10mM下游引物 1ul
阳性对照DNA 2ul
ddH20 8.5ul
将阴性和阳性对照分别加入标记好的管中，然后把样品做好标记并依次加入，置于PCR仪中。PCR反应条件为：98℃预变性1min；98℃变性10s、54℃退火30s、72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸7min。
使用琼脂糖、TAE和琼脂糖配置1.5％的琼脂糖凝胶，加入显色液，***梳子等其冷却后，120V电压下电泳15分钟后在紫外灯下观察凝胶，若结果产生一条特异谱带(如图1所示)，则该样品含有广州管圆线虫；若扩增结果没有出现谱带，则该样品中不含有广州管圆线虫。
实施例4
对广州管圆线虫检测试剂盒的特异性试验
选择恶性疟原虫、弓形虫、隐孢子虫、鞭毛虫、旋毛虫、蛔虫、异尖线虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫、肝片吸虫等10种寄生虫样本来进行试剂盒特异性检测，按照实施例3所述的方法提取各虫体基因组DNA。以这些基因组DNA为模板，进行扩增。检测结果如图2-4所示，泳道2-11依次为：恶性疟原虫、弓形虫、隐孢子虫、鞭毛虫、旋毛虫、蛔虫、异尖线虫、卫氏并殖吸虫、大片吸虫、肝片吸虫；只有广州管圆线虫扩增产物出现典型的条带，即为阳性检测。其它等寄生虫样本都为阴性，无假阳性和假阴性结果。说明采用本发明所述的PCR试剂盒特异性强。
实施例5
对广州管圆线虫检测试剂盒的灵敏度试验
按照实施例3所述的方法提取各虫体基因组DNA，以稀释至20ng/ul的广州管圆线虫DNA为原始浓度，依次进行10倍梯度稀释：10倍稀释、102倍稀释、103倍稀释、104倍稀释、105稀释、106稀释、107稀释DNA倍数的灵敏度检测。以稀释好的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。检测结果如图5-7所示，泳道2-9的DNA浓度依次为：20ng、2ng、200pg、20pg、2pg、200fg、20fg、2fg。广州管圆线虫DNA的特异性条带清晰、明亮，稀释至200pg时，特异性产物条带均清晰可见，说明本发明实施例的试剂盒灵敏度高，完全满足灵敏度的要求。
实施例6
对广州管圆线虫检测试剂盒的生物样本试验
采集深圳市南山区新屋村褐云玛瑙螺18份，对褐云玛瑙螺样本进行处理，用试剂盒对实际生物样本进行检测。具体地，收集褐云玛瑙螺并称重记录，用锤子砸碎螺壳，取出螺肉。将螺肉放入匀浆机内，加入适量纯水进行研磨，取匀浆放入烧杯中静置20分钟，反复沉淀3次后收集沉淀液于50ml离心管中，5000xg离心30分钟并倒去上清液，收集沉淀于4℃冷藏室保存。按照实施例3的方法，用组织DNA提取试剂盒提取处理好的褐云玛瑙螺样本基因组DNA，并进行PCR扩增，观察PCR产物进行实际生物样本检测，结果如图8所示。
图8中，泳道2-19为18份褐云玛瑙螺基因组DNA；泳道20为阴性对照；泳道21为阳性对照。通过图8的条带可以看出第2、3、9和18个生物样本是受到广州管圆线虫感染的褐云玛瑙螺，与微镜下检测广州管圆线虫的结果相同，说明该试剂盒的检出率为100％，对实际生物样本进行检测完全可行。
将检出广州管圆线虫阳性的PCR产物的送往深圳市百赛生物技术有限公司测序，经PCR扩增共有4个阳性结果，对阳性结果进行序列测定，所测序列与广州管圆线虫序列完全一致，正确率为100％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure ISA0000220459850000011
Figure ISA0000220459850000021

Claims (10)

1.一种检测广州管圆线虫的引物，其特征在于，包括如下至少一种引物对：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的第一引物对；
SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的第二引物对；
SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的第三引物对。
2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物由所述第一引物对、所述第二引物对和所述第三引物对组成。
3.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物检测褐云玛瑙螺感染的广州管圆线虫。
4.一种检测广州管圆线虫的试剂盒，包括扩增所述广州管圆线虫的引物，其特征在于，所述引物包括如下至少一种引物对：
SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的第一引物对；
SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的第二引物对；
SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的第三引物对。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述引物由所述第一引物对、所述第二引物对和所述第三引物对组成。
6.如权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所说试剂盒还包括PCR反应液、阳性对照、阴性对照和空白对照。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括Taq聚合酶、dNTP和PCR缓冲液。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为广州管圆线虫DNA。
9.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为未感染广州管圆线虫的褐云玛瑙螺螺肉。
10.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述空白对照为水。
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