CN112010940A - 抑制pd-1/pd-l1的大环化合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大环类化合物及其应用,该化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、外消旋体或异构体可以制备PD‑1/PD‑L1抑制剂,影响抑制生长因子的生成和细胞增殖,在制备***药物中有良好的应用前景。与单抗研究开发相比,PD‑1/PD‑L1抑制剂领域的肽类抑制剂却进展缓慢,所以研究开发抑制PD‑1/PD‑L1相互作用的抑制剂具有重要的临床意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种大环类化合物或其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物在制备PD-1/PD-L1抑制剂药物中的应用。
背景技术
PD-1又称CD279,是一种相对分子量为55000~60000的I型跨膜蛋白,属免疫球蛋白超家族成员,其结构主要包括胞外免疫球蛋白可变区(IgV)样结构域、疏水的跨膜区以及胞内区。胞内区包括C端和N端氨基酸残基,含有2个独立的磷酸化作用位点,分别为免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif,ITIM)和免疫受体酪氨酸转换基序(immunoreceptor tyrosine based switch motif,ITSM)。PD-1主要表达于活化的CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和树突状细胞等免疫细胞上,促进T细胞的成熟。PD-1的配体属B7家族成员,包括PD-L1(又名 B7-H1,CD274)和PD-L2(又名B7-DC),两者均高表达于胎盘组织;低表达于脾脏、***、胸腺;脑组织中无表达。其中,PD-L1同是I型跨膜蛋白,主要表达于抗原提呈细胞、B细胞、T细胞、上皮细胞、肌细胞、内皮细胞等。PD-1及PD-L1共同组成 PD-1/PD-L1信号通路,抑制生长因子的生成和细胞增殖,并对T细胞的活化及调控免疫应答起到重要作用。PD-1/PD-L1通路激活后,在癌症、妊娠、组织移植以及自身免疫病中抑制免疫***。目前PD-1/PD-L1抑制剂的开发主要集中在单克隆抗体领域,已有Nivolumab,Lambrolizumab,Atezolizumab,Durvalumab,Avelumab等单抗在国内外上市,可用于治疗非小细胞肺癌,黑色素瘤等常规治疗方法效果不佳的疾病具有明显的治疗效果。与单抗研究开发相比,该领域的肽类抑制剂却进展缓慢。所以研究开发抑制PD-1/PD-L1相互作用的抑制剂具有重要的临床意义。
发明内容
发明目的:本发明的目的在于提供一种大环类化合物及其应用,该化合物为 PD-1/PD-L1抑制剂,影响抑制生长因子的生成和细胞增殖,在制备***药物中有良好的应用前景。
技术方案:本发明公开了一种大环类化合物及其应用。该化合物或其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物为PD-1/PD-L1抑制剂,可用于治疗恶性肿瘤。
一种大环类化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、外消旋体或异构体,该化合物结构如通式(I)所示:
其中,通式中的Q可独立选自于下列结构中的立体异构或消旋体中的一种;
其中,A为氢原子或甲基。
M可独立选自于下列结构中的立体异构或消旋体中的一种;
L可独立选自于下列结构中的一种;
其中,R1为H或CONH2。
药物组合物,包括所述的大环类化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、外消旋体或异构体。
药物组合物的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、糖浆剂、口服液或注射剂。
所述的大环类化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、外消旋体或异构体在制备PD-1/PD-L1通路抑制剂中的应用。
所述的大环类化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、外消旋体或异构体或所述的药物组合物在制备预防或***药物中的应用。
所述预防或***药物为PD-1/PD-L1通路的预防或***药物。
所述肿瘤为人乳腺癌,包括其在远离肿瘤原发部位的组织或器官的转移病变。
所述的预防或***药物为癌症免疫治疗药物、癌症化疗药物或癌症靶向治疗药物。
在一些实施方案中,本申请涉及的化合物或其药学上可以接收的盐、酯或溶剂化合物选自以下化合物:
有益效果:本发明提供的大环类化合物,可制备PD-1/PD-L1抑制剂,影响抑制生长因子的生成和细胞增殖,并对T细胞的活化及调控免疫应答起到重要作用,在制备***药物中有良好的应用前景。
具体实施方式
为了进一步对本发明进行说明,下面通过具体实例进行详细阐述。
合成一般方法:
1.固相合成一般方法
固相氨基酸的合成均在固相反应合成管中进行,使用rink amide-AM树脂(Merrifield 聚合物负载(2,4-二甲氧基苯基)(4-烷氧基苯基)甲烷,其中4-烷氧基为与树脂连接的位置和化学键类型,负载量0.7mmol/g)。使用DMF和DCM溶解反应所用试剂后,沿管壁加入到反应管中,通入氮气后振荡所需时间。之后,反应液从反应管下侧通过真空泵抽去。反应中所用的溶剂和试剂为:DMF=N,N-二甲基甲酰胺;DCM=二氯甲烷; HATU=1-[二(二甲胺基)亚甲基]-3-氧代-1H-1,2,3-三氮唑并[4,5-b]吡啶六氟磷酸盐; DEPBT=3-(二乙氧基磷酰氧基)-1,2,3-苯并三嗪-4-酮;TBTU=O-苯并三氮唑-N,N,N',N'- 四甲基脲四氟硼;DIPEA=二异丙基乙胺。树脂的溶胀过程如下文“树脂溶胀步骤”所述。缩合步骤如下文“缩合步骤”所述。使用的氨基酸衍生物和末端羧酸如下所示(侧链保护基置于括号中):Fmoc-L-Gly-OH,Fmoc-L-Cys(Trt)-OH,Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-[N-Me]Nle-OH,Fmoc-L-Trp(CH2COOtBu)-OH,Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-L-Dab(Boc)-OH,Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH,Fmoc-L-Dap(Boc)-OH,Fmoc-L-Pro-OH, Fmoc-L-Asn(Trt)-OH,Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH,Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH,ClCH2COOH。
在一些实施例中,以下氨基酸和末端羧酸也会使用:Fmoc-L-Trp(Cbz)-OH, Fmoc-L-Dab(Cbz)-OH,Fmoc-L-[O-Bn]Hyp-OH,Fmoc-L-Dap(Cbz)-OH, Fmoc-L-[O-Bn]Tyr-OH,丙烯酸。
在一些实施例中,如下氨基酸衍生物也会被使用:2-芴甲氧羰基氨基-4-丁烯酸
2.树脂溶胀步骤
将Rink Amide-AM树脂(286mg,0.2mmol)加入到10mL的固相合成反应管中,加入8mL的DCM,静置半小时。之后将DCM经真空泵抽去即可完成树脂的溶胀。
3.缩合步骤
将6mL 20%的哌啶/DMF溶液加入到反应管中,振荡30分钟。反应液抽干,树脂用无水DMF(10mL),无水甲醇(10mL)和无水DCM(10mL)分别洗涤3次后,取样经四氯苯醌显色,树脂呈蓝色可指示脱除保护基结束。
脱除保护基结束后,将所需氨基酸(0.6mmol),HATU(228mg,0.6mmol),DMF (6mL)和DIPEA(210μL,1.2mmol)依次加入到干燥的圆底烧瓶中,超声助溶使其澄清。将混合液加入到固相合成反应管中,25℃反应3小时,取样经四氯苯醌显色,树脂呈无色透明可指示缩合反应结束。树脂用无水DMF(10mL),无水甲醇(10mL) 和无水DCM(10mL)分别洗涤3次后即可进行下一次缩合。
4.肽游离步骤
完成所需直链肽合成后,将树脂再用无水DMF洗涤1次,后抽至干。向干燥的树脂加入切割液(三氟乙酸:硫代苯甲醚:1,2-乙二硫醇:苯甲醚=90:5:2.5:2.5,体积比)。混合物在10℃下振摇3小时。反应结束后,将切割液抽滤出来,浓缩至原体积1/2,浓缩液逐滴加入到10倍体积的-20℃无水***中。抽滤形成的沉淀即得粗肽,可不经处理直接进行下一步反应。
5.RP-HPLC分离步骤
将所得的粗品肽溶于一定量的纯净水中,使用三乙胺或2M HCl调节PH至7,加入乙腈至澄清,冻干得粗品固体。加入一定量的乙腈使其完全溶解,经0.33μM滤器过滤。使用Aglient Eclipase XDB-C18柱进行分离,流动相A:0.1%TFA/H2O;流动相B: 0.1%TFA/MeCN。色谱条件为10%B-100%B,60min。
实施例1
的制备
实施例1的总合成路线如下所示:
化合物1-B的合成:
将化合物1-A(1g,3mmol)溶于甲苯(80mL)中,加入多聚甲醛(450mg)和对甲苯磺酸(52mg,0.3mmol)中,接分水器加热至130℃,反应1h。反应结束后,旋干反应液,用乙酸乙酯复溶,饱和碳酸氢钠洗涤2次,水洗2次,饱和食盐水洗1次。浓缩至干,粗品经硅胶柱层析分离(100%DCM)可得化合物1-A(940mg,产率90%)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.81(dd,J=7.9,1.1Hz,2H),7.73–7.63(m,4H), 7.55(td,J=7.6,1.2Hz,2H),5.85–5.73(m,1H),5.19(d,J=9.1Hz,1H),5.12(d,J=9.1 Hz,1H),5.02(dq,J=12.0,0.9Hz,2H),4.59–4.49(m,2H),4.37(dd,J=10.6,5.5Hz,1H), 4.34–4.29(m,1H),2.65(dddt,J=13.6,7.1,4.4,0.9Hz,1H),2.52–2.43(m,1H).MS (ESI):350.1[M+H]+
化合物1-C的合成:
将化合物1-B(1.3g,3.7mmol)溶于21mL CHCl3中,加入三异丙基硅烷2.1mL,将反应液置于冰浴,缓慢加入21mL三氟醋酸。该反应在室温下反应24h。反应液浓缩至干,乙酸乙酯复溶,水洗2次,饱和食盐水洗1次,有机层浓缩至干,经硅胶柱层析分离可得化合物1-C(1.11g,86%)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.84–7.78(m, 2H),7.70–7.62(m,4H),7.55(td,J=7.6,1.2Hz,2H),5.85(tt,J=9.6,7.1Hz,1H),5.08(dt, J=9.7,1.0Hz,2H),4.48(d,J=5.5Hz,2H),4.32–4.26(m,1H),4.16(t,J=5.5Hz,1H), 3.09(s,3H),2.64(dddt,J=13.7,6.7,5.7,1.1Hz,1H),2.47(dddt,J=13.7,7.3,5.5,0.9Hz, 1H).MS(ESI):352.3[M+H]+
化合物1-D的合成:
将化合物1-C(1.11g,3.2mmol)溶于5mL THF与5mL DMF的混合溶剂中,加入N-羟基琥珀酰亚胺(478mg,4.2mmol),将反应液置于冰浴,缓慢加入1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(1.04g,5.5mmol)。该反应在室温下反应24h。反应液浓缩至干,乙酸乙酯复溶,水洗5次,饱和食盐水洗1次,有机层浓缩至干,可不经纯化直接进行下一步反应。
化合物1-E的合成
将化合物1-D(1.5g,3.2mmol)溶于15mL丙酮与15mL 10%的碳酸钠水溶液中,将反应液置于冰浴,缓慢加入烯丙基甘氨酸盐酸盐(485mg,3.2mmol)。该反应在室温下反应24h。反应液浓缩至干,乙酸乙酯复溶,水洗5次,饱和食盐水洗1次,有机层浓缩至干,经硅胶柱层析分离可得目标产物1-E(1.1g,82%)。1H NMR(500MHz, Chloroform-d)δ7.97(d,J=9.2Hz,1H),7.84–7.78(m,2H),7.70(dd,J=7.8,1.4Hz,2H), 7.65(td,J=7.6,1.5Hz,2H),7.55(td,J=7.6,1.2Hz,2H),5.89–5.74(m,2H),5.14(dq,J= 9.7,1.1Hz,2H),5.04(dt,J=9.7,1.0Hz,2H),4.52–4.45(m,3H),4.33(t,J=5.5Hz,1H), 4.17(dt,J=9.3,5.4Hz,1H),2.89(s,3H),2.61(dddt,J=13.7,7.3,5.5,1.0Hz,1H),2.52 (ddt,J=7.3,5.5,1.1Hz,2H),2.41(dddt,J=13.6,7.3,5.5,0.9Hz,1H).MS(ESI):449.2 [M+H]+
化合物1的合成:
将化合物1-E(1.24g,3.1mmol)溶于10mL无水二氯甲烷中,加入Grubbs’2nd催化剂(79mg,3mmol%)。该反应在氮气保护下,回流反应2天。反应结束后,反应液用二氯甲烷稀释,水洗3次,饱和食盐水洗1次,有机相浓缩至干,经硅胶柱层析分离(DCM:MeOH=100:1)可得化合物1(1.04g,80%)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d) δ7.95(d,J=9.3Hz,1H),7.84–7.78(m,2H),7.71–7.61(m,4H),7.55(td,J=7.6,1.2Hz, 2H),5.70–5.58(m,2H),4.53(dd,J=10.7,5.4Hz,1H),4.42(dd,J=10.6,5.5Hz,1H), 4.34–4.25(m,3H),3.06(s,3H),2.50–2.39(m,3H),2.39–2.27(m,1H).MS(ESI):421.2 [M+H]+
实施例2
的制备
取化合物1(1.24g,3.1mmol)溶于15mL四氢呋喃中,加入124mg的10%Pd/C。该反应在氢气氛下,45℃反应8h。反应结束后,硅藻土助滤除去不溶物,滤饼用乙酸乙酯洗涤2次。合并有机相,浓缩至干,经硅胶柱层析分离(DCM:MeOH=100:1)可得化合物2(1.25g,99%)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.81(dd,J=7.6,1.2Hz,2H), 7.70(dd,J=7.8,1.4Hz,2H),7.69–7.60(m,3H),7.55(td,J=7.6,1.3Hz,2H),4.61(t,J= 6.0Hz,1H),4.53(dd,J=10.7,5.4Hz,1H),4.42(dd,J=10.6,5.5Hz,1H),4.28(dt,J=9.4, 5.9Hz,2H),3.02(s,2H),1.97–1.85(m,2H),1.85–1.75(m,1H),1.77–1.66(m,1H),1.68 –1.58(m,1H),1.61–1.50(m,3H).MS(ESI):423.2[M+H]+
实施例3
的制备
化合物3的总合成路线如下:
化合物3-B的合成:
化合物3-A(0.7mL,5.4mmol)溶于无水二氯甲烷(10mL)中,缓慢滴加氯磺酰异氰酸酯0.52mL,该反应液在氮气氛下回流2天。反应结束后,向反应液中加入预先配好的10%亚硫酸钠和10%氢氧化钾水溶液各10mL,使反应液的pH值保持在9。混合液分液,取有机层水洗3次,饱和食盐水洗1次,并浓缩至干。粗品经乙酸乙酯重结晶可得目标产物3-B,(620mg,79%)可直接进行下一步反应。MS(ESI):154.1[M+H]+
化合物3-C的合成:
取化合物3-B(190mg,1.3mmol)和四丁基溴化铵(42mg,0.13mmol)溶于5mL 四氢呋喃中,加入碘甲烷(121μL,1.95mmol)和氢氧化钾(80mg,1.43mmol)。该反应液在常温下反应8小时。反应结束后,反应液用2M HCl调节pH至4,二氯甲烷萃取3次,合并有机相,水洗3次,饱和食盐水洗1次,浓缩至干。粗品经***重结晶可得目标产物3-C(620mg,91%),可直接进行下一步反应。MS(ESI):165.2[M+H]+
化合物3-D的合成:
取化合物3-D(190mg,1.2mmol)溶于5mL 6M盐酸中,反应液在60℃下反应8小时。反应结束后,反应液浓缩至干,加入***常温搅拌。化合物3-D可从***中析出。抽滤即可得化合物3-D(188mg,71%)。MS(ESI):186.1[M-HCl+H]+
化合物3的合成:
取化合物3-D(190mg,0.85mmol),溶于10mL 10%的碳酸钠和10mL丙酮的混合液中,向该混合物中加入Fmoc-OSu(344mg,1mmol),反应在室温下反应24h。反应结束后,反应液用2M HCl调节pH至3,乙酸乙酯萃取3次,合并有机相,水洗3 次,饱和食盐水洗1次,有机相浓缩至干,经硅胶柱层析分离(DCM:MeOH=75:1)可得化合物3(325.6mg,90%)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.81(dd,J=7.9,1.2Hz, 2H),7.73–7.62(m,4H),7.56(td,J=7.6,1.2Hz,2H),4.53(dd,J=10.6,5.5Hz,1H),4.38 (dd,J=10.6,5.5Hz,1H),4.32–4.26(m,1H),4.06(dt,J=6.4,5.5Hz,1H),2.97(s,3H), 2.87(q,J=6.3Hz,1H),1.88–1.75(m,2H),1.75–1.62(m,2H),1.60–1.27(m,8H).MS (ESI):408.5[M+H]+
实施例4
的制备
化合物4的总合成路线如下:
按照实施例1的化合物1的制备,将起始原料Fmoc-烯丙基甘氨酸(1-A)更换为Fmoc-(3-丁烯)甘氨酸(1g,3mmol),可得目标产物化合物4-B(1.12g,84%)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.81(dd,J=7.9,1.2Hz,2H),7.73–7.63(m,4H),7.55 (td,J=7.6,1.2Hz,2H),5.86(tt,J=13.8,6.2Hz,1H),5.18(d,J=9.1Hz,1H),5.11(d,J= 9.1Hz,1H),5.05(dt,J=14.0,1.1Hz,2H),4.54–4.45(m,3H),4.29(t,J=5.5Hz,1H), 2.39–2.28(m,1H),2.28–2.17(m,1H),2.08(dtd,J=12.4,7.5,4.9Hz,1H),1.75–1.64(m, 1H).MS(ESI):362.2[M+H]+
按照实施例1中的化合物1的制备,将中间体1-B更换为4-B(1.3g,3.6mmol),可得目标产物4-C(1.09g,84%)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.81(dd,J=7.9,1.1 Hz,2H),7.73–7.63(m,4H),7.55(td,J=7.6,1.2Hz,2H),5.87(tt,J=13.8,6.2Hz,1H), 5.05(dt,J=13.9,1.1Hz,2H),4.55–4.45(m,3H),4.29(t,J=5.5Hz,1H),3.10(s,3H), 2.37–2.21(m,2H),2.04(dtd,J=11.9,7.5,6.0Hz,1H),1.77(dtd,J=11.9,7.5,6.0Hz,1H). MS(ESI):364.3[M+H]+
按照实施例1中的化合物1的制备,将中间体1-C更换为4-C(1.13g,3.2mmol),可得目标产物4-D粗品,可不经纯化直接进行下一步反应。
按照实施例1中的化合物1的制备,将中间体1-D更换为4-D(1.6g,3.2mmol),可得目标产物3-E(1.0g,78%)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.04(d,J=9.3Hz, 1H),7.84–7.78(m,2H),7.70(dd,J=7.8,1.4Hz,2H),7.65(td,J=7.6,1.5Hz,2H),7.55 (td,J=7.6,1.2Hz,2H),5.87(ttd,J=13.9,6.2,3.1Hz,2H),5.05(dq,J=13.7,0.9Hz,4H), 4.86(t,J=6.0Hz,1H),4.48(d,J=5.4Hz,2H),4.32–4.22(m,2H),3.00(s,3H),2.31– 2.11(m,4H),2.02–1.89(m,2H),1.85–1.69(m,2H).MS(ESI):477.1[M+H]+
按照实施例1中的化合物1的制备,将中间体1-E更换为4-E(1.6g,3.2mmol),可得目标产物化合物4(890mg,66%)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.84–7.78 (m,2H),7.73–7.61(m,5H),7.55(td,J=7.6,1.2Hz,2H),5.60(dtt,J=10.8,4.3,0.9Hz, 1H),5.52(dtt,J=10.8,4.5,0.9Hz,1H),4.53(dd,J=10.6,5.5Hz,1H),4.37(dd,J=10.7, 5.4Hz,1H),4.29(td,J=5.8,3.6Hz,2H),4.14(dt,J=9.3,6.0Hz,1H),2.99(s,3H),2.26– 1.82(m,8H).MS(ESI):449.2[M+H]+
实施例5
的制备
按照实施例2中的化合物2的制备,将起始原料化合物1更换为化合物4(1.02g,3mmol),可得目标产物化合物5(1.01g,99%)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.84 –7.78(m,2H),7.77–7.68(m,3H),7.65(td,J=7.6,1.5Hz,2H),7.55(td,J=7.6,1.2Hz, 2H),4.53(dd,J=10.6,5.5Hz,1H),4.43–4.34(m,2H),4.30(dt,J=9.2,5.9Hz,2H),2.95 (s,3H),1.89–1.78(m,3H),1.78–1.67(m,2H),1.57–1.43(m,3H),1.43–1.38(m,2H), 1.38–1.28(m,3H).MS(ESI):424.8[M+H]+
实施例6
的制备
化合物6的总合成方法如下所示:
取化合物6-1(6g,17.4mmol)溶于二氯甲烷(84mL)中,该反应液移至-60℃冷肼中,向反应液中鼓臭氧气体,1.5小时后,反应液缓慢升温至室温,向反应液中鼓入氮气以排除未反应完的臭氧。再将反应液移至冰浴下,缓慢加入二甲硫醚(101.8 mmol,38mL)。反应在室温下搅拌5天。反应结束后,反应液浓缩至干,经硅胶柱色谱层析(hexane:EA=8:2)可得目标产物6-2(4.53g,75%)。1H NMR(200MHz,CDCl3): δ=1.4-1.5(2s,9H),1.6-2.4(m,4H),2.4-3.2(m,2H),4.3-4.5(m,2H),5.15(s,2H), 7.30(m,5H),9.8(2s,1H).MS(ESI):347.3[M+H]+
取叔丁醇钾(825mg,7.36mmol)溶于40mL无水DCM中,-78℃下搅拌10分钟。另外将(±)苄基氧基羰基-a-膦酰甘氨酸三甲酯(2.5g,7.36mmol)溶于5mL无水DCM 中,缓慢滴加入叔丁醇钾的DCM溶液中,该反应在-78℃下反应0.5h。另外将化合物6-2(2.6g,7.36mmol)溶于25mL无水DCM中,加入到前述混合液中。该反应在-78℃下反应5h。反应结束后,反应液用磷酸盐缓冲液淬灭,水相用DCM萃取3次,合并有机相,水洗3次,饱和食盐水洗1次,有机相浓缩至干,经硅胶柱层析分离(hexane:EA=2:1) 可得目标产物6-3(Z/E混合物,总产率98%)。MS(ESI):552.6[M+H]+
取化合物6-3(6g,11.0mmol)溶于干燥THF(40mL)中,加入Boc2O(4.8g, 22.0mmol)和催化量的DMAP,该反应在室温下反应30分钟。反应结束后,反应液加水终止反应,乙酸乙酯萃取3次,水洗1次,饱和氯化钠水溶液洗1次,有机相浓缩至干,经硅胶柱层析分离(Hexane:EA=7:3)可得目标产物6-4(7.1g,98%)。δ=1.25-1.50[3 s,9H],1.5-2.3(m,4H),2.8-3.3(m,2H),3.8(2s,3H),4.1(m,1H),4.25(m,1H),5.15(2s, 4H),6.30(m,1H),7.30(m,10H).MS(ESI):652.3[M+H]+
取化合物6-4(320mg,0.49mmol)溶于5mL甲醇中,加入催化量的10%Pd/C,该反应在室温氢气氛下反应12小时。反应结束后,过滤除去催化剂,甲醇洗涤滤饼,有机相合并经硅胶柱层析分离(hexane:EA=7:3)可得目标产物6-5(122mg,70%)。1H NMR(200MHz,CDCl3):δ=1.43-1.45(2s,18H),1.5-2.5(m,8H),3.69(m,1H),4.1(m, 1H),4.38(dd,J=7.7Hz,J=1.8Hz,1H),5.59(d,J=5.4Hz,1H)。MS(ESI):340.2[M+H]+
取化合物6-5(120mg,0.35mmol)溶于无水乙酸乙酯1mL中,加入1mL自制的 4M EA/HCl,在室温下反应12小时。反应结束后抽滤,滤饼即为化合物6-6的二盐酸盐,可不经纯化直接进行下一步反应。
取化合物6-6(2HCl)粗品(约0.3mmol)溶于3mL丙酮和3mL 10%Na2CO3水溶液中,向该溶液中加入Fmoc-OSu(122mg,0.36mmol),该反应在室温下搅拌1天。反应结束后,用2M盐酸溶液调节pH至2-3,乙酸乙酯萃取3次,水洗1次,饱和食盐水洗1次。有机相浓缩至干,经硅胶柱层析分离(DCM:MeOH=200:1)可得目标产物化合物6(102mg)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.84–7.78(m,2H),7.73–7.62(m, 4H),7.55(td,J=7.7,1.2Hz,2H),5.38(d,J=9.7Hz,1H),4.37(dd,J=10.7,5.4Hz,1H), 4.30(dd,J=10.7,5.6Hz,1H),4.22(ddd,J=6.0,5.5,0.8Hz,1H),3.95–3.86(m,1H),3.39 (dd,J=11.1,3.4Hz,1H),3.20–3.14(m,1H),2.98(ddt,J=6.6,4.8,4.0Hz,1H),2.75(dd, J=11.1,5.8Hz,1H),2.17–2.07(m,1H),2.07–1.98(m,1H),1.98–1.91(m,1H),1.91– 1.79(m,2H),1.75–1.61(m,3H).MS(ESI):406.3[M+H]+
实施例7
的制备
化合物7的总合成路线如下所示:
取化合物7-1(3.03g,10mmol),N,O-二甲基羟胺盐酸盐(1.07g,11mmol),HOBt(1.62g,12mmol),DIPEA(5.3mL,30mmol)溶于50mL无水四氢呋喃中,反应液置于0℃下,缓慢加入EDCI(2.5g,13mmol),反应液移至室温,反应1天。反应结束后,反应液用乙酸乙酯稀释,饱和碳酸氢钠溶液洗2次,水洗3次,饱和食盐水洗1 次。有机相浓缩至干,可得化合物7-2粗品,无需进一步纯化直接进行下一步反应。
取化合物7-2粗品(约5mmol),溶于50mL无水四氢呋喃中,反应液移至0℃,缓慢加入三叔丁氧基氢化铝锂(3.8g,15mmol)反应液移至室温下搅拌3小时。反应结束后,反应液用饱和硫酸氢钠溶液淬灭,乙酸移至萃取3次,水洗3次,饱和食盐水洗1次。有机相浓缩至干,可得化合物7-3粗品,无需进一步纯化直接进行下一步反应。
取化合物7-3粗品(约3mmol)溶于15mL无水DCM中,向该溶液中依次加入半胱氨酸乙酯盐酸盐(710mg,4.5mmol),醋酸钠(370mg,4.5mmol)。该反应在室温下反应1天。反应结束后,二氯甲烷稀释反应液,有机相水洗3次,饱和食盐水洗1次,有机相浓缩至干,经硅胶柱层析分离(DCM:MeOH=300:1)可得目标化合物7-4(813mg)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.37–7.27(m,10H),5.81(d,J=9.3Hz,2H),5.08(qt, J=11.8,0.9Hz,4H),4.28–4.18(m,3H),4.18–4.11(m,3H),3.86–3.78(m,2H),3.68 (ddd,J=8.8,3.7,2.7Hz,2H),3.61–3.53(m,2H),3.02(dd,J=14.2,2.7Hz,2H),2.93(dd, J=14.3,3.7Hz,2H),1.98–1.92(m,1H),1.92–1.85(m,4H),1.85–1.82(m,1H),1.75– 1.64(m,2H),1.41(s,18H),1.26(t,J=6.9Hz,6H).MS(ESI):452.2[M+H]+
取化合物7-4(900mg,2mmol)溶于乙酸乙酯(2mL)中,加入2mL自制4M EA/HCl溶液,该反应在室温下反应12小时。反应结束后,抽滤可得化合物7-5的盐酸盐,可不经纯化直接进行下一步反应。
取化合物7-5的盐酸盐(约2mmol)溶于4mL DMF中,依次加入DIPEA(1mL, 6mmol)和HATU(1.2g,3mmol),该反应在室温下反应24小时。反应结束后,反应液用乙酸乙酯稀释,分别用1M盐酸溶液,1M碳酸氢钠溶液,水洗3次,饱和食盐水洗1次。有机相浓缩至干,经硅胶柱层析分离(DCM:MeOH=500:1)可得目标产物化合物7-6(390mg)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.36–7.26(m,5H),6.34(d,J=9.9 Hz,1H),5.14–5.04(m,2H),4.95(ddd,J=6.0,4.0,2.9Hz,2H),4.42(ddd,J=10.1,6.7,4.4 Hz,1H),4.23(dq,J=9.9,6.9Hz,1H),4.08(dq,J=10.1,6.9Hz,1H),3.30(dd,J=13.3,2.8 Hz,1H),3.13(dd,J=13.3,3.8Hz,1H),2.31–2.21(m,1H),2.12(dddd,J=13.2,8.2,5.9, 4.3Hz,1H),1.98(ddt,J=12.3,8.2,6.0Hz,1H),1.70(dddd,J=13.2,8.2,6.6,5.9Hz,1H), 1.26(t,J=6.9Hz,3H).MS(ESI):379.4[M+H]+
取化合物7-6(1.1g,3mmol)溶于15mL甲醇中,加入10%(w/w)的10%Pd/C,该反应在室温氢气氛下反应12小时。反应结束后,过滤除去催化剂,甲醇洗涤滤饼,有机相合并,浓缩至干,复溶于3mL 6M稀盐酸中,该反应在60℃下反应6小时。反应结束后,反应液浓缩至干得目标产物7-7盐酸盐粗品,可不经纯化直接进行下一步反应。
取化合物7-7盐酸盐粗品(约2.5mmol)溶于25mL丙酮和25mL 10%碳酸氢钠水溶液中,加入Fmoc-OSu(1g,3mmol)。该反应在室温下反应24小时。反应结束后,用2M稀盐酸调节pH至2-3,乙酸乙酯萃取3次,水洗3次,饱和食盐水洗1次。有机相浓缩至干,经硅胶柱色谱层析(DCM:MeOH=75:1)可得目标产物化合物7(850mg)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.81(dd,J=7.7,1.2Hz,2H),7.70(dd,J=7.8,1.4Hz, 2H),7.65(td,J=7.6,1.5Hz,2H),7.55(td,J=7.6,1.2Hz,2H),6.09(d,J=10.0Hz,1H), 5.05–4.99(m,1H),4.82(dd,J=3.8,2.8Hz,1H),4.37(dd,J=10.7,5.4Hz,1H),4.30(dd, J=10.7,5.6Hz,1H),4.22(ddd,J=5.9,5.4,0.7Hz,1H),4.07–3.98(m,1H),3.43(dd,J= 13.4,2.7Hz,1H),3.11(dd,J=13.4,3.8Hz,1H),2.20–2.07(m,2H),1.96(ddt,J=12.3,8.2, 6.2Hz,1H),1.77–1.66(m,1H).MS(ESI):439.1[M+H]+
实施例8
的制备
化合物8A/8B的总合成路线如下:
将化合物8-1(3.27g,10mmol),化合物8-2(2.19g,10mmol),HOBt(1.76g, 13mmol)溶于50mL THF中,反应液移至0℃,向该溶液中缓慢加入EDCI(3.26g, 17mmol)。该反应液在室温下反应24小时。反应结束后,反应液用乙酸乙酯稀释,水洗3次,饱和食盐水洗1次,有机相浓缩至干,经硅胶柱层析分离(DCM:MeOH=150:1) 可得目标产物化合物8-3(4.7g,90%)。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.89–7.78(m, 3H),7.70(dd,J=7.8,1.4Hz,2H),7.65(td,J=7.6,1.5Hz,2H),7.56(td,J=7.6,1.2Hz, 2H),7.38–7.27(m,5H),6.45(d,J=9.3Hz,1H),5.85(tt,J=13.9,6.2Hz,1H),5.18(s,2H), 5.05(dt,J=14.0,1.0Hz,2H),4.84(dt,J=9.3,6.4Hz,1H),4.48–4.41(m,1H),4.37(dd,J =10.7,5.4Hz,1H),4.30(dd,J=10.6,5.5Hz,1H),4.26–4.19(m,1H),4.08(dt,J=9.3,6.0 Hz,1H),3.70(ddd,J=11.7,7.1,6.4Hz,1H),3.59(ddd,J=11.7,7.1,6.4Hz,1H),2.37– 2.26(m,1H),2.15–2.04(m,1H),1.92(dtd,J=12.6,7.5,6.0Hz,1H),1.77–1.67(m,1H). MS(ESI):529.2[M+H]+
将化合物8-3(9.2g,17.4mmol)溶于二氯甲烷(84mL)中,该反应液移至-60℃冷肼中,向反应液中鼓臭氧气体,1.5小时后,反应液缓慢升温至室温,向反应液中鼓入氮气以排除未反应完的臭氧。再将反应液移至冰浴下,缓慢加入二甲硫醚(101.8 mmol,38mL)。反应在室温下搅拌5天。反应结束后,反应液浓缩至干,经硅胶柱色谱层析(DCM:MeOH=100:1)可得目标产物8-4(6.9g,76%)。1H NMR(500MHz, Chloroform-d)δ9.72(t,J=3.8Hz,1H),7.89–7.78(m,3H),7.70(dd,J=7.8,1.4Hz,2H), 7.65(td,J=7.6,1.5Hz,2H),7.56(td,J=7.6,1.2Hz,2H),7.38–7.27(m,5H),6.56(d,J= 9.3Hz,1H),5.27–5.21(m,1H),5.12(d,J=11.9Hz,1H),4.54(dt,J=9.3,6.3Hz,1H), 4.48–4.33(m,3H),4.31(dd,J=10.6,5.5Hz,1H),4.22(td,J=5.6,0.7Hz,1H),3.68(ddd, J=11.7,7.1,6.4Hz,1H),3.59(ddd,J=11.7,7.0,6.3Hz,1H),2.60–2.43(m,2H),2.25– 2.14(m,1H),2.03(dtd,J=12.9,7.5,6.0Hz,1H).MS(ESI):531.2[M+H]+
将化合物8-4(0.92g,1.73mmol)溶于10mL无水DCM中,加入1mL TFA,该反应液在40℃下回流反应1小时。反应结束后,反应液浓缩至干,经硅胶柱色谱层析 (100%DCM)可得目标产物8-5A(80mg,9%)和8-5B(640mg,72%)。1H NMR (8-5A)(500MHz,Chloroform-d)δ7.84–7.78(m,2H),7.70(dd,J=7.8,1.4Hz,2H), 7.65(td,J=7.6,1.5Hz,2H),7.56(td,J=7.6,1.2Hz,2H),7.38–7.27(m,5H),5.94(d,J= 10.0Hz,1H),5.39–5.34(m,1H),5.21(d,J=11.9Hz,1H),5.13(dd,J=11.9,0.9Hz,1H), 4.90(ddd,J=9.9,6.7,4.4Hz,1H),4.54–4.47(m,1H),4.37(dd,J=10.7,5.4Hz,1H),4.31 (dd,J=10.6,5.5Hz,1H),4.22(dd,J=5.7,5.0Hz,1H),4.11(dd,J=11.4,4.4Hz,1H),3.81 (dd,J=11.3,6.8Hz,1H),2.21–2.08(m,3H),2.01–1.91(m,1H).
1H NMR(8-5B)(500MHz,Chloroform-d)δ7.81(dd,J=7.8,1.1Hz,2H),7.70(dd,J=7.8,1.4Hz,2H),7.65(td,J=7.6,1.5Hz,2H),7.56(td,J=7.6,1.2Hz,2H),7.38–7.27(m,5H),5.94(d,J=10.0Hz,1H),5.37(dd,J=3.9,3.1Hz,1H),5.24–5.17(m,1H),5.16–5.10(m3-,1H),4.90(ddd,J=10.1,6.7,4.4Hz,1H),4.49(dd,J=4.9,3.8Hz,1H),4.37(dd,J=10.7,5.4Hz,1H),4.31(dd,J=10.6,5.5Hz,1H),4.22(ddd,J=6.0,5.4,0.8Hz,1H),4.10(dd,J=11.4,4.4Hz,1H),3.81(dd,J=11.3,6.7Hz,1H),2.24–2.14(m,1H),2.14–2.02(m,2H),1.98–1.88(m,1H).MS(ESI):513.2[M+H]+
将化合物8B 640mg溶于5mL三氟醋酸中,室温搅拌3天,可得化合物8A480mg。1H-NMR和MS数据与前述8A数据完全一致。
取化合物8-5A或8-5B(640mg)溶于15mL甲醇中,加入10%(w/w)的10%Pd/C,该反应在45℃氢气氛下反应12小时。反应结束后,过滤除去催化剂,甲醇洗涤滤饼,有机相合并,浓缩至干,可得目标产物8A或8B,可不经纯化直接进行下一步反应。
实施例9
根据前述“树脂溶胀步骤”,使树脂溶胀后,根据“缩合步骤”,选用衍生物为实施例4中的化合物4,选用氨基酸分别为Fmoc-L-Gly-OH,Fmoc-L-Cys(Trt)-OH, Fmoc-L-Leu-OH,Boc-L-Trp-OH,Fmoc-L-Trp(Boc)-OH,Fmoc-L-Dab(Boc)-OH, Fmoc-L-[O-tBu]Hyp-OH,Fmoc-L-Dap(Boc)-OH,Fmoc-L-Pro-OH,Fmoc-L-Asn(Trt)-OH, Fmoc-L-[N-Me]Ala-OH,Fmoc-L-[O-tBu]Tyr-OH。缩合完成后,根据前述“肽游离步骤”,可得直链肽前体粗品。取60mg该粗品溶于乙腈:0.1M碳酸铵=1:1(体积比)总共 60mL溶液中,该反应在室温搅拌5小时。将反应液旋干,经冷冻干燥后得到粉末状混合物。将该混合物溶于乙腈:水=1:1(体积比)中,根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得大环化合物前体纯品。tR=18.550min。
HRESIMS:[M+H]+=1883.0002.
实施例10
将实施例9中的化合物9纯品5mg,溶于乙腈:水=1:1(体积比)总共0.6mL 中,向该溶液中加入0.07mL 30%H2O2,在室温下搅拌3小时。反应结束后,过量的双氧水用抗坏血酸破坏,溶液浓缩至干,冷冻干燥可得粗品。根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=18.760min。HRESIMS:[M+H]+=1896.9560.
实施例11
按照实施例10的制备方法,tR=18.800min,HRESIMS:[M+H]+=1896.9561.
实施例12
按照实施例9所述合成方法,将选用的衍生物更换为实施例3中的化合物3。所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=18.607min,HRESIMS: [M+H]+=1801.2036.
实施例13
按照实施例10的合成方法,将原料更换为实施例12中的化合物12。所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=18.637min,HRESIMS:[M+H]+=1829.9102.
实施例14
按照实施例13的制备方法,tR=18.731min,HRESIMS:[M+H]+=1829.8996.
实施例15
按照实施例9的制备方法,将所需氨基酸衍生物更换为实施例1的化合物1,。所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=18.642min,HRESIMS: [M+H]+=1826.8311.
实施例16
按照实施例10的合成方法,将起始原料更换为实施例15中的化合物15,所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=18.633min,HRESIMS: [M+H]+=1856.8922.
实施例17.
按照实施例16的合成方法,tR=18.666min,HRESIMS:[M+H]+=1856.8921.
实施例18
根据实施例9的合成方法,将所需的氨基酸衍生物更换为实施例1中的化合物1,所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=17.925min,HRESIMS: [M+H]+=1826.8611.
实施例19
根据前述实施例10中化合物10的合成方法,将起始原料更换为实施例18中的化合物18,所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=18.266min, HRESIMS:[M+H]+=1856.8922.
实施例20
根据前述实施例19的合成方法可得,tR=18.285min,HRESIMS: [M+H]+=1856.8862.
实施例21
根据前述实施例9的合成方法,将所需的氨基酸衍生物更换为实施例4中的化合物4,所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=18.266min,HRESIMS: [M+H]+=1854.8922.
实施例22
根据前述实施例10的方法,将起始原料更换为实施例21中的化合物2。所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=18.234min,HRESIMS: [M+H]+=1884.9029.
实施例23
根据前述实施例22的合成方法可得。tR=18.246min,HRESIMS: [M+H]+=1884.9132.
实施例24
根据前述实施例9的合成方法,将氨基酸衍生物更换为实施例3中的化合物3,所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=18.762min,HRESIMS: [M+H]+=1813.9055.
实施例25
根据前述实施例10的合成方法,将起始原料更换为实施例24中的化合物2。所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=18.633min,HRESIMS: [M+H]+=1843.9167.
实施例26
根据前述实施例25的合成方法可得。tR=18.246min,HRESIMS: [M+H]+=1843.9333.
实施例27
根据前述实施例9的合成方法,将所需氨基酸衍生物更换为实施例5中的化合物5。所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=18.665min,HRESIMS: [M+H]+=1884.9399.
实施例28
根据前述实施例10的合成方法,将起始原料更换为实施例27中的化合物27.所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=18.331min,HRESIMS: [M+H]+=1883.9693.
实施例29
根据前述实施例28的合成方法可得。tR=18.662min,HRESIMS: [M+H]+=1883.2355.
实施例30
根据实施例9的合成方法,将所需的氨基酸衍生物更换为实施例2中的化合物2,所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=18.041min,HRESIMS: [M+H]+=1828.8622.
实施例31
按照实施例10的合成方法,将起始原料更换为实施例30中的化合物30,所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=19.233min,HRESIMS: [M+H]+=1858.8622.
实施例32
按照实施例31的合成方法,tR=19.252min,HRESIMS:[M+H]+=1858.8920.
实施例33
根据实施例9的合成方法,将所需的氨基酸衍生物更换为实施例2中的化合物2,所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=18.041min,HRESIMS: [M+H]+=1828.8622.
实施例34
按照实施例10的合成方法,将起始原料更换为实施例33中的化合物33,所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=18.002min,HRESIMS: [M+H]+=1834.8922.
按照实施例16的合成方法,tR=18.101min,HRESIMS:[M+H]+=1834.8999.
实施例36
根据前述实施例9的合成方法,将所需的氨基酸衍生物更换为实施例5中的化合物5,所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=18.556min,HRESIMS: [M+H]+=1856.8922.
实施例37
根据前述实施例10中化合物10的合成方法,将起始原料更换为实施例36中的化合物36,所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=18.602min, HRESIMS:[M+H]+=1872.8822.
实施例38
根据前述实施例37的合成方法可得,tR=18.633min,HRESIMS: [M+H]+=1872.8866.
实施例39
根据前述实施例9的合成方法,将所需的氨基酸衍生物更换为实施例6中的化合物6,所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=22.236min,HRESIMS: [M+H]+=1855.9444.
实施例40
根据前述实施例10中化合物10的合成方法,将起始原料更换为实施例39中的化合物39,所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=22.562min, HRESIMS:[M+H]+=1871.9122.
实施例41
根据前述实施例40的合成方法可得,tR=22.585min,HRESIMS: [M+H]+=1871.9000.
实施例42
根据前述实施例10中化合物10的合成方法,将所需氨基酸衍生物更换为实施例7中的化合物7,所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=22.732min,HRESIMS:[M+H]+=1873.9022.
实施例43
根据前述实施例10中化合物10的合成方法,将起始原料更换为实施例42中的化合物42,所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=22.881min, HRESIMS:[M+H]+=1890.0002.
实施例44
根据前述实施例43的合成方法可得,tR=22.998min,HRESIMS: [M+H]+=1889.9996.
实施例45
根据前述实施例10中化合物10的合成方法,将所需氨基酸衍生物更换为实施例8中的化合物8B,所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=21.011min,HRESIMS:[M+H]+=1857.9922.
实施例46
根据前述实施例10中化合物10的合成方法,将起始原料更换为实施例45中的化合物45,所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=21.025min, HRESIMS:[M+H]+=1874.0004.
实施例47
根据前述实施例46的合成方法可得,tR=21.079min,HRESIMS: [M+H]+=1873.9981.
实施例48
根据前述实施例10中化合物10的合成方法,将所需氨基酸衍生物更换为实施例8中的化合物8A,所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=21.011min,HRESIMS:[M+H]+=1857.9921.
实施例49
根据前述实施例10中化合物10的合成方法,将起始原料更换为实施例48中的化合物48,所得产物根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=21.025min, HRESIMS:[M+H]+=1874.0003.
实施例50
根据前述实施例49的合成方法可得,tR=21.079min,HRESIMS: [M+H]+=1873.9980.
实施例51
根据根据前述实施例10中化合物10的合成方法,将所需氨基酸衍生物更换为(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-脲基丙酸可得。根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=18.033min,HRESIMS:[M+H]+=1929.0001.
实施例52
的制备
化合物52的总合成路线如下所示:
取化合物52-1(4.26g,10mmol)溶于10mL 5%哌啶/DMF溶液中,该反应液在室温下搅拌过夜,反应结束后,反应液浓缩至干,加入正己烷搅拌过夜。所得沉淀即为目标产物52-2,可不经纯化直接进行下一步反应。
取化合物52-2(约10mmol)溶于50mL无水乙腈中,加入市售的4-(吡啶-4-基) 苯甲醛(1.85g,10mmol)和三乙酰氧基硼氢化钠(3.2g,15mmol)。该反应在室温下搅拌过夜。反应结束后,反应液用乙酸乙酯稀释,碳酸氢钠水溶液洗3次。有机相浓缩至干,经硅胶柱色谱层析(DCM:MeOH=50:1)可得目标产物52-3(3.4g,90%)。1H NMR (500MHz,Chloroform-d)δ8.71–8.66(m,2H),7.68–7.63(m,2H),7.61–7.55(m,2H), 7.28(dt,J=8.4,1.0Hz,2H),6.40(t,J=5.3Hz,1H),3.91–3.68(m,5H),3.43(dt,J=12.7, 5.1Hz,1H),1.43(s,9H).MS(ESI):372.2[M+H]+
取化合物52-3(3.7g,10mmol)溶于50mL丙酮和50mL 10%碳酸钠水溶液中,溶液移至0℃,加入Fmoc-OSu(4g,12mmol)。反应液移至室温并搅拌24小时。反应结束后,反应液用2M盐酸溶液调节pH至3,乙酸乙酯萃取3次,合并有机相,水洗3次。有机相浓缩至干,经硅胶柱色谱层析分离(DCM:MeOH=150:1)可得目标产物。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ8.70–8.65(m,2H),7.81(dd,J=7.7,1.2Hz,2H), 7.73–7.54(m,10H),7.37(dt,J=8.4,1.1Hz,2H),6.37(t,J=5.3Hz,1H),5.09(t,J=5.2 Hz,1H),4.68(dt,J=12.6,0.9Hz,1H),4.45(d,J=5.5Hz,2H),4.36–4.26(m,2H),3.60 (dt,J=11.9,5.2Hz,1H),3.51(dt,J=11.9,5.2Hz,1H),1.43(s,9H).MS(ESI):594.9 [M+H]+
实施例53
根据前述实施例10中化合物10的合成方法,将所需氨基酸衍生物更换为实施例52中的化合物52,根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=21.121min, HRESIMS:[M+H]+=2084.0291.
实施例54
根据前述实施例10中化合物10的合成方法,将所需氨基酸衍生物更换为实施例4中的化合物4和实施例6中的化合物6,根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。 tR=19.885min,HRESIMS:[M+H]+=1851.9633.
实施例55
的制备
根据前述实施8中的化合物8A的合成方法,将起始原料之一“Fmoc-L-Ser-OH”更换为“Fmoc-L-Homo-Ser-OH”。可得目标化合物55.1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.81 (dd,J=7.7,1.1Hz,2H),7.70(dd,J=7.8,1.4Hz,2H),7.65(td,J=7.6,1.5Hz,2H),7.55 (td,J=7.6,1.2Hz,2H),5.90(d,J=12.2Hz,1H),5.44–5.38(m,1H),4.61(ddd,J=12.1, 8.7,6.0Hz,1H),4.53–4.47(m,1H),4.37(dd,J=10.6,5.3Hz,1H),4.31(dd,J=10.6,5.5 Hz,1H),4.22(ddd,J=6.1,5.5,0.8Hz,1H),3.67(ddd,J=11.7,9.3,6.8Hz,1H),3.58(ddd, J=11.7,9.4,6.9Hz,1H),2.20–1.91(m,6H).MS(ESI):437.5[M+H]+。
实施例56
的制备
根据前述实施例6中化合物6的合成方法,将起始原料化合物6-1更换为化合物56-1,可得目标产物化合物56.1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.81(dd,J=7.7,1.2 Hz,2H),7.70(dd,J=7.8,1.4Hz,2H),7.65(td,J=7.6,1.5Hz,2H),7.55(td,J=7.6,1.2Hz,2H),6.19(d,J=12.2Hz,1H),4.61–4.46(m,3H),4.37(dd,J=10.6,5.3Hz,1H),4.31(dd, J=10.6,5.5Hz,1H),4.26–4.19(m,1H),2.27–2.18(m,1H),2.09–1.97(m,2H),1.96– 1.86(m,1H),1.87–1.62(m,6H).MS(ESI):435.2[M+H]+。
实施例57
根据前述实施例9中化合物9的合成方法,将所需氨基酸衍生物更换为实施例56中的化合物56,根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=21.011min,HRESIMS: [M+H]+=1869.9542.
实施例58
根据前述实施例10中化合物10的合成方法,将所需氨基酸衍生物更换为实施例56中的化合物56,根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=21.024min,HRESIMS: [M+H]+=1898.9611.
实施例59
根据前述实施例59的合成方法可得,tR=21.052min,HRESIMS: [M+H]+=1898.6623.
实施例60
根据前述实施例9中化合物9的合成方法,将所需氨基酸衍生物更换为实施例55中的化合物55,根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=20.002min,HRESIMS: [M+H]+=1871.9665.
实施例61
根据前述实施例9中化合物9的合成方法,将所需氨基酸衍生物更换为实施例60中的化合物60,根据前述“RP-HPLC分离步骤”可得目标产物。tR=20.863min,HRESIMS: [M+H]+=1887.9212.
实施例62
根据前述实施例61的合成方法可得,tR=21.996min,HRESIMS: [M+H]+=1887.9291.
体外抑制活性的测定
1.均相时间荧光法测定实施例抑制PD-1/PD-L1相互作用的评估:
PD-1和PD-L1的相互作用可使用两种蛋白的胞外域部分的重组蛋白测定。PD-1和PD-L1蛋白质细胞外结构域表达为具有检测标签的融合蛋白,对于PD-1,标签是免疫球蛋白(PD-1-Ig)的Fc部分,对于PD-L1,它是6组氨酸基序(PD-L1-His)。人PD-1 (25-167),具有免疫球蛋白G(Ig)表位标签[hPD-1(25-167)-3S-IG]的C末端人Fc 结构域和人PD-L1(18-239)具有C末端His表位标签[hPD-L1(18-239)-TVMV-His1] 在HEK293T细胞中表达,并通过蛋白A亲和层析和尺寸排阻层析依次纯化。
相互作用研究均在由额外添加0.1%(含)牛血清白蛋白和0.05%(v/v)Tween-20的dPBS组成的HTRF测定缓冲液中进行。对于hPD-L1-His结合测定,将抑制剂与 PD-L1-His(终浓度10nM)在4ul测定缓冲液中预孵育15分钟,然后加入PD-1-Ig(终浓度20nM)。在1uL测定缓冲液中并进一步培养15分钟。使用铕钙磷酸盐标记的抗Ig (终浓度1nM)和异烟酞菁(APC)标记的抗His(最终20nM)实现HTRF检测。将抗体在HTRF检测缓冲液中稀释并取5ul。使反应混合物平衡30分钟,并使用EnVision 荧光计获得所得信号(665nm/620nm)。
各个大环类化合物抑制PD-1/PD-L1相互作用测定结果如表1所示。
A:IC50<100nM;B:100nM<IC50<10μM;C:10μM<IC50<100μM
实施例 | IC<sub>50</sub> | 实施例 | IC<sub>50</sub> | 实施例 | IC<sub>50</sub> | 实施例 | IC<sub>50</sub> |
9 | A | 22 | A | 35 | A | 48 | A |
10 | A | 23 | A | 36 | A | 49 | A |
11 | A | 24 | A | 37 | A | 50 | A |
12 | A | 25 | A | 38 | A | 51 | A |
13 | A | 26 | A | 39 | A | 53 | A |
14 | A | 27 | A | 40 | A | 57 | A |
15 | A | 28 | A | 41 | A | 58 | A |
16 | A | 29 | A | 42 | A | 59 | A |
17 | A | 30 | A | 43 | A | 60 | A |
18 | A | 31 | A | 44 | A | 61 | A |
19 | A | 32 | A | 45 | A | 62 | A |
20 | A | 33 | A | 46 | A | ||
21 | A | 34 | A | 47 | A |
如上表所示,实施例中的大环化合物均有一定的抑制PD-1/PD-L1相互作用的能力。
2.实施例刺激脾细胞增殖作用的评估:
人乳腺癌细胞MDA-MB-231表面表达有PD-L1蛋白,会激活PD-1/PD-L1通路,进而抑制T细胞的激活,引起T细胞增殖变缓,并减少IFN-γ、IL-2和TNF-α等细胞因子的释放。本实验的目的是检测化合物阻断MDA-MB-231细胞抑制人T细胞增殖的能力。
具体操作方法为:小鼠脾细胞是将小鼠脾脏在40um细胞滤网中捣碎后,在室温下用1mL ACK裂解缓冲液进一步处理5分钟得到。用9mL RPMI完全培养基洗涤后,将细胞重悬于15mL管中的3mL 1xPBS中。小心地将3mLHistopaque加入管底部,不干扰覆盖的脾细胞悬浮液。在室温下以800×g离心20分钟后,收集不透明的脾细胞层。得到的脾细胞再用冷PBS溶液冲洗两次,使用台盼蓝染色计数总细胞数用于之后的细胞层面测试。脾细胞在RPMI完全培养基(RPMI+10%胎牛血清+1mM丙酮酸钠+10,000 u/mL青霉素和10,000ug/mL链霉素)中培养,并保持在37℃下含5%CO2的CO2培养箱中。
CFSE是一种被动扩散到细胞内并与细胞内蛋白结合的染料。1×106细胞/mL的脾细胞用5uM CFSE在预热的1x PBS/0.1%BSA溶液中于37℃处理10分钟。过量CFSE 将5倍体积的0℃培养基淬灭至细胞中并在冰上孵育5分钟。用0℃完全RPMI培养基进一步洗涤CFSE标记的脾细胞三次。将CFSE标记的1×105脾细胞加入到含有 MDA-MB-231细胞(在高葡萄糖DMEM培养基中培养1×105个细胞)或重组人PD-L1 (100ng/mL)和测试化合物的孔中。用抗小鼠CD3和抗小鼠CD28抗体(各1ug/mL) 刺激脾细胞,并将培养物在37℃,5%CO2下进一步培养72小时。收获细胞并用冰冷的 FACS缓冲液洗涤三次,并通过流式细胞术用488nm激发和521nm发射滤光片分析百分比增殖。
使用FACS程序分析脾细胞增殖百分比,并且在扣除背景增殖值(%)并将刺激的脾细胞增殖(%,阳性对照)标准化为100%后以计算化合物回复脾细胞增殖百分比。
刺激的脾细胞:脾细胞+anti-CD3/CD28
刺激背景增殖:脾细胞+anti-CD3/CD28+PD-L1
化合物增殖:脾细胞+anti-CD3/CD28+PD-L1+化合物
通过添加所需浓度来检测化合物效果。在配体(PD-L1)存在下化合物对anti-CD3/CD28刺激的脾细胞的表达(表2)。
各个大环类化合物在5nM浓度下抑制PD-1/PD-L1相互作用测定结果如表2所示。
A:>90%;B:70%<IC50<90%;C:50%<IC50<70%;D:<50%
如上表所示,实施例中的大环化合物在人乳腺癌细胞MDA-MB-231存在下,均有一定的恢复被抑制的T细胞活性的能力和抑制PD-1/PD-L1相互作用的能力。
Claims (8)
2.一种药物组合物,其特征在于包括权利要求1所述的大环类化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、外消旋体或异构体。
3.根据权利要求2所述的药物组合物,其特征在于药物组合物的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、散剂、糖浆剂、口服液或注射剂。
4.如权利要求1所述的大环类化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、外消旋体或异构体在制备PD-1/PD-L1通路抑制剂中的应用。
5.如权利要求1所述的大环类化合物及其药学上可接受的盐、溶剂化物、前药、外消旋体或异构体或权利要求2所述的药物组合物在制备预防或***药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于所述预防或***药物为PD-1/PD-L1通路的预防或***药物。
7.根据权利要求5所述的应用,其特征在于所述肿瘤为人乳腺癌,包括其在远离肿瘤原发部位的组织或器官的转移病变。
8.根据权利要求5所述的应用,其特征在于所述的预防或***药物为癌症免疫治疗药物、癌症化疗药物或癌症靶向治疗药物。
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