CN111926027B

CN111926027B - 一种邻苯二甲酸酯水解酶及其制备方法和应用

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Publication number: CN111926027B
Application number: CN202010724268.5A
Authority: CN
Inventors: 杜欢; 蔡全英; 赵海明; 莫测辉; 李彦文; 李慧; 向垒; 胡瑞文
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2020-07-24
Filing date: 2020-07-24
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2040-07-24
Also published as: CN111926027A

Abstract

本发明公开了一种邻苯二甲酸酯水解酶及其制备方法和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明得到的新型PAEs水解酶可在一个较宽的温度(20～50℃)和pH(6.0～8.0)范围内有效降解PAEs，具有良好的温度和pH适应性；该酶具有较强的热稳定性，在40℃时预孵育1h后仍可保持90％以上原活性；该酶对长短侧链的PAEs均具有水解催化能力，尤其是对短链PAEs具有较高的水解催化能力。

Description

一种邻苯二甲酸酯水解酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种邻苯二甲酸酯水解酶及其制备方法和应用。

背景技术

邻苯二甲酸酯(Phthalic acid esters,PAEs)是一种典型难降解的有机增塑剂，被广泛应用于各类工业产品中。由于PAEs在塑料及其它制品中呈现游离态，随着时间的变化，PAEs极易转移进入环境中而广泛存在于大气、水体、土壤以及生物体中。大部分PAEs及其代谢物被认为是内分泌干扰物，可导致心血管疾病、生殖发育毒性甚至癌症等人类健康问题。因此，如何有效控制和消除环境中的PAEs污染已成为当务之急。

生物降解被认为是高效、安全、无二次污染的清洁环境新兴技术。近些年来，国内外学者在有机污染物的生物降解方面进行了大量研究，但对降解途径中关键酶的研究还比较少。与直接利用微生物细胞相比，利用生物酶法进行污染物的净化有着催化效能高、特异性强、对温度、浓度和环境适应范围广等优点，而且降解酶作为一种天然蛋白质，本身没有毒副作用，可以安全地用于各个环境中有机污染物的去除，具有广阔的应用前景。

一般情况下，PAEs的微生物降解过程包括两个步骤：1)PAEs通过酯键水解作用转化成邻苯二甲酸；2)邻苯二甲酸的分解代谢。而在步骤一中，酯酶作为裂解酯键的关键酶被认为是整个PAEs降解过程的关键点。在早期的研究中， PAEs水解酶是直接从降解菌的细胞提取物中进行纯化得到的，但天然降解菌株通常产酶量小，酶的分离纯化比较困难，而且成本过高，不利于降解酶的大规模生产和应用(翁宏飚,牛宝龙,孟智启,徐孟奎.抗菌肽Cecropin B基因的克隆及体内活性检测方法的构建.浙江农业学报.2003；15(5):0-279；Asgher M,Khan SW,Bilal M.Optimization of lignocellulolytic enzyme productionby Pleurotus eryngii WC 888utilizing agro-industrial residues and bio-ethanolproduction. Romanian Biotechnological Letters.2016Jan 1；21(1):11133)。

近年来，基于降解菌DNA文库构建、基因组测序及元基因组挖掘的PAEs 水解酶基因克隆和鉴定受到了广泛的关注。但迄今为止，仅有少量的PAEs水解酶基因被克隆鉴定，而筛选克隆新种类的PAEs水解酶基因为降解PAEs工程菌的定向改造提供更丰富的基因资源，还为高效修复污染环境和保障人体健康提供理论和技术支撑。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种邻苯二甲酸酯水解酶及其制备方法和应用。

本发明的第一个目的是提供一种邻苯二甲酸酯水解酶基因。

本发明的第二个目的是提供一种邻苯二甲酸酯水解酶。

本发明的第三个目的是提供一种重组载体。

本发明的第四个目的是提供一种重组工程菌。

本发明的第五个目的是提供所述的邻苯二甲酸酯水解酶基因、所述的邻苯二甲酸酯水解酶、所述的重组载体，和/或所述的重组工程菌在降解二甲酸酯中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种二甲酸酯水解酶的制备方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明利用构建的菌株Rhodococcus sp.2G的基因组文库，获得了一个具有 PAEs水解能力的阳性转化子，对其进行测序和***发育树分析，发现它属于一种新型的酯水解酶，并命名其为Hyd基因。再通过转化筛选高效表达的重组工程菌，获得了大量具有高活性的新型PAEs水解酶，为该酶的进一步理论和实际应用开发奠定基础。

因此，本发明要求保护一种邻苯二甲酸酯水解酶基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

一种邻苯二甲酸酯水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

一种重组载体，含有所述基因或所述编码基因。

一种重组工程菌，含有所述的重组载体。

所述的邻苯二甲酸酯水解酶基因、所述的邻苯二甲酸酯水解酶、所述的重组载体，和/或所述的重组工程菌在降解二甲酸酯中的应用。

一种二甲酸酯水解酶的制备方法，包括以下步骤：

S1.将权利要求5所述的重组工程菌培养至菌液OD600值为0.3～1.0时，加入IPTG至0.1～1.0mM，15～30℃培养15～24h诱导表达；

S2.固液分离，收集菌体；

S3.重悬菌体，超声破碎菌体，固液分离，收集上清；

S4.Ni-NTA亲和层析柱纯化。

优选地，步骤S1中，将所述的重组工程菌培养至菌液OD600值为0.6时，加入IPTG至0.5mM，20℃培养。

优选地，所述Ni-NTA亲和层析柱纯化的具体方法为：Ni-NTA树脂到平衡柱中，用2～8倍柱床体积的Binding buffer清洗平衡柱，流速为2～10mL/min；将1～5倍柱床体积菌体上清液上柱，流速为1～5mL/min，收集穿透液；然后使用2～10倍柱床体积的Bindingbuffer清洗柱子，流速为2～10mL/min；接下来使用Wash buffer洗杂，流速为2～10mL/min，收集流穿液并重复此过程，直到流穿液吸光度在280nm处接近基线；最后用Elution buffer洗脱柱上的组氨酸标签蛋白，流速为1～5mL/min，收集洗脱液并保存。

更优选地，所述Ni-NTA亲和层析柱纯化的具体方法为：Ni-NTA树脂到平衡柱中，用5倍柱床体积的Binding buffer清洗平衡柱，流速为5mL/min；将2 倍柱床体积菌体上清液上柱，流速为2mL/min，收集穿透液；然后使用5倍柱床体积的Binding buffer清洗柱子，流速为5mL/min；接下来使用Wash buffer 洗杂，流速为5mL/min，收集流穿液并重复此过程，直到流穿液吸光度在280nm 处接近基线；最后用Elution buffer洗脱柱上的组氨酸标签蛋白，流速为2mL/min，收集洗脱液并保存。

优选地，Binding buffer为20～60mM Tris，200～500mM NaCl，pH 7～10。

更优选地，Binding buffer为50mM Tris，300mM NaCl，pH 8.0。

优选地，Wash buffer为20～60mM Tris，200～500mM NaCl，200～1000mM 咪唑，pH7～10。

更优选地，Wash buffer为50mM Tris，300mM NaCl，500mM咪唑，pH 8.0。

优选地，Elution buffer为20～60mM Tris，200～500mM NaCl，200～1000 mM咪唑，pH7～10。

更优选地，Elution buffer为50mM Tris，300mM NaCl，500mM咪唑，pH 8.0。

优选地，步骤S3中，用用破碎Buffer重悬菌体，破碎Buffer为0.5～4M Tris， 50～200mM NaCl，0.05～0.5mM PMSF，0.05～0.5％Triton X-100，pH 7～10。

更优选地，步骤S3中，用破碎Buffer重悬菌体，破碎Buffer为1M Tris， 150mMNaCl，0.2mM PMSF，0.2％Triton X-100，pH 8.0。

优选地，步骤S3中，超声破碎菌体的具体做法为功率200～600W，5～30 min，超声1～5S暂停2～10S为一个循环。

更优选地，步骤S3中，超声破碎菌体的具体做法为功率400W，20min，超声2S暂停6S为一个循环。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明得到的新型PAEs水解酶可在一个较宽的温度(20～50℃)和pH (6.0～8.0)范围内有效降解PAEs，具有良好的温度和pH适应性；该酶具有较强的热稳定性，在40℃时预孵育1h后仍可保持90％以上原活性；该酶对长短侧链的PAEs均具有水解催化能力，尤其是对短链PAEs具有较高的水解催化能力。

附图说明

图1为Rhodococcus sp.2G基因组DNA酶切。

图2为阳性转化子的筛选。

图3为Hyd基因的核酸序列，加下划线的部分代表Hyd基因的ORF。

图4为Hyd基因推断的氨基酸序列。

图5为Hyd蛋白酶的***发育关系。

图6为重组Hyd蛋白诱导与纯化的SDS-PAGE分析；M1：蛋白质分子量标准；1：纯化的重组蛋白；2：0.5mM IPTG诱导后的E.coli BL21(DE3)/Hyd-pET28a 全细胞蛋白；3：未诱导的E.coli BL21(DE3)/Hyd-pET28a全细胞蛋白；4：未转化的E.coli BL21(DE3)全细胞蛋白。

图7为温度(A)和pH(B)对重组Hyd酶活性的影响，(C)Hyd在不同温度下孵育60分钟后测定剩余酶活性。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1 PAEs水解酶基因的克隆

一、降解菌DNA提取

在超净工作台中，吸取10μL保存于50％甘油中的PAEs降解菌Rhodococcus sp.2G(保藏名称：红球菌2G，保藏编号：CCTCC No.M2015056，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2015年1月22日，保藏地址：中国武汉武汉大学)，接种于已灭菌的LB 液体培养基中，在37℃恒温摇床，150rpm，过夜扩大培养。然后取适量扩大培养的浑浊菌液，低温(4℃)离心，收集菌体，提取DNA。

二、降解菌DNA的酶切

按照表1中所示的酶切反应体系加入各反应溶液，混合均匀，置于温度为 37℃的恒温水浴锅中水浴20min。反应结束后，将所有反应产物跑1％琼脂糖凝胶电泳并拍照，结果如图1所示，并根据DNA Marker分子量标准，切下1～3 Kb胶块，分装于1.5mL离心管中，并称取胶块质量。之后利用胶回收试剂盒对 DNA目的片段进行回收。

表1 菌株Rhodococcus sp.2G基因组DNA酶切体系

三、pUC19质粒的转化与提取

取出感受态细胞产品中附带的pUC19质粒DNA粉末，加入10μL无菌水使其溶解。之后取适量pUC19 DNA溶解液按照感受态细胞产品说明手册，进行转化实验。转化成功后，从平板上挑取蓝色转化子接种于含有100mg/mL Amp溶液的LB液体培养基，置于37℃，150r/min恒温振荡器中过夜培养，取2～3mL 浑浊菌液按照质粒提取试剂盒说明手册进行质粒DNA的提取。

四、pUC19质粒的完全酶切

按照表2所示体系，将各个组分混合均匀后，置于温度为37℃的恒温水浴锅中水浴3h，反应完毕后，加入20μL终止反应液，终止酶切反应。将载体质粒酶切产物以1％琼脂糖凝胶进行电泳，并切割下含有线性载体的胶块，进行胶回收实验。

表2 pUC19质粒酶切反应体系：

五、线性载体的去磷酸化

在DNA目的片段与线性载体连接的过程中，为防止线性载体自连现象的出现，导致连接效率下降，转化率降低，需要对线性克隆载体进行去磷酸化。线性克隆载体去磷酸化的反应体系见表3所示。

表3 线性克隆载体去磷酸化反应体系：

六、连接反应及重组载体的转化

在0.5mL的离心管中，将前文回收备用的DNA目的片段与已去磷酸化的线性克隆载体按照表4所示体系混合均匀后，置于低温连接仪中，在16℃的温度条件下，连接18h。取10μL连接产物按照感受态细胞产品说明手册进行转化实验。

表4 连接反应体系

七、基因组文库的筛选

取适量转化培养物均匀的涂布于含有200μL Amp(100mg/mL)的LB固体琼脂平板上，再依次添加24μL IPTG(200mg/mL)和40μL X-gal(200mg/mL) 于平板中，使用三角棒顺时针方向，缓慢涂布均匀。然后将平板倒置放入温度＝37℃的生化培养箱，过夜培养；使用灭过菌的挑菌针，将约18000个长出的白色菌落挑取到新的具有Amp的LB固体琼脂平板上，并向每个菌落中心，依次添加3μL X-caprylate(100μmol/L)溶液。然后待溶液自然风干后，将平板倒置放入温度为37℃的生化培养箱，过夜培养；第二天，将产生酯酶水解圈的阳性克隆子(图2)进行保存，并将其命名为2G-I，之后将其接种到以200mg/L DBP 为唯一碳源的MSM无机盐固体培养基，观察菌落的生长情况。最终结果显示，在2G-I菌落周围形成DBP透明水解圈，表示该区域的DBP可被2G-I水解利用。

八、重组质粒的提取与测序分析

将筛选出的目的克隆子，挑取适量接种于LB液体培养基中，培养至 OD600＝0.6时，提取重组质粒，送至公司测序，测序结果表明，***pUC19载体中的DNA片段全长为1325bp，其中***的基因片段为795bp(其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)。使用生物信息学软件DNA Star对基因片段序列进行分析，结果如图3和图4所示，该基因片段编码264个氨基酸(其氨基酸序列如 SEQ ID NO：2所示)，预测蛋白分子量为28.70kDa，理论等电点为5.27。此外，将该基因片段ORF的DNA序列上传至NCBI在线网站上，并与被选取的8个不同家族细菌脂质酶和一些被报道的PAEs水解酶序列进行序列比对，构建了相邻连接的***发育树。结果如图5所示，Hyd蛋白不属于任何一个之前被定义过的酯酶家族，并且与报道的PAE降解水解酶氨基酸序列没有同源性，但却具有水解酶的高度保守的催化基序GXSXG。综上表明，Hyd蛋白酶是一种新型PAEs 水解酶。

实施例2 重组Hyd基因表达载体的构建

一、Hyd基因的PCR扩增

使用生物信息学软件DNA Star设计Hyd基因的碱基序列原核表达引物，并按照表5所示体系，进行Hyd基因的PCR扩增。其中，Hyd基因的表达引物序列为：上游引物P-F：CGCGGATCCGATCTTCTGCACACCCATCTG(BamHI)；下游引物P-R：CCCAAGCTTCTACACCATCCGGGCCACG(HindIII)。

表5 PCR扩增反应体系：

PCR扩增程序具体如下：

(1)94℃预变性5min

(5)72℃延伸10min

反应完毕后，取5μL扩增产物与适量6×终止反应液混合，加样于1％琼脂糖凝胶进行电泳。然后根据DNA Marker的指示，切胶回收目的条带。将胶回收产物于-20℃保存备用。

二、表达载体pET28a(+)的提取与双酶切

将适量表达载体pET28a(+)转化至E.coli BL21(DE3)。挑取卡那霉素抗性平板上的阳性转化子，接种于(含终浓度为30μg/mL卡那霉素)LB液体培养基，置于37℃，150r/min恒温振荡器中过夜培养，取2～3ml浑浊菌液按照质粒提取试剂盒说明手册进行pET28a(+)质粒的提取。然后使用内切酶BamH I，Hind III对提取的pET28a(+)表达载体DNA进行双酶切反应。具体酶切反应体系如下：

表6 双酶切反应体系：

将上述反应体系置于温度为37℃的恒温水浴锅中，水浴30min之后，加入 10×终止反应液以终止酶切反应。然后上样于1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，根据DNA Marker的分子量标准，将pET28a(+)表达载体酶切产物进行切胶回收。

三、Hyd基因PCR产物的双酶切

取适量的Hyd基因PCR扩增产物，使用内切酶BamH I，Hind III对扩增产物进行双酶切，具体酶切反应体系如下：

表7 PCR产物酶切反应体系

将上述反应体系置于温度为37℃的恒温水浴锅中，水浴30min之后，加入 10×终止反应液以终止酶切反应，然后上样于1％琼脂糖凝胶进行电泳检测。根据DNA Marker的分子量标准，将双酶切目的片段进行切胶回收

四、连接与转化

取适量Hyd基因的回收产物连接到pET28a(+)表达载体上，具体的连接反应体系如下：

表8 连接反应体系

将上述反应体系中各组分混合均匀后，置于低温连接仪中，在16℃的条件下，连接18h。将连接好的pET28a-Hyd重组质粒4℃保存，用于后续转化。

实施例3 重组Hyd基因的诱导表达与纯化

一、重组Hyd基因的诱导表达

取适量重组表达载体质粒DNA转化E.coli BL21(DE3)菌株，37℃培养过夜；随机挑取表达菌株BL21(DE3)的单菌落于含10mL LB液体培养基(含终浓度为30μg/mL卡那霉素)试管中，置于37℃，220rpm的摇床中培养过夜；将过夜培养的菌液按1:100比例分别接种于10mL LB液体培养基中，添加(含终浓度为30μg/mL卡那霉素)，37℃，220rpm培养约3h；当菌液OD600值达到0.6 左右时，分别添加终浓度为0.5mM的IPTG，置于20℃，220rpm的摇床中，诱导过夜；将离心收集的细菌菌体用破碎Buffer(1M Tris，150mM NaCl，0.2mM PMSF，0.2％Triton X-100，pH 8.0)溶解，冰浴中超声破碎菌体，功率400W， 20min(超声2S，暂停6S为一个循环)。超声完毕后，在温度为4℃的条件下， 12000r/min离心20min，取上清液做下一步纯化。

二、重组Hyd蛋白纯化

取5mL Ni-NTA树脂到平衡柱中，用5倍柱床体积的Binding buffer(50mM Tris，300mM NaCl，pH 8.0)清洗平衡柱，流速为5mL/min；将2倍柱床体积菌体上清液上柱，流速为2mL/min，收集穿透液。然后使用5倍柱床体积的 Binding buffer清洗柱子，流速为5mL/min。接下来使用Wash buffer(50mM Tris，300mM NaCl，500mM咪唑，pH 8.0)洗杂，流速为5mL/min，收集流穿液并重复此过程，直到流穿液吸光度在280nm处接近基线。最终用Elution buffer(50 mM Tris，300mM NaCl，500mM咪唑，pH 8.0)洗脱柱上的组氨酸标签蛋白，流速为2mL/min，收集洗脱液并保存。

取适量纯化蛋白样品用于SDS-PAGE检测，检测结果如图6所示。其余部分透析到10mmol/L Tris-Hcl(pH＝7.5)溶液中，4℃透析过夜，透析结束后，用PEG20000浓缩，0.45μm滤膜过滤后分装于1.5mL离心管中，-20℃保存。

实施例4 重组Hyd蛋白酶学性质

一、重组Hyd蛋白酶活力测定方法

1、重组Hyd蛋白酶降解DBP

在体积为10mL玻璃进样瓶中，按表9所示的反应体系，依次加入10mmol/L Tris-Hcl反应缓冲溶液、底物DBP溶液(100mg/L，甲醇为溶剂)以及Hyd蛋白溶液，混合均匀后，将玻璃进样瓶放入恒温水浴锅中，恒温反应5min，反应完毕后，加入100μL TCA(1mol/L)溶液终止反应。空白对照是将加入的Hyd 纯化蛋白溶液经过100℃煮沸灭活处理。

表9 Hyd蛋白降解底物实验反应体系

2、降解实验反应液中PAEs的提取方法

向降解实验反应结束的玻璃进样瓶中加入5mL甲醇，并将其密封好置于恒温振荡器，并以120r/min的振荡速度，室温条件下振荡10min。随后取出玻璃进样瓶，将瓶中的全部溶液转移并通过长度为18cm的无水Na₂SO₄(经400℃烘干)柱，收集进入鸡心瓶中。之后以同样的方式重复清洗玻璃进样瓶两次。然后利用旋转蒸发仪，将鸡心瓶收集到的液体旋转蒸发至近干的状态，并用9mL甲醇(色谱级)分3次洗涤鸡心瓶，依次将洗涤溶液转移到10mL容量瓶内，最终定容至10mL。取2mL容量瓶中的液体经0.45μm滤膜过滤，收集滤液于棕色进样瓶中，密封保存于4℃冰箱待测。酶活性单位定义为：37℃温度条件下，每分钟水解1μmolPAEs所需要的酶量。

3、GC-MS测定PAEs

待测液中PAEs采用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)分析，色谱柱为DB-5MS 石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)，载气为高纯氦气(He)。初始压力 33.6kPa，流速为1.0mL/min；采用不分流进样，进样量为1.0μL。升温程序：初始温度为100℃，保持2min；再以15℃/min的速度升至130℃；之后，以30℃ /min的速度升至280℃，保持5min。离子源的温度为220℃，进样口的温度为 250℃；质谱所用离子源为电子轰击源(EI)，选择离子监测模式(SIM)进行扫描，电离能量为70eV。

二、温度对重组Hyd酶活性的影响

1、实验方法

按照表9所示的Hyd蛋白降解底物实验反应体系，将全部溶液混合均匀后，分别置于20、25、30、37、40、45、50、55、60℃的水浴中，恒温反应5min。每个处理3个重复，反应结束后，加入100μL TCA(1mol/L)溶液以终止反应，并按照上文描述的PAEs的提取与检测方法，计算不同温度下，各自的酶活力，其中以酶活力最高的温度处理作为100％，以相对酶活力来分析温度对Hyd水解酶酶活力的影响。

2、实验结果

结果如图7A所示，随着温度的升高，Hyd降解酶活性逐渐上升，在37℃的温度条件下，降解酶活性达到最高峰，之后随着温度升高，降解酶活性开始降低，当温度上升至60℃时，其相对酶活力仅为18％，在此温度条件下，Hyd降解酶可能因为温度过高，导致酶结构发生变化而逐渐失活。因此，从图中可以得出， Hyd降解酶最适反应温度为37℃，且在20～50℃的范围内可有效降解DBP。说明该菌具有良好的温度适应能力。

三、pH对重组Hyd酶活性的影响

按照表9中Hyd蛋白降解底物实验反应体系，先将10mMol/L Tris-Hcl反应缓冲溶液pH值分别调整为4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0，再依次加入DBP标准母液和Hyd水解酶溶液，混合均匀后，置于37℃的水浴中，反应5min。每个处理3个重复，反应结束后，加入100μL TCA(1mol/L)溶液以终止反应，并对反应体系中的DBP进行提取和检测，计算不同pH值下，各自的酶活力，其中以酶活力最高的pH值处理作为100％，以相对酶活力来分析pH 值对Hyd水解酶酶活力的影响。

结果如图7B所示，当pH值在4.0～7.5的范围内，随着pH值的上升，Hyd 降解酶活性逐渐上升，而pH值在7.5～8.0的范围内，随着pH值的上升，Hyd 降解酶活性逐渐下降。因而Hyd降解酶反应的最适pH值为7.5，且pH值在6.0～ 8.0的范围内，Hyd降解酶相对酶活性较高，均超过65％，说明该酶具有很强的 pH适应能力，实际应用潜能巨大。

四、热稳定性检测

将适量Hyd蛋白提前分别置40、50、60、65℃的水浴锅中孵育，并在2、5、10、20、30、45、60分钟的时间点，按照上文描述的方法，对每个温度下孵育的蛋白进行酶活性检测。每个温度的孵育设三个重复，并以不添加酶处理为空白对照。

结果如图7C所示，该酶在40℃孵育情况下，活性相当稳定，孵育1h后仍可保持90％以上的原活性；但在60℃以上温度孵育时，其酶活性迅速下降，20min 后仅保留不到初始活性的40％。

五、重组Hyd蛋白酶对多种PAEs降解的酶反应动力学参数测定

按照上文描述的方法，分别测定不同底物(DMP、DEP、BBP、DBP、DnOP、 DEHP、DINP)，在不同初始浓度(0.1～10mM)下，重组Hyd蛋白酶的降解能力。以PAEs的降解初速度的倒数对底物浓度的倒数作Linweaver-Burk图，求出该酶对PAEs的K_m和V_max。k_cat可由下列公式计算得到：

k_cat＝V_max/[E]

[E]为反应体系里酶的浓度。

结果如表10所示，重组Hyd蛋白酶不仅对短链PAEs具有水解作用，还可以对长链PAEs水解；相比于长链PAEs，此酶对短链PAEs水解时，其Km值较低，Vmax和Kcat/Km值较高，说明此酶在对短链PAEs具有较高的水解效率。

表10 重组Hyd水解酶对不同底物的反应动力学参数

序列表

<110> 暨南大学

<120> 一种邻苯二甲酸酯水解酶及其制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 795

<212> DNA

<213> Rhodococcus sp. 2G

<400> 1

gtggtcggcg tgagtgccac ggatcttctg cacacccatc tgttcggccc cgtcgacgga 60

ccggaggtcc tcgccctgca cggactcacc ggtcacggcc gacgctggcg gaacctcggc 120

gaacgacacc tgccccacct gcggttcgtc gctccggacc tccggggtca cggccggtcg 180

ccgtggactc ccccgtggtc gttcgaggcg cacatcgccg acctgaaggc cgtgctggac 240

gcacacacca ccggtcccgt caccgtggtg ggccactcct tcggtggtgc cctcgcgctg 300

catctcgccg ccgcggtgcc cgacagggtg cgggcgctgg tactcctcga tccggcgatc 360

ggcctcccgg ccgaccggat gctcgagatc gccgacctca ccctccacaa ccccgactac 420

acggacgagg cggaggcgcg ggccgagaag gtccacggcg actggggcga ggtggccccc 480

gagttgctcg acgaagagat cgccgagcac ctcgtcgaac tcgactcggg gcgtgtcaac 540

tggcggatct gcgtacctgc gctggtgacc tcgtgggggg agctggcccg cggacccgtc 600

ctgccgccgg ccggtatccc gacgatcttc gtgcaggccg ggaaggtgca acccccgtac 660

accacgtcaa atttccgtcg cgacctggcg gaacgactcg gcgacgacct gaccctgctc 720

gagttcgact gcgaccacat gatcgaccag gcgcgtcccg ccgagaccgc cgaactcgtg 780

gcccggatgg tgtag 795

<210> 2

<211> 264

<212> PRT

<213> Rhodococcus sp. 2G

<400> 2

Val Val Gly Val Ser Ala Thr Asp Leu Leu His Thr His Leu Phe Gly

1 5 10 15

Pro Val Asp Gly Pro Glu Val Leu Ala Leu His Gly Leu Thr Gly His

20 25 30

Gly Arg Arg Trp Arg Asn Leu Gly Glu Arg His Leu Pro His Leu Arg

35 40 45

Phe Val Ala Pro Asp Leu Arg Gly His Gly Arg Ser Pro Trp Thr Pro

50 55 60

Pro Trp Ser Phe Glu Ala His Ile Ala Asp Leu Lys Ala Val Leu Asp

65 70 75 80

Ala His Thr Thr Gly Pro Val Thr Val Val Gly His Ser Phe Gly Gly

85 90 95

Ala Leu Ala Leu His Leu Ala Ala Ala Val Pro Asp Arg Val Arg Ala

100 105 110

Leu Val Leu Leu Asp Pro Ala Ile Gly Leu Pro Ala Asp Arg Met Leu

115 120 125

Glu Ile Ala Asp Leu Thr Leu His Asn Pro Asp Tyr Thr Asp Glu Ala

130 135 140

Glu Ala Arg Ala Glu Lys Val His Gly Asp Trp Gly Glu Val Ala Pro

145 150 155 160

Glu Leu Leu Asp Glu Glu Ile Ala Glu His Leu Val Glu Leu Asp Ser

165 170 175

Gly Arg Val Asn Trp Arg Ile Cys Val Pro Ala Leu Val Thr Ser Trp

180 185 190

Gly Glu Leu Ala Arg Gly Pro Val Leu Pro Pro Ala Gly Ile Pro Thr

195 200 205

Ile Phe Val Gln Ala Gly Lys Val Gln Pro Pro Tyr Thr Thr Ser Asn

210 215 220

Phe Arg Arg Asp Leu Ala Glu Arg Leu Gly Asp Asp Leu Thr Leu Leu

225 230 235 240

Glu Phe Asp Cys Asp His Met Ile Asp Gln Ala Arg Pro Ala Glu Thr

245 250 255

Ala Glu Leu Val Ala Arg Met Val

260

Claims

1.一种邻苯二甲酸酯水解酶基因在降解二甲酸酯中的应用，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯水解酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述二甲酸酯为DMP或DEP。

2.一种邻苯二甲酸酯水解酶在降解二甲酸酯中的应用，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述二甲酸酯为DMP或DEP。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯水解酶的制备方法包括以下步骤：

S1.将重组工程菌培养至菌液OD600值为0.3～1.0时，加入IPTG至0.1～1.0mM，15～30℃培养15～24h诱导表达，得到诱导表达后的重组工程菌，所述重组工程菌能表达氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的邻苯二甲酸酯水解酶；

S2.固液分离步骤S1得到的诱导表达后的重组工程菌，收集菌体；

S3.重悬S2得到的菌体，超声破碎菌体，固液分离，收集上清；

S4.Ni-NTA亲和层析柱纯化S3得到的上清；

其中，步骤S4中，将Ni-NTA树脂置于平衡柱中，用2～8倍柱床体积的Binding buffer清洗平衡柱，流速为2～10mL/min；然后，将步骤S3获得的菌体上清以1～5倍柱床体积上柱，流速为1～5mL/min，收集穿透液；然后，使用2～10倍柱床体积的Binding buffer清洗柱子，流速为2～10mL/min；接下来使用Wash buffer洗杂，流速为2～10mL/min，收集流穿液并重复此过程，直到流穿液吸光度在280nm处到达基线；最后用Elution buffer洗脱柱上的组氨酸标签蛋白，流速为1～5mL/min，收集洗脱液并保存；

步骤S3中，用破碎Buffer重悬菌体，破碎Buffer为0.5～4M Tris，50～200mM NaCl，0.05～0.5mM PMSF，0.05～0.5％Triton X-100，pH 7～10；

步骤S3中，超声破碎菌体的具体做法为功率200～600W，5～30min，超声1～5S暂停2～10S为一个循环。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将所述的重组工程菌培养至菌液OD600值为0.6时，加入IPTG至0.5mM，20℃培养。

5.一种重组载体在降解二甲酸酯中的应用，其特征在于，所述重组载体含有核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的邻苯二甲酸酯水解酶基因，所述二甲酸酯为DMP或DEP。

6.一种重组工程菌在降解二甲酸酯中的应用，其特征在于，所述重组工程菌能表达氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的邻苯二甲酸酯水解酶，所述二甲酸酯为DMP或DEP。