CN111825764A - 一种犬种布鲁氏菌单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种犬种布鲁氏菌单克隆抗体及其应用。本发明所述犬种布鲁氏菌单克隆抗体(单抗)，该单抗与犬种布鲁氏菌参考毒株和临床分离株抗原均呈特异性免疫学反应，而与布鲁氏菌有强烈交叉反应的小肠结肠炎耶尔森氏菌、大肠杆菌、都柏林沙门氏菌，以及与交叉反应的无关的沙门氏菌均不反应。其特异性较高，可广泛用于犬种布鲁氏菌血清学检测，填补犬种布鲁氏菌血清学方法中缺少特异性单抗的空白；同时基于该单抗建立了一种高通量、准确诊断犬种布鲁氏菌的cELISA方法，该方法具有快速、高通量、准确诊断犬种布鲁氏菌血清抗体特点，有效解决小肠结肠炎耶尔森氏菌、大肠杆菌和都柏林沙门氏菌干扰诊断的技术难题，丰富了犬种布鲁氏菌血清学检测方法。

Description

一种犬种布鲁氏菌单克隆抗体及其应用

技术领域 本发明涉及一种犬种布鲁氏菌单克隆抗体杂交瘤细胞株，犬种布鲁氏菌单克隆抗 体的制备方法，以及利用该单克隆抗体建立的cELISA方法或产品，属于兽医微生物学诊断领域。

背景技术

布鲁氏菌病(简称“布病”)是由布鲁氏菌引起的一种严重慢性***反应性传染病，系《国家中长 期动物疫病防治规划(2012－2020年)》中优先防治的16种国内动物疫病之一，世界动物卫生组织 (OIE)将其列为法定报告动物疫病。人感染布病主要来于患病动物及其产品(朱良全et al.微生物 学通报,2015(01):171～177；毛开荣,等.动物布鲁氏菌病诊断技术.中国农业出版社，2014.)。

布鲁氏菌根据抗原性和主要宿主分成6个经典种，包括羊种布鲁氏菌(B.melitensis)、牛种布 鲁氏菌(B.abortus)、猪种布鲁氏菌(B.suis)、犬种布鲁氏菌(B.canis)、绵羊附睾种布鲁氏菌(B. ovis)与沙林鼠种布鲁氏菌(B.neotomae)。对人产生致病力的主要是羊种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌、 猪种布鲁氏菌和犬种布鲁氏菌。其中羊、牛、猪种布鲁氏菌属于光滑型布鲁氏菌，对人致病力较强， 且是家畜布鲁氏菌病主要病原，受到广泛关注；而犬种布鲁氏菌属于粗糙型菌株，对人致病力弱， 长期以来研究报道相对较少(毛开荣,等.动物布鲁氏菌病诊断技术.中国农业出版社，2014.)。

随着经济发展，饲养犬数量增多以及与人类的密切接触，犬布鲁氏菌病的发病数量迅速增加， 给人类健康和公共卫生安全带来潜在的危害日趋严重。至今，全世界已经报道了数十例犬种布鲁氏 菌引起的人布鲁氏菌病的病例。我国犬群普遍存在布鲁氏菌感染，，据报道我国犬布病阳性率为1. 68％～13.4％，部分地区犬布鲁氏菌病抗体阳性率可达20％左右(周桂兰，等.中国兽医杂志,2001(1 1):60。刘志国,等.微生物学通报,2019,46(12):3325-3334。黄萃et al.生物灾害科学,2018,41(04):290-293。)； 而2018年国家动物布鲁氏病参考实验室对北京、山东等数部分宠物医院的宠物犬血清进行检测， 犬种布鲁氏菌血清阳性率高达2％(未发表数据)。犬布鲁氏菌病传染源主要是病犬和带菌犬，受 感染的妊娠母犬的流产和分娩时随胎儿、胎衣排出大量病原菌，流产后的***分泌物和乳汁中也含 有病原菌。感染公犬发生***时，***中含有病原菌，可通过交配传染给母犬(黄萃et al.生 物灾害科学,2018,41(04):290-293；王兴龙，等.中国比较医学杂志,2010,20(Z1):121-125.姜海,等. 布鲁氏菌病诊疗及防控手册.人民卫生出版社，2014.)。

对于犬种布鲁氏菌病，目前没有疫苗和理想的药物防控和治疗，主要采取“检疫和淘汰”策 略。虽然细菌分离鉴定是诊断的金标准，但因其操作时间长，分离率低、而且涉及生物安全因素 和技术条件所限，故常用血清学方法。

常用的犬布鲁氏菌血清学检测方法有快速平板凝集实验(RSAT)、含2巯基乙醇快速平板凝集 实验(ME-RSAT)、试管凝集试验(SAT)和琼脂凝胶免疫扩散(AGID)。因犬种布鲁氏菌与光滑型 的牛、羊、猪种布鲁氏菌抗原表型不同，其为粗糙型，免疫原性相对较弱，并具有自凝特性，因此 RSAT、ME-RSAT和SAT等血清学凝集反应特异性不强，而且与小肠结肠炎耶尔森氏菌、大肠 杆菌、都柏林沙门氏菌等容易发生交叉反应，存在假阳性；国外常用AGID进行确诊，但其敏感性 相对较低(Fernandes,A.R.F.et al，Brazilian Journal ofMicrobiology(2011)42:1405-1408；Ana Laura Bello de Oliveira，et al，BrazilianJournal of Microbiology(2019)50:307–312；R.Bruce Hollett， Theriogenology 66(2006)575–587)；Sharma Barkha，et al，Asian Pacific Journal of Tropical Medicine(2011)857-861；Tory V Whitten et al，Preventive Veterinary Medicine 168(2019)90–94)。鉴于国内 外几乎未有成功制备犬种布鲁氏菌单克隆抗体的报道，因此制备成功高亲和力、能特异性识别犬种 布鲁氏菌抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株,并利用该单抗建立快速、高通量、准确诊断犬种布鲁氏 菌血清学方法，对于广泛开展犬布鲁氏菌病流行病学调查和疫病防控具有重要意义。

发明内容

本发明的目的：主要针对传统方法诊断犬种布鲁氏菌病缺点，如细菌分离培养鉴定其操作时间 长，分离率低、而且涉及生物安全因素和技术条件所限；传统血清凝集反应特异性差；琼脂扩散试 验敏感性低等特点，建立了一种犬种布鲁氏菌单克隆抗体杂交瘤细胞株，并获得犬种布鲁氏菌单克 隆抗体，并利用该单克隆抗体建立的cELISA检测方法，实现犬种布鲁氏菌血清快速、高通量确诊 和疫病及时防控。

本发明技术方案

1.一种犬种布鲁氏菌单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体为IgG2b亚类，其轻链类型应为 к；所述单克隆抗体分别与犬种布鲁氏菌抗原产生明显的免疫学反应，而与布鲁氏菌存在较强血清 学交叉反应的小肠结肠炎耶尔森氏菌O9、大肠杆菌O157抗原、都柏林沙门氏菌抗原以及无交叉 反应的抗原应无反应；

所述的犬种布鲁氏菌单克隆抗体是由被命名为犬种布鲁氏菌杂交瘤细胞4H3株制备，细胞株 已于2020年08月17日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为CGMCCNo.19964。

2.本发明所述一种犬种布鲁氏菌单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体的制备步骤如下：(1) 以犬种布鲁氏菌RM6/66株菌裂解抗原蛋白为免疫原免疫6-8周龄Balb/c小鼠；(2)分离ELISA 效价≥1:20000免疫小鼠的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合,得到杂交瘤细胞；(3)通过犬种布鲁氏 菌全菌裂解蛋白抗原建立的间接ELISA筛选并经亚克隆培养获得杂交瘤细胞；(4)从细胞培养液 或接种杂交瘤细胞的小鼠腹水中分离并纯化出单克隆抗体。

3.本发明所述一种犬种布鲁氏菌单克隆抗体，其特征在于用该单克隆抗体建立犬种布鲁氏菌 血清抗体的cELISA检测法；

所述犬种布鲁氏菌血清抗体的cELISA检测法主要是用含有犬种布鲁氏菌株裂解蛋白抗原包 被ELISA板，同时加入特异性犬布鲁氏菌单克隆抗体和待检犬布鲁氏菌血清，并设立不加血清的 空白对照，然后按正常cELISA程序操作进行，结果阳性血清吸光度值被特异性抑制，阴性血清吸 光度值无抑制，其与空白对照无差异。

本发明新的技术效果

本发明涉及一种犬种布鲁氏菌单克隆抗体及其应用。本发明所述犬种布鲁氏菌单克隆抗体，该 单抗与犬种布鲁氏菌参考毒株和临床分离株抗原均呈特异性免疫学反应，而与布鲁氏菌有强烈交叉 反应的小肠结肠炎耶尔森氏菌、大肠杆菌、都柏林沙门氏菌，以及与交叉反应无关的沙门氏菌均不 反应。其特异性较高，可广泛用于犬种布鲁氏菌血清学检测，填补犬种布鲁氏菌血清学方法中缺少 特异性单抗的空白；同时基于该单抗建立了一种高通量、准确诊断犬种布鲁氏菌的cELISA方法， 该方法具有快速、高通量、准确诊断犬种布鲁氏菌血清抗体特点，有效解决小肠结肠炎耶尔森氏菌、 大肠杆菌和都柏林沙门氏菌干扰诊断的技术难题，丰富了犬种布鲁氏菌血清学检测方法。

附图说明

图1不同抗原蛋白与单抗4H3 Westernblot结果

图2 ROC曲线图

本发明涉及的微生物资源信息

犬种布鲁氏菌CVCC70701(RM6/66)株菌来自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，请参见《中 国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著，中国兽医菌种目录，第二版，p28(中 国农业科学技术出版社，2002)》。

犬种布鲁氏菌杂交瘤细胞4H3株，该细胞株已于2020年08月17日送交北京市朝阳区北辰西 路1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保 藏编号为CGMCC No.19964。

本发明具体实施方式

1.通过犬种布鲁氏菌裂解蛋白连续5次免疫6-8周龄Balb/C小鼠，经融合后连续3次亚克隆， 成功筛选获得了一株杂交瘤细胞，被命名为犬种布鲁氏菌杂交瘤细胞株4H3。(1)该株细胞产生的 单克隆抗体ELISA效价达1:25000；对其亚型鉴定，重链类型结果为IgG2b亚类，其轻链类型应为 к；(2)该单克隆抗体分别与犬种布鲁氏菌抗原，与布鲁氏菌存在较强血清学交叉反应的小肠结肠 炎耶尔森氏菌O9、大肠杆菌O157抗原、都柏林沙门氏菌抗原以及与布鲁氏菌无交叉反应的沙门 氏菌抗原，分别进行平板凝集试验、间接ELISA和Westernblot，结果4H3单抗与都柏林沙门氏菌 抗原、小肠结肠炎耶尔森氏菌O9、大肠杆菌O157抗原和无交叉反应的沙门氏菌抗原均不凝集， 而与犬种布鲁氏菌抗原出现特异性凝集。同时将上述裂解抗原以1μg/mL浓度包被ELISA板，运 用间接ELISA对细胞上清进行检测，结果对犬种布鲁氏菌抗原均呈明显的反应，而与小肠结肠炎 耶尔森氏菌O9、大肠杆菌O157抗原、都柏林沙门氏菌抗原、无交叉反应的沙门氏菌抗原均无反 应；同时将上述抗原进行SDS-PAGE，并采用杂交瘤培养上清作为一抗进行Westernblot(见图1)， 进一步证明了上述结论。

2.选用犬种布鲁氏菌CVCC 70701(RM6/66)，经胰酪蛋白胨琼脂(TSA)37℃培养48h，并 进行扩大增殖培养，收获菌体经80℃水浴灭活2h，然后用蒸馏水调整至3.0×10⁹CFU/mL，采用超 声波处理，频率30Hz，15min/次，重复3～4次。裂解上清经8000r/min离心10min，弃沉淀，上 清经定量后稀释至约0.2mg/mL。然后将其与弗氏佐剂按照1:1浓度比例乳化，作为首免免疫原， 然后将其与弗氏不完全佐剂按照1:1配比比例乳化作为后续加强免疫原；三次免疫后，每次采血用 间接ELISA方法检测小鼠血清效价，待血清效价达到1:20000以上进行融合；融合前3天腹腔注 射双倍剂量不加佐剂抗原蛋白加强免疫，然后取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合、并采用有 限稀释法依次进行3次亚克隆，每次亚克隆产生的细胞培养上清用犬种布鲁氏菌RM6/66株菌裂解 抗原包被板进行ELISA筛选，取对犬种布鲁氏菌RM6/66株菌抗原单特异性识别而且ELISA效价 最高的杂交瘤细胞株进行传代和保存，直至第四次亚克隆获得杂交瘤细胞株4H3。

3.将杂交瘤细胞株连传5代，制备单克隆杂交瘤细胞株4H3腹水，并运用层析柱法进行纯化， 然后以1ug/mL犬种布鲁氏菌裂解蛋白包被ELISA板，同时加入特异性犬布鲁氏菌单克隆抗体4H3 和待检犬布鲁氏菌血清，并设不加血清的空白对照，然后按正常ELISA程序操作进行，结果阳性 血清吸光度值OD450nm均＜0.2；而阴性血清吸光度值均≥1.8，与空白对照无差异。采用背景清 楚的70份犬种布鲁氏菌血清(阳性40份；阴性30份)，进行cELISA检测，建立ROC曲线(见 图2)，并确定其Cut-off值，即抑制率PI≥30％判为阳性。

4.运用建立的cELISA方法，以及RSAT、ME-RSAT、SAT和AGID方法对80份临床犬血清检测，cELISA与AGID吻合率最高，与RSAT、ME-RSAT、SAT和AGID方法符合率分别为75.0％、87.5％、85.0％和96.2％。说明临床应用效果良好。同时用抗体凝集价为1:1000的阳性血清，经系 列稀释后分别运用cELISA和AGID，发现cELISA灵敏度明显高于AGID。

实施例

以下实施例为进一步说明本发明，不对本发明构成限制。

实施例1——杂交瘤细胞株及其产生的单克隆抗体

1.抗原制备取-80℃保存的犬种布鲁氏菌CVCC70701(RM6/66)株菌甘油菌1支(取自中 国兽医微生物菌种保藏管理中心，并有中国兽医药品监察国家动物布鲁氏菌参考实验室制备并鉴定 保存)，化冻后按1％比例接种于10mL TSB培养基(大豆酪蛋白胨肉汤培养基，购自BD公司)小 管中，37℃、200r/min振荡培养48h。用接种环蘸取少许菌液在TSA平板(大豆酪蛋白胨琼脂培 养基，购自BD公司)进行单菌落划线纯培养，37℃培养48h后，挑取典型单菌落在TSA平板进 行密集划线，37℃培养48h，每块平板用5mL生理盐水将菌苔洗下，混匀后，80℃水浴灭活2h， 将上述灭活菌株用蒸馏水调整至约3×10⁹CFU/mL，采用超声波处理，频率30Hz，15min/次，重复 3～4次。经8000r/min离心10min，弃沉淀，上清经定量后稀释至约0.2mg/mL。

2.动物免疫取上述浓度RM6/66犬种布鲁氏菌裂解蛋白抗原与弗氏完全佐剂或弗氏不完全 佐剂按照1:1比例混合，乳化抗原直至达到油包水状态。皮下注射0.2mL于6周龄BALB/c小鼠。 首免加完全佐剂，2周后的二免、三免等后续免疫采用不完全佐剂；三次免疫后用间接ELISA方 法检测小鼠血清效价，待血清效价达到1:20000以上融合。

3.饲养细胞制备一般在融合前1～2天制备，将未经免疫的Balb/c小鼠放血后颈椎脱臼处 死，浸泡于75％酒精内5min进行消毒；将小鼠置超净工作台无菌平皿内，小心剪开腹部皮肤，分 离皮肤与腹膜，暴露腹壁，用酒精棉球擦拭腹壁消毒；用无菌注射器吸取5mLDMEM营养液注入 小鼠腹腔，使腹腔细胞充分进入营养液，轻轻吸回营养液加入无菌离心管内；重复洗腹腔三到四次， 将吸出的培养基以1000r/min离心10min，弃上清，沉淀用HAT选择培养基(1％HAT+10％牛血清 +88％DMEM+1％青链霉素双抗)悬浮，混匀后加入3～6块96孔细胞培养板，每孔100μL，置37℃5％CO₂培养备用。

4.SP2/0细胞的制备融合前24～48h将SP2/0细胞传代培养。融合当天，选择形态良好、 呈对数生长的SP2/0细胞，用适量DMEM基础培养基将其从瓶壁上轻轻吹下，收集于50mL离心 管内，细胞计数；1000r/min离心10min备用。

5.免疫脾细胞的制备融合前3天腹腔注射双倍剂量不加佐剂的蛋白抗原进行加强免疫，在 强化免疫后第3天取免疫小鼠，摘除眼球放血并分离血清作为抗体阳性对照；处死小鼠，置75％ 酒精中浸泡5min，无菌取出小鼠脾脏，放入盛有10mL DMEM营养液的平皿中，轻轻漂洗；将脾 脏移入另一盛有约20mL DMEM营养液的平皿中，用一次性注射器吸取营养液***脾脏的一端， 将脾脏内的细胞冲洗出来，反复冲洗数次，直至脾脏颜色变白为止；将洗下的脾细胞移入50mL离 心管内，细胞计数，1000r/min离心10min，弃上清，细胞沉淀重悬浮备用。

6.细胞融合分别吸取适量脾细胞和骨髓瘤细胞(两者数量比例约10:1)，加入到一只50mL 离心管内，轻轻混匀。1000r/min离心10min，将上清尽量弃去，用手指轻弹管底，使沉淀细胞松 散均匀，一手均匀转动离心管，另一只手吸取1mL PEG2000，沿转动的离心管壁缓缓加入，控制 在60s加完，然后将细胞悬液吸入吸管(时间控制在30s左右)，静置30s，再将其轻轻吹入离心管 内(时间也控制在30s左右)；然后加入25mL DMEM液终止PEG2000的作用。具体方法如下：第 1min缓缓加入1mL DMEM液，第2min加入4mL DMEM液，然后在第3min内加入20mL DMEM 液，加完之后静置10min；将融合细胞1000r/min离心7min，弃上清，加入适量HAT培养液 (1％HAT+10％牛血清+88％DMEM+1％青链霉素双抗)轻轻吹吸，使沉淀细胞混合均匀。将悬浮 细胞液加入4块铺有饲养细胞的96孔板中，每孔100μL，置CO₂培养箱中培养；每天记录细胞生 长情况，融合后第4天，用1％HAT(1％HAT+10％牛血清+88％DMEM+1％青链霉素双抗)选择培 养液半量换液，第8天改用1％HT选择培养液(1％HT+10％牛血清+88％DMEM+1％青链霉素双抗) 半量换液，第14天后改用普通的10％牛血清DMEM培养基培养。

7.阳性杂交瘤细胞的筛选及亚型鉴定待融合后的细胞克隆生长到覆盖细胞孔底部1/3时， 用建立的间接ELISA方法对所有有克隆细胞生长的培养上清进行检测，将检测为阳性的细胞扩大 培养并进行抗体亚类的鉴定，鉴定为IgG的阳性孔进行克隆。

8.阳性杂交瘤细胞的克隆采用有限稀释法，克隆的前一天制备饲养细胞，方法如前所述； 将检测为强阳性的细胞孔用吸管轻轻吹吸使细胞分散均匀，吸至1mL含10％胎牛血清的DMEM液 中，取少量悬液进行细胞计数；用1％HAT选择培养液稀释阳性杂交瘤约10个/mL；将稀释好的细 胞悬液加到有饲养细胞的96孔培养板中，100μL/孔；每天观察细胞生长情况。第四天1％HT选择 培养液半量换液，检测上清，选择仅有一个克隆生长的阳性孔再次进行克隆；待数次亚克后，单克 隆阳性率达到100％时，即获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，及时扩大培养并冻存。

9.腹水的制备及效价的测定

(1)腹水的制备挑选经产Balb/c母鼠，腹腔注射灭菌石蜡油或弗氏不完全佐剂0.5mL/只。 10天后，将扩大培养的杂交瘤细胞吹打下来计数。l000r/min离心10min，弃上清，用灭菌PBS洗 涤一次后，用适量的PBS重新悬浮，调整细胞浓度约1×10⁷个/mL。每株杂交瘤细胞株接种10 只小鼠，腹腔接种0.5mL只。7～10天后，待小鼠腹部胀大接近饱和时，采集腹水。然后将腹水 5000r/min离心10min，收集上清，-20℃保存备用。

(2)效价测定

1)免疫后抗体监测结果见表1。

表1加强免疫后ELISA抗体效价检测结果

	1:10	1:100	1:1000	1:5000	1:10000	1:20000	阳性对照(+)	阴性对照(-)
									三免	3.234	2.03	1.553	0.4013	0.153	0.108	3.124	0.102
四免	3.348	3.134	2.5878	0.6329	0.321	0.219	3.013	0.127
									五免	3.785	3.321	2.6975	0.7764	0.415	0.316	3.254	0.116

根据P/N≥2.1判定，从表1看出，五免后ELISA效价达到1:20000。

2.融合及亚克隆筛选结果见表2。

表2融合及亚克隆筛选细胞株上清检测结果

	粗糙型犬种ZG	光滑型S2	阳性对照(+)	阴性对照(-)
					融合	3.3621	0.4013	3.024	0.202
第一次亚克隆	2.3878	0.2329	2.813	0.127
					第二次亚克隆	2.2975	0.1764	2.926	0.216
第三次亚克隆	2.1976	0.187	2.845	0.136
					第四次亚克隆	2.218	0.165	2.937	0.222

表2结果看出，从融合以及经有限稀释法亚克隆4次，选取特异性识别犬种单克隆抗体细胞株， 其阳性值均较高，可稳定获得100％阳性克隆。

实施例2——犬种单克隆抗体亚型测定及凝集反应

按Thermo公司亚型鉴定试剂盒标准程序操作对单抗进行鉴定。按单抗亚型鉴定试剂盒(Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit,Thermo，37503)按下面的操作程序对4H3细胞培养上清进 行亚型鉴定:1)将试剂盒恢复至室温。2)每列(A～H)各孔加入50μL稀释好的待检抗体后，再 向每个孔加入50μL HRP标记的羊抗鼠(IgG+IgA+IgM)混合物。混匀后孵育1小时，倒去孔内液 体。加入250μL洗涤液，洗涤2次后，甩干。3)每孔加入75μL TMB显色液，避光显色15min后 加入75μL终止液，测定OD_450nm值。4)结果判定OD_450nm值＞0.2判为阳性，其中A～F孔测定 抗体种类/亚类，G～H孔测定抗体轻链类型，类型列表见表3。

表3酶标板中A～H孔与抗体种类及轻链类型检测对应表

孔号

A

B

C

D

E

F

G

H

类型

IgG1

IgG2a

IgG2b

IgG3

IgA

IgM

Kappa

Lambda

结果经测定，获得4H3株单克隆抗体重链类型检测结果为IgG2b亚类，其轻链类型应为к。

实施例3——犬种布鲁氏菌杂交瘤细胞计数

将上述杂交瘤细胞连续传5代，取第1、3、5代运用秋水仙素法进行杂交瘤细胞计数。具体程 序如下：

1.在加秋水仙素前48～36小时先将杂交瘤细胞传代。

2.秋水仙素处理：在培养瓶中加入秋水仙素(100μg/mL，除菌，-20℃保存)，使最终浓度为 0.1～0.4μg/mL。继续培养4～6小时，然后吹打细胞，移入离心管中，800g离心沉淀细胞5min， 弃上清。

3.加入已预温到37℃的0.075mol/L KCl溶液5mL，将沉淀细胞悬浮并混匀，37℃水浴15～ 20min。

4.向悬液中加入新配制的固定液(甲醇与冰醋酸3:1混合)1mL，混匀，800g离心沉淀细胞 5min，弃去上清液。

5.加入固定液5mL，将细胞悬浮并混匀，室温静置20～30min，然后800g离心沉淀细胞5min， 弃去上清液；重复操作一次；其后加5mL固定液，将细胞悬浮并混匀，封上管口，置2～8℃过夜。

6.取出离心管，800g离心沉淀细胞5min，轻轻吸去上清液，根据细胞压积多少而留下0.5～ 1mL固定液，将细胞悬浮并混匀后，吸取细胞悬液1～2滴，滴在刚从冰水中取出的载玻片上，用 口吹散，并在火焰上通过数次，使细胞平铺于载玻片上，自然干燥。

7.用新配制的10％Giemsa染液染色10～20min，用水洗去染液，自然干燥。(Giemsa染液配 方：Giemsa粉0.5g，甘油33mL，55～60℃保温2小时，加甲醇33mL混匀，保存于棕色瓶内作为 原液；取原液1份，加1/15mol/L pH6.8 PBS 9份，即成10％Giemsa染液)。

8.镜检：选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞进行观察分析。每份标本应计数100个 完整的中期核细胞，并注意观察是否有标志染色体。

结果：

表4 3个不同代次株杂交瘤细胞染色体数目和形态特点

根据表4结果看出，连续传5代，细胞染色体形态均比较一致，分散良好，染色体数平均值在 102～111范围内，符合脾细胞染色体(40)和SP2/0细胞染色体(62～72)数目之和。

实施4——单克隆抗体腹水效价测定

收集的腹水以10000g离心5min，除去细胞碎片和脂类，并用层析柱纯化，用测定腹水效价的 cELISA方法进行测定，具体操作如下：

1.腹水稀释将制备的腹水用1×PBS溶液作1:10000、1:15000、1:20000、1:25000、1:30000、 1:35000和1:40000稀释。

2.抗原包被板的制备以包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6)将犬种布鲁氏菌裂解抗 原稀释至1μg/mL，加入到酶标板中，每孔100μL，2～8℃包被16小时。以1×洗涤液洗涤1次， 每孔加入封闭液(含3％明胶的0.01M pH7.4的PBS)200μL，2～8℃封闭24小时。

3.加样以1×洗涤液300μL/孔洗板1次，弃去洗涤液。将稀释好的阳性对照血清和阴性对照 血清分别加入到ELISA板中，50μL/孔，其中阳性及阴性对照血清各做2个重复。加样结束后，加 入已稀释好的单克隆抗体，每孔50μL，振荡混匀5min。37℃孵育30min后，取出反应板，弃去反 应液，每孔加入300μL 1×洗涤液，洗涤3次后，甩干。

4.加酶标抗体将HRP标记的山羊抗鼠IgG用相应的稀释液作1:100稀释后，每孔加入 100μL，37℃孵育30min后，按2.项中的方法洗涤3次，甩干。

5.显色与终止将底物溶液A和B按1:1(V/V)混合后，立即加入到ELISA反应板中，100μL/ 孔，室温避光显色15min后，每孔加50μL终止液终止反应。

6.结果判定反应终止后，15min内用酶标仪测定OD_450nm值。

7.计算公式

PI(抑制率)＝(阴性对照OD_450nm—阳性对照OD_450nm)/阴性对照OD_450nm×100％

8.效价判定在1.项各稀释度中使阳性对照血清的PI平均值≥90％的最高稀释度作为腹水的 效价。

结果：经测定，F1、F3、F5代细胞制备的腹水cELISA效价分别为1:25000，1:30000，1:25000。 说明连传5代，其与之前原代细胞生产腹水的效价(1:25000)变化不大，且较稳定。

实施例6——单克隆抗体特异性鉴定

1.间接ELISA检测抗体反应性

将犬种布鲁氏菌抗原，与布鲁氏菌存在较强血清学交叉反应的小肠结肠炎耶尔森氏菌O9、大 肠杆菌O157抗原、都柏林沙门氏菌抗原以及与布鲁氏菌无交叉反应的沙门氏菌抗原1791按犬种 布鲁氏菌裂解蛋白抗原制备方法制备成各自裂解蛋白抗原，然后分别用0.05M的碳酸盐缓冲液(碳 酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，用灭菌去离子水溶解至1000mL，含0.05％的proclin 300，pH 9.6) 稀释到1μg/mL，按100μL/孔包被96孔酶标板(Nunc，468667)，2～8℃作用14～18小时。加入 300μL 1×PBS-Tween洗涤液洗板4次，每次3min。按150μL/孔加入3％鱼皮胶(Sigma，G7041) 37℃封闭2小时。弃去包被液，加入300μL 1×PBS-Tween洗涤液洗板4次。将阳性对照血清和阴 性对照血清作1:50稀释后，每孔加入100μL，37℃作用30min。取出反应板，弃去反应液，每孔 加入300μL 1×洗涤液，洗涤3次，最后1次甩干或拍干。将HRP标记的羊抗鼠IgG用稀释液作1:200 稀释后，每孔加入100μl，37℃作用30min。同上法洗涤3次，甩干。将底物溶液A和B按1:1(V/V) 混合后，立即加入到ELISA反应板中，100μL/孔，室温避光显色15min后，每孔加50μL终止液终 止反应。反应终止后，15min内用酶标仪测定OD_450nm值。

表5 3代杂交瘤细胞培养上清检测不同抗原蛋白ELISA结果

	犬ZG	犬6/66	犬QD	犬SL	大肠O157	耶尔森O9	都柏林	沙门1791	阳性对照	阴性对照
											F1	2.2888	1.6842	1.7837	1.8142	0.0659	0.0596	0.0641	0.0569	2.3012	0.031
F3	2.2049	1.5012	1.7332	1.7983	0.06215	0.0773	0.06231	0.07326	/	/
											F5	2.062	1.4799	1.611	1.8299	0.0727	0.0699	0.06453	0.0804	/	/

从表5结果看出，F1、F3、F5代细胞制备的腹水能够特异性识别犬种布鲁氏菌。

2.凝集反应特性

用0.5％苯酚生理盐水通过比浊调节都柏林沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌O9、大肠杆菌O157、 犬种标准布鲁氏菌菌株RM6/66、犬种布鲁氏菌临床分离株ZG、犬种布鲁氏菌临床分离株QD、犬 种布鲁氏菌临床分离株SL与布鲁氏菌无交叉反应的沙门氏菌菌株1791的抗原浓度，使上述各抗 原的浊度与布鲁氏菌病试管凝集试验抗原国家参照品(中国兽医药品监察所，202001批)浊度一 致，进一步作1:20稀释后作试管凝集试验抗原。将单抗腹水稀释至间接ELISA效价为1:100时进 行凝集试验，根据凝集情况判断反应强度。

表6 3代杂交瘤细胞培养上清与不同抗原凝集试验结果

从表6结果看出，F1、F3、F5代细胞制备的腹水与犬种布鲁氏菌抗原进行特异性识别。

3.Westernblot

将上述浓度部***解抗原蛋白样品经定量后按1:6的比例加入样品缓冲液，煮沸5分钟，经过 聚丙烯酰胺凝胶电泳后转印至硝酸纤维素膜上；用TBS配制的5％脱脂乳在37℃封闭1.5小时；封 闭后分别用稀释后的腹水孵育1.5小时，经过TBST洗涤4次，用HRP标记的羊抗鼠IgG 37℃孵 育1小时；TBST洗涤5次，反应终止于化学发光底物，经化学发光仪扫描获得结果图1。

从图1结果看出，单抗与犬种布鲁氏菌抗原产生免疫学反应，而与其他菌抗原无免疫学反应。

本发明实施例中所使用的检测样品：羊种布鲁氏菌16M株(CVCC70002株)、大肠杆菌O157 株(CVCC1489株)、都柏林沙门氏菌(CVCC78352株)、沙门氏菌CVCC1791株、犬种布鲁氏 菌RM6/66株(CVCC70701)来自中国兽医微生物菌种保藏中心；小肠结肠炎耶尔森氏菌O9株(来 自中国医学细菌保藏管理中心)犬种布鲁氏菌临床分离株：ZG株、QD株和SL株来自中国兽医药 品监察所国家动物布鲁氏菌病参考实验室鉴定、保管。

实施例7——cELISA的建立

取经含2-巯基乙醇的快速平板凝集试验、试管凝集试验、琼脂扩散试验检测均为阳性的血清 40份、阴性血清30份，按照1:20稀释后进行cELISA，测定OD_450nm，计算PI。具体ELISA程序 如下：将提取的犬种布鲁氏菌裂解抗原蛋白用碳酸盐缓冲液(pH9.6)配制成1μg/mL，按100μL/ 孔加于96孔酶标板中，4℃孵育过夜；用PBST配制的5％脱脂乳在37℃封闭3小时；封闭结束后 用PBST洗涤2次，每孔加入50μL稀释的单克隆抗体和50μL 1:20稀释的待检样品，同时设置阴、 阳对照，充分混匀后在37℃孵育30min；PBST洗涤4次，每孔加入100μLHRP标记的羊抗鼠IgG， 37℃孵育30min；PBST洗涤4次，加入底物显色液室温作用10min，以1M HCL终止。读取OD_450nm值并根据公式：抑制率(PI)＝(阴性对照OD_450nm检测样品OD_450nm)/阴性对照OD_450nm×100％。 计算抑制率(PI)。然后采用SPSS 17.0软件对检测结果进行分析。使用非参数法构建ROC曲线，并 以Youden指数最大的切点作为阴阳性判断的临界点。

结果：

本次试验共检测70份血清，其计算统计结果见表7，根据结果绘制成的ROC曲线见图2，曲 线相关系数见表8。

表7血清检测的计算结果

一般用ROC曲线下面积(Area Under the Curve)反映诊断***的准确性。理论上这一指标取 值范围为0.5至1，完全无价值的诊断为0.5，完善的诊断为1。一般认为Az为0.5～0.7时，表示 诊断准确性较低；为0.7～0.9时，表示诊断准确性为中等；为0.9以上时表示诊断准确性较高。本 试验中，曲线下面积为0.986(见表8，介于Lower Bound和Upper Bound之间)，表明本诊断方法 的准确性较高，该试剂盒具有良好的诊断价值。

表8 ROC曲线相关参数

由上述结果发现，当PI＝31.21％，其Youden指数最高，据此确定PI为30％作为本cELISA方 法临界点。

实施例8——cELISA反应特性

按上述建立的cELISA方法对3份犬种布鲁氏菌阳性血清，2份犬种布鲁氏菌阴性血清，小肠 结肠炎耶尔森O9抗血清、大肠杆菌O157阳性血清以及粗糙型布鲁氏阳性血清各1份进行检测， 按上述公式计算抑制率，结果见表9。从实验结果来看，检测的3份犬种布鲁氏菌阳性血清抑制率 分别为97.4％、96.7％、93.8％，而2份布鲁氏菌阴性血清的抑制率都小于10％，分别为9.97％和 0.85％，说明本研究建立的cELISA方法能够初步用于检测犬种布鲁氏菌血清。另外，检测了1份 小肠结肠炎耶尔森菌O9的阳性血清，1份大肠杆菌O157阳性血清，1份光滑型布鲁氏菌阳性血清 及1份都柏林沙门氏菌。结果显示，其抑制率分别为27.0％，19.8％，19.2％和18.8％，均小于30％。 说明基于单克隆抗体4H3建立的cELISA检测方法可行，能有效排除大肠杆菌O157、小肠结肠炎 耶尔森O9和都柏林沙门氏菌带来的假阳性。

表9基于4H3建立的cELISA反应特性结果

实施例9——临床样本检测及灵敏度试验

1.运用已建立的cELISA方法、RSAT方法、ME-RSAT方法、SAT方法、AGID方法对80份用临床犬血清样本检测。比较cELISA方法与其他方法符合率。从表10～表13看出，cELISA与AGID吻合率最高，与RSAT、ME-RSAT、SAT和AGID方法符合率分别为75.00％、87.5％、85.0％和96.2％。

表10犬种布鲁氏菌cELISA与快速平板比对结果

表11犬种布鲁氏菌cELISA与试管凝集试验比对结果

表12犬种布鲁氏菌cELISA与含有2巯基乙醇的快速平板比对结果

表13犬种布鲁氏菌cELISA与琼脂扩散试验比对结果

2.将cELISA与AGID对已知阳性样品(抗体凝集价约1:1000)进行最小检测量的检测。

表14犬种布鲁氏菌cELISA与琼脂扩散试验比对结果

	琼扩	cELISA
			原倍	+	+
1:10	+	+
			1:50	(+)	+
1:100	—	+
			1:200	—	+
1:1000	—	+
			1:5000	—	—

从表14看出，cELISA检测阳性样本的灵敏度高于琼扩。

Claims (3)

1.一种犬种布鲁氏菌单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体为IgG2b亚类，其轻链类型应为к；所述单克隆抗体分别与犬种布鲁氏菌抗原产生明显的免疫学反应，而与布鲁氏菌存在较强血清学交叉反应的小肠结肠炎耶尔森氏菌O9、大肠杆菌O157抗原、都柏林沙门氏菌抗原以及无交叉反应的抗原应无反应；

所述的犬种布鲁氏菌单克隆抗体是由被命名为犬种布鲁氏菌杂交瘤细胞4H3株制备，细胞株已于2020年08月17日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为CGMCC No.19964。

2.如权利要求1所述一种犬种布鲁氏菌单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体的制备步骤如下：(1)以犬种布鲁氏菌RM6/66株菌裂解抗原蛋白为免疫原免疫6-8周龄Balb/c小鼠；(2)分离ELISA效价≥1:20000免疫小鼠的脾细胞，将其与骨髓瘤细胞融合,得到杂交瘤细胞；(3)通过犬种布鲁氏菌全菌裂解蛋白抗原建立的间接ELISA筛选并经亚克隆培养获得杂交瘤细胞；(4)从细胞培养液或接种杂交瘤细胞的小鼠腹水中分离并纯化出单克隆抗体。

3.如权利要求1所述一种犬种布鲁氏菌单克隆抗体，其特征在于用该单克隆抗体建立犬种布鲁氏菌血清抗体的cELISA检测法；

所述犬种布鲁氏菌血清抗体的cELISA检测法主要是用含有犬种布鲁氏菌株裂解蛋白抗原包被ELISA板，同时加入特异性犬布鲁氏菌单克隆抗体和待检犬布鲁氏菌血清，并设立不加血清的空白对照，然后按正常cELISA程序操作进行，结果阳性血清吸光度值被特异性抑制，阴性血清吸光度值无抑制，其与空白对照无差异。

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