CN111793128B - 抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的单克隆抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111793128B
CN111793128B CN202010753197.1A CN202010753197A CN111793128B CN 111793128 B CN111793128 B CN 111793128B CN 202010753197 A CN202010753197 A CN 202010753197A CN 111793128 B CN111793128 B CN 111793128B
Authority
CN
China
Prior art keywords
swine fever
african swine
fever virus
monoclonal antibody
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010753197.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111793128A (zh
Inventor
迟立超
徐黎晖
陈西钊
王雨佳
周景云
梁臻妮
闫歌
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Anheal Laboratories Co ltd
Original Assignee
Beijing Anheal Laboratories Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Anheal Laboratories Co ltd filed Critical Beijing Anheal Laboratories Co ltd
Priority to CN202010753197.1A priority Critical patent/CN111793128B/zh
Publication of CN111793128A publication Critical patent/CN111793128A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111793128B publication Critical patent/CN111793128B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/12011—Asfarviridae
    • C12N2710/12051—Methods of production or purification of viral material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一种分泌特异性识别非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系和上述细胞系分泌的单克隆抗体，以及检测或辅助检测待测样品中是否含有非洲猪瘟病毒抗体的酶联免疫试剂盒及其应用。所述的杂交瘤细胞系4G12是通过杂交瘤技术以真核表达的重组可溶性CD2v蛋白作为免疫原建立的；所述细胞系分泌的单克隆抗体能够识别非洲猪瘟病毒CD2v抗原并被非洲猪瘟病毒阳性血清显著阻断，灵敏度高，特异性强；所述单克隆抗体经过辣根过氧化物酶标记，制备诊断非洲猪瘟病毒抗体的ELISA试剂盒具备灵敏度高、特异性强、批间差异小的特点。

Description

抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的杂交瘤细胞系和单克隆抗体。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触的烈性传染性疾病。其特征为病程短、病死率高，可高达100％。临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，在诊断时极易误诊，临床表现为发热，皮肤发绀，***，肾，胃肠粘膜明显出血。本病自1909年在肯尼亚首次报道，一直存在于撒哈拉以南的非洲国家，1957年先后流传至西欧和拉美国家，多数被及时扑灭，但在葡萄牙，西班牙西南部和意大利的撒丁岛仍有流行。2007年以来，非洲猪瘟在全球多个国家发生、扩散、流行，特别是俄罗斯及其周边地区。2017年3月，俄罗斯远东地区伊尔库茨克州发生非洲猪瘟疫情，疫情发生地距离我国较近。2018年，经中国动物卫生与流行病学中心诊断，在沈阳市沈北新区发生疑似非洲猪瘟疫情。世界动物卫生组织(OIE)列为A类疫病，我国规定为动物一类疾病，受到世界各国的高度重视。非洲猪瘟病毒(ASFV)主要的靶细胞是单核细胞和肺泡巨噬细胞。ASFV是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员。病毒粒子直径约为200nm，呈正20面体结构，由多层同心圆结构组成，由内到外依次是类核、核壳、内膜、衣壳和外囊膜。ASFV基因组为线性双链DNA分子，约为170～193kb。基因组的两端通过部分碱基配对形成发夹环，中间区域较为保守，两端靠近发夹环部位有末端重复序列和可变区。不同的毒株因基因组可变区长度不同而导致其基因组大小存在差异。基因组编码151～167种蛋白质，成熟的病毒粒子包含54种结构蛋白。科学家们根据p72和CD2v基因分别进行基因型和血清型分析。而CD2v是非洲猪瘟中蛋白中的主要外膜蛋白，在病毒的逃逸机制中存在重要的意义。非洲猪瘟病毒编码的CD2v蛋白能使病毒感染的细胞及细胞外病毒颗粒吸附红细胞，帮助病毒扩散，并抑制淋巴细胞的功能。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的杂交瘤细胞系和单克隆抗体，在检测非洲猪瘟病毒抗体时具有较高的灵敏度和特异性。
本发明的第一个方面是提供一种抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的单克隆抗体，是由保藏号为CGMCC No.19947的小鼠杂交瘤细胞株4G12分泌的。
进一步地，所述单克隆抗体特异性识别并结合如SEQ ID NO.2所示的抗原表位或非洲猪瘟病毒CD2v蛋白。
进一步地，所述单克隆抗体的亚型为IgG1，kappa链。
第二个方面是提供一株分泌抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株4G12，所述小鼠杂交瘤细胞株4G12已于2020年06月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.19947。
进一步地，所述小鼠杂交瘤细胞株4G12是以SEQ ID NO.2所示的抗原表位为免疫原。
第三个方面是提供上述的单克隆抗体或小鼠杂交瘤细胞株4G12在如
a1.在制备诊断或检测与具有如SEQ ID NO.2所示的抗原表位相关的抗原的产品的用途；
a2.在制备诊断或检测非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的产品的用途；
a3.在制备诊断、检测或预防与非洲猪瘟病毒相关的疾病的产品的用途；
a4.在制备诊断或检测与非洲猪瘟病毒抗体相关的产品的用途；优选的，在制备诊断非洲猪瘟病毒抗体酶联免疫试剂盒中的用途；
a5.在具有如SEQ ID NO.2所示的抗原表位相关的抗原的分离纯化或检测的用途；
a6.在非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的分离纯化或检测的用途；
a7.在非洲猪瘟病毒抗体的分离纯化或检测的用途；
所述产品包括试剂、试纸条或试剂盒。
第四个方面是提供一种检测或辅助检测待测样品中是否含有非洲猪瘟病毒抗体的酶联免疫试剂盒，其包括上述的单克隆抗体。
第五个方面是一种检测或辅助检测待测样品中是否含有非洲猪瘟病毒抗体的酶联免疫试剂盒，所述试剂盒包括：酶标结合板、洗涤液、样品稀释液、底物、终止液、封闭液、酶标记上述的单克隆抗体结合液、标准阴性对照、标准阳性对照和说明书。
进一步地，酶标结合板是通过如下方法得到的：
用0.05mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，将纯化后重组CD2v蛋白稀释后，按0.3μg/mL加入微孔板中，每孔100μL。4℃包被过夜，次日弃去包被缓冲液，按200μL/孔加入2％(m/v)酪蛋白的封闭液，4℃封闭过夜，室温干燥后装入真空铝封袋，抽真空封装保存，即得。
进一步地，洗涤液(20×)
PBST(pH 7.4)：KH2PO40.2g，Na2HPO4-12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Tween-200.5mL，加蒸馏水至1L。浓缩成20倍作为存储液。
进一步地，样品稀释液：BSA 1g，酪蛋白2g，加洗涤液(1×)至1L。
底物液A：醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30％(v/v)H2O2溶液0.3mL，加蒸馏水至500mL。
底物液B：TMB(用水溶)0.15g，甘油50mL，柠檬酸0.95g，乙二胺四乙酸二钠0.2g，加蒸馏水至500mL。
终止液(2M H2SO4)：蒸馏水891.5mL，逐滴加入98％(v/v)浓硫酸至1L。
酶标记单克隆抗体结合液：用样品稀释液将酶标记单克隆抗体稀释至0.1μg/mL。
标准阳性对照：CD2v抗原免疫猪血清，经过OIE推荐的间接免疫荧光试验及本发明的ELISA试剂盒标定。
标准阴性对照：SPF猪血清(使用样品稀释液进行20倍稀释)
第六个方面是上述的单克隆抗体或上述的小鼠杂交瘤细胞株或上述的酶联免疫试剂盒在检测或辅助检测待测样品中是否含有非洲猪瘟病毒抗体中的应用；
或，上述的单克隆抗体或上述的小鼠杂交瘤细胞株在制备检测或辅助检测待测样品中是否含有非洲猪瘟病毒试剂或胶体金试纸条或试剂盒中的应用。
第七个方面是上述的单克隆抗体经过酶标记在制备诊断非洲猪瘟病毒抗体酶联免疫试剂盒中的应用。
第八个方面是一种检测或辅助检测待测样品中是否含有非洲猪瘟病毒抗体的方法，是将上述的单克隆抗体经过酶标记后，作为酶标抗体的竞争ELISA检测方法。
进一步地，上述方法包括如下步骤：
(1)将非洲猪瘟病毒重组CD2v蛋白包被到酶标板上，洗涤；
(2)封闭(1)得到的酶标板，洗涤；
(3)向(2)得到的酶标板中加入阳性对照、阴性对照或待测样品，孵育，洗涤；
(4)向(3)得到的酶标板中加入酶标记所述的单克隆抗体，孵育，洗涤；
(5)向(4)得到的酶标板中加入底物显色，显色后加入终止液终止反应；
(6)用酶标仪检测各孔的在450nm和620nm处的吸光度值；
(7)按以下方法判定结果：
①样品Inh％≥40％，样品判为非洲猪瘟病毒抗体阳性；
②样品Inh％＜40％，样品判为非洲猪瘟病毒抗体阴性；
Inh％＝(阴性对照OD450nm/OD620nm均值-样品孔OD450nm/OD620nm均值)/阴性对照孔OD450nm/OD620nm均值×100％。
进一步地，所述步骤(1)中，用碳酸盐缓冲液将非洲猪瘟病毒重组CD2v蛋白稀释后包被到酶标板上；
所述步骤(3)中，用BSA溶液将待测样品稀释后加入酶标板中；
所述步骤(4)中，用BSA溶液将生物素化的所述的单克隆抗体稀释至0.1-0.5μg/mL后加入酶标板中。
进一步地，所述非洲猪瘟病毒重组CD2v蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
进一步地，上述的检测或辅助检测待测样品中是否含有非洲猪瘟病毒抗体的方法，酶标记为辣根过氧化物标记。
进一步地，所述待测样品为猪血清。
进一步地，所述待测样品来源疑似感染非洲猪瘟病毒。
本发明具备以下优点：
1、本发明根据GenBank中非洲猪瘟病毒CD2v基因序列，登录号为(MK333180.1)，筛选抗原表位序列进行截短和优化设计并合成，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA分子，编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。用SEQ ID NO:2构建载体转染细胞，表达CD2v蛋白，作为抗原免疫小鼠，制备杂交瘤细胞系，得到高效稳定分泌抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株4G12，并进行了保藏。该小鼠杂交瘤细胞株4G12分泌的单克隆抗体用于检测非洲猪瘟病毒CD2v抗体具有较高的灵敏度和特异性。
2、本发明非洲猪瘟病毒的酶联免疫试剂盒能够特异性的识别非洲猪瘟病毒CD2v抗原，重复性好，灵敏度高(ASFV阳性血清1:400稀释)。本发明的试剂盒与市售试剂盒同时检测156份临床血清样品，结果见表6，敏感性为96.6％，特异性为97.1％，符合率为96.8％。说明本发明研制的试剂盒性能较好。
3、本发明所制备的杂交瘤细胞系4G12分泌的单克隆抗体能够识别非洲猪瘟病毒CD2v抗原并被非洲猪瘟病毒阳性血清显著阻断，使本发明的非洲猪瘟病毒抗体酶联免疫试剂盒在本领域兽用检测试剂ELISA中具有很高的实用价值。
4、将用SEQ ID NO:3替换SEQ ID NO:2后制备的小鼠杂交瘤细胞株，制备单抗，用两种抗原(ASFV-CD2v-S重组蛋白、ASFV-CD2v-L重组蛋白)和与之配对的抗体，以相同的条件分别建立竞争ELISA方法对临床血清进行检测。结果表明以纯化的ASFV-CD2v-S重组蛋白作为免疫原和筛选抗原出的单抗4G12，与ASFV-CD2v-S重组蛋白配对建立的竞争ELISA方法对血清检测的敏感性和符合率真更高，可用于竞争试剂盒进一步研发。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1中1.3非洲猪瘟病毒CD2v蛋白Western Blot鉴定结果，左边条带为Marker，右边条带为非洲猪瘟病毒CD2v蛋白；
图2为实施例1中5.3的小鼠杂交瘤细胞株4G12分泌的单克隆抗体SDS-PAGE鉴定结果，左边条带为Marker，右边条带为小鼠杂交瘤细胞株4G12分泌的单克隆抗体；
图3为实施例1中小鼠杂交瘤细胞株4G12分泌的单克隆抗体Western Blot鉴定结果，左边条带为Marker，右边条带为非洲猪瘟病毒CD2v蛋白。
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术，实施例中所用到的试剂和原料均可由市场购得。
实施例1
一、建立细胞系
1.抗原制备
1.1非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的真核表达
根据GenBank中非洲猪瘟病毒CD2v基因序列，登录号为(MK333180.1)，筛选抗原表位序列进行截断和优化设计并合成，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的DNA分子，编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。SEQ ID NO:1第1-6位和631-636位为引入的酶切位点。将核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的基因进行Hind III和Xho I双酶切后并***pcDNA3.1(+)表达载体中，pcDNA3.1(+)表达载体的其他序列不变，得到表达质粒pcDNA3.1-ASFV-CD2v。大量制备表达质粒pcDNA3.1-ASFV-CD2v，瞬时转染至ExpiCHO细胞中进行蛋白大量表达。
1.2非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的纯化
37℃培养ExpiCHO细胞240小时，收集上清。将收集的上清液用GE的NiSepharoseexcel介质进行亲和层析，具体为：收集的上清5000rpm离心5min，作为上样液。用5倍柱体积的蒸馏水清洗介质。用5倍柱体积的平衡缓冲液清洗介质。上样，柱子每毫升可挂4mg蛋白。用20倍柱体积的洗涤缓冲液清洗介质。用5倍柱体积的洗脱缓冲液将蛋白洗脱。经过纯化，收集的非洲猪瘟病毒CD2v蛋白表达量达到8mg/L。将纯化的CD2v蛋白进行SDS-PAGE电泳，检测蛋白的纯度。SDS-PAGE电泳后经薄层扫描定量，CD2v蛋白纯度达到95％。
1.3非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的鉴定
将1.2制备的蛋白进行SDS-PAGE，采用半干法20V转印30min，将目的蛋白条带转移到PVDF膜，转印膜用含5％BSA封闭液封闭过夜，PBST洗涤3次，1∶500稀释的非洲猪瘟病毒阳性血清37℃作用1h，PBST洗3次，用1∶4000稀释的HRP标记兔抗猪酶标抗体37℃作用1h，PBST洗涤3次，显影液(A+B)溶液(Bio-RAD公司产品，货号为：Immun-Star HRP Substrate#1705041)作用5min，在化学发光仪进行显色，结果见图1，CD2V蛋白条带很亮，说明ExpiCHO细胞能够表达CD2v蛋白，且免疫原性好。
2.抗原免疫
以1.2纯化的非洲猪瘟病毒CD2v蛋白为抗原，常规方法免疫6周龄BALB/c小鼠，首次基础免疫皮下注射抗原200μg，使用完全弗氏佐剂；每隔3周进行一次免疫，共三次，50μg/只/次，最后一次基础免疫后3周后脾内注射加强免疫，25μg/只，免疫完成。
3.杂交瘤细胞的制备
3.1饲养细胞的制备
以BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。融合前1天，将小鼠拉颈处死，体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10mL DMEM培养液至腹腔，反复冲洗，回收冲洗液，1000rpm离心10分钟，弃上清。用含20％胎牛血清的DMEM培养液重悬沉淀，调整细胞浓度为2×105个/mL。将上述细胞悬液加入96孔板，每孔0.1mL，置37℃，5％CO2的培养箱中培养过夜。
3.2免疫脾细胞的制备
取上述步骤2中免疫完成后的BALB/c小鼠，通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75％酒精中5min，无菌条件下取出脾脏，至于平皿中，DMEM培养液清洗1次。将脾脏移入另一盛有10mLDMEM培养液的平皿中，使脾细胞进入培养液。用吸管吹打数次过滤，收获脾细胞悬液，1000rpm离心10min，用DMEM培养液离心洗涤2次，然后将细胞重悬计数，用于细胞融合。
3.3骨髓瘤细胞的制备
于融合前48h，将骨髓瘤细胞(sp2/0)扩大培养，融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50mL离心管。1000rpm离心10min，弃去上清。加入30mL不完全DMEM培养基，同法离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于10mL不完全DMEM培养基混匀。取骨髓瘤细胞悬液计数，用于细胞融合。
3.4细胞融合
将骨髓瘤细胞(sp2/0)与免疫脾细胞按1∶5比例混合，在50mL离心管内用DMEM培养液洗1次，1200rpm离心10min，弃上清用滴管小心吸出残留液体。在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀，置37℃水浴中预热。45s加入0.8-0.9mL预热至37℃的50％PEG-1450，继续搅拌1min，轻轻搅起PEG，静置90s。加入1mL DMEM，边加边搅拌，搅起PEG，中止反应。加入40mL DMEM，边加边搅动，1000rpm离心5min，洗掉PEG，并弃上清。加入5mL HAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加含饲养细胞的HAT培养基至80mL。分装96孔细胞培养板，每孔0.1mL，然后将培养板置37℃，5％CO2培养箱内培养。24h后用HAT培养基换出半量换液，48h后完全换液。两周后用HT培养基换出HAT培养基，再维持两周后，改用DMEM培养液。
4.杂交瘤细胞的筛选和克隆化
4.1杂交瘤细胞的筛选
杂交瘤细胞融合10天后，按照常规免疫酶技术(ELISA)进行杂交瘤细胞的筛选。包被原为非洲猪瘟病毒CD2v蛋白。用包被液(0.05mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液)将包被原稀释至工作浓度1μg/mL；向板孔中每孔加100μL，4℃过夜；然后弃去孔内液体。洗涤三次，拍干。每孔加200μL封闭液(含2％酪蛋白的PBST)，37℃2h，洗涤2次，拍干。将3.4中的96孔细胞培养板中的细胞培养上清液顺序加入，每孔100μL；每块板同时设空白对照、阴性对照(SP2/0细胞上清)和阳性对照(免疫小鼠血清)各2孔。置37℃0.5h，洗涤5次，拍干。用PBST将酶标二抗稀释到工作浓度，每孔加100μL，置37℃0.5h，洗涤5次，拍干。各孔加底物A液和底物B液各50μL，反应10min。每孔加终止液50μL终止反应。判定结果：阴性对照孔(SP2/0细胞上清)无颜色反应，阳性对照孔(免疫小鼠血清)有颜色反应。待测样品孔OD450值，样品孔OD450值/阴性对照OD450值≥2.1倍即为阳性。
4.2杂交瘤细胞的克隆
克隆化方案为有限稀释法，按照常规杂交瘤细胞克隆方法进行。经过三次亚克隆，筛选出6株非洲猪瘟病毒CD2v-ELISA检测均为阳性、能高效稳定分泌抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株，分别命名为1A5、1B2、2C4、3D12、4B2和4G12。将稳定的单克隆抗体小鼠杂交瘤细胞株逐步扩大培养，直至能在细胞培养瓶中稳定传代，冻存保存。
5杂交瘤细胞及单克隆抗体的鉴定
5.1单克隆抗体效价测定和稳定性
用ELISA方法测定筛选出的6株小鼠杂交瘤细胞株的上清效价，通过非洲猪瘟病毒感染猪的阳性血清阻断ELISA法(用包被液将包被原CD2v蛋白稀释至工作浓度0.3μg/mL)；向板孔中每孔加100μL，4℃过夜；然后弃去孔内液体。洗涤三次，拍干。每孔加200μL封闭液，37℃2h，洗涤2次，拍干。将非洲猪瘟病毒阳性血清用PBS 2倍稀释后加入6孔，每孔100μL；同时设置8个孔，用等体积PBS缓冲液代替猪阳性血清稀释液，作为阴性对照。完成上述步骤的酶标板置37℃0.5h，洗涤5次，拍干。6株杂交瘤细胞培养上清液稀释后顺序加入阳性血清孔和PBS对照孔，每孔100μL，剩余2孔PBS对照(PBS空白对照)继续添加PBS。置37℃0.5h，洗涤5次，拍干。用PBST稀释液将酶标二抗(HRP标记山羊抗小鼠IgG)稀释到工作浓度，每孔加100μL，置37℃0.5h，洗涤5次，拍干。各孔加底物A液和底物B液各50μL，反应10min。每孔加终止液50μL终止反应。判定结果：阳性血清孔无颜色反应，PBS对照孔(加杂交瘤细胞培养上清液)有颜色反应，PBS空白对照无颜色反应。阳性血清孔OD450nm值/PBS对照孔OD450nm值≤0.5，即为阳性。选出1株高效、稳定分泌非洲猪瘟CD2v单克隆抗体并能被阳性血清显著阻断的小鼠杂交瘤细胞株(表1)，为4G12，此株杂交瘤细胞经20代传代培养(表2)，效价均可达到1：25600。小鼠杂交瘤细胞株4G12已于2020年06月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.19947。
表1：非洲猪瘟CD2v小鼠杂交瘤细胞株上清阳性血清阻断ELISA的检测结果
Figure GDA0003512523380000141
表2：非洲猪瘟CD2v小鼠杂交瘤细胞株4G12不同代次上清检测结果
Figure GDA0003512523380000142
5.2单克隆抗体免疫球蛋白类及亚类的鉴定
经Southern Biotech公司试剂盒测定，小鼠杂交瘤细胞株4G12分泌的非洲猪瘟病毒CD2v单克隆抗体的亚型鉴定结果：IgG1，kappa链。
5.3 Western Blot鉴定
将CD2v蛋白和单克隆抗体进行SDS-PAGE，单克隆抗体SDS-PAGE的结果见图2。CD2v蛋白胶不染色直接半干法20V转印30min，将目的蛋白条带转移到PVDF膜，转印膜用含5％BSA的PBST封闭液封闭过夜，PBST洗涤3次，1∶200(体积比)稀释小鼠杂交瘤细胞株4G12分泌的单克隆抗体37℃作用1h，PBST洗3次，用1∶4000(体积比)稀释的HRP标记兔抗小鼠IgG抗体37℃作用1h，PBST洗涤3次，显影液(A+B)溶液(Bio-RAD公司产品，货号为：Immun-Star HRPSubstrate#1705041)作用5min，在化学发光仪进行显色，结果见图3，CD2v蛋白条带很亮，说明纯化的单克隆抗体与CD2v蛋白反应性良好。
6单克隆抗体的特异性
采用间接ELISA对单克隆抗体特异性进行鉴定。用纯化猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒作为抗原,分别建立间接ELISA方法，检测杂交瘤细胞培养上清。结果显示，细胞上清均不其他抗原有免疫反应，表明该单克隆抗体具有良好的特异性。
实施例2、单克隆抗体制备
本发明中，大量生产单克隆抗体的方案为小鼠腹水法，步骤如下：本方案将上述获得的小鼠杂交瘤细胞株4G12接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，得到大量的腹水单抗。
具体方法为：BALB/c小鼠腹腔接种无菌液体石蜡，每只小鼠0.5mL。两周后，腹腔接种DMEM培养基稀释的杂交瘤细胞4G12,密度为5×105个/mL，每只小鼠注射0.5mL。5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，并在无菌条件下抽取腹水。室温静止30min，1000rpm离心10min，收集上清，-80℃冻存备用。
实施例3、小鼠杂交瘤细胞株4G12分泌的单克隆抗体纯化及辣根过氧化酶(HRP)标记
1.单克隆抗体的纯化
称取活化的sepharose 4B 0.5g，溶于2mmol/L的HCl溶液中，4℃过夜。将溶胀好了的sepharose 4B预装于层析柱中，用10倍体积的2mmol/L HCl溶液洗涤后，用0.1mol/LNaHCO3溶液对柱子进行平衡。将5mg protein A/G溶于0.1mol/L NaHCO3溶液中，加入上述已平衡的柱子，置于摇床上轻轻混合2-8℃过夜。用0.1mol/L NaHCO3溶液洗涤，0.01mol/Ltris base平衡柱子后，加入0.5％BSA封闭sepharose4B 2-4小时。用0.01mol/L tris base平衡柱子，加入经预微滤(0.45μm)的腹水5mL，置于摇床上在室温反应2-4小时。用0.01mol/L tris base洗涤柱子3次，用9mL、0.1mol/L、pH 2.5甘氨酸洗脱结合在柱子上的抗体。将1mL、1mol/L NaHCO3溶液加入西林瓶中和洗脱的抗体。将洗脱抗体溶液装入透析袋经PEG20000浓缩至2mL后于0.01mol/LPBS中透析4次。用紫外可见分光光度计测定抗体的浓度为5mg/mL，将纯化抗体分装保存、备用。
2.单克隆抗体的辣根过氧化酶标记
纯化后的单克隆抗体的酶标记物的制备方案为过碘酸钠法，具体步骤如下：称取5mg HRP溶解于1mL蒸馏水中；向其中加入0.2mL新配的0.1mol/L NaIO4溶液，室温避光搅拌20min；用1mmol/L、pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；向其中再加入20μL、0.2mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液，使溶液pH升高到9.0，然后立即加入0.5mL、10mg/mL的单克隆抗体(溶于0.01mol/L碳酸盐缓冲液)，室温避光轻柔搅拌2h；加入0.1mL新配的4mg/mL NaBH4，混匀4℃放置2h；所得产物在0.15mol/L、pH7.4PBS中4℃透析过夜。透析完成后，边搅拌边逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1h。3000rpm离心30min，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15mol/L、pH 7.4的PBS中。将上述溶液装入透析袋中，用0.15mol/L、pH7.4的PBS缓冲液透析，10000rpm离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装备用。
3.单克隆抗体的辣根过氧化酶标记物检验
性状为无色透明澄清液体。
无菌按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。
效能检验将单克隆抗体的辣根过氧化酶标记物按1:1000、1:2000、1:4000、1:8000稀释，重复2孔，用直接ELISA方法检测，单克隆抗体的辣根过氧化酶标记物的效价大于1:4000。
实施例4、诊断非洲猪瘟病毒抗体ELISA试剂盒的建立
1.试剂盒的检测原理
采用竞争法，将重组的非洲猪瘟病毒外膜蛋白CD2v包被于微孔板中，然后用封闭液将酶标板封闭，加入待测样本及标准阳性对照、阴性对照。样本或标准品中的非洲猪瘟病毒抗体能与酶标板中包被的CD2v抗原反应，加入针对CD2v抗原的酶标单克隆抗体后参与结合表位的竞争。随后，加入底物TMB显色，H2SO4终止液终止反应，通过酶标仪在450nm/620nm波长下，测定各孔吸光度值，值的大小(终止显色反应后颜色的深浅)与待测样本中非洲猪瘟病毒抗体的含量成反比。
2.诊断非洲猪瘟病毒抗体ELISA试剂盒的组成
2.1酶标结合板
用0.05mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液，将上述制备的纯化后重组CD2v蛋白稀释后，按0.3μg/mL加入微孔板中，每孔100μL。4℃包被过夜，次日弃去包被缓冲液，按200μL/孔加入2％(m/v)酪蛋白的封闭液，4℃封闭过夜，室温干燥后装入真空铝封袋，抽真空封装保存。
2.2洗涤液(20×)
PBST(pH 7.4)：KH2PO4、0.2g，Na2HPO4-12H2O、2.9g，NaCl、8.0g，KCl、0.2g，Tween-20、0.5mL，加蒸馏水至1L。浓缩成20倍作为存储液。
2.3封闭液：酪蛋白2g，加洗涤液(1×)至1L。
2.4样品稀释液：BSA1g，酪蛋白2g，加洗涤液(1×)至1L。
2.5底物液A：醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30％(v/v)H2O2溶液0.3mL，加蒸馏水至500mL。
2.6底物液B：TMB(用水溶)0.15g，甘油50mL，柠檬酸0.95g，乙二胺四乙酸二钠0.2g，加蒸馏水至500mL。
2.7终止液(2M H2SO4)：蒸馏水891.5mL，逐滴加入98％(v/v)浓硫酸至1L。
2.8酶标记单克隆抗体结合液：用样品稀释液将酶标记单克隆抗体稀释至0.1μg/mL。
2.9标准阳性对照：CD2v抗原免疫猪血清，经过OIE推荐的间接免疫荧光试验及本ELISA试剂盒标定。
2.10标准阴性对照：SPF猪血清(使用样品稀释液进行20倍稀释)
2.11产品说明书
2.11.1操作步骤
使用前所有试剂应恢复至室温(25℃)，试剂应轻轻旋转或振荡混匀。取出酶标结合板，在记录表上记录阳性对照、阴性对照和样品的位置；在相应孔中分别加入阳性对照(2孔)和阴性对照(2孔)原液。待测样品孔中先加入50μL样品稀释液，再加入50μL待测样品。充分混匀后，贴上封板膜，置37℃孵育60分钟；小心揭掉封板膜，弃去各孔中液体、拍净。每孔加350μL洗涤液，静置约30秒，重复洗涤5次，最后在吸水纸上拍净；每孔加入酶标记单克隆抗体结合液100μL，贴上封板膜，置37℃左右孵育30分钟；重复洗涤5次；每孔加入底物液A和底物液B各50μL，置37℃左右避光显色10分钟；每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，置酶标仪450nm/620nm波长处测定各孔OD值。
2.11.2结果(阻断率，Inh％)计算：
Inh％＝(阴性对照孔OD450nm/OD620nm均值-样品孔OD450nm/OD620nm均值)/阴性对照孔OD450nm/OD620nm均值×100％
2.11.3结果判定：
试验结果同时符合下列条件，方为有效：
①两孔阴性对照OD450nm/OD620nm平均值应≥1.00；
②阳性对照阻断率应≥50％；
按以下方法判定结果：
①样品Inh％≥40％，样品判为非洲猪瘟病毒抗体阳性。
②样品Inh％＜40％，样品判为非洲猪瘟病毒抗体阴性。
2.12非洲猪瘟病毒(CD2v)抗体阻断ELISA检测试剂盒性能评估
2.12.1特异性试验
用非洲猪瘟病毒(CD2v)抗体阻断ELISA检测试剂盒检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪腹泻病毒(PEDV)、猪***病毒(FMDV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型病毒(PCV2)(上述几种血清均由中国兽医微生物菌种保藏管理中心CVCC提供)，并设置标准阴性对照和标准阳性对照，按照2.11.1操作步骤操作，结果见表3。除阳性对照血清检测为阳性(Inh≥40％)外，其余血清均检测为阴性(Inh％＜40％)。表明本试剂盒特异性良好，且与其他猪血清无交叉反应。
表3：特异性实验
Figure GDA0003512523380000211
2.11.2重复性试验
用非洲猪瘟病毒(CD2v)抗体阻断ELISA检测试剂盒检测非洲猪瘟血清的OD450nm/OD620nm值，测定试剂盒的板间CV值。结果见表4，A-H表示同一批次不同的酶标结合板，1-12表示每个板上设置的12个重复样品孔。结果表明，板间CV值为6.56％，小于10％，符合生产要求，表明本试剂盒重复性良好。
表4：重复性试验
Figure GDA0003512523380000212
2.11.3敏感性试验
用制备好的非洲猪瘟病毒(CD2v)抗体阻断ELISA检测试剂盒和商品化ASFV抗体试剂盒同时检测自制灵敏度质控盘L1(ASFV阳性血清1:100稀释(体积比))、L2(ASFV阳性血清1:200稀释(体积比))、L3(ASFV阳性血清1:400稀释(体积比))、L4(ASFV阳性血清1:800稀释(体积比))、L5(ASFV阳性血清1:1600稀释(体积比))，结果见表5，二者均将L1-L3检测为阳性，L4-L5检测为阴性，说明本发明研制的试剂盒敏感性较好，灵敏度达1:400
表5：敏感性试验
Figure GDA0003512523380000221
本发明试剂盒判界：Inh％≥40％为ASFV抗体阳性，Inh％＜40％为ASFV抗体阴性；商品化试剂盒判界：X％≥50％为ASFV抗体阳性，X％≤40％为ASFV抗体阴性，介于两者之间为可疑。
2.11.4用制备好的非洲猪瘟病毒(CD2v)抗体阻断ELISA检测试剂盒和商品化ASFV抗体试剂盒同时检测156份临床血清样品。结果见表6，敏感性为96.6％(85/88)，特异性为97.1％(66/68)，符合率为96.8％(151/156)，说明该研制的试剂盒性能较好。
表6：156份临床血清的CD2v抗体检测结果
Figure GDA0003512523380000222
对比例
1、将实施例中氨基酸序列如SEQID NO：2所示的蛋白(下面称为ASFV-CD2v-S重组蛋白)，替换为氨基酸序列如SEQID NO：3所示的蛋白(ASFV-CD2v-L重组蛋白)进行对比实验。
2、实验方法
2.1抗ASFV-CD2v-L重组蛋白单抗筛选
具体步骤见上述实施例。
2.2细胞上清效价测定
具体步骤见上述实施例。
2.3单克隆抗体鉴定
具体步骤见上述实施例。
2.4单克隆抗体制备纯化标记
具体步骤见上述实施例。
2.5单克隆抗体阻断效果比较
以纯化ASFV-CD2v-S重组蛋白与HRP-4G12抗体(实施例3制备得到)、纯化ASFV-CD2v-L重组蛋白与配对标记抗体分别建立竞争ELISA方法，对20份血清样品进行检测。纯化重组蛋白用包被液将包被原稀释至工作浓度(0.3μg/mL)，相应孔中分别加入标准阳性对照(2孔)和标准阴性对照(2孔)原液。孔中先加入50μL样品稀释液，再加入50μL待测样品。充分混匀后，贴上封板膜，置37℃孵育60分钟；小心揭掉封板膜，弃去各孔中液体、拍净。每孔加350μL洗涤液，静置约30秒，重复洗涤5次，最后在吸水纸上拍净；每孔加入酶标抗体溶液100μL，贴上封板膜，置37℃左右孵育30分钟；重复洗涤5次；每孔加入底物液A和底物液B各50μL，置37℃左右避光显色10分钟；每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，置酶标仪450nm/620nm波长处测定各孔OD值。结果(阻断率，Inh％)计算：Inh％＝(阴性对照OD450nm/OD620nm均值-样品孔OD450nm/OD620nm均值)/阴性对照孔OD450nm/OD620nm均值×100％。结果判定：①Inh％≥40％，样品判为非洲猪瘟病毒抗体阳性。②Inh％＜40％，样品判为非洲猪瘟病毒抗体阴性。
3、实验结果
3.1抗ASFV-CD2v-L重组蛋白单抗筛选
经三次亚克筛选，共获得3株高效稳定分泌抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株1H5、2C9、3B6。
3.2细胞上清效价测定
以纯化的ASFV-CD2v-L重组蛋白为包被抗原，用ELISA方法测定筛选出的3株杂交瘤细胞的上清效价测定，见表7，从表7中可以看出，稀释为1:6400时，1H5、2C9和3B63株单抗的/OD450nm值均为阴性对照的2.1倍以上，说明3株单抗的效价均可达到1：6400，结果见表7。
表7：3株非洲猪瘟CD2v杂交瘤细胞上清效价测定结果
Figure GDA0003512523380000241
Figure GDA0003512523380000251
3.3单克隆抗体鉴定
以阳性血清与筛选出的3株单抗建立竞争ELISA方法，对单抗阻断效果进行测定，结果显示小鼠杂交瘤细胞株3B6与阳性血清存在显著竞争作用，结果见表8。
表8：3株非洲猪瘟CD2v杂交瘤细胞上清阳性血清阻断ELISA的检测结果
Figure GDA0003512523380000252
3.4单克隆抗体制备纯化标记
杂交瘤细胞注入小鼠腹腔制备单抗，经纯化后浓度达到5mg/mL，辣根过氧化酶标记后，酶标抗体效价大于1:4000。
3.5单克隆抗体阻断效果比较
分别以纯化的ASFV-CD2v-S重组蛋白与4G12单抗、ASFV-CD2v-L重组蛋白与3B6单抗分别建立竞争ELISA方法，对20份非洲猪瘟阳性血清进行检测，结果见表9。
表9：20份血清检测结果
Figure GDA0003512523380000253
Figure GDA0003512523380000261
备注：本发明实施例和对比例试剂盒判界：Inh％≥40％为ASFV抗体阳性，Inh％＜40％为ASFV抗体阴性；商品化试剂盒判界：X％≥50％为ASFV抗体阳性，X％≤40％为ASFV抗体阴性，介于两者之间为可疑。
4、结果表明：上述实验通过以纯化的ASFV-CD2v-L重组蛋白为免疫原和筛选抗原，制备相应的单抗。用两种抗原(ASFV-CD2v-S重组蛋白、ASFV-CD2v-L重组蛋白)和与之配对的抗体，以相同的条件分别建立竞争ELISA方法对临床血清进行检测。结果表明以纯化的ASFV-CD2v-S重组蛋白作为免疫原和筛选抗原出的单抗4G12，与ASFV-CD2v-S重组蛋白配对建立的竞争ELISA方法对血清检测的敏感性和符合率真更高，可用于竞争试剂盒进一步研发。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京世纪元亨动物防疫技术有限公司
<120> 抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的杂交瘤细胞系和单克隆抗体
<130> HA202001580
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 636
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aagcttatga ttgactactg ggtgtctttc aacaagacca tcattctgga ctctaacatc 60
acaaacgaca acaacgacat taacggcgtg agctggaact tcttcaacaa ctctttcaac 120
accctcgcca catgcggcaa ggccggcaac ttctgcgagt gctccaacta cagcacatct 180
atttacaaca ttaccaacaa ctgcagcctg accattttcc ctcacaacga cgtgttcgac 240
accacatacc aggtggtgtg gaaccagatt attaactaca ccatcaagct gctgacccca 300
gccacccctc caaacattac ctacaactgc acaaacttcc tgatcacatg caagaagaac 360
aacggcacaa acacaaacat ttacctgaac attaacgaca ccttcgtgaa gtacacaaac 420
gagtctatcc tcgagtacaa ctggaacaac tctaacatta acaacttcac cgccacatgc 480
atcattaaca acaccatctc cacctctaac gagaccaccc tgattaactg cacctacctg 540
acactcagct ctaactactt ctacaccttc ttcaagctgt acgaattcgg cggcatgccc 600
agaggctctc accaccacca tcaccactaa ctcgag 636
<210> 2
<211> 207
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Ile Asp Tyr Trp Val Ser Phe Asn Lys Thr Ile Ile Leu Asp Ser
1 5 10 15
Asn Ile Thr Asn Asp Asn Asn Asp Ile Asn Gly Val Ser Trp Asn Phe
20 25 30
Phe Asn Asn Ser Phe Asn Thr Leu Ala Thr Cys Gly Lys Ala Gly Asn
35 40 45
Phe Cys Glu Cys Ser Asn Tyr Ser Thr Ser Ile Tyr Asn Ile Thr Asn
50 55 60
Asn Cys Ser Leu Thr Ile Phe Pro His Asn Asp Val Phe Asp Thr Thr
65 70 75 80
Tyr Gln Val Val Trp Asn Gln Ile Ile Asn Tyr Thr Ile Lys Leu Leu
85 90 95
Thr Pro Ala Thr Pro Pro Asn Ile Thr Tyr Asn Cys Thr Asn Phe Leu
100 105 110
Ile Thr Cys Lys Lys Asn Asn Gly Thr Asn Thr Asn Ile Tyr Leu Asn
115 120 125
Ile Asn Asp Thr Phe Val Lys Tyr Thr Asn Glu Ser Ile Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Trp Asn Asn Ser Asn Ile Asn Asn Phe Thr Ala Thr Cys Ile Ile
145 150 155 160
Asn Asn Thr Ile Ser Thr Ser Asn Glu Thr Thr Leu Ile Asn Cys Thr
165 170 175
Tyr Leu Thr Leu Ser Ser Asn Tyr Phe Tyr Thr Phe Phe Lys Leu Tyr
180 185 190
Glu Phe Gly Gly Met Pro Arg Gly Ser His His His His His His
195 200 205
<210> 3
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Ile Asp Tyr Trp Val Ser Phe Asn Lys Thr Ile Ile Leu Asp Ser
1 5 10 15
Asn Ile Thr Asn Asp Asn Asn Asp Ile Asn Gly Val Ser Trp Asn Phe
20 25 30
Phe Asn Asn Ser Phe Asn Thr Leu Ala Thr Cys Gly Lys Ala Gly Asn
35 40 45
Phe Cys Glu Cys Ser Asn Tyr Ser Thr Ser Ile Tyr Asn Ile Thr Asn
50 55 60
Asn Cys Ser Leu Thr Ile Phe Pro His Asn Asp Val Phe Asp Thr Thr
65 70 75 80
Tyr Gln Val Val Trp Asn Gln Ile Ile Asn Tyr Thr Ile Lys Leu Leu
85 90 95
Thr Pro Ala Thr Pro Pro Asn Ile Thr Tyr Asn Cys Thr Asn Phe Leu
100 105 110
Ile Thr Cys Lys Lys Asn Asn Gly Thr Asn Thr Asn Ile Tyr Leu Asn
115 120 125
Ile Asn Asp Thr Phe Val Lys Tyr Thr Asn Glu Ser Ile Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Trp Asn Asn Ser Asn Ile Asn Asn Phe Thr Ala Thr Cys Ile Ile
145 150 155 160
Asn Asn Thr Ile Ser Thr Ser Asn Glu Thr Thr Leu Ile Asn Cys Thr
165 170 175
Tyr Leu Thr Leu Ser Ser Asn Tyr Phe Tyr Thr Phe Phe Lys Leu Tyr
180 185 190
Tyr Ile Pro Leu Ser Ile Ile Ile Gly Ile Thr Ile Ser Ile Leu Leu
195 200 205
Ile Ser Ile Ile Thr Phe Leu Ser Leu Arg Lys Arg Lys Lys His Val
210 215 220
Glu Glu Ile Glu Ser Pro Pro Pro Glu Ser Asn Glu Glu Glu Gln Cys
225 230 235 240
Gln His Asp Asp Thr Thr Ser Ile His Glu Pro Ser Pro Arg Glu Pro
245 250 255
Leu Leu Pro Lys Pro Tyr Ser Arg Tyr Gln Tyr Asn Thr Pro Ile Tyr
260 265 270
Tyr Met Arg Pro Ser Thr Gln Pro Leu Asn Pro Phe Pro Leu Pro Lys
275 280 285
Pro Cys Pro Pro Pro Lys Pro Cys Pro Pro Pro Lys Pro Cys Pro Pro
290 295 300
Pro Lys Pro Cys Pro Ser Ala Glu Ser Tyr Ser Pro Pro Lys Pro Leu
305 310 315 320
Pro Ser Ile Pro Leu Leu Pro Asn Ile Pro Pro Leu Ser Thr Gln Asn
325 330 335
Ile Ser Leu Ile His Val Asp Arg Ile Ile Glu Phe Gly Gly Met Pro
340 345 350
Arg Gly Ser His His His His His His
355 360

Claims (11)

1.一种抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的单克隆抗体，是由保藏号为CGMCC No.19947的小鼠杂交瘤细胞株4G12分泌的。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别并结合氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的抗原或非洲猪瘟病毒CD2v蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的亚型为IgG1，kappa链。
4.一株小鼠杂交瘤细胞株4G12，其保藏号为CGMCC No.19947。
5.根据权利要求4所述的小鼠杂交瘤细胞株4G12，其特征在于，所述小鼠杂交瘤细胞株4G12是以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的抗原为免疫原制备得到的。
6.权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体或权利要求4或5所述的小鼠杂交瘤细胞株4G12在如下任一项中的用途：
a1.在制备诊断或检测与具有如SEQ ID NO.2所示的抗原表位相关的抗原的产品的用途；
a2.在制备诊断或检测非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的产品的用途；
a3.在制备诊断、检测或预防与非洲猪瘟病毒相关的疾病的产品的用途；
a4.在制备诊断或检测与非洲猪瘟病毒抗体相关的产品的用途；
a5.在制备具有如SEQ ID NO.2所示的抗原表位相关的抗原的分离纯化或检测的产品中的用途；
a6.在制备非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的分离纯化或检测的产品中的用途；
a7.在制备非洲猪瘟病毒抗体的分离纯化或检测的产品中的用途；
所述产品包括试剂、试纸条或试剂盒。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的单克隆抗体或所述的小鼠杂交瘤细胞株4G12在制备诊断非洲猪瘟病毒抗体酶联免疫试剂盒中的用途。
8.一种检测或辅助检测非洲猪瘟病毒抗体的酶联免疫试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体。
9.一种非疾病诊断方法的检测或辅助检测非洲猪瘟病毒抗体的方法，其特征在于，将权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体经过酶标记后，作为酶标抗体的竞争ELISA检测方法。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）将非洲猪瘟病毒重组CD2v蛋白包被到酶标板上，洗涤；
（2）封闭（1）得到的酶标板，洗涤；
（3）向（2）得到的酶标板中加入阳性对照、阴性对照或待测样品，孵育，洗涤；
（4）向（3）得到的酶标板中加入酶标记权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体，孵育，洗涤；
（5）向（4）得到的酶标板中加入底物显色，显色后加入终止液终止反应；
（6）用酶标仪检测各孔的在450nm和620nm处的吸光度值；
（7）按以下方法判定结果：
①样品Inh% ≥40%，样品判为非洲猪瘟病毒抗体阳性；
②样品Inh%＜40%，样品判为非洲猪瘟病毒抗体阴性；
Inh%=（阴性对照OD450nm/OD620nm均值-样品孔OD450nm/OD620nm均值）/阴性对照孔OD450nm/OD620nm均值×100%。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：
所述步骤（1）中，用碳酸盐缓冲液将非洲猪瘟病毒重组CD2v蛋白稀释后包被到酶标板上；
所述步骤（3）中，用BSA溶液将待测样品稀释后加入酶标板中；
或，所述步骤（4）中，用BSA溶液将酶标记的权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体稀释至0.1-0.5 μg/mL后加入酶标板中。
CN202010753197.1A 2020-07-30 2020-07-30 抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的单克隆抗体及其应用 Active CN111793128B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010753197.1A CN111793128B (zh) 2020-07-30 2020-07-30 抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的单克隆抗体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010753197.1A CN111793128B (zh) 2020-07-30 2020-07-30 抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的单克隆抗体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111793128A CN111793128A (zh) 2020-10-20
CN111793128B true CN111793128B (zh) 2022-04-08

Family

ID=72828095

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010753197.1A Active CN111793128B (zh) 2020-07-30 2020-07-30 抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的单克隆抗体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111793128B (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114426974B (zh) * 2020-10-29 2023-11-21 洛阳普泰生物技术有限公司 特异性结合非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的抗体或抗体片段
CN112505333B (zh) * 2020-11-30 2022-05-31 吉林大学 一种旋毛虫竞争elisa抗体检测试剂盒及其检测方法
CN113563461B (zh) * 2021-06-29 2022-05-06 中国检验检疫科学研究院 一种基于非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的竞争性单克隆抗体、试剂盒及其应用
CN113444153B (zh) * 2021-07-21 2022-04-12 华中农业大学 非洲猪瘟病毒CD2v截短蛋白及在制备野毒和自然弱毒检测试剂盒中的应用
CN113480642B (zh) * 2021-08-11 2022-06-24 郑州大学 抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白单克隆抗体、制备方法及应用
CN114478762B (zh) * 2022-02-15 2024-06-04 武汉天德生物科技有限公司 一种β-淀粉样多肽1-42单克隆抗体、ELISA试剂盒及其应用
CN114966013A (zh) * 2022-05-10 2022-08-30 中牧实业股份有限公司 检测非洲猪瘟病毒抗原的酶联免疫试剂盒及其应用
CN115073591B (zh) * 2022-06-30 2023-01-20 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种可识别asfv外膜糖基化修饰蛋白的单克隆抗体及应用
CN115232206B (zh) * 2022-06-30 2023-04-11 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 抗CD2v蛋白单克隆抗体及其应用
CN116143888B (zh) * 2022-10-10 2024-05-14 沈阳农业大学 非洲猪瘟病毒p30蛋白抗原表位多肽及其应用
CN116879538A (zh) * 2023-04-28 2023-10-13 中国检验检疫科学研究院 用于elisa检测的样本稀释液和酶标稀释液

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110658339A (zh) * 2019-12-02 2020-01-07 北京纳百生物科技有限公司 非洲猪瘟病毒的检测试纸、试剂盒及其制备方法
CN110927390A (zh) * 2019-12-16 2020-03-27 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种检测非洲猪瘟CD2v蛋白抗体的ELISA方法、试剂盒及应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101831407B (zh) * 2010-04-23 2012-06-06 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其所分泌的单克隆抗体
CN109734810A (zh) * 2019-01-24 2019-05-10 深圳市雅臣智能生物工程有限公司 抗非洲猪瘟病毒和cd双靶标猪源化抗体、制备法和应用
CN110981944B (zh) * 2019-11-11 2022-05-06 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 非洲猪瘟病毒t细胞抗原多肽及其抗原表位筛选的elispot检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110658339A (zh) * 2019-12-02 2020-01-07 北京纳百生物科技有限公司 非洲猪瘟病毒的检测试纸、试剂盒及其制备方法
CN110927390A (zh) * 2019-12-16 2020-03-27 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种检测非洲猪瘟CD2v蛋白抗体的ELISA方法、试剂盒及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
猪瘟病毒抗体纳米荧光检测试纸条的临床应用;刘百红等;《中国动物检疫》;20200220;第37卷(第2期);全文 *
非洲猪瘟病毒CD2v重组蛋白真核表达及单克隆抗体的制备;王雨佳等;《中国动物传染病学报》;20210430;全文 *
非洲猪瘟病毒Georgia 2007/1株CD2v蛋白的原核表达及多克隆抗体制备;任肖等;《中国畜牧兽医》;20191220;第46卷(第12期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111793128A (zh) 2020-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111793128B (zh) 抗非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的单克隆抗体及其应用
CN105837686B (zh) 一种单克隆抗体及其应用
CN107058239B (zh) 一种抗猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体细胞株及其应用
CN111848786A (zh) 一种单克隆抗体、其制备方法及用途
CN114057868B (zh) 猪δ冠状病毒抗体、含有猪δ冠状病毒抗体的试剂盒及应用
CN104725490A (zh) 猪圆环病毒2型elisa抗体检测试剂盒
CN108614121A (zh) 牛病毒性腹泻病毒e2蛋白抗原多表位融合肽及其制备与应用
CN113740536A (zh) 一种非洲猪瘟病毒p30阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用
CN114874995A (zh) 猪瘟病毒2型Erns蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株及应用
CN106518989B (zh) 用于检测猪Delta冠状病毒抗体的多肽、制备方法及其应用
CN108918869B (zh) fiber2蛋白及其重组蛋白在检测血清4型禽腺病毒抗体方面的应用
CN109959788B (zh) 一种用于检测猪伪狂犬病病毒gE抗体的包被抗原和酶标抗体及阻断法试剂盒
CN108752471B (zh) 抗pcv2单克隆抗体的制备方法及其应用
CN105542000B (zh) 一种单克隆抗体及其应用
CN105424928B (zh) 一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的免疫层析条及其制备方法和应用
CN110229218B (zh) 检测塞内卡病毒抗体的试剂及其所用多肽
CN114384247A (zh) 一种非洲猪瘟单克隆抗体及其制备方法和应用
CN114316038A (zh) 猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒快速检测试纸条及其制备方法和应用
CN114113634A (zh) 一种检测非洲猪瘟病毒抗体的ELISA检测试剂盒以及protein L的应用
CN113687073A (zh) 一种非洲猪瘟病毒p54阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用
CN107064501B (zh) 一种定量检测猪瘟病毒IgG抗体竞争ELISA试剂盒及其检测方法
CN112458060A (zh) 1型PAstV的单克隆抗体及其制备和ELISA应用
Li et al. Development and application of a blocking ELISA based on a N protein monoclonal antibody for the antibody detection against porcine reproductive and respiratory syndrome virus 2
CN116621976B (zh) 抗PDCoV核衣壳蛋白的单克隆抗体2H7及其应用方法
CN117169499B (zh) 一种盖他病毒的双抗体夹心elisa检测试剂盒以及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant