CN111714519B - 海蟑螂有机溶剂提取物的应用及组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及海洋天然药物领域，具体涉及海蟑螂有机溶剂提取物在制备镇痛抗炎药物、或镇痛抗炎药物组合物、或具有镇痛抗炎功能的保健品、或具有镇痛抗炎功能的功能食品中的应用。海蟑螂鲜体或干体粉碎后用有机溶剂提取，减压浓缩后获得海蟑螂有机溶剂提取物。体外试验表明，海蟑螂有机溶剂提取物具有显著的环氧化酶(COX‑2)抑制活性。细胞试验与动物试验证明，海蟑螂提取物对巨噬细胞RAW264.7分泌一氧化氮(NO)具有强效抑制作用，对实验小鼠表现出显著的镇痛作用，而且没有急性毒性，安全性较高。因此，本发明提供的海蟑螂有机溶剂提取物具有开发为镇痛抗炎药物或药物组合物、保健品以及功能食品的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及海洋天然药物领域，具体涉及海蟑螂有机溶剂提取物在制备镇痛抗炎药物、或镇痛抗炎药物组合物、或具有镇痛抗炎功能的保健品、或具有镇痛抗炎功能的功能食品中的应用。。
背景技术
根据国际疼痛学会的定义，疼痛是一种不愉快的感觉和情绪上的感受，伴随现有或潜在的组织损伤。同呼吸、脉搏、血压、体温一样，疼痛也被列为“第五大生命体征”。疼痛是迄今为止人类面临的重大医疗挑战之一。现代医学认为，疼痛不仅是一种疾病症状，疼痛本身也是一种疾病。疼痛不仅影响患者的生活质量，也带来高昂的社会经济成本。如何有效治疗和缓解疼痛是当今医学和社会共同面临的公共医学难题。作为临床最常见的病理疼痛之一，炎症痛与关节炎、风湿病、癌症、糖尿病等许多重大疾病都有密切关系。阿片样镇痛药(Opioid Analgesics)和非甾体抗炎药(NSAIDs)是目前临床应用最广泛的镇痛药物，其在缓解中枢及外周性疼痛方面具有良好的临床效果，但是长期临床应用表明它们均存在严重的副反应。阿片样镇痛药易产生严重的呼吸抑制、成瘾性等副反应。非甾体抗炎药是许多关节炎、风湿病等典型炎症痛的主要治疗药物，但也存在损伤胃肠道、增加心血管疾病风险等严重副反应，临床应用受到极大限制。寻找安全、高效的镇痛抗炎药物海洋天然药物研究的热点。
我国具有丰富的海洋药物资源，是发现镇痛抗炎药物的重要宝库。海蟑螂属于节肢动物门，甲壳纲，等足目，潮虫亚目，海蟑螂科，广泛分布于我国沿海各地。海蟑螂一般生活于高潮区或潮上区的岩石间隙，喜食海藻，常以紫菜、海带为食，是潮间带生态***的重要成员。但在南方海藻养殖区域，海蟑螂经常成群大量出现，咬食海藻造成产量下降，是海藻养殖业的敌害之一。
海蟑螂在我国具有重要的药用价值。海蟑螂是一味完全由民间挖掘而来的海洋药物，历代本草未载。但《全国中草药名鉴》、《中华本草》、《动物本草》等现代药学典籍中均收录海蟑螂作为药用动物，并认为其味咸、性温，归肝、胃经，具有消肿止痛、活血解毒等功效。在南方沿海地区当地渔民常用海蟑螂治疗跌打损伤，腰背扭伤等，效果明显。
目前海蟑螂的现代药学研究还很不充分，对海蟑螂这一药用资源的开发利用程度较低。2005年，范秋领等报道了海蟑螂95％醇提物具有抗肿瘤作用和抑菌作用，其中抑制人肿瘤细胞SMMU-7721的IC50值为220μg/mL。2007年，卞俊等发现海蟑螂干品水提物对多株肿瘤细胞系具有明显的抑制作用，并且在体内肿瘤模型中确认了海蟑螂水提物(1g/Kg)的抗肿瘤作用。在专利“一种抗肿瘤海蟑螂提取物及其制备工艺与检测方法与用途”(专利号，CN106937959B)中，奚志芳公开了一种海蟑螂提取物在抗肿瘤中的用途。在专利“海蟑螂活性成分的提取方法”(专利号，CN1253780A)中，卞俊等提出海蟑螂水提物具有抗炎、镇痛活性。因此，当前研究结果暗示海蟑螂水相提取物是海蟑螂镇痛抗炎的活性成分。而且，宣伟东等在文献“紫外分光光度法测定海蟑螂中腺苷含量”(中国海洋药物杂志，2005年第24卷第1期)中认为腺苷可能是海蟑螂水提物中的主要活性成分。目前，文献中报道的从海蟑螂分离得到纯化合物仅有几种类胡罗卜素和一种二糖肌苷。因此，海蟑螂起镇痛抗炎作用的物质基础还未被阐明。
为研究海蟑螂的镇痛抗炎作用，我们从海蟑螂中制备了多种海蟑螂提取物，包括海蟑螂水提物。在以巨噬细胞RAW264.7为抗炎模型筛选提取物的抗炎活性时发现，海蟑螂有机溶剂提取物的活性远高于水提物。利用腺苷对照品和海蟑螂有机溶剂提取物进行高效液相分析，表明海蟑螂有机提取物中不含腺苷。因此，我们认为，海蟑螂有机溶剂提取物是海蟑螂的主要活性部位，且其有效成分不是腺苷。
综上所述，为充分挖掘海蟑螂的现代药学价值，我们创新了海蟑螂的提取、制备方法，通过活性筛选确定了海蟑螂发挥镇痛抗炎作用的活性组分，为开发海蟑螂镇痛抗炎药物或药物组合物、保健品和特殊功能食品奠定了基础。
发明内容
本发明的目的在于提供海蟑螂有机溶剂提取物在制备镇痛抗炎药物、或镇痛抗炎药物组合物、或具有镇痛抗炎功能的保健品、或具有镇痛抗炎功能的功能食品中的应用。
本发明的另一目的是提供海蟑螂有机溶剂提取物在制备抑制环氧化酶-2(COX-2)的药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
所述海蟑螂为海蟑螂科海蟑螂属海蟑螂(Ligia spp.)的干燥全体和/或新鲜个体，包括奇异海蟑螂(Ligia exotica Roux)、灰色海蟑螂(Ligia cinerascens)、西方海蟑螂(Ligia occidentalis Dana)中的一种或二种以上。
其中，所述有机溶剂提取物是指乙酸乙酯、石油醚、正己烷、二氯甲烷、氯仿、丙酮、甲醇、乙醇中的一种或二种以上混合物作为提取剂分别提取得到的提取物、或者上述溶剂两种以上提取剂先后提取得到的提取物；其中乙醇优选体积浓度为60％-100％的乙醇溶液。
其中，所述的海蟑螂提取物优选按照如下方法制备：
以新鲜海蟑螂和/或干燥海蟑螂为原料，将海蟑螂粉碎，在温度15-45℃下，按照质量体积比(w/v，g/mL)1:1～1:100加入提取剂(乙酸乙酯、石油醚、正己烷、二氯甲烷、氯仿、丙酮、甲醇、乙醇中的一种或二种以上混合物作为提取剂，优选石油醚和/或乙酸乙酯)进行浸泡提取和/或搅拌提取，收集提取液，重复提取过程1-4次，收集提取液合并后过滤或离心，然后减压浓缩，干燥，即得海蟑螂提取物；
或，以新鲜海蟑螂和/或干燥海蟑螂为原料，海蟑螂粉碎后在温度15-55℃下，以60％～95％乙醇进行浸泡或搅拌提取1-4次，过滤，合并乙醇提取液，减压浓缩得粗提物浸膏；浸膏以1-3倍(质量比，w/w)蒸馏水分散后，分别向浸膏中加入与分散液等体积的提取剂(乙酸乙酯、石油醚、正己烷、二氯甲烷、氯仿、丙酮中的一种或二种以上混合物作为提取剂，优选石油醚或乙酸乙酯)萃取1-3次，转移有机相，经减压浓缩、干燥，即得海蟑螂提取物。
本发明还提供了海蟑螂的乙醇提取物在制备抑制环氧化酶-2(COX-2)的药物中的用途，即海蟑螂的乙醇提取物在制备镇痛抗炎药物或药物组合物的用途。
本发明还提供了海蟑螂的乙醇提取物的石油醚萃取物在制备抑制环氧化酶-2(COX-2)的药物中的用途，即海蟑螂的乙醇提取物的石油醚萃取物在制备镇痛抗炎药物或药物组合物的用途。
本发明还提供了海蟑螂的乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物在制备抑制环氧化酶-2(COX-2)的药物中的用途，即海蟑螂的乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物在制备镇痛抗炎药物或药物组合物的用途。
进一步的，本发明还提供了一种通过分离纯化制备镇痛、抗炎活性更高的海蟑螂提取物的方法，即所述的海蟑螂提取物可以进一步利用硅胶、反相填料、凝胶过滤LH-20、大孔树脂等柱层析填料分离纯化得到镇痛、抗炎活性更高的海蟑螂提取物。
所述海蟑螂提取物能显著抑制COX-2活性，抑制巨噬细胞分泌一氧化氮(NO)，同时具有镇痛作用且无急性毒性。
以所述海蟑螂有机提取物为活性成分，与药学或食品上可接受的辅料或辅助添加剂成分混合后，按照常规制剂方法，可以用来制备具有镇痛和/或抗炎作用的药物或组合物、或保健品或功能食品。
进一步的本发明还提供了该镇痛抗炎药物或药物组合物、保健品以及功能食品的制备方法，包括以下步骤：
(a)海蟑螂鲜个体和/或海蟑螂粉末，按照质量体积比(w/v，g/mL)1:1～1:100加入60％～95％乙醇进行浸泡或搅拌提取2-4次，过滤，合并乙醇提取液，减压浓缩得乙醇提取物浸膏。
(b)浸膏以蒸馏水分散后，经过石油醚、乙酸乙酯萃取1-3次得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物，浓缩以后得到相应的粗提物组分。
(c)以海蟑螂有机溶剂提取物为活性成分，加入加入药学或食品上可接受的辅料或辅助性成分制备成制剂。
所述含有海蟑螂有机溶剂提取物，或海蟑螂有机溶剂提取物与其它具有镇痛抗炎作用的西药和/或中药活性成分配伍组成的镇痛抗炎药物或药物组合物、或保健品，按照常规制剂技术制备成口服制剂、局部给药制剂或注射剂。
所述镇痛和/或抗炎应用的具体适应症状或疾病包括腰肌损伤、腰椎痛、颈椎痛、关节炎、风湿、癌症痛、术后痛、糖尿病性疼痛以及其它原因引起的急性或慢性疼痛中的一种或二种以上。
一种镇痛和/或抗炎组合物，其以海蟑螂有机溶剂提取物(优选权利要求5制备得到的提取物)为活性成分，与药学或食品上可接受的辅料或辅助添加剂成分混合后获得。
体外试验表明，海蟑螂有机溶剂提取物具有显著的环氧化酶(COX-2)抑制活性。细胞试验与动物试验证明，海蟑螂有机溶剂提取物对巨噬细胞RAW264.7分泌一氧化氮(NO)具有强效抑制作用，对化学刺激引起的急性疼痛及中枢性疼痛均表现出显著的镇痛作用，而且没有明显的急性毒性，安全性高。因此，本发明提供的海蟑螂有机溶剂提取物具有开发为镇痛抗炎药物或具有镇痛抗炎功能的药物组合物、保健品或功能食品的潜力。
本发明所具有的优点:
1.本发明所提供的海蟑螂有机溶剂提取物具有显著的镇痛抗炎活性，无急性毒性，安全性高，LD50高于5000mg/Kg。
2.本发明提供的海蟑螂有机溶剂提取物通过现代药学研究可用于制备具有镇痛抗炎药物或药物组合物、保健品以或功能食品，具有良好的开发利用前景。
附图说明
图1.海蟑螂PE提取物的HPLC-DAD图谱(A)及PE急性毒性试验中ICR小鼠的体重变化
图2.海蟑螂提取物PE、EE及腺苷的HPLC对比图谱。
图3.海蟑螂提取物PE的减压柱层析馏分Fr.1～Fr.5的HPLC图谱。(A)Fr.1；(B)Fr.2；(C)Fr.3；(D)Fr.4；(E)Fr.5。
图4.海蟑螂提取物PE的减压柱层析馏分Fr.1～Fr.5的COX-2抑制活性。
具体实施方式
下面对本发明作进一步说明，并且本发明的保护范围不仅局限于以下实施例。
实施例1：
制备海蟑螂乙醇提取物：新鲜捕捉的海蟑螂先去除海草等杂质后称鲜重。室温条件下，按照质量体积比(w/v，g/mL)1:6.5向海蟑螂匀浆物中加入体积浓度85％乙醇浸泡提取24h。第一次提取完成后，用200目筛绢过滤，滤液在45℃条件下减压浓缩，去除提取溶剂，残渣重新按照质量体积比(w/v，g/mL)1:6.5加入体积浓度85％乙醇浸泡提取，每次浸泡24h，重复提取两次。然后，将三次滤液合并，合并后的滤液以旋转蒸发仪在45℃下减压浓缩，最终得黑色粘稠浸膏，即海蟑螂乙醇提取物(以下简称海蟑螂醇提物)。
实施例2：
取实施例1中的海蟑螂醇提物浸膏，室温下，加入质量体积比1:2(w/v，g/mL)的去离子水搅拌。室温下将以上混合物超声分散30min，使海蟑螂醇提物均匀分散在水相中。然后，将以上混合物转移至分液漏斗，分别向分液漏斗中加入与分散液等体积的石油醚、乙酸乙酯萃取，每个溶剂分别萃取2次，每次萃取2h。每次萃取完成后在室温下充分静置6h。然后，分别小心转移出石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物，合并相同萃取溶剂下的提取物，在40℃条件下减压浓缩去除石油醚或乙酸乙酯，即得到海蟑螂醇提物的石油醚萃取物(PE)、海蟑螂醇提物的乙酸乙酯萃取物(EE)。经石油醚、乙酸乙酯萃取后的残余水相，在45℃下减压浓缩重新得到海蟑螂提取物浸膏，然后，室温下分别向此浸膏中加入质量体积比(w/v，g/mL)1:3的甲醇、体积浓度95％乙醇、体积浓度50％乙醇搅拌提取三次，每次提取2h，每次提取完成后静置6h，转移并合并相同提取溶剂下的提取物，使用旋转蒸发仪在45℃条件下减压浓缩，干燥，即得海蟑螂醇提物的甲醇提取物(ME)，海蟑螂醇提物的体积浓度95％乙醇提取物(95E)，海蟑螂醇提物的体积浓度50％乙醇提取物(50E)。
对干燥后的不同海蟑螂提取物称重后发现，PE、EE、ME、95E、50E的质量分别为76.9g、9.0g、352.8g、22.2g、81.0g。因此，不同提取物占海蟑螂鲜重的比例分别为：1.17％、0.14％、5.39％、0.34％、1.22％。其中，中低极性成分(PE、EE)占鲜重的1.31％，占总提取物质量的15.85％。
海蟑螂水提物WE-1、WE-2的制备：取50g干燥海蟑螂，手动研磨粉碎后置于5L大烧杯中。向烧杯加入2L去离子水，在室温下搅拌提取4h。提取完成后以200目筛绢过滤，滤渣重复提取1次，合并两次滤液。滤液经4000rpm离心20min后，将滤液倾入置有截留分子量为160Da滤膜的实验室膜分离设备(上海朗极膜分离设备工程有限公司)中脱盐，收集滤液，然后，再将滤液加入到内置截留分子量为3500Da的滤膜的实验室膜分离设备中进行超滤浓缩2h，分别从废液口和出液口收集滤液。滤液分别使用旋转蒸发仪在45℃下减压浓缩至50ml左右，然后分别冷冻干燥，即获得海蟑螂室温水提物WE-1(<3500Da)和WE-2(>3500Da)。
实施例3：
取海蟑螂干燥个体50.0g，以小型粉碎机粉碎后过60-80目筛，得海蟑螂干燥粉末。然后，室温下向海蟑螂粉末中按照质量体积比1:30(w/v，g/mL)分别加入石油醚、乙酸乙酯、甲醇、体积浓度95％乙醇、体积浓度50％乙醇、去离子水各提取三次，每次提取2h。每次提取完成后，合并相同提取溶剂下的提取物，提取物以200目筛绢过滤，室温下滤液以3000rpm离心20min。然后，合并相同提取溶剂下的提取物，在45℃条件下利用旋转蒸发仪对各个提取物进行减压浓缩，分别得石油醚提取物(油状浸膏，0.4g)、乙酸乙酯提取物(油状浸膏，2.9g)、甲醇提取物(固体粉末，11.1g)，体积浓度95％乙醇提取物(固体粉末，0.3g)、体积浓度50％乙醇提取物(固体粉末，7.7g)、室温水提物(固体粉末，2.9g)。其中，中低极性成分(石油醚提取物、乙酸乙酯提取物)占海蟑螂干重的6.6％，占总提取物质量的13.04％。
实施例4：以实施例2中制备的海蟑螂有机溶剂提取物PE、EE、ME、95E、50E及水提物WE-1、WE-2进行抗炎活性筛选试验。具体如下，小鼠单核巨噬细胞RAW264.7购自中科院上海细胞库，DMEM培养基和胎牛血清购自BI公司。Griess Reagent、脂多糖LPS及对照药物L-NMMA购自Sigma公司。用含胎牛血清的DMEM培养基将巨噬细胞RAW264.7配成细胞混悬液，以每孔1×105个细胞/孔的密度接种至96孔板，细胞培养12h后，用终浓度LPS(终浓度，1μg/ml)进行诱导刺激，同时向培养基中加入待测化合物(终浓度，200μg/ml)处理，设置不含药物组和L-NMMA阳性药物组做对照，每孔设置3个重复。细胞过夜培养后，从每孔取出100μL上层培养基至新的96孔板中，不含药物组加100μL未经处理的培养基，向每孔加入100μLGriess试剂混匀后放置10min，然后在570nm处测定每孔的吸光值以检测一氧化氮(NO)的生成情况。在剩余培养基中加入MTS进行细胞存活率检测，排除化合物对细胞的毒性影响。
IC50值(50％concentration of inhibition)按照Reed&Muench法(L.J.Reed&H.Muench，A simple method of estimating fifty percent endpoints,AmericanJournal of Epidemiology,1938,27(3):493-497)计算。具体实验结果见下表。
表1不同海蟑螂提取物的NO生成抑制剂筛选试验结果
以上结果表明：样品PE在200μg/ml浓度有67.13±1.89％(n＝3)的抑制活性，高于阳性对照L-NMMA(50μM)，进一步测定其IC50为131.74±1.39μg/mL。样品EE在500μg/ml浓度下有明显细胞毒性，将其浓度降低至200μg/ml后无细胞毒性，但仍有很好的抑制活性。其它提取物(ME、95E、50E)水溶性较好，也有一定的抗炎作用，但与PE、EE比较活性较弱，说明海蟑螂极性较大成分抗炎活性较低。另外，表1也表明海蟑螂水提物WE-1、WE-2均没有抑制巨噬细胞产生NO的作用。通过本实施例，说明海蟑螂抗炎活性成分并非水提物，而是主要集中在有机溶剂提取物中，特别是中低极性成分(PE、EE)抗炎活性显著。
实施例5：采用小鼠醋酸扭体试验、热板试验研究海蟑螂有机溶剂提取物的镇痛活性。具体如下：
(1)醋酸扭体试验
使用醋酸扭体试验初步评价海蟑螂粗提物的镇痛作用，小鼠扭体试验采用ICR小鼠。室温(25℃)下将小鼠随机分为9组，每组8只。每组小鼠雌雄各半，体重22-25g。待试样品PE、ME、95E、50E、WE-1、WE-2以及阳性对照药物吲哚美辛均用0.5％羧甲基纤维素钠溶液配制成均一的悬浊液。ICR小鼠分组如下：(1)空白对照组，灌胃给药10mL/Kg的0.5％羧甲基纤维素钠溶液；(2)阳性对照组，灌胃给药20mg/Kg吲哚美辛；(3)海蟑螂提取物PE高剂量组，灌胃给药600mg/Kg海蟑螂提取物PE；(4)PE低剂量组，灌胃给药200mg/Kg海蟑螂提取物PE；(5)ME处理组，灌胃给药600mg/Kg ME；(6)95E处理组，灌胃给药600mg/Kg 95E；(7)50E处理组，灌胃给药600mg/Kg50E；(8)WE-1处理组，灌胃给药600mg/Kg WE-1；(9)WE-2处理组，灌胃给药600mg/Kg WE-2。每组小鼠的灌胃体积均为0.5mL。1小时后，给每组实验小鼠腹腔注射0.8％冰乙酸(v/v)，并立即计时，记录小鼠出现第一次扭体的时间(s)及在25min内的扭体次数。扭体行为学标准：腹部收缩，臀部抬起，身体拉长并伴有后肢伸张。出现以上行为记录扭体一次。
以醋酸扭体试验为模型初步评价海蟑螂不同提取物的镇痛活性,结果显示，空白对照组小鼠在测定时间内扭体次数为28.0±4.3(mean±S.E.M,n＝8)，而低剂量PE(200mg/Kg)灌胃组小鼠在测定时间内发生扭体10.0±1.9次(mean±S.E.M,n＝8)(P<0.001)，高剂量PE组扭体次数为8.8±2.0次(mean±S.E.M,n＝8)(P<0.001)。由此可见，海蟑螂PE样品可极显著减少小鼠扭体次数，其镇痛作用与阳性对照药物20mg/Kg吲哚美辛(9.9±2.0，mean±S.E.M，n＝8)相当。其它样品组ME、95E、50E、WE-1、WE-2中小鼠的扭体次数分别为35.29±2.83(mean±S.E.M,n＝7)、26.14±4.09(mean±S.E.M,n＝7)、21.25±1.94(mean±S.E.M,n＝8)、27.83±3.06(mean±S.E.M,n＝8)、30.83±1.09(mean±S.E.M,n＝8)，与空白对照相比均没有显著性差异，说明ME、95E、50E、WE-1、WE-2未在实验中表现出镇痛活性。这些结果也表明，海蟑螂提取物中起主要镇痛作用的成分来自有机溶剂提取物PE。
(2)热板试验
采用热板镇痛试验研究海蟑螂提取物PE对中枢性疼痛的镇痛作用。镇痛试验采用雌性ICR小鼠。热板镇痛试验采用智能热板仪，温度设定为55℃。首先采用智能热板仪挑选对热刺激反应时间在20s以内的ICR小鼠用于实验。小鼠随机分为4组，每组8-10只，体重22-25g。PE及曲马多均使用0.5％羧甲基纤维素钠溶液配制成均匀的混悬液。样品处理组中，海蟑螂提取物PE设高剂量组(600mg/Kg)、低剂量组(200mg/Kg)两组，每个样品的灌胃体积均为0.5mL。空白对照组灌胃10mL/Kg0.5％羧甲基纤维素钠溶液，阳性对照组灌胃20mg/Kg曲马多。灌胃给药后，分别于0min、30min、60min、120min、48h将小鼠至于热板仪上，记录小鼠出现疼痛反应的潜伏期(s)。所得结果如表2所示。
表2热板镇痛试验中海蟑螂PE提取物对小鼠疼痛潜伏期(s)的影响
Notes:Results were expressed as mean±S.E.M(n＝8-10).#p<0.01,***p,###p,§§§p<0.001were considered significantly different with their respectivecontrol group at 0h.
由表2所示的结果表明，海蟑螂PE提取物的镇痛作用具有明显的剂量依赖性，能够显著延长小鼠舔(咬)足时间，提高小鼠对疼痛反应的阈值，且高剂量PE(600mg/Kg)在灌胃给药2h后的镇痛作用优于曲马多(20mg/Kg)。这说明，海蟑螂提取物PE不仅对化学刺激引起的急性疼痛具有良好的镇痛作用，而且对中枢性疼痛也具有良好的镇痛作用。
实施例6：海蟑螂提取物PE的急性毒性试验
实验前ICR小鼠灌随机分为3组，每组10只，雌雄各半。每组小鼠称量体重后采用红、黑两色标记。海蟑螂提取物PE以0.5％羧甲基纤维素钠溶液配制成均匀的混悬液。将小鼠置于饲养笼中适应半小时后开始灌胃，PE高剂量组按照0.4mL/10g体重灌胃给药，中剂量和低剂量组按照0.2mL/10g体重灌胃给药，海蟑螂提取物PE灌胃给药的终剂量分别为800mg/Kg、2000mg/Kg、5000mg/Kg。灌胃后持续观察30min，然后1～4小时内每小时观察一次，以后每天观察一次，记录各组动物8天内体重变化、中毒表现、特点，毒性反应出现和消失的时间、死亡时间。
结果如图1所示。海蟑螂提取物PE成分十分复杂，含有多种不同紫外吸收峰(图1A)，但是海蟑螂样品PE分别以800、2000、5000mg/Kg剂量单次灌胃ICR小鼠(n＝10)，连续观察8d，在高、中、低三个剂量下各组实验动物均未出现死亡个体，小鼠行为正常，毛发光泽、无明显中毒迹象，且实验小鼠在观察期内体重逐渐增加(图1B)，这说明海蟑螂提取物PE的LD50高于5000mg/Kg，无明显急性毒性，具有较高的安全性。
实施例7：海蟑螂提取物PE、EE的HPLC分析
取少量海蟑螂提取物PE、EE、腺苷标准品以色谱级甲醇溶解，然后用0.22μm滤膜除去不溶性杂质后，取20μL进行高效液相分析。高效液相***为SHIMADZU Prominence，检测器为SPD-M20A阵列检测器。色谱分离条件如下：色谱柱，Waters-C18column(5μm，250mm×4.6mm，i.d.)；柱温，30℃；流速，1.0mL/min。流动相组成为甲醇(B相)-水(A相)，流动相的梯度变化为：0～5min，5％B；5～45min，5％～100％B；45～55min，100％B；55～60min，100％～5％B。
由图2可知，海蟑螂PE、EE样品组成十分复杂，含有多种化学成分，但是不含腺苷。
实施例8：本实施例以硅胶柱层析说明制备通过海蟑螂提取物PE制备高活性精制组分的方法。
拌样：取65g海蟑螂PE样品，以足量甲醇溶解。待样品溶解充分后加入60g硅胶(200-300目，青岛海洋化工有限公司)，搅拌，减压浓缩去除甲醇，蒸干后备用。
干法装柱：称取139.6g硅胶，装入玻璃减压柱(直接5.6cm)，轻轻拍打使硅胶上表面平整，并用隔膜真空泵反复将硅胶柱床压实。
干法上样：将用硅胶拌好的海蟑螂样品PE轻轻加入到硅胶柱床上层，轻轻拍打使样品层表面平整。为防止加洗脱溶剂时将样品层冲起，在样品层上面覆盖一个棉花垫，再加一层滤纸，并用玻璃塞压住。
展开：以石油醚-乙酸乙酯(1:0～0:1)，二氯甲烷-甲醇(10:1～1:2)两种溶剂体系对样品进行梯度洗脱，每个梯度用溶剂1.0～3.0升。收集馏分后，45℃减压浓缩后获得12个亚馏分。按照实施例7中的方法对每个馏分进行HPLC分析，合并相似组分后得到5个馏分(图3A-E)，即Fr.1～Fr.5。
按照实施例4中的方法对Fr.1～Fr.5五个样品进行抗炎活性测定。结果见表3。结果表明，Fr.1-3在250μg/ml时对巨噬细胞表现出细胞毒性，但降低浓度后Fr.1-3均未表现出细胞毒作用。可以看出，Fr.3在62.5μg/ml对NO的抑制率为69.84±1.92(n＝3)，高于Fr.1(125μg/ml)、Fr.2(125μg/ml)的抗炎作用，而且远高于Fr.4、Fr.5的抗炎活性。由于Fr.1～Fr.3主要为石油醚-乙酸乙酯洗脱的中低极性馏分，而Fr.4、Fr.5为二氯甲烷-甲醇-水(5:1:0～0:0:1)洗脱的较高极性馏分。这也说明，在具有显著镇痛、抗炎作用的海蟑螂提取物PE中有效成分主要为石油醚-乙酸乙酯洗脱的中低极性成分(图3A-C)。
表3海蟑螂PE减压柱层析样品的NO生成抑制率
实施例9.海蟑螂提取物及其柱层析馏分对环氧化酶COX-2的抑制率测定。
环氧化酶-2(COX-2)抑制剂筛选试验按照环氧化酶-2(COX-2)抑制剂筛选试剂盒(S0618，碧云天)中说明书上的方法测定。该试剂盒采用荧光检测方法，简单、快速、灵敏。检测原理为，在辅助因子(Cofactor)存在的情况下，COX-2将花生四烯酸等底物环氧化生成PGG2等中间产物，继而COX-2使用其过氧化物酶活性把PGG2等中间产物催化生成PGH2等最终产物。同时，把没有荧光的COX-2探针(Probe)催化生成有强荧光的探针(Ex560/Em590)。这样通过荧光检测就可以非常灵敏地检测COX-2的酶活性。如果在反应中加入COX-2抑制剂，荧光的生成就会被抑制，荧光强度与抑制剂的抑制效果成反比，这样就可以检测出抑制剂的抑制效果。
具体检测方法参照试剂盒说明书。海蟑螂乙醇提取物的石油醚提取物(PE，5.2mg/mL)、海蟑螂乙醇提取物的乙酸乙酯提取物(EE，5.3mg/mL)及PE的VLC馏分Fr.1(5.6mg/mL)、Fr.2(5.2mg/mL)Fr.3(5.8mg/mL)、Fr.4(5.2mg/mL)、Fr.5(5.6mg/mL)溶于DMSO中，按照试剂盒说明书中的方法依次加入各种试剂和5μL样品、阳性对照塞来昔布(1000nM)，在37℃孵育10min后测定反应体系的荧光强度(激发波长为560nm，发射波长为590nm)。试验重复测定两次，计算平均抑制率。抑制率的计算方式如下：
抑制率(％)＝(RFU100％酶活性对照-RFU样品)/(RFU100％酶活性对照-RFU空白对照)×100％。
结果表明，EE在0.26mg/mL浓度下对COX-2的平均抑制率为92.0％；PE及其分离馏分Fr.1-5对COX-2的平均抑制率如图4所示，其中Fr.1(终浓度，0.28mg/mL)、Fr.2(终浓度，0.26mg/mL)Fr.3(终浓度，0.29mg/mL)的抑制率分别为92.3％、83.5％，90.0％，而Fr.5对COX-2的抑制作用较弱。阳性对照塞来昔布(Celecoxib，终浓度50nM)的抑制率为72.9％。
因此，本实施例结合实施例4、实施例5、实施例8以及实施例9说明海蟑螂有机溶剂提取的中低极性成分具有重要的抗炎镇痛作用。按照本专利提供的方法制备的海蟑螂有机溶剂提取物及其分级、分离组分在制备镇痛抗炎药物、或镇痛抗炎药物组合物、或具有镇痛抗炎功能的保健品、或具有镇痛抗炎功能的功能食品中的应用均在本专利保护的范围内。
Claims (9)
1.海蟑螂有机溶剂提取物在制备镇痛抗炎药物或镇痛抗炎药物组合物中的应用，其特征在于，
所述海蟑螂有机溶剂提取物按照如下方法制备：
以新鲜海蟑螂和/或干燥海蟑螂为原料，海蟑螂粉碎后在温度15-55℃下，以60%~95%乙醇进行浸泡或搅拌提取1-4次，过滤，合并乙醇提取液，减压浓缩得粗提物浸膏；浸膏以1-3倍，质量比，w/w蒸馏水分散后，分别向浸膏中加入与分散液等体积的提取剂萃取1-3次，转移有机相，经减压浓缩、干燥，即得海蟑螂提取物，所述提取剂为乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷、氯仿、丙酮中的一种或二种以上混合物；
其中海蟑螂乙酸乙酯提取物的浓度为200μg/ml。
2.海蟑螂有机溶剂提取物在制备抑制环氧化酶-2（COX-2）的药物中的应用，所述海蟑螂有机溶剂提取物的制备如权利要求1所述。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述海蟑螂为海蟑螂科海蟑螂属海蟑螂Ligia spp.的干燥全体和/或新鲜个体，包括奇异海蟑螂Ligia exotica Roux、灰色海蟑螂Ligia cinerascens、西方海蟑螂Ligia occidentalis Dana中的一种或二种以上。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述提取剂为乙酸乙酯和/或石油醚。
5.按权利要求1或2所述的应用，其特征在于：以所述海蟑螂有机提取物为活性成分，与药学或食品上可接受的辅料或辅助添加剂成分混合后，按照常规制剂方法，可以用来制备具有镇痛和/或抗炎作用的药物。
6.按照权利要求1所述的应用，其特征在于：所述镇痛和/或抗炎应用的具体适应症状或疾病包括腰肌损伤、腰椎痛、颈椎痛、关节炎、风湿、癌症痛、术后痛、糖尿病性疼痛以及其它原因引起的急性或慢性疼痛中的一种或二种以上。
7.按照权利要求1、2或5所述的应用，其特征在于：所述含有海蟑螂有机溶剂提取物，或海蟑螂有机溶剂提取物与其它具有镇痛抗炎作用的西药和/或中药活性成分配伍组成的镇痛抗炎药物或药物组合物，按照常规制剂技术制备成口服制剂或注射剂。
8.按照权利要求1、2或5所述的应用，其特征在于：所述含有海蟑螂有机溶剂提取物，或海蟑螂有机溶剂提取物与其它具有镇痛抗炎作用的西药和/或中药活性成分配伍组成的镇痛抗炎药物或药物组合物，按照常规制剂技术制备成局部给药制剂。
9.一种镇痛和/或抗炎药物组合物，其特征在于：其以权利要求1所述的海蟑螂有机溶剂提取物为活性成分，与药学或食品上可接受的辅料或辅助添加剂成分混合后获得。
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