CN111440817A - 一种浮萍表达凡纳滨对虾抗菌肽vps载体的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种浮萍表达凡纳滨对虾抗菌肽VPS载体的构建方法，本方法以虾RNA为材料，通过反转录获得cDNA作为模板，设计Penaeidin3a.1基因特异性引物，经过PCR、酶切，将产物与烟草花叶病毒35S启动子和NOS终止子之间相连接，最终经过双酶切，构建到植物双元表达载体1301上。通过PCR鉴定、双酶切鉴定和基因测序，最终确定完成浮萍表达凡纳滨对虾抗菌肽VPS载体的构建。本项发明中构建方法具有简单、便捷、易操作、保存1301载体原有GUS基因易于进行筛选等特点，可应用于浮萍表达抗菌肽应用研究，是浮萍作为生产抗菌肽蛋白不可或缺的关键操作。
Description
本发明得到国家重点研发计划资助(2018YFD0901301)，国家自然科学基金青年项目(31700443)，天津市水产产业技术体系创新团队(ITTFRS2017007)的资助。
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种浮萍表达凡纳滨对虾抗菌肽VPS载体的构建方法。
背景技术
在水产养殖业中，抗生素的大量使用造成了食物和水源的双重危害，且出现了相应的抗药性治病菌，目前已成为水产养殖业的一大问题。抗菌肽具有广谱抗菌性，并对部分病毒、寄生虫和癌细胞等均具有抗性，同时可提高免疫力和伤口愈合，是取代常规抗生素、解决致病菌抗药性问题的极佳选择。因此，将抗菌肽替代抗生素应用于生产实践越来越受到科学工作者和水产养殖业的重视。获得植物表达抗菌肽载体，可应用于利用浮萍生产抗菌肽的生产实际中，是利用浮萍作为植物反应器生产抗菌肽分析不可或缺的关键操作。
发明内容
本发明涉及一种浮萍表达凡纳滨对虾抗菌肽VPS载体的构建方法。
本发明的目的构建浮萍表达凡纳滨对虾抗菌肽VPS的载体，提供一种载体构建方法，特异性引物设计方案及其相关限制性内切酶的选择。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种浮萍表达凡纳滨对虾抗菌肽VPS载体的构建方法的具体步骤如下所述：
1)凡纳滨对虾cDNA的获得：取凡纳滨对虾组织进行研磨，提取RNA，反转录为cDNA。
2)T-VPS的构建：利用VPS特异性引物，以凡纳滨对虾cDNA为模板，通过PCR技术获得带有特定酶切位点的抗菌肽基因，并将其连接到T-载体上，所述T-载体采用pMD19-T质粒，所述VPS特异性引物如下所述：
VPS上游引物：GAAGATCTTC ATGCGCCTCG TGGTCTGC，其中在5’末端加上了BglⅡ酶的酶切位点及保护碱基：GAAGATCTTC；
VPS下游引物：AACTGCAG TCAACCGGA ATATCCTTTC，其中在5’末端加上了Pst I酶的酶切位点及保护碱基：AACTGCAG。
3)启动子-VPS-终止子中间载体的构建：对启动子-cTP-终止子中间载体和T-Pen3同时进行双酶切，所采用的限制性内切酶为BglⅡ和Pst I，产物利用T4连接酶进行连接。
4)最终载体的构建：对启动子-VPS-终止子中间载体和pCAMBIA 1301载体同时进行双酶切，所采用的限制性内切酶为Sac I和EcoR I，对产物利用T4连接酶进行连接，经过PCR鉴定、双酶切鉴定和基因测序并比对结果为100％正确后，最终获得植物表达凡纳滨对虾VPS的载体。
本发明的优点和有益效果为：本发明首创了浮萍表达抗菌肽载体的构建，利用该技术可在短时间获得产抗菌肽浮萍，国际上相继成立了多个浮萍生物反应器公司，但利用浮萍生产对虾抗菌肽的研究鲜有报道，其关键技术尚待突破。本发明通过对浮萍生产抗菌肽的关键技术进行探索，拟建立有效的对虾抗菌肽表达体系，具有重要的应用价值，对抗菌肽在产业中的应用具有推进作用，是浮萍合成生物学分析不可或缺的关键操作。
附图说明
图1为本发明载体构建技术路线图。
图2为实施例的步骤3中VPS基因的PCR凝胶电泳图。
图3为实施例的步骤3中pMD19-T-VPS载体验证结果凝胶电泳图，其中a为菌落PCR结果，b为酶切验证结果。
图4为实施例的步骤3中pMD19-T-VPS的序列比对结果图。
图5为实施例的步骤4中PSK-sgat质粒的凝胶电泳图。
图6为实施例的步骤4中PSK-sgat质粒的酶切验证凝胶电泳图。
图7为实施例的步骤4中PSK-VPS载体验证结果凝胶电泳图，其中a为菌落PCR结果，b为质粒验证结果，c为质粒验证结果，d为酶切验证结果。
图8为实施例的步骤4中PSK-VPS的序列比对结果图。
图9为实施例的步骤5中pCAMBIA 1301质粒的凝胶电泳图。
图10为实施例的步骤5中pCAMBIA 1301质粒的酶切验证凝胶电泳图。
图11为实施例的步骤5中pCAMBIA 1301-VPS载体验证结果凝胶电泳图，其中a为pCAMBIA 1301质粒，b为酶切验证结果，c为pCAMBIA 1301-Pen3的PCR产物验证结果。
对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
下述技术方案中，载体pMD19-T、PSK和pCAMBIA的来源分别保存于天津师范大学动植物抗性重点实验室
一种浮萍表达凡纳滨对虾抗菌肽VPS载体的构建方法，其步骤如下所述：
步骤1：查询得到抗菌肽Penaeidin 3a.1的基因序列
在GenBank上查询获得Penaeidin 3a.1基因序列，GenBank号为AAK73084.1，该基因全长为249bp，序列如下所述(见序列表SEQ NO.1)：
ATGCGCCTCGTGGTCTGCCTGGTCTTCTTGGCCTCCTTCGCCCTGGTCTGCCAAGGCCAAGTGTACAAGGGCGGTTACACGCGCCCGATACCCAGGCCACCACCCTTCGTGAGACCTTTGCCAGGAGGGCCTATTGGTCCATACAACGGTTGCCCTGTCTCATGCCGGGGAATTTCCTTCTCACAAGCGCGTTCTTGCTGCTCCCGGTTAGGGCGTTGCTGTCACGTGGGAAAGGGATATTCCGGTTGA
步骤2：引物设计
依据步骤1中查询得到的Penaeidin 3a.1序列设计得到用于扩增Penaeidin 3a.1基因(下文中缩写为VPS)的引物并根据pMD19-T质粒载体信息，在引物上添加两种限制性内切酶Bgl II、Pst I的酶切位点及保护碱基，得到的上下游扩增引物如下所述：
VPS上游引物：5’-GAAGATCTTCATGCGCCTCGTGGTCTGC-3’(见序列表SEQ NO.2)
其在5’末端添加有BglⅡ酶的酶切位点及保护碱基：GAAGATCTTC；
VPS下游引物：5’-AACTGCAGTCAACCGGA ATATCCTTTC-3’(见序列表SEQ NO.3)
在5’末端添加有Pst I酶的酶切位点及保护碱基：AACTGCAG。
步骤3：pMD19-T-VPS的构建
取凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)组织进行研磨，提取RNA，反转录为cDNA，利用步骤2中得到VPS特异性上下游引物，以凡纳滨对虾cDNA为模板，通过PCR技术获得带有特定酶切位点的VPS基因，并将其连接到pMD19-T上得到pMD19-T-VPS。
1)提取RNA
具体步骤和反应条件为：RNA提取参考TRNzol说明书(北京天根公司)方法进行，提取试剂由DEPC处理水配制，玻璃及金属器皿在180℃烘干6小时，枪头和离心管等耗材经121℃高温灭菌50分钟。
a)取小于100mg对虾组织，液氮迅速研磨，立即加入1ml提取TRNZol试剂裂解液，研磨并转入离心管。
b)室温放置5min(匀浆样品需在15-30℃放置5min)，注意平放离心管，使表面积最大。
c)4℃12000g离心10min，上清(约1ml)移入新管(冰上操作，抑制RNA酶活性。该步为可选步骤，由于拟南芥杂质较少，一般可省去，防止RNA因操作形成的降解)。
d)加入0.2ml氯仿(去蛋白)，剧烈震荡15s，室温放置3分钟。
e)4℃12000g离心10-15min取上层水相(约600μl)转入新的管中(若共提取富含淀粉或多酚，可重复4、5步骤)。
f)加入等体积(约600μl)的异丙醇混匀，室温放置20min。
g)4℃12000g离心10min弃上清，75％乙醇沉淀，风干(切勿用吹风机)。
h)DEPC处理水(42.5μl)溶解沉淀。
i)除去DNA：50μl体系，10×DNase buffer 5μl、DNase(Rnase free)2μl、Rnase抑制剂0.5μl、42.5μl RNA。37℃水浴30min。
j)将50μl体系扩至400μl，加入200μl水饱和酚和200μl氯仿/异戊醇。12000g，离心10min。
k)去上清，加入无水乙醇1ml，NaAC 40μl。-20℃放置2h。
l)反转录：20μl体系，10×RT Buffer 2μl，dNTP(2.5mM)4μl，Digo-dt(10μm)2μl，Rnase inhibitor 1μl，MM-Lv-RTase反转录酶1μl，DEPC处理水8μl。
2)反转录cDNA
a)RT-PCR步骤如下：
b)A.2μg RNA+Digo-dt(10μm)1.5μl+无Rnase H2O up to 16.5μl；
c)B.65℃，5min，4℃，冰浴5min；
d)C.5×RTbuffer 5μl+10mM dNTP 2μl+Rnase inhibitor(HPR)0.5μl。
e)D.混匀，37℃，10min，冰浴5min。
f)E.MM-Lv-RTase 1μl。
g)F.42℃1h，95℃5min，冰浴3min。取1～2μl用于PCR.
3)VPS基因的特异性扩增
对目的基因VPS的扩增，得到的凝胶电泳图如图2所示，条带大小为246bp。
4)pMD19-T-VPS载体构建
酶切反应参考宝生物公司限制性内切酶说明书进行。双酶切体系共用Buffer参考说明书进行。每单位(U)的酶量所消化的DNA量小于其最大值。37℃反应2～3h或过夜。在20μl反应体系中，加入2μg质粒，限制性内切酶1～2μl(约5U)，其相应10×Buffer 2μl，dd水将总体积补至20μl。
5)pMD19-T-VPS载体的验证
a)菌落PCR验证
对携带有pMD19-T-VPS载体的大肠杆菌进行菌落PCR，菌落PCR反应的体系为20μl，其各成分配比如下：
菌落PCR的凝胶电泳图如图3所示，其中1-4为pMD19-T-Pen3菌落PCR产物，负为负对照，条带大小为246bp。
b)BglⅡ和Pst I的双酶切验证
对pMD19-T-VPS载体进行BglⅡ和Pst I的双酶切验证，
反应体系为在20μl反应体系中，加入2μg质粒，限制性内切酶1～2μl(约5U)，其相应10×Buffer 2μl，dd水将总体积补至20μl。
双酶切产物的凝胶电泳图如图4所示，1-4为酶切产物，其中载体、目的基因的条带大小分别为246bp。
c)测序验证
对VPS基因进行测序并与步骤1中从GenBank上查询获得的VPS基因序列利用blast进行序列比对，结果显示序列完全一致。
根据上述a)、b)和c)步骤的结果，证实克隆载体pMD19-T-VPS构建成功。
步骤4：PSK-VPS载体的构建
1)PSK载体的回收
a)PSK-sgat质粒提取，质粒凝胶电泳图如图5所示，质粒大小符合预期。
质粒提取方法如下：
用灭菌牙签或枪头挑取单菌落置于5ml含相应抗生素的LB培养基中，37℃振荡培养12～16h；
4℃，12000×rpm离心30s离心弃上清收集菌体，多次离心，将菌体一并收集入离心管中；
用100μl预冷的溶液Ⅰ重悬菌体，剧烈震荡，充分重悬菌体(提取土壤农杆菌质粒时，该溶液中加入4mg/ml溶菌酶)；
溶液I：50mM葡萄糖，25mM Tris-Cl(pH 8.0)，10mM的EDTA(pH 8.0)
加入200μl溶液Ⅱ(现用现配)，轻柔颠倒混匀，将离心管放置于冰上1～5min；
溶液Ⅱ：1％SDS，0.2mol/LNaOH
加入150μl预冷的溶液Ⅲ，上下颠倒混匀，温和振荡10s，冰浴5～10min；
溶液Ⅲ：5mol/L乙酸钾，冰乙酸，水溶液对钾为3mol/L，对乙酸根为5mol/L；
4℃，12000g，离心5min，收集上清至另一离心管中；
加入等体积的酚/氯仿(约400μl)，振荡混匀；
4℃，12000g，离心10min，将上清转移到另一离心管中；
加入1ml无水乙醇，40μl 3M NaAC，轻轻混匀，-20℃沉淀1h以上；
4℃，12000g，离心10min；
除去上清液，5000g离心30s，用枪头再次吸取上清将其除尽；
用0.5ml 75％乙醇洗涤DNA沉淀，4℃，12000g，离心5min；
吸干上清，风干DNA，溶于20μl dd水中。
BglⅡ和Pst I双酶切，酶切产物凝胶电泳图如图6所示，条带大小为，符合预期。
酶切反应体系如上所示。
2)VPS基因片段的回收
3)PSK载体与VPS基因片段的连接转化
连接反应参照北京全试金公司T4连接酶的说明书进行，目的片段和载体的摩尔比为3:1～10:1，连接反应体系如下：
加入各成分后，轻轻混匀，于25℃连接10min，或16℃过夜。
将连接产物导入大肠杆菌中。
4)PSK-VPS载体的验证
a)菌落PCR验证，如图7a所示。
b)质粒验证，如图7b所示。
c)双酶切验证，酶切位点是Bgl II和Pst I，条带大小为246bp。如图7c所示。
d)双酶切验证，酶切位点是Sac I和EcoR I，条带大小为2900bp。如图7d所示。
e)测序验证
将PSK-Pen3载体送去测序，并与与步骤1中从GenBank上查询获得的VPS基因序列利用blast进行序列比对，结果显示序列完全一致。
根据上述a)、b)、c)、d)和e)步骤的结果，证实克隆载体PSK-VPS构建成功。
步骤5：pCAMBIA 1301-VPS载体的构建
1)pCAMBIA 1301质粒的提取。
pCAMBIA 1301质粒和双酶切验证，如图9及图10所示。
2)pCAMBIA 1301载体的回收，将上述1)中pCAMBIA 1301质粒利用Sac I和EcoR I双酶切得到pCAMBIA 1301载体。
3)Pen3片段回收，将PSK-Pen3质粒利用Sac I和EcoR I双酶切得到Pen3片段。
4)pCAMBIA 1301载体与Pen3片段的连接
5)pCAMBIA 1301-Pen3载体的验证
a)质粒验证，如图11a所示。
b)酶切验证，酶切采用Sac I和EcoR I，条带大小为2900bp，符合预期，如图11b所示。
c)酶切验证，酶切采用Bgl II和Pst I，条带大小为246bp，符合预期，如图11c所示。
d)测序验证，将pCAMBIA 1301-VPS载体送去测序，并与与步骤1中从GenBank上查询获得的Penaeidin 3a.1基因序列利用XX进行序列比对，结果显示序列完全一致。
根据上述a)、b)和c)步骤的结果，证实pCAMBIA 1301-VPS载体构建成功。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津师范大学
<120> 一种浮萍表达凡纳滨对虾抗菌肽VPS载体的构建方法
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 249
<212> DNA
<213> 凡纳滨对虾
<400> 1
atgcgcctcg tggtctgcct ggtcttcttg gcctccttcg ccctggtctg ccaaggccaa 60
gtgtacaagg gcggttacac gcgcccgata cccaggccac cacccttcgt gagacctttg 120
ccaggagggc ctattggtcc atacaacggt tgccctgtct catgccgggg aatttccttc 180
tcacaagcgc gttcttgctg ctcccggtta gggcgttgct gtcacgtggg aaagggatat 240
tccggttga 249
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gaagatcttc atgcgcctcg tggtctgc 28
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
aactgcagtc aaccggaata tcctttc 27
Claims (4)
1.一种浮萍表达凡纳滨对虾抗菌肽VPS载体的构建方法，其特征在于按照下列步骤进行：
1)取凡纳滨对虾组织进行研磨，提取RNA，反转录为cDNA；
2)利用VPS特异性引物，以凡纳滨对虾cDNA为模板，通过PCR技术获得带有特定酶切位点的抗菌肽基因，并将其连接到T-载体上；
3)启动子-VPS-终止子中间载体的构建：对启动子-cTP-终止子中间载体和T-Pen3同时进行双酶切，所采用的限制性内切酶为BglⅡ和Pst I，产物利用T4连接酶进行连接；
4)最终载体的构建：对启动子-VPS-终止子中间载体和pCAMBIA 1301载体同时进行双酶切，所采用的限制性内切酶为Sac I和EcoR I，对产物利用T4连接酶进行连接获得植物表达凡纳滨对虾VPS的载体。
2.根据权利要求1所述的一种浮萍表达凡纳滨对虾抗菌肽VPS载体的构建方法，其特征在于：在步骤1)中，所述VPS特异性引物如下所述：
VPS上游引物如序列表SEQ NO.2所述，其中在5’末端加上了BglⅡ酶的酶切位点及保护碱基：GAAGATCTTC；
VPS下游引物如序列表SEQ NO.3所述，其中在5’末端加上了Pst I酶的酶切位点及保护碱基：AACTGCAG。
3.根据权利要求1所述的一种浮萍表达凡纳滨对虾抗菌肽VPS载体的构建方法，其特征在于：在步骤1)中，所述T-载体为pMD19-T质粒。
4.根据权利要求1所述的一种浮萍表达凡纳滨对虾抗菌肽VPS载体的构建方法，其特征在于：在步骤2)中，所述中间载体为PSK质粒。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN112048519A (zh) * | 2020-09-11 | 2020-12-08 | 青萍湾（武汉）生物科技有限公司 | 利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法及应用 |
| CN113667691A (zh) * | 2021-08-20 | 2021-11-19 | 天津师范大学 | 一种神经递质γ-氨基丁酸荧光探针iGABASnFR的浮萍表达载体及其构建方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040261148A1 (en) * | 2000-07-31 | 2004-12-23 | Biolex, Inc. | Expression of biologically active polypeptides in duckweed |
| CN101603051A (zh) * | 2009-05-20 | 2009-12-16 | 湖北汇特生物医药技术有限公司 | 利用浮萍lemna minor生产用于治疗感染的抗菌肽 |
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2019
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20040261148A1 (en) * | 2000-07-31 | 2004-12-23 | Biolex, Inc. | Expression of biologically active polypeptides in duckweed |
| CN101603051A (zh) * | 2009-05-20 | 2009-12-16 | 湖北汇特生物医药技术有限公司 | 利用浮萍lemna minor生产用于治疗感染的抗菌肽 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ZHI-QIANG DU ET AL: "Molecular Characterization and Antibacterial Activity Analysis of Two Novel Penaeidin Isoforms from Pacific White Shrimp, Litopenaeus vannamei", 《APPL BIOCHEM BIOTECHNOL》 * |
| 钟鸣等: "基于农杆菌介导法的植物转基因载体的改造", 《华北农学报》 * |
| 高安健等: "斑节对虾抗菌肽Penaeidin基因的克隆及其序列分析", 《热带医学杂志》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112048519A (zh) * | 2020-09-11 | 2020-12-08 | 青萍湾（武汉）生物科技有限公司 | 利用小浮萍作生物反应器表达鱼类抗弧菌病口服疫苗的方法及应用 |
| CN113667691A (zh) * | 2021-08-20 | 2021-11-19 | 天津师范大学 | 一种神经递质γ-氨基丁酸荧光探针iGABASnFR的浮萍表达载体及其构建方法 |
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