CN111436549A - 一种增强小龙虾抗氧化应激能力的发酵饲料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种增强小龙虾抗氧化应激能力的发酵饲料及其制备方法，发酵饲料中加入抗氧化青绿饲料组分，其含有发酵桑叶粉、至少一种茎叶类植物、至少一种浆果类植物；通过诱食剂、复合添加剂、粘合剂和混合发酵菌液混合搅拌，经恒温短时发酵后造粒，获得饲料成品。该饲料的原料廉价易得，制作简便，大大降低了生产成本；其组分保证小龙的各项营养指标，显著提高了小龙虾的免疫力和肝功能，且发酵后的蛋白成分更易于析出，便于小龙虾消化吸收，有利于肠道健康，能够促进小龙虾的快速生长。

Description

一种增强小龙虾抗氧化应激能力的发酵饲料及其制备方法
技术领域
本发明涉及水产配合饲料领域，具体地说涉及一种增强小龙虾抗氧化应激能力的发酵饲料制备方法。
背景技术
小龙虾是杂食性动物，既吃青绿草料，又吃谷物和动物饲料。每年从5月开始，小龙虾极易出现大量死亡，俗称五月瘟。五月瘟其实是一种综合症状引起的，5月温度升高以后，水体中藻类、底质、菌群以及各种理化性质都会发生较大变化，一旦小龙虾应激后停止摄食，在体质下降的情况下，就给细菌入侵和疾病的暴发创造了条件。同时，为了使小龙虾生长速度加快，长期投喂高蛋白饲料，也会对小龙虾肝脏代谢造成负担，致使小龙虾食欲减退，活力变差，严重时肝脏积水糜烂，整体体质偏弱，极易发病。氧自由基 (ROS) 是机体代谢过程中排出外源物质和抗应激反应时的产物，包括超氧离子自由基、羟自由基和过氧化氢。当机体内的抗氧化酶***不能及时清除过量的 ROS，就会造成氧化损伤。肝胰腺作为甲壳动物氧化代谢的主要场所，抗氧化酶的水平较高，也是产生大量 ROS 的器官。抗氧化应激能力对小龙虾养殖非常重要，急需一种营养丰富又能增强抗氧化应激的饲料以满足提高小龙虾生产量的需求。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种保证小龙虾提高产量的同时，用于增强小龙虾抗氧化应激能力并促进营养物质消化吸收的饲料；本发明还有一个目的是提供前述饲料的制备方法。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明的一种增强小龙虾抗氧化应激能力的发酵饲料，按质量份数计包括：
抗氧化青绿饲料 35-45份，
玉米 18-23份，
膨化豆粕 40-50份，
膨化肉骨粉 8-11份，
麸皮粉 10-15份，
诱食剂 1-2份，
复合添加剂 1-3份，
黏合剂 5-10份，
混合发酵菌液 15-20份；
其中，所述抗氧化青绿饲料中至少包括30 wt%的发酵桑叶粉。
上述的玉米、豆粕、肉骨粉和麸皮为能量饲料组分；豆粕和肉骨粉作为蛋白质和能量饲料组分提供必需氨基酸，采用膨化工艺最大程度释放出了可消化物质，钝化了蛋白酶抑制剂，提高营养物质利用率，且高温消毒减少了病害发生，另一方面是考虑到水产投食特性，膨化饲料在水中的稳定性较好，减少营养成分在水中的溶解及沉淀损失；为了保证营养代谢，还需要添加复合添加剂提供必要的维生素和矿物质。需要说明的是，本发明通过在饲料中加入新鲜的抗氧化青绿饲料，使其富含抗氧化活性成分黄酮类和多酚类物质，有利于及时清除小龙虾体内产生的氧自由基，减少过氧化反应，保护了小龙虾的肝脏健康；混合发酵菌液的添加，有利于肠道健康，减少肠炎的发病率，并能促进对营养物质的消化吸收，提高产量。
本发明所述膨化豆粕为豆粕粉碎后短时高温膨化加工获得；所述膨化肉骨粉为肉骨粉经热喷膨化加工获得；所述麸皮粉为小麦面粉加工副产物粉碎获得，平均粒径≤55.23μm。
所述的诱食剂是为了吸引小龙虾增加采食量，包括但不限于大蒜素、谷氨酸、甜菜碱、田螺粉、鱼粉、鱼油的任意一种或多种的组合，优选采用对小龙虾有增强免疫力作用的大蒜素。
所述的复合添加剂包括配合饲料中常用的微量元素和维生素。其中，矿物质包括但不限于Mn、Se、Cu、Fe、I、Zn、Co、F、Cd、Cr、Mo的任意一种或多种的组合；维生素包括但不限于维生素A、维生素B1、维生素B2、泛酸、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D2、维生素E、维生素D3、维生素K3、叶酸的任意一种或多种的组合；前述的微量元素和维生素一般以易消化的能量饲料作为载体，本发明选用小麦粉。
所述黏合剂包括带壳生鸡蛋以及至少一种黏性粉体，所述黏性粉体选自玉米淀粉、糯米粉、高筋面粉、土豆粉的任意一种或多种的组合。选用带壳生鸡蛋，一是利用蛋清的黏合性，二是利用蛋壳为小龙虾提供钙源，三是利用蛋黄的营养成分。
所述混合发酵菌液包括乳酸菌、枯草芽孢杆菌、日本根霉菌、酵母菌、沼泽红假单孢菌的任意一种或多种的组合。
进一步地，所述抗氧化青绿饲料至少包括40 wt%的发酵桑叶粉、至少一种茎叶类植物、以及至少一种浆果类植物；所述茎叶类植物选自包括但不限于红薯藤、南瓜藤、银杏叶的任意一种或多种的组合，所述浆果类植物选自包括但不限于西红柿、葡萄渣、柑橘渣任意一种或多种的组合。优选采用发酵桑叶粉、红薯藤、西红柿的组合方式。
作为本发明的优选实施案例，所述抗氧化青绿饲料按质量百分比包括40% - 55%发酵桑叶粉，35% - 50%红薯藤，5% - 20%西红柿。
所述发酵桑叶粉是将新鲜桑叶与解淀粉芽孢杆菌混合后，常温密封发酵1-3天，然后烘干粉碎获得。相对于水产发酵饲料常添加的乳酸菌，解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的添加有利于提高桑叶发酵后总氮和总磷溶出量和蛋白含量，对小龙虾生长发育，尤其是蜕皮脱壳起到重要作用。
优选地，每100g新鲜桑叶中加入解淀粉芽孢杆菌10ml，解淀粉芽孢杆菌的菌液浓度为106-108CFU/mL。更候选地，以每100g新鲜桑叶中加入10ml的107CFU/mL解淀粉芽孢杆菌菌液为宜。
如前述增强小龙虾抗氧化应激能力的发酵饲料的制备方法，包括如下步骤：
（1）将新鲜桑叶切碎，向桑叶中加入解淀粉芽孢杆菌，混合均匀，装入发酵桶压实，加盖密封后常温发酵1-3天，取出后烘干粉碎，获得发酵桑叶粉备用；
（2）将发酵桑叶粉、红薯藤、西红柿混合搅拌均匀，获得一次料；
（3）将带壳生鸡蛋打碎，与黏性粉体混合搅拌均匀，获得二次料；
（4）将所述的一次料、二次料、玉米、膨化豆粕、膨化肉骨粉、麸皮粉、诱食剂、复合添加剂和混合发酵菌液混合、搅拌，经恒温短时发酵后取出，造粒，烘干。
所述恒温短时发酵是在35-40℃恒温发酵箱内发酵3-4h。恒温短时发酵有利于控制发酵的程度，使饲料既便于消化，又不让微生物过度繁殖消耗饲料的营养成分，最大限度地保存饲料的营养价值。
利用前述方法制备获得的发酵饲料，每百克至少含有多酚0.35g以及黄酮1.5g，远高于目前市售的常规水产饲料；该饲料配方营养均衡，饲喂小龙虾，投料一个月后的平均体增重最高可达11.29±0.42g/只，成活率不低于95%。
有益效果：本发明利用发酵桑叶粉、红薯藤和西红柿等作为抗氧化青绿饲料，玉米和麸皮作为谷物饲料，豆粕和肉骨粉作为蛋白饲料，玉米淀粉、糯米粉和蛋清等作为黏合剂的主要成分，蛋壳作为钙源，营养搭配合理，且原料廉价易得。发酵工艺处理的抗氧化青绿饲料，显著提高了饲料中黄酮和多酚类化合物的含量；进而提高了小龙虾的总抗氧化能力，降低其因氧化应激造成的肝胰腺细胞损伤，有效提高小龙虾的成活率和体增重。其中，选用解淀粉芽孢杆菌配合其发酵工艺，可进一步提高饲料中总氮、总磷和蛋白质含量，使发酵后的饲料蛋白成分更容易被消化吸收，降低致病菌的感染风险，有利于肠道健康，提高产量。
附图说明
图1是试验例1的没食子酸标准曲线；
图2是试验例1中芦丁的标准曲线；
图3是试验例2中小龙虾成活率的柱形图；
图4是试验例2中试验期内小龙虾体增重的柱形图，*表示差异显著，P＜0.05；
图5是试验例3中滤液离心上清液的总氮含量；
图6是试验例3中滤液离心上清液的总氮含量；
图7是试验例3发酵液蛋白质含量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
Figure 849070DEST_PATH_IMAGE001
上述饲料的制备方法如下：
（1）将新鲜桑叶切碎，每100g桑叶加入10mL解淀粉芽孢杆菌，菌浓度为107CFU/mL，混合均匀，装入发酵桶压实，加盖密封后常温发酵2天，取出后烘干粉碎，获得发酵桑叶粉备用；
（2）将发酵桑叶粉、红薯藤、西红柿按比例混合搅拌均匀，20-25℃放置2-4h，获得一次料；
（3）将带壳生鸡蛋打碎，与黏性粉体混合搅拌均匀，获得二次料；
（4）将所述的一次料、二次料、玉米、膨化豆粕、膨化肉骨粉、麸皮粉、诱食剂、复合添加剂和混合发酵菌液混合、持续搅拌20-30min，搅拌速度为1500r/min，然后置入35-40℃恒温发酵箱内发酵3-4h，取出，造粒，烘干。
实施例2
Figure 703763DEST_PATH_IMAGE002
上述饲料的制备方法如下：
（1）将新鲜桑叶切碎，每100g桑叶加入10mL解淀粉芽孢杆菌，菌浓度为107CFU/mL，混合均匀，装入发酵桶压实，加盖密封后常温发酵2天，取出后烘干粉碎，获得发酵桑叶粉备用；
（2）将发酵桑叶粉、南瓜藤、西红柿按比例混合搅拌均匀，20-25℃放置2-4h，获得一次料；
（3）将带壳生鸡蛋打碎，与黏性粉体混合搅拌均匀，获得二次料；
（4）将所述的一次料、二次料、玉米、膨化豆粕、膨化肉骨粉、麸皮粉、诱食剂、复合添加剂和混合发酵菌液混合、持续搅拌20-30min，搅拌速度为1500r/min，然后置入35-40℃恒温发酵箱内发酵3-4h，取出，造粒，烘干。
实施例3
Figure 19644DEST_PATH_IMAGE003
上述饲料的制备方法如下：
（1）将新鲜桑叶切碎，每100g桑叶加入10mL解淀粉芽孢杆菌，菌浓度为107CFU/mL，混合均匀，装入发酵桶压实，加盖密封后常温发酵2天，取出后烘干粉碎，获得发酵桑叶粉备用；
（2）将发酵桑叶粉、红薯藤、西红柿按比例混合搅拌均匀，20-25℃放置2-4h，获得一次料；
（3）将带壳生鸡蛋打碎，与黏性粉体混合搅拌均匀，获得二次料；
（4）将所述的一次料、二次料、玉米、膨化豆粕、膨化肉骨粉、麸皮粉、诱食剂、复合添加剂和混合发酵菌液混合、持续搅拌20-30min，搅拌速度为1500r/min，然后置入35-40℃恒温发酵箱内发酵3-4h，取出，造粒，烘干。
对比例1
Figure 668800DEST_PATH_IMAGE004
本实施例饲料的制备方法参照实施例1，区别在于不含有抗氧化青绿饲料及其加工步骤。
对比例2
本实施例与实施例1基本相同，其区别在于：不含步骤（1）的鲜桑叶发酵工艺，一次料中的桑叶粉未经过发酵工艺处理。
对比例3
市售小龙虾饲料，主要原料为鱼粉、大豆磷脂油、面粉、花生粕、菜籽粕、磷酸二氢钙、多种维生素和矿物质，营养成分含粗蛋白28%，粗脂肪3%，粗纤维8%，总磷1.2%，粗灰分18%，钙1.5%-3%，赖氨酸1.5%-3%。
对比例4
本实施例的配方与实施例1基本型相同，区别在于不含有混合发酵菌液，在最后一步直接混合、造粒、烘干，未经过发酵工艺。
试验例1
多酚是植物中的酚类次生代谢产物，黄酮类化合物主要包括芦丁、槲皮素和异槲皮苷等成分，是优良的天然抗氧化活性物质，能清除自由基，增强动物抗应激能力。本试验通过对比前文各个实施例和对比例的多酚和总黄酮含量，证明本发明的技术效果。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
实施例1、2、3；对比例1、2、3。
1.2 方法
1.2.1 多酚物质的测定
称取3.00 g样品，用20 mL 80%甲醇研磨搅拌，在4℃下浸提12 h以上，于8 000 r/min离心 20 min，过滤，洗渣，定容至25 mL，即为样品提取液。
标准曲线的绘制：准确称取1.000g没食子酸，用去离子水定容至100mL，配制成质量浓度为10 mg/mL没食子酸标准溶液，依次稀释成50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL标准工作液。分别取0.5 mL标准工作液于25 mL比色管中，加入1 mL福林-酚显色剂，混匀静置30 s后加入18 mL 4%的Na2CO3溶液并用去离子水定容至刻度，40℃水浴反应20 min后，以去离子水作为参比，于波长736 nm处测定吸光度值，以没食子酸质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制没食子酸标准曲线，如图1所示。
采用福林-酚比色法检测样品提取液中多酚物质的含量。具体方法为：准确吸取1mL样品提取液6份于6支25 mL的具塞比色管中，加入1 mL福林-酚显色剂，混匀静置30 s后加入18 mL 4%的Na2CO3溶液并用去离子水定容至刻度，40℃水浴反应20min后，以去离子水作为参比，于波长736nm处测定吸光度值，由标准曲线计算样品提取液中多酚含量，再折算出样品中多酚物质的含量。
1.2.2 总黄酮的测定
称取样品5.00 g，加体积分数70%乙醇40 mL研磨搅拌，在4℃下浸提12 h以上，于8 000r/min离心 20 min，过滤，洗渣，定容至25 mL，即为样品提取液。
标准曲线的绘制：准确称取芦丁标准品10.40 mg，用50%乙醇溶解、定容至50 mL，配制成芦丁标准溶液。分别准确吸取芦丁标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于10 mL容量瓶中，分别加入5%的NaNO2溶液0.5 mL摇匀，放置5 min后加入10% Al(NO3)3溶液0.5mL，再过5 min后再加入4 mL 4% NaOH溶液，混匀，用50%乙醇稀释至刻度。放置15 min，在510 nm下测定吸光度，以第一管溶液作为空白。以芦丁浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，如图2所示。
准确吸取待测样品液1mL，放入10 mL容量瓶中，分别加入5%的NaNO2溶液0.5 mL摇匀，放置5 min后加入10%Al（NO3）3溶液0.5 mL，再过5 min后再加入4 mL的4%NaOH溶液，混匀，用50%乙醇稀释至刻度。放置15 min，在510 nm下测定吸光度。根据标准曲线计算总黄酮含量。
2. 结果与分析
试验结果如表1所示：
Figure 813343DEST_PATH_IMAGE005
经过检测，本发明的3个实施例多酚含量＞0.36 g/100g，总黄酮含量＞1.66 g/100g，远远高于市售小龙虾饲料（对比例3）的多酚和总黄酮含量。对比例1不含抗氧化青绿饲料，样品中的多酚和总黄酮含量明显降低，可见抗氧化青绿饲料的添加可显著提高饲料中的抗氧化成分。对比例2中的桑叶未经过发酵，与实施例1比较，样品中的多酚和总黄酮含量有所降低，尤其是总黄酮含量明显减少，表明利用解淀粉芽孢杆菌和发酵工艺有利于桑叶中抗氧化成分的析出，发酵桑叶比鲜桑叶的抗氧化性能好。
试验例2 小龙虾抗氧化应激能力试验
氧自由基 (ROS) 是机体代谢过程中排出外源物质和抗应激反应时的产物，包括超氧离子自由基、羟自由基(•OH)和过氧化氢(H2O2)。当机体内的抗氧化酶***不能及时清除过量的 ROS，就会造成氧化损伤。肝胰腺作为甲壳动物氧化代谢的主要场所，抗氧化酶的水平较高，也是产生大量 ROS 的器官。因此，本实验主要通过肝胰腺抗氧化酶活的变化，并结合成活率和体重的数据来评估幼虾的健康状况。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
实施例1、2、3，对比例3、4；2月龄克氏原螯虾（淡水小龙虾，青壳）。
1.2 方法
5月易应激季节选择小水泥池5个，规格为长195cm，宽150cm，高100cm。使用前先清洗干净，再用20mg/L的高锰酸钾消毒处理。采用静水养殖，在池底铺约1cm的泥土，水池水位约20cm，并放入金鱼藻适量。待水质澄清后放入幼虾，每池45尾。分别用上述实施例和对比例的饲料饲喂小龙虾1个月，同时撒料，喂料量相等。饲养管理按常规方法进行。
幼虾放入水池前随机测定每池10尾的体重，并求出初始平均体重，作为该池虾的初始平均体重。试验结束后，干池捕捞仔虾，分别记录存活尾数，并对每个池中虾的体重进行测定，并做好记录。
每池随机选取6尾小龙虾置于解剖盘上，用吸水纸擦干体表，将1 mL 的注射器针头***虾的附肢关节膜，抽取血液于2 mL的离心管中。剪开头胸甲和腹部取出肝胰腺和肌肉，立即放入液氮里冻存，然后转移至-80 ℃冰箱中待测。
肌肉和肝胰腺粗酶液的制备：取肝胰腺或肌肉样品称质量，移液枪取9倍于组织块的预冷匀浆介质，用电动匀浆器冰浴匀浆，充分匀浆后用4 ℃低温离心机8 000 r/min离心10 min，取上清液即为粗酶液，之后放入-80 ℃冰箱保存备用，用于组织酶活力的测定。
血清的制备：血液样品用4 ℃低温离心机10 000 r·min-1 离心10 min，取上清液即为血清待测液。
1.3 检测指标
检测指标为血糖浓度，肌肉乳酸含量，肝胰腺的总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、氧化氢酶（CAT）和丙二醛（MDA）。
T-AOC、SOD、CAT和MDA均采用南京建成生物技术有限公司试剂盒进行测定。T-AOC的单位定义为37℃条件下，样品组织使反应体系的吸光度(OD)每增加0.066时，为1个总抗氧化能力单位(U·g−1)。SOD活力测定采用NBT法，单位定义为在反应体系中抑制百分率为50%时，反应体系中的SOD酶活力定义为1个酶活力单位(U·g−1)。CAT酶活的单位定义为每克组织每分钟催化1mol的H2O2降解定义为1个酶活力单位。MDA质量摩尔浓度(nmol·g−1)采用硫代巴比妥酸(TAB)法测定。血糖(μmol·mL−1)和乳酸(μmol·g−1)采用南京建成生物技术有限公司的试剂盒进行测定，具体方法按照试剂盒说明书进行。
2. 结果与分析
如表2所示，5组饲料饲喂的小龙虾肌肉乳酸含量均在1.8 μmol/mL左右，为正常值，说明在这样的养殖环境和密度下，5组小龙虾肌肉均没有进行无氧呼吸，小龙虾无缺氧现象发生。
“高血糖”是甲壳动物典型的应激反应标志。与饲喂市售小龙虾饲料对比例3相比，实施例1、2、3和对比例4显著降低了小龙虾的血糖浓度，这与饲料中含有抗氧化青绿饲料，尤其是桑叶有关。
总抗氧化能力 (T-AOC) 主要包括机体内的抗氧化酶体系和抗氧化物质体系，也是衡量机体抗氧化***功能状况的综合性指标。SOD是O2 -主要的清除剂，可以与O2 -发生歧化反应，生成 H2O2和O2，CAT再将H2O2分解生成H2O和O2，2种酶之间相互协同，抑制细胞膜脂氧化，减少氧化损伤。从表2可以看出，实施例1、2、3组小龙虾T-AOC活力显著高于对比例3组（P＜0.05），SOD活力显著高于对比例3和4组（P＜0.05），CAT主要用于分解反应产物H2O2，实施例1、2、3组小龙虾CAT含量显著低于对比例3组（P＜0.05），说明本发明饲料能显著提高小龙虾的总抗氧化能力，对比例4由于未经过发酵，抗氧化能力不及发酵饲料。MDA 是细胞脂类过氧化作用的产物，其浓度反映了细胞的受损伤程度。本试验实施例1、2、3组小龙虾肝胰腺MDA含量显著低于对比例3组（P＜0.05），说明本发明饲料能显著减少氧化应激对小龙虾肝胰腺细胞的损伤。
Figure 209077DEST_PATH_IMAGE006
图3为5组饲料对小龙虾成活率的影响，从图中可以看出，实施例1、2、3组小龙虾成活率高于对比例3和4组（p＜0.05），本发明饲料能在“五月瘟”时提高小龙虾10%-13%的成活率。图4为5组小龙虾的尾平均体增重，由于营养充足且搭配合理，实施例1、2、3的配方提高小龙虾的抵抗力，体增重显著大于对比例3和对比例4（p＜0.001），可提高增重2-4 g/尾。
试验例3 桑叶单菌发酵效果比较
1. 材料和方法
1.1 试验材料
鲜桑叶切碎，备用。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis AB90008、IIIA-2、A160418、S1X-15）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens JY-24）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulan 3-1）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus AB94044）等8种发酵微生物由江苏省苏微微生物有限公司提供。
嗜水气单胞菌，维氏气单胞菌，副溶血性弧菌，温和气单胞菌，鳗利斯顿氏菌，爱德华氏菌，豚鼠气单胞菌，溶藻弧菌，大肠杆菌。由江苏省苏微微生物有限公司分离保存。
1.2 试验方法
1.2.1 分组
按每100g桑叶加入10mL菌，菌浓度为107CFU/mL，25℃发酵2-3d。
对照组（C）：向桑叶中加灭菌蒸馏水。
试验组：将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis AB90008、IIIA-2、A160418、S1X-15），解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens JY-24），巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium），凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulan 3-1），短小芽孢杆菌（Bacillus pumilusAB94044）喷洒到桑叶中，混合均匀，设置三个重复。
1.2.2测定指标及方法
按料水比10%提取发酵桑叶水溶液，过滤。
①水中溶出的总N，总P（发酵液离心取上清液）：将发酵液置于离心管中，在4000r/min的速度下离心5分钟，取上清液，用过硫酸盐氧化，分光光度法测定；
②发酵液蛋白含量：凯氏定氮法；
③抑菌圈：游标卡尺测量。
抑菌试验方法
①取在150转/min，30℃培养24h的新鲜致病菌菌液，用0.1ml涂布LB平皿；
②取滤液，浸泡空白纸片1h，贴于上述平皿；
③室温25℃培养48-72h，用游标卡尺测量抑菌圈大小。
2. 试验结果
图5和图6分别展示了滤液离心上清液总氮N和总磷P含量。对照C为灭菌蒸馏水，BS+1为枯草芽孢杆菌AB90008，BS+2为枯草芽孢杆菌IIIA-2，BS+3为枯草芽孢杆菌A160418，BS+4为枯草芽孢杆菌S1X-15，BP+5为短小芽孢杆菌AB94044，BA+6为解淀粉芽孢杆菌JY-24，BM+7为巨大芽孢杆菌，BC+8为凝结芽孢杆菌3-1。
由图5和图6可知，短小芽孢杆菌AB94044、解淀粉芽孢杆菌JY-24、巨大芽孢杆菌水中溶出的总N量较高，短小芽孢杆菌AB94044、解淀粉芽孢杆菌JY-24、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌3-1总P的溶出量较高。综合来看，短小芽孢杆菌AB94044和解淀粉芽孢杆菌JY-24的氮磷总量要高于其他发酵菌种。总N和总P均是小龙虾生长的必需元素，其中总P对于小龙虾的骨骼构成起着主要作用，能够直接参与到细胞中各种能够产生能量的反应。
图7进一步展示了滤液离心上清液蛋白质的含量，其中，对照C为灭菌蒸馏水，BS+1为枯草芽孢杆菌AB90008，BS+2为枯草芽孢杆菌IIIA-2，BS+3为枯草芽孢杆菌A160418，BS+4为枯草芽孢杆菌S1X-15，BP+5为短小芽孢杆菌AB94044，BA+6为解淀粉芽孢杆菌JY-24，BM+7为巨大芽孢杆菌，BC+8为凝结芽孢杆菌3-1。从图7可看出，短小芽孢杆菌AB94044、解淀粉芽孢杆菌JY-24、巨大芽孢杆菌发酵滤液中蛋白含量较高。经室温培养对微生物不同发酵时间的抑菌效果进行评价，结果如表3和表4所示：
Figure 122675DEST_PATH_IMAGE007
Figure DEST_PATH_IMAGE008
通过表3、表4可得，用解淀粉芽孢杆菌（JY-24）发酵48h的桑叶发酵液，抑菌活性更强，对六种水产致病菌均具有抑菌活性。用解淀粉芽孢杆菌（JY-24）发酵72h的桑叶发酵液，抑菌活性较强，对四种水产致病菌具有抑菌活性。
以上数据总结，解淀粉芽孢杆菌（JY-24）25℃ 发酵鲜桑叶48h，总氮、总磷溶出量高，蛋白质含量高，抑菌效果好。进而有利于小龙虾的肠道健康，降低致病菌感染的风险。

Claims (10)

1.一种增强小龙虾抗氧化应激能力的发酵饲料，其特征在于，按质量份数计包括：
抗氧化青绿饲料 35-45份，
玉米 18-23份，
膨化豆粕 40-50份，
膨化肉骨粉 8-11份，
麸皮粉 10-15份，
诱食剂 1-2份，
复合添加剂 1-3份，
黏合剂 5-10份，
混合发酵菌液 15-20份；
其中，所述抗氧化青绿饲料中至少包括30 wt%的发酵桑叶粉。
2.根据权利要求1所述的一种增强小龙虾抗氧化应激能力的发酵饲料，其特征在于：所述抗氧化青绿饲料至少包括40 wt%的发酵桑叶粉、至少一种茎叶类植物、以及至少一种浆果类植物；所述茎叶类植物选自红薯藤、南瓜藤、银杏叶的任意一种或多种的组合，所述浆果类植物选自西红柿、葡萄渣、柑橘渣任意一种或多种的组合。
3.根据权利要求2所述的一种增强小龙虾抗氧化应激能力的发酵饲料，其特征在于：所述抗氧化青绿饲料按质量百分比包括40% - 55%发酵桑叶粉，35% - 50%红薯藤，5% - 20%西红柿。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的一种增强小龙虾抗氧化应激能力的发酵饲料，其特征在于：所述发酵桑叶粉是将新鲜桑叶与解淀粉芽孢杆菌混合后，常温密封发酵1-3天，然后烘干粉碎获得的；每100g新鲜桑叶中加入解淀粉芽孢杆菌10ml，解淀粉芽孢杆菌的菌液浓度为106-108CFU/mL。
5.根据权利要求4所述的一种增强小龙虾抗氧化应激能力的发酵饲料，其特征在于：所述黏合剂包括带壳生鸡蛋以及至少一种黏性粉体，所述黏性粉体选自玉米淀粉、糯米粉、高筋面粉、土豆粉的任意一种或多种的组合。
6.根据权利要求4任意一项所述的一种增强小龙虾抗氧化应激能力的发酵饲料，其特征在于：所述混合发酵菌液包括乳酸菌、枯草芽孢杆菌、日本根霉菌、酵母菌、沼泽红假单孢菌的任意一种或多种的组合。
7.根据权利要求4任意一项所述的一种增强小龙虾抗氧化应激能力的发酵饲料，其特征在于：所述诱食剂包括大蒜素、谷氨酸、甜菜碱、田螺粉、鱼粉、鱼油的任意一种或多种的组合。
8.根据权利要求4所述的一种增强小龙虾抗氧化应激能力的发酵饲料，其特征在于：所述复合添加剂包括矿物质和维生素，所述矿物质选自Mn、Se、Cu、Fe、I、Zn、Co、F、Cd、Cr、Mo的任意一种或多种的组合，所述维生素选自维生素A、维生素B1、维生素B2、泛酸、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D2、维生素E、维生素D3、维生素K3、叶酸的任意一种或多种的组合。
9.如权利要求4所述发酵饲料的制备方法，其特征在于：
将新鲜桑叶切碎，向桑叶中加入解淀粉芽孢杆菌，混合均匀，装入发酵桶压实，加盖密封后常温发酵1-3天，取出后烘干粉碎，获得发酵桑叶粉备用；
将发酵桑叶粉、红薯藤、西红柿混合搅拌均匀，获得一次料；
将带壳生鸡蛋打碎，与黏性粉体混合搅拌均匀，获得二次料；
将所述的一次料、二次料、玉米、膨化豆粕、膨化肉骨粉、麸皮粉、诱食剂、复合添加剂和混合发酵菌液混合、搅拌，经恒温短时发酵后取出，造粒，烘干。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述恒温短时发酵是在35-40℃恒温发酵箱内发酵3-4h。
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