CN111273034A - 定量检测***灭活抗原中非结构蛋白残留的试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及定量检测***灭活抗原中非结构蛋白残留的化学发光试剂盒及应用,属于生物技术领域,所述试剂盒含有包被有3ABC多抗的化学发光板、酶标单抗、抗原标准品、血清稀释液、20×PBST洗涤液、化学发光液;所述的包被有3ABC多抗的化学发光板为白色可拆卸的聚苯乙烯96孔板;所述酶标单抗为识别3B蛋白的酶标单抗9E2‑HRP;所述抗原标准品为含有10 ng/ml的3ABC,质量分数为0.2%的BSA和体积分数为0.05% prolin300。本发明所述的试剂盒灵敏度高,能够对***灭活抗原中非结构蛋白进行快速定量。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体地,涉及定量检测***灭活抗原中非结构蛋白残留的试剂盒及应用。
背景技术
***(FMD)是由***病毒(FMDV)引起的,以感染猪、牛、羊等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触传染性动物疫病。FMDV是单股正链RNA病毒,属于小RNA病毒科***病毒属,基因组大小为8400bp,编码4种结构蛋白(SPs:VP4,VP2,VP3和VP1)和8种非结构蛋白(NSPs:L,2A,2B,2C,3A,3B,3C,3D),以及存在一些未裂解的前体,如3ABC。我国***防控主要采取疫苗免疫、扑杀感染和可疑动物以及血清监测的综合性防控措施来控制***的流行。理论上来说只有感染FMDV的动物,体内才存在NSPs抗体,而免疫动物体内不存在NSPs抗体。所以区分***感染与免疫主要依赖于检测NSPs抗体。但由于抗原纯化工艺的问题,灭活疫苗抗原中仍会残留少量的NSPs。因此在疫苗免疫地区进行NSPs检测时,NSPs抗体不仅能在***感染动物中检测到,而且也能在一些多次疫苗免疫的动物体内检测到。但国内目前还没有一种能够定量检测***灭活抗原中NSPs的方法,因此急需一种定量检测方法来评价***灭活抗原中NSPs的残留。
为了控制***的传播,世界动物卫生组织(OIE)规定在***发生国家或疫苗免疫国家要想恢复***无疫状态,必须通过检测动物体内无***NSPs抗体来证明该国无***循环。因此OIE对***灭活疫苗的纯净度制定了准则,该准则需要***生产厂家证明疫苗中缺乏NSPs的免疫原性,并推荐评价疫苗纯净度的方法。该评价方法具体是:至少用8头牛免疫两次,首免后21-30天后进行第二次免疫,第二次免疫后的30-60天检测牛体内非结构蛋白抗体。其中有一头检测为NSPs抗体阳性是可以接受的;若超过两头检测为NSPs抗体阳性,则这批疫苗是不合格;若两头检测为NSPs抗体阳性,厂家有权要求进行复检。然而,动物实验即费钱又费时,如果有一批疫苗不能满足纯度要求,厂家必须将整批苗弃掉。目前国内***灭活疫苗的保存期多为1年,仅这一项NSPs残留评价就需2-3月,这给生产厂家带来很大负担。因此目前亟待一种定量检测***抗原中NSPs的试剂盒,为***生产厂家在抗原纯化以及制定标准化流程提供技术指导。
发明内容
为了解决现有技术中的不足,本发明的目的一在于提供一种定量检测***灭活抗原中NSPs残留的化学发光试剂盒,目的二在于提供所述试剂盒在***灭活抗原中NSPs残留定量检测方面的应用。所述试剂盒灵敏度高,能够对***灭活抗原中非结构蛋白进行快速定量。
为了实现上述目的,本发明采用的具体方案为:
定量检测***灭活抗原中非结构蛋白残留的试剂盒,包括包被有3ABC多抗的化学发光板、酶标单抗、抗原标准品、血清稀释液、20×PBST洗涤液、化学发光液;
所述酶标单抗为标记HRP的识别3B蛋白的单克隆抗体;
所述抗原标准品中含有10ng/ml的3ABC、质量分数为0.2%的BSA和体积分数为0.05%prolin300;
所述血清稀释液为含有质量分数为1%酪蛋白、体积分数为0.05%Tween-20、体积分数为0.1%proclin-300、质量分数为2%蔗糖的磷酸盐缓冲液;
所述20×PBST为含有体积分数为1%Tween-20的0.2M磷酸盐缓冲液;
所述化学发光液包括A液和B液;所述A液含有0.1mM的鲁米诺和0.07M发光增强剂IPP,所述B液为3mM的H2O2溶液。
本发明还提供所述试剂盒在***灭活抗原中NSPs残留定量检测方面的应用。
进一步地,所述试剂盒的操作步骤为:
1、标准品的稀释:用PBST将10ng/ml的抗原标准品稀释为若干个稀释度,PBST作为空白对照,用以建立标准曲线;
2、样品稀释:将待检抗原样品原液用PBST 1:4稀释获得稀释样品;
3、加样:将稀释后的抗原标准品、空白对照、待测抗原样品原液以及稀释样品分别加入到化学发光板中,然后将化学发光板置于37℃反应30min,弃掉反应液,洗涤液洗板;
4、加入检测抗体:用血清稀释液将酶标抗体做10,000倍稀释,然后向每孔中加入100μl,37℃反应30min,弃掉反应液,洗涤液洗板;
5、检测:将化学发光液的A液和B液1:1混匀,每孔加入100μl,室温反应5min后用化学发光检测仪检测化学发光值;
6、检测结果的判定:
首先计算抗原标准品若干个稀释度的平均值和空白对照的平均值,以稀释度作为X轴,所测得的化学发光值为Y轴,建立标准曲线和线性回归方程;
通过步骤5得出待检抗原样品原液和稀释样品的CLIA值,待检抗原样品原液中NSPs含量的计算方法有以下三种情况:
a、若待检抗原样品原液和稀释样品的CLIA值均<10,000,那么待检抗原样品原液中NSPs残留低于本试剂盒的检测限;
b、若待检抗原样品原液和稀释样品的CLIA值均>10,000,那么将稀释样品的CLIA值乘以4后代入回归方程计算出待检抗原样品原液中NSPs的含量;
c、若待检抗原样品原液的CLIA值>10,000,而稀释样品的CLIA值<10,000,那么将待检抗原样品原液的CLIA值代入回归方程计算出待检抗原样品原液中NSPs的含量。
有益效果:
1、本发明利用3ABC多抗作为捕获抗体,识别3B的单抗作为检测抗体,能够对***抗原中NSPs残留进行定量检测,从而为疫苗生产厂家提供技术指导和疫苗中NSPs的证明。
2、本发明所述试剂盒灵敏度高,检测限为0.02ng/ml,线性范围为0.1-10ng/ml,通过本发明所述的结果判定的方法,使计算结果更精确。
3、由于本发明是用3ABC多抗作为捕获抗体,识别3B的单克隆抗体9E2-HRP作为检测抗体,因此检测抗原中NSPs的量是3B、3AB以及3ABC之和。
附图说明
图1是3ABC蛋白纯化的SDS-PAGE图;
图2是单抗9E2识别3B的WB图;
图3是以3ABC浓度为10,5,2.5,1,0.5,0.25,0.1,0ng/ml作为X轴,所测得的化学发光值为Y轴,建立的标准曲线图。
具体实施方式
定量检测***灭活抗原中NSPs残留的化学发光试剂盒,包括包被有3ABC多抗的化学发光板、酶标单抗(9E2-HRP)、抗原标准品、血清稀释液、20×PBST洗涤液、化学发光液(A液和B液)。
所述的包被有3ABC多抗的化学发光板为白色可拆卸的聚苯乙烯96孔板,每孔包被3ABC多抗。具体是用磷酸盐缓冲液(CBS,pH 9.6)将3ABC多抗稀释为0.5μg/ml,100μl/孔,4℃过夜包被;PBST洗三次后,向每孔中加入200μl封闭液进行封闭,37℃封闭2h。甩掉拍干后,于37℃干燥2h,装袋真空封闭,4℃保存。
所述的封闭液为含有体积分数为0.05%Tween-20、质量分数为5%蔗糖、质量分数为1%鱼明胶、体积分数为0.1%proclin-300的磷酸盐缓冲液。
所述酶标单抗为9E2-HRP,该单抗识别3B蛋白。
所述的抗原标准品为含有10ng/ml的3ABC,质量分数为0.2%的BSA和体积分数为0.05%prolin300。
所述血清稀释液为含有质量分数为1%酪蛋白、体积分数为0.05%Tween-20、体积分数为0.1%proclin-300、质量分数为2%蔗糖的磷酸盐缓冲液;所述20×PBST为含有体积分数为1%Tween-20的0.2M磷酸盐缓冲液(pH 7.2-7.4),经0.22μm滤膜除菌;所述化学发光A液含有0.1mM的鲁米诺和0.07M发光增强剂IPP,化学发光B液为3mM的H2O2溶液。
本发明方法的操作步骤为:
1、室温平衡:从4℃取出试剂盒,恢复到室温备用。
2、洗涤液准备:将20×PBST用去离子水或蒸馏水做20倍稀释即可。
3、标准品的稀释:在U型稀释板中,用PBST将10ng/ml的抗原标准品稀释为10,5,2.5,1,0.5,0.25,0.1ng/ml七个稀释度,PBST作为空白对照,即0ng/ml。
4、样品稀释:用PBST按照1:4的比例对待检抗原样品进行稀释(75μl PBST+25μl原液),得稀释样品;
5、加样:将稀释后的抗原标准品、空白对照、待检抗原样品以及1:4稀释的稀释样品分别加入到化学发光板中,然后将化学发光板置于37℃反应30min。
6、洗板:弃掉反应液,每孔加入300μl的稀释后的洗涤液,洗涤5次,中间一次震荡洗涤30-60s,最后一次拍干。
7、加入检测抗体:用血清稀释液将9E2-HRP做10,000倍稀释,然后向每孔中加入100μl,37℃反应30min。
8、洗板:同步骤6。
9、检测:将化学发光A液和B液1:1混匀,每孔加入100μl,室温反应5min后用化学发光检测仪检测化学发光值。
检测结果的判定:
首先计算抗原标准品七个稀释度的平均值和空白对照的平均值,以10,5,2.5,1,0.5,0.25,0.1,0ng/ml作为X轴,所测得的化学发光值为Y轴,建立标准曲线和线性回归方程。
1、若原液和1:4稀释后的CLIA值均<10,000,那么待检抗原样品中NSPs残留低于本试剂盒的检测限;
2、若原液和1:4稀释后的CLIA值均>10,000,那么将1:4稀释后的CLIA值乘以4后代入回归方程计算出待检抗原样品中NSPs的含量;
3、若原液的CLIA值>10,000,而1:4稀释后的CLIA值<10,000,那么将原液的CLIA值代入回归方程计算出待检抗原样品中NSPs的含量。
下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1 3ABC单抗和多抗的制备
将原核表达的***NSP 3ABC进行纯化(图1),并对其进行梯度透析复性,然后将复性后的3ABC免疫小鼠制备单抗,通过有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行3次亚克隆,筛选出反应性强的单克隆细胞,然后将筛选的细胞注入小鼠腹腔制备腹水。具体操作过程:将0.5ml弗氏不完全佐剂注入雌性Balb/c小鼠腹腔中,3天后将约7.0×105的杂交瘤细胞注入腹腔。9-10天后,收集腹水并进行纯化。通过Western blot验证表明该单抗识别3B蛋白,WB结果也表明该单抗识别的是线性表位(图2)。
将复性后的3ABC蛋白免疫兔子制备多抗。
实施例2检测***非结构蛋白CLIA法的优化及标准曲线的建立
将3ABC多抗稀释为0.5μg/ml作为捕获抗体,将3B单抗-HRP 1:10,000,1:30,000,1:100,000倍稀释作为检测抗体,将原核表达的***NSP 3ABC用PBST稀释为500,250,100,50,25,10,5,2.5,1,0.5,0.25,0.1,0.05,0.025,0.01,0ng/ml作为标准抗原。综合考虑经济因素以及检测范围,最终确定捕获抗体的最佳包被浓度为0.5μg/ml,检测抗体最佳稀释度为1:10,000,最佳反应时间均为30min,并建立标准曲线。如图3所示,当3ABC浓度为0.1-10ng/ml时,所测的化学发光强度与3ABC浓度呈线性关系,线性方程为:Y=8252238X–67290。通过公式DL=3.3SD/S计算最低检测限(其中SD为PBST对照的标准差,S为标准曲线的斜率),检测限为0.02ng/ml。
实施例3待检***灭活抗原样本最佳稀释倍数的确定
由于部分抗原中含有一些成分影响抗原抗体反应,因此将待检样本进行1:2,1:4,1:8梯度稀释后与原液的化学发光值(CLIA值)进行对比,从而确定最佳稀释度。通过对8种纯化不同次数的抗原(所用毒株不是一个)进行对比,可以发现有些抗原进行梯度稀释后,CLIA值成比例降低(如a,b,c,d);而有些抗原进行梯度稀释后,CLIA值从1:4-1:8才开始成比例下降(如1,2);而纯化两次的抗原中含有的NSPs量已低于本方法的检测限,因此梯度稀释后,CLIA值变化不大(如I,II)。通过本试验最终确定抗原最佳稀释度为1:4(表1)。
表1待检抗原样本最佳稀释倍数的确定
实施例4检测***灭活抗原中NSPs的实施
1、标准品:将10ng/ml的抗原标准品(含有10ng/ml的3ABC,质量分数为0.2%的BSA,体积分数为0.05%prolin300)用PBST稀释为10,5,2.5,1,0.5,0.25,0.1ng/ml七个稀释度,PBST作为空白对照,即0ng/ml。
2、检测样品:细胞上清和营养液(1-6)、未纯化(7-11)、纯化一次(12-15)、纯化两次(16)的样本。
3、将稀释后的抗原标准品、空白对照、待测样本以及1:4稀释的待检样本加入到包被有3ABC多抗的化学发光板中,然后将化学发光板置于37℃反应30min。用PBST洗涤5次后加入用血清稀释液10,000倍稀释的9E2-HRP,37℃反应30min。再用PBST洗涤5次,然后加入化学发光底物,5min后用化学发光分析检测仪器检测化学发光值。以抗原标准品七个稀释度10,5,2.5,1,0.5,0.25,0.1,0ng/ml作为X轴,所测得的化学发光值为Y轴,建立标准曲线和线性回归方程。将待检样本进行1:4稀释后的化学发光值(CLIA值)与原液进行对比,若原液和1:4稀释后的CLIA值均<10,000,那么待检样品中NSPs残留低于本方法的检测限;若原液和1:4稀释后的CLIA值均>10,000,那么将1:4稀释后的CLIA值乘以4后代入回归方程计算出抗原中NSPs的含量;若原液的CLIA值>10,000,而1:4稀释后的CLIA值<10,000,那么将原液的CLIA值代入回归方程计算出抗原中NSPs的含量(表2)。
表2抗原中NSPs含量的检测
需要说明的是,以上所述的实施方案应理解为说明性的,而非限制本发明的保护范围,本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言,在不背离本发明实质和范围的前提下,对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
Claims (3)
1.定量检测***灭活抗原中非结构蛋白残留的试剂盒,包括包被有3ABC多抗的化学发光板、酶标单抗、抗原标准品、血清稀释液、20×PBST洗涤液、化学发光液;
所述酶标单抗为标记HRP的识别3B蛋白的单克隆抗体;
所述抗原标准品中含有10 ng/ml的3ABC、质量分数为0.2%的BSA和体积分数为0.05%prolin300;
所述血清稀释液为含有质量分数为1%酪蛋白、体积分数为0.05% Tween-20、体积分数为0.1% proclin-300、质量分数为2%蔗糖的磷酸盐缓冲液;
所述20×PBST为含有体积分数为1% Tween-20的0.2M 磷酸盐缓冲液;
所述化学发光液包括A液和B液;所述A液含有0.1 mM的鲁米诺和0.07 M发光增强剂IPP,所述B液为3 mM的H2O2溶液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒在***灭活抗原中NSPs残留定量检测方面的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,所述试剂盒的操作步骤为:
步骤一、标准品的稀释:用PBST将10 ng/ml的抗原标准品稀释为若干个稀释度,PBST作为空白对照,用以建立标准曲线;
步骤二、样品稀释:将待检抗原样品原液用PBST 1:4稀释获得稀释样品;
步骤三、加样:将稀释后的抗原标准品、空白对照、待测抗原样品原液以及稀释样品分别加入到化学发光板中,然后将化学发光板置于37℃反应30 min,弃掉反应液,洗涤液洗板;
步骤四、加入检测抗体:用血清稀释液将酶标抗体做10,000倍稀释,然后向每孔中加入100 μl,37℃反应30 min,弃掉反应液,洗涤液洗板;
步骤五、检测:将化学发光液的A液和B液1:1混匀,每孔加入100 μl,室温反应5 min后用化学发光检测仪检测化学发光值;
步骤六、检测结果的判定:
首先计算抗原标准品若干个稀释度的平均值和空白对照的平均值,以稀释度作为X轴,所测得的化学发光值为Y轴,建立标准曲线和线性回归方程;
通过步骤五得出待检抗原样品原液和稀释样品的CLIA值,待检抗原样品原液中NSPs含量的计算方法有以下三种情况:
a、若待检抗原样品原液和稀释样品的CLIA值均<10,000,那么待检抗原样品原液中NSPs残留低于本试剂盒的检测限;
b、若待检抗原样品原液和稀释样品的CLIA值均>10,000,那么将稀释样品的CLIA值乘以4后代入回归方程计算出待检抗原样品原液中NSPs的含量;
c、若待检抗原样品原液的CLIA值>10,000,而稀释样品的CLIA值<10,000,那么将待检抗原样品原液的CLIA值代入回归方程计算出待检抗原样品原液中NSPs的含量。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200612 |
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