CN110862990B - 与德国小蠊表皮发育相关的Cad96ca基因、该基因的dsRNA及其制备方法与应用 - Google Patents

与德国小蠊表皮发育相关的Cad96ca基因、该基因的dsRNA及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了与德国小蠊表皮发育相关的Cad96ca基因、该基因的dsRNA及其制备方法与应用，所述Cad96ca基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述dsRNA为由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列和与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列反向互补的核苷酸序列组成的双链RNA。本发明利用RNAi干扰技术，通过合成dsRNA来靶向沉默表皮发育相关基因Cad96ca来影响蟑螂的蜕皮，在阻断或破坏蟑螂蜕皮的基础上达到蟑螂防治的目的，为害虫防治提供了新的分子靶标。

Description

与德国小蠊表皮发育相关的Cad96ca基因、该基因的dsRNA及 其制备方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及与德国小蠊表皮发育相关的Cad96ca基因、该基因的dsRNA及其制备方法与应用。
背景技术
蟑螂喜好场地较潮湿、温暖、黑暗的生活场所，喜欢躲藏在隐蔽的缝隙中，活动时间集中在夜晚，因此人类较难消灭其种群。蟑螂分布广泛，也是最难治理的世界性家居卫生害虫，会对人的健康带来较大安全隐患。
从上世纪40年代开始，化学农药和有机杀虫剂在害虫防治实践中表现出高效的杀虫效果，为害虫防治带来了革命性改变。但随着其长期大量使用，土壤退化、农药残留、水源和环境污染、生物链中断、生态失衡等一系列负面问题日益凸显。因此，开发环境友好、高效、低毒的蟑螂防治方法是对于经济发展、社会进步和食品安全具有重要意义。
RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)介导的靶标基因沉默机制，具有高度的序列特异性，基于RNAi技术的害虫防治策略具有专一性，且对非靶标生物安全。基于RNAi技术的害虫防治策略核心是寻找关键的分子靶标基因并获得特异高效的dsRNA片段序列。RNA干扰技术使用生物学手段，不会对环境造成污染，是一种环境友好的害虫防治手段。
蟑螂一生中会出现多次蜕皮，蜕皮是其身体继续生长的关键生命过程，蟑螂每次蜕皮都会伴随体型的增大。而出现多次蜕皮现象则为蟑螂的防治带来了契机，通过阻断蟑螂蜕皮就会使得蟑螂死亡进而成为蟑螂防治的理想策略。
发明内容
本发明的所要解决的第一个技术问题在于：提供一种德国小蠊表皮发育相关基因，通过靶向该基因能够影响德国小蠊的表皮发育，进而建立一种安全高效的新型防治障螂的方法。
本发明的所要解决的第二个技术问题在于：提供一种德国小蠊表皮发育相关基因的片段序列。
本发明的所要解决的第三个技术问题在于：提供上述基因片段的制备方法。
本发明的所要解决的第四个技术问题在于：提供上述基因片段的应用。
本发明的所要解决的第五个技术问题在于：提供基于上述基因片段设计的dsRNA。
本发明的所要解决的第六个技术问题在于：上述dsRNA的制备方法。
本发明的所要解决的第七个技术问题在于：上述dsRNA的应用。
为解决上述第一个技术问题，本发明采用的方案为：一种与德国小蠊表皮发育相关的Cad96ca基因，所述Cad96ca基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
为解决上述第二个技术问题，本发明采用的方案为：一种与德国小蠊表皮发育相关的Cad96ca基因的基因片段，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
为解决上述第三个技术问题，本发明采用的方案为：上述基因片段的制备方法，包括以下步骤：将上述Cad96ca基因克隆到载体中作为模板，设计引物进行PCR扩增后得到所述基因片段。
进一步地，所述引物包括上游引物和下游引物，其中，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
为解决上述第四个技术问题，本发明采用的方案为：含有所述的基因片段的重组载体或重组菌。
上述重组载体或重组菌在德国小蠊防治上的应用。
为解决上述第五个技术问题，本发明采用的方案为：一种干扰与德国小蠊表皮发育相关的Cad96ca基因的dsRNA，所述dsRNA为由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列和与SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列反向互补的核苷酸序列组成的双链RNA。
为解决上述第六个技术问题，本发明采用的方案为：上述dsRNA的制备方法，包括以下步骤：上述Cad96ca基因片段克隆到载体中作为模板，设计引物并通过PCR扩增后体外转录合成得到所述dsRNA。
进一步地，所述引物包括上游引物和下游引物，其中，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
为解决上述第七个技术问题，本发明采用的方案为：上述的dsRNA在制备用于防治德国小蠊或影响德国小蠊表皮发育的产品中的应用。
上述dsRNA在防控德国小蠊中的应用。
一种防控德国小蠊的方法，包括以下步骤：将如上述dsRNA导入到德国小蠊体内。
本发明的有益效果在于：本方案首次将德国小蠊表皮相关基因Cad96ca基因作为害虫防控靶标，基于Cad96ca基因设计合成了一种干扰该基因表达的dsRNA。将该dsRNA导入德国小蠊体内，能够显著抑制Cad96ca基因的表达，进而导致德国小蠊表皮发育障碍，导致其蜕皮过程和表皮生长过程无法正常进行，从而导致其死亡，从而实现防治害虫的最终目的，为害虫防治提供了新的分子靶标。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例2中Cad96ca基因功能域分析图；
图2为本发明实施例2中Cad96ca基因RNAi效率检测图；
图3为本发明实施例2中注射dsCK和dsCad96ca后德国小蠊形态对照图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：通过合成dsRNA靶向Cad96ca基因来影响蟑螂的蜕皮过程，在阻断或破坏蟑螂表发发育的基础上通过阻断蜕皮过程达到蟑螂防治的目的。
本发明的实施例一为：dsRNA的设计与合成：
使用TRIzol(Life Technologies)方法提取德国小蠊脂肪体部位的总RNA，然后使用OligodT引物进行反转录(PrimeScript II reverse transcriptase(Takara Bio,Shiga,Japan))合成cDNA第一条链。
根据已有的德国小蠊基因组信息，通过与其他物种进行比对找到德国小蠊Cad96ca基因的完整序列，如SEQ ID No.1所示。
SEQ ID No.1：
ATGATTCGGAACTGGGTCATCCAGGACACGGTTCCCTTGGGAGAAATCGTCGCCAGGGTGAGAGCCGAGGACTCCGAGATGGACAGACTCGTGTACGGGTTGGAACCCAAGTTCAGTGGCGGAGGCGCCTACAACAAGCCCTTGCCCTTCGTCATCAACAACACGACGGGCATCGTCAAGGTCAACGACTCTCTCCTCAACAGGGGCGGCGAGCAGTTCCTCCTGTACGTCACAGTGAGCGACGGAAAACTGACGAGCAAAAACGAAGTTTGGGTGAAGATCGTCAACTCGTCAGCGGACCCCGATTCGTCCAACATCAACAGTGGCGGGCCACCGCTGGGGGCGGCGAGTTTCCTGCCGAAATTCCACTCCCAATACCCTGGGGGCGGCAATAGCGGAGGTGGCATCTTCCCTCCCCCGAACTTGCAAGGCTTCAGCCGCAAACCTCGGCCCCCGCCCCCGCCACCCCCACCGCCCCTGACGCCCGAACAAACGCAGACGTCACTGGCCACTCAACACGAACCCACCAAAGCGGAGACGGCAGAGACGCCGACGATAAAGGTGCCGACGCCACCCCCGACGAGCAACGGGACCTTGGTGACCCCCGCAGAGGGCACAGTGACCTCCGTGCCTGACCTGGGCGCCACTGTCATCCCCATCTCGGTCGTGTGCGGGCTCGTCATCATCGGAGGCCTGGGCGCCTGGCTCTTCCGGCGGAAGCTCTGTCGCCATAGAAACAAGGCCAACAAGGACGACATGCAAAAGGAACCATCTGGAGGCATTGTCCTGGAGGAACCAATGGCGTTGCAGCATTGGAGAGGACCACGTGCTCACAGCAATCGATACGAGGGTTGGGATCGAGATTCCAATCAACAGCAGGCACCAGGGCCGGGCATTCCTAAGCCTGACGACCGCTGGGAGTTCCCCAGACATCGCCTCAAGGTCTTCAACATCCTCGGCGAGGGATGTTTCGGCCAAGTCTGGCGTTGCGAGGCCCTCGACATTGACGGTCGAGATGGCACCACCGTCGTGGCAGTGAAGACCCTCAAGGAGAACGCGTCGGACAAGGAGCGTTCCGACCTGGTCCAGGAGCTGCAGGTCATGAAGATGCTCGAACCTCACCCCAACGTCGTCCGACTCGTCGGCTGCTGCACCGAGAAAGATCCGCTGTTTGTGATCATGGAGTACGTCCCGCACGGCAAGTTGCAGAGCTTCTTGAGGAATTCGCGTGCCGAGCGTTACTATGGAAACCTCCACGGACCCAGCAACACCCTGACCTCTAGGGACCTCACCTCCTTCGTGTACCAGGTGGCCAGGGGCATGGAGTTCCTCTCCTCCAAAGGGATAATCCACAGGGACCTGGCGGCTCGGAACGTGCTGGTGGGAGAGAACCACGTGTGCAAAGTGGCCGACTTCGGCTTCGCGCGCGACGTCATCTCGAGCCACGTGTACGAGCGCAAGTCCGAAGGTCGACTGCCCATCCGTTGGATGGCCCCGGAGTCGCTGTACGACAACATCTTCTCGGTCAAGTCCGACGTCTGGAGCTTCGGGGTGCTCATCTGGGAGATCGTCACCCTCGGATCGACGCCCTACCCCGGGCTGGCGGCCGCCGAAGTCATGAAGAGGGTGCGGGACGGCTTCAGGCTGGACAAGCCCGAGCACTGTAGGCGCGAGCTCTACAACATCATGTACTACTGCTGGGACAAGGACCCCAAGGAGAGGCCCAGCTTCGGCGAGCTGGTGAAGCTGCTCGAGCAACTCTTGCTCACCGAGACGGAGTACATCGAGCTGGAGAGGTTCCCGGACCACTCGTACTACAACATGGTCAGCCTGAGCGACGAGAAGCTGTAG。
利用dsRNA设计网站E-RNAi(https://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3/)，将整个靶向的德国小蠊Cad96ca基因开放阅读框序列复制粘贴到网站中，通过设计参数筛选得到最佳的dsRNA靶向序列。然后设计引物:GGAAGCTCTGTCGCCATAGAAACAAGGCCA(SEQ IDNo.4)和ACACGAAGGAGGTGAGGTCCCTAGAGGTCA(SEQ ID No.5)。以cDNA为模板扩增得到含有靶向序列的DNA片段，并将其克隆改到pTOPO载体(Aidlab，China)中，测序验证序列是否存在碱基突变，挑选没有任何突变的克隆用于后续实验，载体命名为pTOPO-Cad96ca。dsRNA靶向的DNA序列如SEQ ID No.3所示。
SEQ ID No.3:
GGAAGCTCTGTCGCCATAGAAACAAGGCCAACAAGGACGACATGCAAAAGGAACCATCTGGAGGCATTGTCCTGGAGGAACCAATGGCGTTGCAGCATTGGAGAGGACCACGTGCTCACAGCAATCGATACGAGGGTTGGGATCGAGATTCCAATCAACAGCAGGCACCAGGGCCGGGCATTCCTAAGCCTGACGACCGCTGGGAGTTCCCCAGACATCGCCTCAAGGTCTTCAACATCCTCGGCGAGGGATGTTTCGGCCAAGTCTGGCGTTGCGAGGCCCTCGACATTGACGGTCGAGATGGCACCACCGTCGTGGCAGTGAAGACCCTCAAGGAGAACGCGTCGGACAAGGAGCGTTCCGACCTGGTCCAGGAGCTGCAGGTCATGAAGATGCTCGAACCTCACCCCAACGTCGTCCGACTCGTCGGCTGCTGCACCGAGAAAGATCCGCTGTTTGTGATCATGGAGTACGTCCCGCACGGCAAGTTGCAGAGCTTCTTGAGGAATTCGCGTGCCGAGCGTTACTATGGAAACCTCCACGGACCCAGCAACACCCTGACCTCTAGGGACCTCACCTCCTTCGTGT。
采用PCR在靶向序列两侧引入T7启动子，具体方法为用设计两端含有T7启动子的引物，引物序列为：GGATCCTAATACGACTCACTATAGG GGAAGCTCTGTCGCCATAGA(SEQ ID No.6)和GGATCCTAATACGACTCACTATAGG ACACGAAGGAGGTGAGGTCC(SEQ ID No.7)。以pTOPO-Cad96ca载体为模板进行扩增，得到两端含有T7启动子的PCR产物，然后利用T7RiboMAXTM ExpressRNAi System(购买自Promega Corporation)来合成正向和反向RNA，在T7 RNA聚合酶和DNaseI依次处理后将两条正反向的RNA混合并70℃处理10min，然后逐渐降温到室温使其退火变成dsRNA，序列为由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列和相对应的反向互补的核苷酸组成的双链RNA。
SEQ ID No.2：
GGAAGCUCUGUCGCCAUAGAAACAAGGCCAACAAGGACGACAUGCAAAAGGAACCAUCUGGAGGCAUUGUCCUGGAGGAACCAAUGGCGUUGCAGCAUUGGAGAGGACCACGUGCUCACAGCAAUCGAUACGAGGGUUGGGAUCGAGAUUCCAAUCAACAGCAGGCACCAGGGCCGGGCAUUCCUAAGCCUGACGACCGCUGGGAGUUCCCCAGACAUCGCCUCAAGGUCUUCAACAUCCUCGGCGAGGGAUGUUUCGGCCAAGUCUGGCGUUGCGAGGCCCUCGACAUUGACGGUCGAGAUGGCACCACCGUCGUGGCAGUGAAGACCCUCAAGGAGAACGCGUCGGACAAGGAGCGUUCCGACCUGGUCCAGGAGCUGCAGGUCAUGAAGAUGCUCGAACCUCACCCCAACGUCGUCCGACUCGUCGGCUGCUGCACCGAGAAAGAUCCGCUGUUUGUGAUCAUGGAGUACGUCCCGCACGGCAAGUUGCAGAGCUUCUUGAGGAAUUCGCGUGCCGAGCGUUACUAUGGAAACCUCCACGGACCCAGCAACACCCUGACCUCUAGGGACCUCACCUCCUUCGUGU。
本发明的实施例二为：dsRNA的应用(德国小蠊体内实验)：
为了验证本发明制备的靶向Cad96ca基因的dsRNA在德国小蠊表皮发育过程中的影响，对德国小蠊进行dsRNA注射的方式来实现。采用不靶向德国小蠊任何基因的CK作为dsRNA的阴性对照。
步骤如下：挑选刚蜕皮的5龄(N5)和6龄(N6)的德国小蠊进行饲养，在其蜕皮后的第二天将其低温麻醉后放在显微镜解剖台上，然后使用显微注射方法将靶向沉默Cad96ca基因的dsRNA按照一定的剂量注射到德国小蠊的腹部，总共注射一次，注射后持续观察dsRNA处理对德国小蠊蜕皮的影响，在使基因表达量降低的情况下研究Cad96ca基因对德国小蠊蜕皮的影响。其中，实验组和对照组各三个生物学重复，每个重复为德国小蠊10只，共60只。
验证结果如下：
(一)Cad96ca基因功能域分析：
使用在线基因功能域分析网站Pfam(https://pfam.xfam.org/ncbiseq/PF02008)对德国小蠊Cad96ca基因进行功能域分析，结果见图1，发现该基因中含有CP2转录因子核心元件，可以起到DNA的结合的功能。
(二)dsRNA对Cad96ca基因干扰效果验证：
在注射一次dsRNA后的48h将德国小蠊麻醉并进行解剖，将腹部表皮解剖出来并提取RNA，使用RN28-EASYspin Plus组织/细胞RNA快速提取试剂盒对脂肪体进行处理，按照试剂盒说明书进行操作。利用Nanodrop One对RNA浓度进行测定，然后量取2μg RNA进行反转录得到cDNA。利用premier 5引物设计软件设计qPCR引物，引物序列为：AGCGGAGACGGCAGAGAC(SEQ ID No.8)和ACGACCGAGATGGGGATG(SEQ ID No.9)通过对定量结果进行分析，检测靶基因干扰效果，结果如图2所示。从图2可以看出，经过dsRNA处理可以显著干扰靶基因Cad96ca的表达，而对照组则完全无干扰。
(三)德国小蠊蜕皮观察与死亡率统计：
与对照组(注射无法靶向德国小蠊任何内源基因的dsCK)进行比较，观察不同处理组德国小蠊的蜕皮异同，并进行统计。实验结果如图3所示，其中图3为5龄(N5)和6龄(N6)的德国小蠊形态图对照，从图3中可以看出注射对照组的德国小蠊可以正常蜕皮并顺利进入下一龄期；而Cad96ca基因干扰组的德国小蠊绝大多数出现蜕皮障碍。同时，由下表1统计的死亡率可以看出注射dsCad96ca后德国小蠊死亡率高达100％。因此，由上述结果可知本方案合成的dsRNA能够影响蟑螂的蜕皮和表皮生成过程，对蟑螂致死率高，可以达到蟑螂防治的目的。
死亡率结果如下表(表1)所示：
表1：死亡率统计
处理 dsCK dsCad96ca
数目(n) 60 60
死亡率(％) 0 100
dsCK靶向的DNA核苷酸序列为SEQ ID No.10所示，序列如下：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG。
本实施例中出现的dsCad96ca即表示本发明中合成的靶向Cad96ca基因的dsRNA。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 华南师范大学
梅州市华师昆虫发育生物学与应用技术重点实验室广梅园研发中心
<120> 与德国小蠊表皮发育相关的Cad96ca基因、该基因的dsRNA及其制备方法与应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1851
<212> DNA
<213> 德国小蠊(Blattella germanica)
<400> 1
atgattcgga actgggtcat ccaggacacg gttcccttgg gagaaatcgt cgccagggtg 60
agagccgagg actccgagat ggacagactc gtgtacgggt tggaacccaa gttcagtggc 120
ggaggcgcct acaacaagcc cttgcccttc gtcatcaaca acacgacggg catcgtcaag 180
gtcaacgact ctctcctcaa caggggcggc gagcagttcc tcctgtacgt cacagtgagc 240
gacggaaaac tgacgagcaa aaacgaagtt tgggtgaaga tcgtcaactc gtcagcggac 300
cccgattcgt ccaacatcaa cagtggcggg ccaccgctgg gggcggcgag tttcctgccg 360
aaattccact cccaataccc tgggggcggc aatagcggag gtggcatctt ccctcccccg 420
aacttgcaag gcttcagccg caaacctcgg cccccgcccc cgccaccccc accgcccctg 480
acgcccgaac aaacgcagac gtcactggcc actcaacacg aacccaccaa agcggagacg 540
gcagagacgc cgacgataaa ggtgccgacg ccacccccga cgagcaacgg gaccttggtg 600
acccccgcag agggcacagt gacctccgtg cctgacctgg gcgccactgt catccccatc 660
tcggtcgtgt gcgggctcgt catcatcgga ggcctgggcg cctggctctt ccggcggaag 720
ctctgtcgcc atagaaacaa ggccaacaag gacgacatgc aaaaggaacc atctggaggc 780
attgtcctgg aggaaccaat ggcgttgcag cattggagag gaccacgtgc tcacagcaat 840
cgatacgagg gttgggatcg agattccaat caacagcagg caccagggcc gggcattcct 900
aagcctgacg accgctggga gttccccaga catcgcctca aggtcttcaa catcctcggc 960
gagggatgtt tcggccaagt ctggcgttgc gaggccctcg acattgacgg tcgagatggc 1020
accaccgtcg tggcagtgaa gaccctcaag gagaacgcgt cggacaagga gcgttccgac 1080
ctggtccagg agctgcaggt catgaagatg ctcgaacctc accccaacgt cgtccgactc 1140
gtcggctgct gcaccgagaa agatccgctg tttgtgatca tggagtacgt cccgcacggc 1200
aagttgcaga gcttcttgag gaattcgcgt gccgagcgtt actatggaaa cctccacgga 1260
cccagcaaca ccctgacctc tagggacctc acctccttcg tgtaccaggt ggccaggggc 1320
atggagttcc tctcctccaa agggataatc cacagggacc tggcggctcg gaacgtgctg 1380
gtgggagaga accacgtgtg caaagtggcc gacttcggct tcgcgcgcga cgtcatctcg 1440
agccacgtgt acgagcgcaa gtccgaaggt cgactgccca tccgttggat ggccccggag 1500
tcgctgtacg acaacatctt ctcggtcaag tccgacgtct ggagcttcgg ggtgctcatc 1560
tgggagatcg tcaccctcgg atcgacgccc taccccgggc tggcggccgc cgaagtcatg 1620
aagagggtgc gggacggctt caggctggac aagcccgagc actgtaggcg cgagctctac 1680
aacatcatgt actactgctg ggacaaggac cccaaggaga ggcccagctt cggcgagctg 1740
gtgaagctgc tcgagcaact cttgctcacc gagacggagt acatcgagct ggagaggttc 1800
ccggaccact cgtactacaa catggtcagc ctgagcgacg agaagctgta g 1851
<210> 2
<211> 588
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggaagcucug ucgccauaga aacaaggcca acaaggacga caugcaaaag gaaccaucug 60
gaggcauugu ccuggaggaa ccaauggcgu ugcagcauug gagaggacca cgugcucaca 120
gcaaucgaua cgaggguugg gaucgagauu ccaaucaaca gcaggcacca gggccgggca 180
uuccuaagcc ugacgaccgc ugggaguucc ccagacaucg ccucaagguc uucaacaucc 240
ucggcgaggg auguuucggc caagucuggc guugcgaggc ccucgacauu gacggucgag 300
auggcaccac cgucguggca gugaagaccc ucaaggagaa cgcgucggac aaggagcguu 360
ccgaccuggu ccaggagcug caggucauga agaugcucga accucacccc aacgucgucc 420
gacucgucgg cugcugcacc gagaaagauc cgcuguuugu gaucauggag uacgucccgc 480
acggcaaguu gcagagcuuc uugaggaauu cgcgugccga gcguuacuau ggaaaccucc 540
acggacccag caacacccug accucuaggg accucaccuc cuucgugu 588
<210> 3
<211> 588
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggaagctctg tcgccataga aacaaggcca acaaggacga catgcaaaag gaaccatctg 60
gaggcattgt cctggaggaa ccaatggcgt tgcagcattg gagaggacca cgtgctcaca 120
gcaatcgata cgagggttgg gatcgagatt ccaatcaaca gcaggcacca gggccgggca 180
ttcctaagcc tgacgaccgc tgggagttcc ccagacatcg cctcaaggtc ttcaacatcc 240
tcggcgaggg atgtttcggc caagtctggc gttgcgaggc cctcgacatt gacggtcgag 300
atggcaccac cgtcgtggca gtgaagaccc tcaaggagaa cgcgtcggac aaggagcgtt 360
ccgacctggt ccaggagctg caggtcatga agatgctcga acctcacccc aacgtcgtcc 420
gactcgtcgg ctgctgcacc gagaaagatc cgctgtttgt gatcatggag tacgtcccgc 480
acggcaagtt gcagagcttc ttgaggaatt cgcgtgccga gcgttactat ggaaacctcc 540
acggacccag caacaccctg acctctaggg acctcacctc cttcgtgt 588
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggaagctctg tcgccataga aacaaggcca 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acacgaagga ggtgaggtcc ctagaggtca 30
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggatcctaat acgactcact ataggggaag ctctgtcgcc ataga 45
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggatcctaat acgactcact ataggacacg aaggaggtga ggtcc 45
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agcggagacg gcagagac 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acgaccgaga tggggatg 18
<210> 10
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717

Claims (6)

1.一种与德国小蠊表皮发育相关的Cad96ca基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种干扰与德国小蠊表皮发育相关的Cad96ca基因的dsRNA，其特征在于，所述dsRNA为由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列和与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列反向互补的核苷酸序列组成的双链RNA。
3.如权利要求2所述的dsRNA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将如SEQ IDNo.3所述的Cad96ca基因片段克隆到载体中作为模板，设计引物并通过PCR扩增后体外转录合成得到所述dsRNA。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，其中，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示。
5.如权利要求2所述的dsRNA在制备用于防治德国小蠊或影响德国小蠊表皮发育的产品中的应用。
6.如权利要求2所述的dsRNA在防控德国小蠊中的应用。
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