CN110606878B - 一种蛋白及其基因在控制植物种子性状中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蛋白及其基因在控制植物种子性状中的应用。所述植物种子性状包括植物所结的种子的籽粒大小、所述种子的粒重、所述种子的产量和所述种子的含油量中的至少一种，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

Description

一种蛋白及其基因在控制植物种子性状中的应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白及其基因在控制植物种子性状中的应用，特别是该蛋白在控制植物所结的种子的籽粒大小、所述种子的粒重、所述种子的产量和所述种子的含油量中的至少一种中的应用。

背景技术

随着人们生活水平的提高，对油脂的需求量日益增大。

油菜是世界第二大油料作物,也是中国重要的油料作物，菜籽油占国产食用植物油的近57％。决定油菜产油量高低的两个最重要构成因子是种子含油量和单位面积种子产量，因此，提高产量和含油量是提高油菜产油量的重要途径。粒重是构成甘蓝型油菜的单株产量重要构成因子之一，发掘控制粒重、种子含油量等性状方面的基因，对提高油菜生产、满足人类的油脂需求具有重要意义。

发明内容

本发明之一提供了一种蛋白在控制植物所结的种子的籽粒大小(种子的长和/或宽)、所述种子的粒重(可以以平均的单粒、百粒重或千粒重来计)、所述种子的产量和所述种子的含油量中的至少一种中的应用，其中所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

在一个具体实施方式中，在所述植物的生长阶段，在所述植物中存在所述蛋白时，能够提高所述籽粒大小(种子的长和/或宽)、所述种子的粒重、所述种子的产量和所述含油量中的至少一种，其中，这些性状的提高是相对于植物中不存在所述蛋白或所述蛋白的表达量更少的情况来讲的；在所述植物的生长阶段，在所述植物中不存在所述蛋白时，能够降低所述籽粒大小、所述粒重、所述种子的产量和所述含油量中的至少一种；其中，这些性状的降低是相对于植物中存在所述蛋白或所述蛋白的表达量更多的情况来讲的。

在一个具体实施方式中，所述植物为芸薹属(Brassica)中的植物中的至少一种。

在一个具体实施方式中，所述植物为白菜型油菜(Brassica rapa(campestris)L)、芥菜型油菜(Brassica juncea L.)、甘蓝型油菜(Brassica napus L.)、埃塞俄比亚芥(Brassica carinata Braun)、甘蓝(Brassica oleracea L.)和黑芥(Brassica nigraKoch)中的至少一种。

本领域的技术人员公知，一般对于蛋白来讲，其通常具有保守区域和可变区域，当改变其中的保守区域的一个或多个氨基酸时，虽然不必然导致改变蛋白的功能、使蛋白的功能减弱、使蛋白的功能增强或使蛋白的功能消失，但产生这些可能的情况的几率是非常大的；而当改变其中的可变区域的一个或多个氨基酸时，则一般不会影响该蛋白原有的功能。因此，在一个具体实施方式中，所述蛋白的氨基酸序列具有与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列75％以上的一致性，且与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

在一个具体实施方式中，所述蛋白的氨基酸序列具有与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列85％以上的一致性，且与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

在一个具体实施方式中，所述蛋白的氨基酸序列具有与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列95％以上的一致性，且与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

在一个具体实施方式中，所述蛋白的氨基酸序列具有与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列99％以上的一致性，且与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

本发明之二提供了一种核苷酸在控制植物所结的种子的所述籽粒大小、所述种子的粒重、所述种子的产量和所述种子的含油量中的至少一种中的应用，其中所述核苷酸能够编码如本发明之一中任意一项所述的应用中的所述蛋白。

例如，在一个具体实施方式中，所述核苷酸能够编码的蛋白的氨基酸序列如SEQID No.2所示。

例如，在一个具体实施方式中，所述核苷酸能够编码与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列75％以上的一致性，且与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的蛋白。

例如，在一个具体实施方式中，所述核苷酸能够编码与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列85％以上的一致性，且与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的蛋白。

例如，在一个具体实施方式中，所述核苷酸能够编码与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列95％以上的一致性，且与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的蛋白。

例如，在一个具体实施方式中，所述核苷酸能够编码与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列99％以上的一致性，且与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的蛋白。

在一个具体实施方式中，所述核苷酸如SEQ ID No.1所示。

在一个具体实施方式中，在所述植物的生长阶段，在所述植物中存在所述核苷酸且所述核苷酸能够表达出所示蛋白时，能够提高所述籽粒大小、所述种子的粒重、所述种子的产量和所述含油量中的至少一种；

在所述植物的生长阶段，在所述植物中不存在所述核苷酸时，能够降低所述籽粒大小、所述种子的粒重、所述种子的产量和所述含油量中的至少一种。

在一个具体实施方式中，所述植物为芸薹属(Brassica)中的植物中的至少一种。

在一个具体实施方式中，所述植物为白菜型油菜(Brassica rapa(campestris)L)、芥菜型油菜(Brassica juncea L.)、甘蓝型油菜(Brassica napus L.)、埃塞俄比亚芥(Brassica carinata Braun)、甘蓝(Brassica oleracea L.)、黑芥(Brassica nigraKoch)中的至少一种。本发明的有益效果：

本发明首次发现如SEQ ID No.2所示的蛋白能够显著提高植物(例如拟南芥)的粒重，种子的长和/或宽，种子的产量以及含油量。通过将其所对应的基因在植物中超表达，可以改善植物的上述多种性状，例如，包括可提高籽粒大小、种子的粒重、种子的产量和含油量。基于此，为了使籽粒更重、籽粒更大(包括籽粒的长和/或宽)、种子的产量更高或者含油量更高，需要使植物在生长阶段有如SEQ ID No.2所示的蛋白存在，并通过现有已知的生物技术手段使如SEQ ID No.2所示的蛋白尽量多的存在，或比原有水平(此种情况下指的是原来存在一定量的表达)更多量的存在。例如通过过表达(或称之为超表达)的方式使植物植株内积累更多的如SEQ ID No.2所示的蛋白。

附图说明

图1显示了如SEQ ID No.2所示的蛋白的保守结构域分析。

图2显示了转化BnRS31基因的拟南芥株系1-12的转录水平。其中，WT为野生型对照，31720-1至31720-10依次为按照1至10的顺序编号的10株阳性苗。**表示在P<0.01水平下具有极显著差异。

图3显示了种子形态图。其中，WT为野生型对照，31720-3、31720-7和31720-8依次为编号3、7和8的阳性苗。标尺＝0.5mm。

图4显示了种子的平均长度和宽度。其中，WT为野生型对照，31720-3、31720-7和31720-8依次为编号3、7和8的阳性苗。**表示在P<0.01水平下具有极显著差异。

图5显示了种子的百粒重。其中，WT为野生型对照，31720-3、31720-7和31720-8依次为编号3、7和8的阳性苗。**表示在P<0.01水平下具有极显著差异。

图6显示了拟南芥植株的单株产量。其中，WT为野生型对照，31720-3、31720-7和31720-8依次为编号3、7和8的阳性苗。*表示在P<0.05水平下具有显著差异。

图7显示了种子的含油量。其中，WT为野生型对照，31720-3、31720-7和31720-8依次为编号3、7和8的阳性苗。**表示在P<0.01水平下具有极显著差异。

具体实施方式

以下通过优选的实施案例的形式对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但其不构成对本发明的限制。

如无特别说明，本发明的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。

MS培养基：M519(phytotechlab)4.4g、蔗糖30g，琼脂8g，用蒸馏水补至1升，pH5.8。

1.基因的克隆与过表达载体构建

(1)基因的克隆与序列分析

从油菜基因组数据库Genoscope(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)中获得BnRS31基因的gDNA序列(SEQ ID No.1)，其能够编码的蛋白具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。该蛋白的分子量为31.751kDa，等电点9.62。

通过PFAM保守结构域分析，该蛋白含有RRM结构域(图1)，序列中的第1位至69位为RRM蛋白的保守结构域，其他为可变区，那么保守区占比为25％，可变区占比为75％。

根据上述gDNA序列设计扩增该基因全长的引物，并在引物部分引入酶切位点(KpnI/XbaI)和保护碱基，引物为31720-F(SEQ ID No.3)和31720-R(SEQ ID No.4)。以CTAB法提取的提取甘蓝型油菜品种Westar叶片的DNA，以所提取得DNA为模板，利用31720-F/31720-R为引物，扩增获得该基因的全长DNA序列，并克隆至克隆载体PMD-18T，转化大肠杆菌DH5α，并对转化产物进行培养，对培养出的重组子进行PCR和测序检测，获得阳性质粒，命名为PMD-3172。

(2)表达载体构建

KpnI/XbaI双酶切质粒PMD-3172和表达载体pCambia2301-KY，回收目的基因片段和载体骨架连接，转化大肠杆菌DH5α。利用载体上目的基因上游35S启动子的引物(35S-F(SEQ ID No.5))和基因的下游引物(31720-R)进行PCR鉴定，结合KpnI/XbaI双酶切检测，获得阳性质粒，命名为pCa-3172。

2.转化拟南芥和转基因植株的筛选鉴定

将pCa-3172质粒转化农杆菌GV3101，并检测阳性菌落。利用农杆菌介导的拟南芥遗传转化方法，将pCa-3172质粒转入拟南芥，然后于22℃，16h光照/8h黑暗条件下培养，收取T1代种子，在含有卡那霉素的培养基初步筛选阳性苗。将阳性苗种植到土壤中，并提取4周拟南芥叶片gDNA，用引物35S-F和31720-R对阳性苗进一步鉴定，结果显示，所检测的10株苗均为阳性苗，将10株阳性苗按照1至10的顺序编号为31720-1至31720-10。

将1至10号转基因拟南芥的T2代种子，在含有卡那霉素的MS培养基上培养并进行筛选，用不含卡那霉素的MS培养基培养野生拟南芥作为对照。提取拟南芥野生型和1至10号转基因拟南芥的RNA，逆转录得到cDNA，用引物RTf1(SEQ ID No.6)和RTr1(SEQ ID No.7)检测各个株系目标BnRS31基因的转录水平，结果见图2。选取表达量较高的3、7和8号转基因拟南芥继续种植，直到获得这3个株系的T3代纯合体阳性苗，得到3、7和8号转基因拟南芥的纯合体种子。

3.转基因拟南芥T3代植株表型鉴定

将获得的3、7和8号转基因纯合体的种子和野生型Col种子在MS培养基萌发并培养至4叶期，挑选长势一致的移栽到土壤中(营养土：蛭石为1:3)，每盆移栽3株(相同株系)，且3、7和8号转基因拟南芥和野生型每个株系移栽3盆，将其放置于温度22℃，16h光照/8h黑暗条件下培养，每次浇等量的水，尽量保证其生长环境的一致性。

收取T3代的种子烘干，用扫描仪扫描种子的形态，用万深的自动考种分析仪软件统计种子的长和宽，同时统计其百粒重和单株产量；利用红外分析技术检测油菜籽含油量测定种子的含油量，结果见图3至7。从种子形态和统计测量数据可以发现，目标BnRS31基因过表达株系种子的长度和宽度、百粒重和含油量都极显著或显著高于野生型；31720-3和31720-8的单株产量显著高于野生型。

序列表

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 一种蛋白及其基因在控制植物种子性状中的应用

<130> LHA1960548

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1343

<212> DNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L.)

<400> 1

atgcttacta caccatggaa acgcctctac atctcttgta caccagcctt cacatatatg 60

caggtgtttt atatatctat ttagctattt tatagggcac acttgttttg ctttattggc 120

tgatcaacag cattgcaggt tttatggacc ggagggactg tcaatctttg tgtcgcattt 180

ttcttattct cgtgttttta tattgcaggg tttggttttg tgtattttga agatgaacgg 240

gatgctgaag atgcaatccg caagcttcac aactaccgtt ttgagaaacg cacgctatca 300

gttgaatggg ggagggtata tatatatagt gttctcgttt ttttttcgtg aagctgatca 360

ctttgtttcc tacttgttaa aaactcttta cttgtctggc tttcagggtt aacgcagcag 420

gcatggtgat gggtcatatc agaagcctac aaagacattg tttgtctgca acttcgactc 480

ctttagaaca aaagaagtcg acattgtaga gcactttcaa ccctatggaa aggtcatcaa 540

cgtacgtatg aggagcaact acttatttgc tcagtttgca actcaagaag aagctacaaa 600

agcccttgag gctactcaaa gaaggtaaat agcaacacag ccgcctgata ctttttcttt 660

atccaaatat ttaacatggt ggtggtggta gcagcttttt ttttatcgaa cacatcacct 720

tttgtgcctg cagccaaata ttgggcaagg ttattgctgt tgagtatggc ttaaaagatg 780

atgatgaaag agatgaccga cgtggtggtg gtagtccgaa gagatctcct agccctgcgt 840

atcgtatcat aggcgtccca ttcctgatta tggtcgtcct cgaagcctga atatgacaga 900

ggcaggagtc cagcagctta tgttagaggc aggaggagtc catcagctta tgacagacgc 960

gggaggagtc catcagctta tgacagacgc gggaggagtc cgtcacctta tgacagacgc 1020

aggaggagtc catcagctta tgaaagacgc aagagtccag cagcttgtga aagacgcatg 1080

agtccagcag attatggaca taggagtcct gataatggta gacaaaggag tccttcttat 1140

gacagataca gaaggtaaat tatagtaatg gctttggttt atcacttgca ctcattggga 1200

tgtctctgta aatgttgatg gtaatgtttt gattgtatag tctatctcca gttccaagag 1260

gaagaaaagc tgaagaatat gagaagagtg cagaaccaga agctaccaag aatgcttgtg 1320

acacaatggt atctcggccg tag 1343

<210> 2

<211> 276

<212> PRT

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L.)

<400> 2

Met Glu Thr Pro Leu His Leu Leu Tyr Thr Ser Leu His Ile Tyr Ala

1 5 10 15

Gly Phe Gly Phe Val Tyr Phe Glu Asp Glu Arg Asp Ala Glu Asp Ala

20 25 30

Ile Arg Lys Leu His Asn Tyr Arg Phe Glu Lys Arg Thr Leu Ser Val

35 40 45

Glu Trp Gly Arg Val Tyr Ile Tyr Ser Val Leu Val Phe Phe Ser Arg

50 55 60

His Gly Asp Gly Ser Tyr Gln Lys Pro Thr Lys Thr Leu Phe Val Cys

65 70 75 80

Asn Phe Asp Ser Phe Arg Thr Lys Glu Val Asp Ile Val Glu His Phe

85 90 95

Gln Pro Tyr Gly Lys Val Ile Asn Val Arg Met Arg Ser Asn Tyr Leu

100 105 110

Phe Ala Gln Phe Ala Thr Gln Glu Glu Ala Thr Lys Ala Leu Glu Ala

115 120 125

Thr Gln Arg Ser Gln Ile Leu Gly Lys Val Ile Ala Val Glu Tyr Gly

130 135 140

Leu Lys Asp Asp Asp Glu Arg Asp Asp Arg Arg Gly Gly Gly Ser Pro

145 150 155 160

Lys Arg Ser Pro Ser Pro Ala Gly Arg Ser Pro Ala Ala Tyr Val Arg

165 170 175

Gly Arg Arg Ser Pro Ser Ala Tyr Asp Arg Arg Gly Arg Ser Pro Ser

180 185 190

Ala Tyr Asp Arg Arg Gly Arg Ser Pro Pro Ser Ala Tyr Glu Arg Arg

195 200 205

Lys Ser Pro Ala Ala Cys Glu Arg Arg Met Ser Pro Ala Asp Tyr Gly

210 215 220

His Arg Ser Pro Asp Asn Gly Arg Gln Arg Ser Pro Ser Tyr Asp Arg

225 230 235 240

Tyr Arg Ser Leu Ser Pro Val Pro Arg Gly Arg Lys Ala Glu Glu Tyr

245 250 255

Glu Lys Ser Ala Glu Pro Glu Ala Thr Lys Asn Ala Cys Asp Thr Met

260 265 270

Val Ser Arg Pro

275

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ggggtaccat gcttactaca ccatgg 26

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

gctctagact acggccgaga taccattg 28

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

gacgcacaat cccactatcc 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

ggagtcctcc atcagcttat g 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

gcttctggtt ctgcactctt 20

Claims (5)

1.一种蛋白在控制植物所结的种子的籽粒大小、所述种子的粒重、所述种子的产量和所述种子的含油量中的至少一种中的应用，其中所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述植物为白菜型油菜(Brassica rapa(campestris)L)、芥菜型油菜(Brassicajuncea L.)和甘蓝型油菜(Brassica napus L.)中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在所述植物的生长阶段，在所述植物中存在所述蛋白时，能够提高所述籽粒大小、所述种子的粒重、所述种子的产量和所述含油量中的至少一种；

在所述植物的生长阶段，在所述植物中不存在所述蛋白时，能够降低所述籽粒大小、所述粒重、所述种子的产量和所述含油量中的至少一种。

3.一种核苷酸在控制植物所结的种子的所述籽粒大小、所述种子的粒重、所述种子的产量和所述种子的含油量中的至少一种中的应用，其中所述核苷酸能够编码如权利要求1或2所述的应用中的所述蛋白。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述核苷酸如SEQ ID No.1所示。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在所述植物的生长阶段，在所述植物中存在所述核苷酸且所述核苷酸能够表达出所示蛋白时，能够提高所述籽粒大小、所述种子的粒重、所述种子的产量和所述含油量中的至少一种；

在所述植物的生长阶段，在所述植物中不存在所述核苷酸时，能够降低所述籽粒大小、所述种子的粒重、所述种子的产量和所述含油量中的至少一种。

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