CN110412266A

CN110412266A - 用于同时检测IL-1β、IL-1Ra和IL-1Ra/IL-1β比值的胶体金试纸条

Info

Publication number: CN110412266A
Application number: CN201910710708.9A
Authority: CN
Inventors: 任洪林; 鞠丹迪; 谭双; 张英; 卢士英; 胡盼; 柳增善; 王海波; 常江; 张士军; 柳溪林; 常恒祯; 李岩松
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2019-08-02
Filing date: 2019-08-02
Publication date: 2019-11-05

Abstract

本发明提供了一种用于同时检测IL‑1β、IL‑1Ra含量和IL‑1Ra/IL‑1β比值的胶体金试纸条及其应用，涉及免疫检测技术领域；所述胶体金试纸条，包括玻璃纤维垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维素垫上包被有胶体金标记的同时结合IL‑1β和IL‑1Ra的抗IL‑1β‑1Ra‑2兔源多克隆抗体；所述硝酸纤维素膜依次包括检测线T1、检测线T2和质控线；所述检测线T1上包被有结合IL‑1β的抗IL‑1β‑1的豚鼠源多克隆抗体；所述检测线T2上包被有结合IL‑1Ra的抗IL‑1Ra‑1的豚鼠源多克隆抗体；所述质控线上包被有羊抗兔抗体。本发明提供的胶体金试纸条具有特异、便捷、成本低、重复性好等优点。

Description

用于同时检测IL-1β、IL-1Ra和IL-1Ra/IL-1β比值的胶体金试纸条

技术领域

本发明涉及免疫检测技术领域，具体涉及一种用于同时检测IL-1β、IL-1Ra和IL-1Ra/IL-1β比值的胶体金试纸条。

背景技术

细胞因子作为炎性疾病研究热点，检测方法层出不穷。IL-1β与IL-1Ra的检测方法主要有免疫学检测法、胞内细胞因子检测法、生物活性检测法、分子生物学方法等。依靠流式细胞术的细胞因子检测方法，操作繁琐价格昂贵，不利于现场检测与基层的推广应用。生物学活性检测法灵敏度较高但是特异性差，且对温度、样品组成等外界环境要求较高。

目前市面上最常见的检测方法为免疫学方法，使用率最高的为酶联反应试剂盒，操作较为简单。但现有商品化试剂盒只能分别检测IL-1β与IL-1Ra，不能同时检测两者数量并计算比值。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于同时检测IL-1β、IL-1Ra含量和IL-1Ra/IL-1β比值的胶体金试纸条及其应用，本发明提供的胶体金试纸条具有特异、便捷、成本低、重复性好等优点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种用于同时检测IL-1β、IL-1Ra含量和IL-1Ra/IL-1β比值的胶体金试纸条，包括玻璃纤维垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维素垫上包被有胶体金标记的同时结合IL-1β和IL-1Ra的抗IL-1β-1Ra-2兔源多克隆抗体；所述硝酸纤维素膜依次包括检测线T1、检测线T2和质控线；所述检测线T1上包被有结合IL-1β的抗IL-1β-1的豚鼠源多克隆抗体；所述检测线T2上包被有结合IL-1Ra的抗IL-1Ra-1的豚鼠源多克隆抗体；所述质控线上包被有羊抗兔抗体。

优选地，所述胶体金标记的抗IL-1β-1Ra-2的兔源多克隆抗体的用量为1.0～1.4μg/100μL。

优选地，所述检测线T1上包被的抗IL-1β-1的豚鼠源多克隆抗体的浓度为1.8～2.2mg/mL。

优选地，所述检测线T2上包被的抗IL-1Ra-1的豚鼠源多克隆抗体的浓度为0.8～1.2mg/mL。

优选地，所述质控线上包被的羊抗兔抗体的浓度为0.6～1.0mg/mL。

本发明还提供了上述技术方案所述的胶体金试纸条在制备检测样品IL-1β和IL-1Ra的浓度的试剂盒中应用。

优选地，包括以下步骤：

(1)将待测样品滴加到玻璃纤维垫；

(2)待质控线显色后，观察检测线是否由无色变为红色；检测线变为红色，待测样品含有IL-1β和IL-1Ra；检测线不变色，待测样品中IL-1β和IL-1Ra含量低于检测限。

本发明还提供了上述技术方案所述的胶体金试纸条在制备检测样品IL-1Ra与IL-1β的比值的试剂盒中应用。

优选地，所述样品包括布鲁氏菌病相关血样，包括布鲁氏菌病感染动物血样、布鲁氏菌病疫苗免疫动物血样、健康未免疫布鲁氏菌病疫苗动物血样。

本发明提供了一种用于同时检测IL-1β、IL-1Ra含量和IL-1Ra/IL-1β比值的胶体金试纸条及其应用。本发明提供的胶体金试纸条使用同种金标抗体，能够同时测定IL-1β与IL-1Ra的数值并做出比值，能够排除不同批次间样品检测误差。本发明提供的胶体金试纸条IL-1β的检测限为0.7ng/mL，IL-1Ra的检测限为1.0ng/mL。

本发明设置的检测抗体为能够同时识别并结合IL-1β与IL-1Ra的IL-1β-1Ra-2抗体。本发明在设置双T线位置时，将IL-1β的捕获抗体作为T1线，标记在靠近金标垫的位置，将IL-1Ra的捕获抗体作为检测线T2线标记在硝酸纤维素膜(NC)膜中间位置，使得结合到IL-1β的胶体金探针会先被IL-1β的捕获抗体捕获，结合到IL-1Ra的胶体金探针会与检测线T2线IL-1Ra的捕获抗体结合，这样IL-1Ra和IL-1β做出的比值对结果影响较小。

附图说明

图1为相关重组蛋白SDS-PAGE结果图，A中1表示IL-1β-1诱导；2表示IL-1β-1未诱导；B中3表示IL-1Ra-1诱导；4表示IL-1Ra-1未诱导；C中5表示IL-1β-1Ra-2诱导；6表示IL-1β-1Ra-2未诱导；D中7表示IL-1β未诱导；8表示IL-1β诱导；E中9表示IL-1Ra诱导；10表示IL-1Ra未诱导；M表示ProteinMarker；

图2为相关重组蛋白的Westernblot结果图，1表示IL-1β-1未诱导；2表示IL-1β-1诱导；3表示IL-1Ra-1未诱导；4表示IL-1Ra-1诱导；5表示IL-1β-1Ra-2未诱导；6表示IL-1β-1Ra-2诱导；7表示IL-1β未诱导；8表示IL-1β-1诱导；9表示IL-1Ra未诱导；10表示IL-1Ra诱导；M表示Marker；

图3为相关重组蛋白纯化SDS-PAGE结果图，1表示IL-1Ra纯化；2表示IL-1β纯化；3表示IL-1β-1纯化；4表示IL-1Ra-1纯化；5表示IL-1β-1Ra-2纯化；M表示Marker；

图4为纯化后抗体电泳图，1表示抗IL-1β-1豚鼠源多抗；2表示抗IL-1Ra-1豚鼠源多抗；3表示抗IL-1β-1Ra-2兔源多抗；

图5为Westernblot分析抗体结合目标蛋白特性结果图，(A)中1表示抗IL-1β-1Ra抗体与IL-1β重组蛋白，2表示抗IL-1β-1Ra抗体与IL-1Ra重组蛋白；(B)中1表示抗IL-1β-1抗体与IL-1Ra重组蛋白，2表示抗IL-1β-1抗体与IL-1β重组蛋白；(C)中1表示抗IL-1Ra-1抗体与IL-1Ra重组蛋白，2表示抗IL-1Ra-1抗体与IL-1β重组蛋白；M表示Marker；

图6为胶体金溶液紫外扫描图谱；

图7为胶体金探针鉴定结果图，1表示阴性结果；2表示IL-1Ra阳性，IL-1β阴性；3表示IL-1β阳性，IL-1Ra阴性；4表示全阳性结果；

图8为金标探针pH值图；

图9为金标探针抗体用量图；

图10为NC膜的结果图，1表示sartorius95；2表示millipore135；3表示millipore180；4表示sartorius140；

图11为抗体浓度结果图；

图12为IL-1β的标准曲线图；

图13为IL-1Ra的标准曲线图；

图14为本发明与市售试剂盒样品检测IL-1Ra/IL-1β比值对比图，其中，左侧条形图为本发明试剂盒，右侧条形图为市售试剂盒；

图15为部分血清样本虎红平板凝集试验结果图，其中A为健康未免疫布病疫苗羊；B为免疫布病疫苗羊；C为布鲁氏菌病感染羊；D为阴性对照和阳性对照；

图16为羊免疫组、健康组和感染组血清样本中IL-1Ra/IL-1β比值差异分析图；

图17为羊血清样本IL-1Ra/IL-1β比值诊断指标的ROC曲线分析图，其中，A为健康组与免疫组IL-1Ra/IL-1β比值的ROC分析；B为健康组与感染组IL-1Ra/IL-1β比值的ROC分析；C为免疫组与感染组IL-1Ra/IL-1β比值的ROC分析。

具体实施方式

本发明对所述玻璃纤维垫的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。在本发明中，所述玻璃纤维垫作为上样垫。本发明所述的玻璃纤维素垫上优选包被有胶体金标记的抗IL-1β-1Ra-2兔源多克隆抗体，所述抗IL-1β-1Ra-2兔源多克隆抗体为检测用抗体，所述抗IL-1β-1Ra-2抗体效价为1:64000。

在本发明中，所述胶体金标记的抗IL-1β-1Ra-2兔源多克隆抗体的用量优选为1.0～1.4μg/100μL，更优选为1.2μg/100μL。

本发明对所述硝酸纤维素膜的种类没有特殊限定，优选包括sartorius95、millipore135、millipore180或sartorius140。本发明对所述硝酸纤维素膜的来源没有特殊限定采用常规市售产品即可。

在本发明中，所述检测线T1上包被的抗IL-1β-1的豚鼠源多克隆抗体的浓度优选为1.8～2.2mg/mL，更优选为2mg/mL。所述检测线T2上包被的抗IL-1Ra-1的豚鼠源多克隆抗体的浓度优选为0.8～1.2mg/mL，更优选为1mg/mL。在本发明中，所述抗IL-1β-1的豚鼠源多克隆抗体和抗IL-1Ra-1的豚鼠源多克隆抗体优选为捕获用抗体，所述抗IL-1β-1抗体效价为1:128000，抗IL-1Ra-1抗体效价为1:128000。

在本发明中，所述质控线上包被的羊抗兔抗体的浓度优选为0.6～1.0mg/mL，更优选为0.8mg/mL。

本发明还提供了上述技术方案所述的胶体金试纸条在制备检测样品IL-1β和IL-1Ra的浓度的试剂盒中应用。优选包括以下步骤进行检测：(1)将待测样品滴加到玻璃纤维垫；(2)待质控线显色后，观察检测线是否由无色变为红色；检测线变为红色，待测样品含有IL-1β和IL-1Ra；检测线不变色，待测样品中IL-1β和IL-1Ra含量低于检测限。

本发明待测样品在侧流层析作用下流动，流经双T(T1和T2)线时，金标探针分别与IL-1β与IL-1Ra捕获抗体结合显色，过量的金标探针在C线处与羊抗兔抗体结合显色，样品中检测物含量越大，T线红色越深。C线作为质控线，无论是否在样品中检测到靶标物质，C线都会显色。若C线不显色，则胶体金探针制备失败，不能组成胶体金试纸条。

本发明还提供了上述技术方案所述的胶体金试纸条在制备检测样品IL-1Ra和IL-1β的比值的试剂盒中应用。所述样品优选包括布鲁氏菌病相关血样，包括布鲁氏菌病感染动物血样、布鲁氏菌病疫苗免疫动物血样、健康未免疫布鲁氏菌病疫苗动物血样。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

IL-1β和IL-1Ra全长及结构域蛋白的表达与制备

1.1材料

1.1.1耗材

小量质粒提取试剂盒，购于爱思进(杭州)生物技术公司；琼脂糖，购于西班牙Biowest公司；甘氨酸、丙烯酰胺、过硫酸铵、三氯甲烷、无水乙醇、冰醋酸，购于北京化工厂；蛋白胨、酵母粉，购于英国OXOID公司；ProteinMarker，购于Genstar康润生物有限公司。

1.1.2仪器设备

双垂直电泳槽，购于北京爱普华美生物科技有限公司；凝胶成像仪分析***，购于美国UVP公司；水平摇床，购于北京六一仪器厂；恒温培养箱，购于上海实验仪器厂有限公司；低温高速离心机，购于美国DNR公司；电子天平、丹佛酸度计，购于丹佛仪器公司；AKTA蛋白纯化***，购于美国通用电气公司。

1.1.3主要试剂制备

LB液体培养基：酵母粉：蛋白胨：NaCl比例为1：2：2，比例基数为1g时，加蒸馏水定容至200mL。高压蒸汽灭菌后，室温降温后4℃短期保存。

LB固体培养基：酵母粉：蛋白胨：NaCl：琼脂粉比例为1：2：2：3，比例基数为1g时，加蒸馏水定容至200mL。高压蒸汽灭菌。倒入平板中，室温放凉至凝固。封口膜封口后，4℃短期保存保存。平板操作应在无菌操作间。

10％过硫酸铵：过硫酸铵0.3g，二馏水1mL，混匀。现用现配。

考马斯亮蓝R-250染色液：250mL异丙醇作为溶剂溶解1gR-250，加100mL乙酸后用去离子水定容至1L。

SDS-PAGE电泳缓冲液：称取Tris15.1g，SDS5.0g，Glycine94g，用800mL去离子水溶解后定容至1L。

膜转移缓冲液：分别称取Glycine2.9g，Tris5.8g，SDS0.37g，溶解在600mL去离子水中后定容至800mL，加入甲醇200mL。

TBST：8.8g氯化钠，20mLTris-HCl(1M，pH8.O)，溶解在800mL去离子水中，加入0.5mLTween20，使用去离子水定容至1L。

封闭缓冲液：5g脱脂奶粉，溶于100mLTBST溶液。

1.2方法

1.2.1质粒提取

已构建全长IL-1β、全长IL-1Ra和IL-1β-1片段、IL-1Ra-1片段、IL-1β-1Ra-2片段(参见(郭兴硕士学位论文,吉林大学,2015年6月)；(水一鸣硕士学位论文,吉林大学,2018年12月))的表达载体，保存在DH5α感受态中。所有重组蛋白均融合标签，IL-1β-1片段、IL-1Ra-1片段、IL-1β-1Ra-2片段融合MBP蛋白。为取得DH5α感受态中的质粒，分别取5mL液体LB培养基，每支培养基试管中加入100μL保存的菌种。IL-1β、IL-1Ra菌种的培养基中分别加入5μL卡那霉素，IL-1β-1、IL-1Ra-1、IL-1β-1Ra-2菌种的培养基中分别加入5μL氨苄西林，37℃摇床中培养8h，离心机8000rpm1min后取沉淀菌体提取质粒。试剂盒提取质粒步骤如下。

1.取5mL37℃培养8h的菌液，离心1min，转速12000rpm(后续步骤转速同此)，取沉淀加入250μLBufferS1均匀重悬。

2.重悬液中加入250μLBufferS2，轻柔翻转4-6次，当菌液透亮时菌体即可得到充***解。此步骤应操作迅速，不可放置超过5min，动作务必轻柔，否则会导致DNA污染和BufferS2失活。

3.已得到充***解的菌体溶液中加入350μLBufferS3，轻柔翻转6-8次后离心10min。此步骤翻转动作务必轻柔，否则会导致DNA污染。

4.取步骤3中离心所得上清，加入制备管中，制备管置于1.5mL离心管中，离心1min，弃滤液。

5.在步骤4的制备管中，加入500μLBufferW1，离心1min后弃滤液。

6.在步骤5的制备管中，加入BufferW2700μL，离心1min，弃滤液。重复此步骤两次，确保盐分彻底清除。

7.取步骤6中的制备管放置在新离心管中，提前预热Eluent至65℃，取50μL加在制备管中心，室温静置1min使其充分反应，离心1min。滤液即为所得质粒。

1.2.2重组蛋白的表达

将上步骤取得的质粒，分别转化入表达菌中。IL-1β、IL-1Ra质粒转化入BL21conden Plus表达菌中，IL-1β-1、IL-1Ra-1、IL-1β-1Ra-2质粒转化入BL21表达菌中，转化方法如下。

1.从-80℃超低温冰箱中取BL21/BL21condenPlus表达菌，放入冰盒中冰浴5min。

2.分别取质粒5μL加入各自表达菌种，轻轻混匀，冰水浴30min。冰盒中冰内添加少量水，让EP管与冰水充分接触。

3.产物42℃电浴90s。

4.冰浴10min。

5.产物中加入LB培养基450μL，37℃电浴10min。

6.产物放入37℃摇床中，85rpm培养20min。提速至100rpm，转动10min。提速至120rpm，转动10min。

7.分别取100μLIL-1β、IL-1Ra产物涂布于含有0.1％卡那霉素的LB固体培养基平板上，IL-1β-1、IL-1Ra-1、IL-1β-1Ra-2产物涂布于含有0.1％氨苄的LB固体培养基平板上。37℃培养12h。

8.分别挑取单克隆菌落，扩大培养后，送至库美技术有限公司长春部门进行测序。测序所得结果进行比对确认。

取1.2.2中测序准确的菌液，IL-1β、IL-1Ra接种于含有0.1％卡那霉素的LB液体培养基中，IL-1β-1、IL-1Ra-1、IL-1β-1Ra-2接种于含有0.1％氨苄的LB液体培养基中。37℃摇床中震荡2h，转速为170rpm。按0.1％的比例加入IPTG诱导剂，继续37℃摇床中震荡6h。取出菌液经低温离心机8000rmp离心10min，取菌体沉淀。用SDS-PAGE电泳验证是否表达蛋白，步骤如下。

a)电泳样品的处理：取诱导菌液1mL和作为对照的未诱导组菌液1mL，离心1min，弃上清取菌体沉淀。1mL菌液的菌体沉淀用80μLPBS悬起，吹吸均匀后，加入20μL上样缓冲液。离心管口包裹封口膜防止爆开，沸水中煮10min，低速离心30s，取上清作为样品。

b)配胶：取清洁干燥的凝胶板安装在电泳槽中，确认安装严密不漏液后，加入9mL12％浓度的下层分离胶，加入1mL异丙醇压至气泡消失且液面平整，室温静置，约30min后凝固。凝固后倒出异丙醇并用吸水纸小心吸净液体，吸水纸不要碰触到下层胶胶体。加满上层浓缩胶，***配套齿梳，室温平放静置，约30min至凝固。

c)电泳：将电泳槽中倒入电泳液至可以形成通路，小心拔出齿梳后在每孔中加入8μL样品。通电时注意正反两极，90V电压30min，观察溴酚蓝条带，跑至分离胶后，调电压至120V，观察条带跑至板底1cm处，即可关闭电源。

d)染色：拆开凝胶板修整除去上层浓缩胶，保留下层分离胶，浸泡在染色液中，摇床震荡染色3h。

e)脱色：染色后的凝胶加入蒸馏水洗去浮色后，再加入蒸馏水脱色，微波炉中火加热5min，倒出液体后重新加入蒸馏水。重复上述步骤至凝胶上显出清晰蛋白条带。分析结果。

菌体沉淀用PBS缓冲液重悬，超声破碎仪破碎菌体。选择6号超声头，功率30W，超声3s，间歇4s，共40min。超声时会产生热量，影响蛋白活性，因此超声时注意菌液冰浴。超声结束后，低温离心机中4℃离心30min，转速12000rmp，得到上清与沉淀，沉淀中即为包涵体。

1.2.3重组蛋白的纯化

上清和包涵体，通过SDS-PAGE电泳验证表达。镍柱纯化法提纯在上清中表达的蛋白，蛋白电泳切胶纯化法提纯在包涵体中表达的蛋白，并通过Western-blot分析纯化后的重组蛋白。

1.镍柱纯化步骤如下：

a)BufferA清洗镍柱两遍，每次10mL。

b)加入上清10mL并混匀，静置30min。

c)镍柱凝胶沉淀后打开盖子使液体自然流出，10滴后接流穿液至液面在凝胶上方1cm处。

d)BufferA清洗镍柱两遍，每次5mL，收集洗液。

e)加40mM咪唑缓冲液并混匀，静置30min至凝胶沉淀，自然流出液体10滴后接洗脱液至液面在凝胶上方0.5cm处。

f)加80mM咪唑缓冲液并混匀，静置30min至凝胶沉淀，自然流出液体10滴后接洗脱液至液面在凝胶上方0.5cm处。

g)加150mM咪唑缓冲液并混匀，静置30min至凝胶沉淀，自然流出液体10滴后接洗脱液至液面在凝胶上方0.5cm处。

h)20％乙醇清洗镍柱两遍，将干净的镍柱放置4℃保存。

2.在包涵体中的蛋白切胶纯化步骤

a)电泳样品的处理：用PBS清洗包涵体2次后，用PBS重悬包涵体，800μLPBS重悬液中加入200μL上样缓冲液。离心管口包裹封口膜防止爆开，沸水中煮10min后作为样品。

b)配胶：取清洁干燥的凝胶板安装在电泳槽中，确认安装严密不漏液后，加入9mL12％浓度的下层分离胶，加入1mL异丙醇压至气泡消失且液面平整，室温静置，约30min后凝固。凝固后倒出异丙醇并用吸水纸小心吸净液体，此过程不要碰触到下层胶，加入上层浓缩胶至板口1cm处，加入1mL异丙醇压至液面平整，室温平放静置，约30min上层胶凝固，倒除异丙醇。

c)电泳：将电泳槽中倒入电泳液至形成通路，小心拔出齿梳后在每孔中加入8μL样品。90V电压跑电泳，观察溴酚蓝条带，跑至分离胶后，调电压至120V，观察条带跑至板底1cm处，即可关闭电源。

d)染色：拆开凝胶板，用刀片修整凝胶上层胶，保留下层分离胶，浸泡在0.4mMKCl溶液中3min。KCl溶液需要提前保存在4℃中。

e)切胶：上步骤中高浓度的盐离子会使蛋白显出白色单一条带，小刀切取白色条带。

f)收集：将白色条带切条放入截留分子量8000-14000Da的透析袋中，放置在装满电泳液的核酸电泳槽中，90V电压跑10min。取出透析袋中液体保存，丢弃变为透明的凝胶切条。

3.Western-blot步骤

a)样品制备与电泳过程过程同SDS-PAGE电泳。

b)剪取大小合适的PVDF膜泡甲醇中活化10min。

c)拆开凝胶板并取出下层分离胶，修整下层分离胶大小，按顺序将滤膜、分离胶、PVDF膜放入转膜夹中，膜与膜之间不能存在气泡。

d)将转膜夹放入电泳槽内并加入缓冲液，注意电极正反，调电流至200mA转膜2h。冰浴电泳槽，防止转膜过程温度过高，蛋白变性。

e)转膜结束后，小心夹取膜放入封闭液及5％的脱脂奶粉中封闭，室温摇床上震荡1h。

f)取相应抗体用封闭液稀释，将封闭后的膜放入其中，37℃温箱中孵育1h，TBST震荡洗涤4次，每次10min。

g)取二抗用脱脂奶粉倍数稀释，将封闭后的膜放入其中，37℃温箱中孵育1h，TBST震荡洗涤4次，每次10min。

h)用显影液对PVDF膜显影，化学发光成像***采集数据。

1.3结果

1.3.1重组蛋白的表达

IL-1β、IL-1Ra、IL-1β-1、IL-1Ra-1、IL-1β-1Ra-2挑取单克隆菌落成功后，其表达菌分别在16℃、25℃、37℃中诱导8h、16h，IL-1β、IL-1Ra的表达菌在37℃8h时表达量最高，IL-1β-1、IL-1Ra-1、IL-1β-1Ra-2的表达菌在16℃16h时表达量最高。SDS-PAGE电泳结果分析后，IL-1β、IL-1Ra、IL-1β-1、IL-1Ra-1、IL-1β-1Ra-2重组蛋白均表达成功。结果如图1所示。

对重组蛋白进行Westernblot检测，以抗His标签的抗体作为一抗，显影后在预期位置均有明显条带，证明图中蛋白为目的蛋白，表达成功。图中未诱导组出现较弱条带，为目的蛋白在未诱导条件下的本底表达，结果如图2所示。

1.3.2重组蛋白的纯化

纯化透析浓缩后IL-1β、IL-1Ra全长重组蛋白浓度为1.5mg/mL，IL-1β-1、IL-1Ra-1重组蛋白浓度为2.0mg/mL，IL-1β-1Ra-2重组蛋白浓度为2.2mg/mL。SDS-PAGE电泳结果分析后，如图3所示，目的蛋白纯化成功。

实施例2

IL-1β和IL-1Ra多克隆抗体的制备

2.1材料

2.1.1耗材

弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，购于Sigma公司。

2.1.2主要仪器设备

超微量微孔板分光光度仪，购于Biotek公司；电子天平，购于美国DenverInstrament公司。

2.1.3主要试剂制备

1.包被液：1.59g/LNa2CO3，2.93g/LNaHCO3，混合均匀后，调节pH至9.6。

2.封闭液：0.1MNH4Cl。

3.PBS：8g氯化钠，2.9g十二水合磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾，800mL去离子水搅拌均匀，调节pH为7.2-7.4，使用去离子水定容至1L。

4.PBST：PBS，混匀0.1％吐温。

5.终止液：11.1mL浓硫酸，88.9mL去离子水，强酸极具腐蚀性，配置时应在容器中先加入去离子水，后倒入强酸，边加边摇晃防止液体迸溅。

2.2方法

2.2.1动物免疫

2.2.1.1家兔免疫

首次免疫取弗氏完全佐剂与L-1β-1Ra-2蛋白等比混合，首次免蛋白量为1mg。验证乳化是否完全的标准是取乳化后液滴滴于水面，液滴紧密完整不扩散，此时取乳化液背部多点注射，免疫新西兰白兔。免疫前耳缘静脉采血留作免疫前阴性血清，免疫后轻按注射点，有助于乳化液的扩散与吸收。以两周作为免疫周期，二免过后乳化剂选用弗氏不完全佐剂，蛋白量和不完全佐剂各1mg共2mg，等体积混合后乳化并验证乳化完全。第三次免疫后，每次免疫后5天对白兔进行耳缘静脉采血，测定血清效价，效价达到预期值后心脏采血收集血清以待纯化。

2.2.1.2豚鼠免疫

首次免疫取弗氏完全佐剂与IL-1β-1或IL-1Ra-1蛋白等比混合，蛋白量为1mg。验证乳化完全方法同上，取乳化液背部多点注射免疫豚鼠。免疫前采血留作免疫前阴性血清，免疫后轻按注射点是有助于乳化液的吸收扩散。以两周作为免疫周期，二免过后乳化剂选用弗氏不完全佐剂，蛋白量为1mg，等体积混合后乳化并验证乳化完全。第三次免疫后，每次免疫后5天采血，测定血清效价，效价达到预期值后心脏采血收集血清以待纯化。

2.2.2抗体效价检测

取免疫前采血所得血清作为阴性血清作为对照，免疫后采血所得血清作为样品检测效价。采血所得新鲜血液应立即放入37℃温箱中30min，转放在4℃冰箱中2h，凝血过程完成后，低温离心机离心5min，转速3000rpm,上清即为所得血清。血清分装，保存于-80℃。

分装后的血清用常规ELISA法检测效价。步骤如下：

1.将三种免疫原分别作为抗原包被在ELISA酶标板板底，包被浓度为1μg/mL，每孔加入100μL，37℃温箱中包被2h。

2.甩干包被液，每孔加入200μL1％脱脂奶粉封闭，37℃封闭1h。

3.甩干封闭液，在样品孔中分别加入不同稀释倍数的免疫后血清，在阴性对照孔中加入免疫前血清。每孔100μL。37℃温箱中孵育1h。用PBST溶液震荡洗涤ELISA板3次，每次60s。

4.用PBS溶液4000倍稀释HRP标记二抗，每孔100μL，37℃温箱中孵育1h。用PBST溶液震荡洗涤ELISA板4次，每次60s。

5.加入TMB底物缓冲液，每孔100μL，37℃温箱中孵育10min。

6.每孔加入50μL终止液。

7.打开酶标仪，测定酶连产物OD值，波长选择450nm。

2.2.3多克隆抗体的纯化

血清效价理想后，用AKATA蛋白纯化***纯化抗体。步骤如下。

1.用超滤仪超滤BindingBuffer、20％乙醇、0.1M甘氨酸(pH2.7)和TrisHCl(pH7.0)，去除杂质和气泡。

2.打开蛋白纯化仪，用20％乙醇清洗机器、加样槽和亲和层析柱至离子线平稳。

3.清洗后完毕后用BindingBuffer平衡机器、加样槽和亲和层析柱。离子线平衡10个柱体积。

4.在加样槽中加入待纯化血清，在接样管中加入200μLTrisHCl。

5.离子线平稳15个柱体积后洗脱，并在出现紫外峰时开始接样。

6.紫外峰下降后，用20％乙醇清洗机器、加样槽和亲和层析柱至离子线平稳。

7.剪取适量长度的透析袋，注意不能直接触碰透析袋。取干净的烧杯，将透析袋在沸腾的蒸馏水中煮0.5h，取出后在透析袋中加入待透析抗体，撵出气泡后用透析袋专用封口夹封口。0.01MpH8.0的PBS作为透析液，置于4℃层析柜中，低速旋转液体，透析72h，每8h换一次液。透析完成后，PEG20000隔袋浓缩。酶标仪测定OD值，分装保存在超低温冰箱-80℃中。

2.2.4抗体特异性分析

利用Western Blot杂交分析三种抗体与其目标蛋白结合的特异性与交叉反应特性，分析三种抗体是否能够应用于双T线胶体金侧流层析试纸条的建立。步骤同1.2.4。

2.3结果

2.3.1抗体效价检测

分别用IL-1β-1和IL-1Ra-1蛋白免疫豚鼠所得为捕获用抗体，用IL-1β-1Ra-2蛋白免疫家兔所得为检测用抗体。抗IL-1β-1抗体效价为1:128000，抗IL-1Ra-1抗体效价为1:128000，抗IL-1β-1Ra-2抗体效价为1:64000。

2.3.2抗体的纯化

经过AKATA蛋白纯化***纯化后得到抗IL-1β-1、IL-1Ra-1、IL-1β-1Ra-2三种抗体，如图4所示，SDS-PAGE电泳结果分析后，纯化成功。

2.3.3抗体的特异性分析

IL-1β-1、IL-1Ra-1、IL-1β-1Ra-2三种重组蛋白作为免疫原，免疫动物纯化后所得抗体，抗IL-1β-1抗体、抗IL-1Ra-1抗体与抗IL-1β-1Ra-2抗体与全长IL-1β、IL-1Ra进行WesternBlot杂交分析。如图5所示，抗IL-1β-1抗体只能与IL-1β结合，抗IL-1Ra-1抗体只能IL-1Ra与结合，抗IL-1β-1Ra-2抗体能够结合IL-1β和IL-1Ra两种蛋白。三种抗体特异性良好。因此，抗IL-1β-1抗体可以用作抗IL-1β豚鼠源捕获用抗体、抗IL-1Ra-1抗体可以用作抗IL-1Ra豚鼠源捕获用抗体，抗IL-1β-1Ra-2抗体可以用作同时抗IL-1β和IL-1Ra的兔源检测用抗体。

实施例3

用于同时检测IL-1β、IL-1Ra含量和IL-1Ra/IL-1β比值的胶体金试纸条制备

3.1材料

3.1.1耗材

氯金酸，购于北京国药；牛血清白蛋白(BSA)，购于Sigma公司；山羊抗兔IgG，博士德生物公司；Tween-20、PEG20000、海藻糖、蔗糖，北京鼎国生物公司；SB06玻璃纤维垫、DL42聚酯纤维垫、硝酸纤维膜、DL42吸水纸、PVC底板、试纸条包装壳、干燥剂、铝箔，购于上海金标生物公司。

3.1.2主要仪器设备

XYZ3060三维点喷平台，购于Biodot公司；电子天平，购于赛多利斯公司；真空封装机，购于金桥电器；恒温培养箱，购于上海实验仪器厂；离心机，购于Thermo公司；冰箱，购于海尔公司。

3.1.3主要溶液配制

1. 5％二氯二甲基硅烷溶液：将50mL二氯二甲基硅烷、950mL氯仿混合均匀，室温避光保存。

2. 0.005％NaCl溶液：称量200mgNaCl用蒸馏水定容至4L，4℃保存。

3. 10％NaCl溶液:称量2gNaCl用蒸馏水定容至20mL，孔径0.22μm滤膜过滤，4℃保存。

4. 1％柠檬酸钠溶液：称量500mg柠檬酸钠用纯净水定容至50mL，孔径0.22μm滤膜过滤，现用现配。

5. 0.2mol/LK₂CO₃溶液：称量1.38gK₂CO₃用纯净水定容至50mL，孔径0.22μm滤膜过滤，4℃保存。

6. 1％BSA溶液：称量2gBSA用纯净水定容至200mL，孔径0.22μm滤膜过滤，-20℃保存，分装使用。

7. 5％PEG20000溶液：称量500mgPEG20000用纯净水定容至10mL，孔径0.22μm滤膜过滤，-20℃保存，分装使用。

8. 0.01mol/LPB溶液：称量2.86gNa₂HPO₄·12H2O、0.272gKH₂PO₄,用纯净水定容至1L，调节pH至7.4，孔径0.22μm滤膜过滤，4℃保存。

9. 0.01mol/LPBS溶液：称量0.8gNaCl、0.29gNa₂HPO₄·12H₂O、0.02gKCl和0.2gKH₂PO₄，使用纯净水定容至100mL，调节PH至7.4,孔径0.22μm滤膜过滤，4℃保存。

10.重悬液：15％蔗糖，2.5％海藻糖，1％BSA，0.1％PEG20000，溶剂为0.01mol/LPB，孔径0.22μm滤膜过滤，-20℃保存，分装使用。

11.上样缓冲液：0.2％PEG20000，2％蔗糖，2％BSA，溶剂为0.01mol/LPB，孔径0.22μm滤膜过滤，-20℃保存，分装使用。

3.2方法

3.2.1胶体金溶液制备与鉴定

在烧制胶体金过程中，纳米级别的胶体金颗粒直径较小，容易附着在玻璃器皿表面，因此需要先硅化处理试验用玻璃器皿。硅化步骤如下：

1.用洗衣液彻底清洗玻璃器皿，烘干后酸缸浸泡过夜；

2.用自来水冲洗酸液浸泡后的器皿，再用蒸馏水冲洗3遍，在蒸馏水中浸泡4h；

3.把浸泡的器皿取出烘干，在通风橱中硅化处理，玻璃器皿中注满5％二氯二甲基硅烷溶液，通风橱中静置0.5h；

4.回收硅化液，硅化后器皿在通风橱中静置干燥1h；

5.玻璃器皿用蒸馏水冲洗5次，烘干后避光保存。二氯二甲基硅烷毒性剧烈，应小心使用，注意安全。

取硅化后锥形瓶中加入纯净水100mL和10％氯金酸100μL混合均匀，在万用电炉上加热至完全沸腾。迅速加入1％柠檬酸钠2.8mL，晃动锥形瓶使其均匀充分反应，肉眼可见液体颜色从淡黄色逐渐变深。胶体金溶液变为酒红色后，保持低沸状态继续烧制5min。自然冷却至室温后，定容胶体金溶液至100mL，孔径0.22μm滤膜过滤到硅化后的蓝口瓶中，4℃低温保存。

肉眼观察胶体金，若清澈透亮无杂质，颜色呈酒红色，则品质优良，适宜标记示踪。紫外分光扫描制备好的胶体金溶液，并推算胶体金粒径。

3.2.2 IL-1β-1Ra2多克隆抗体除盐处理

胶体金颗粒通过表面电荷吸附蛋白质达到稳定结合且不影响蛋白质活性，而过高的盐离子浓度会影响胶体金颗粒电荷情况，胶体金不稳定会影响与蛋白的结合率，影响胶体金探针的敏感性。因在标记胶体金探针之前，一般先进行透析除盐处理，减小离子影响。首先剪取适量长度的透析袋，注意不能直接触碰透析袋。取干净的烧杯，将透析袋在沸腾的蒸馏水中煮0.5h，取出后在透析袋中加入待透析抗体，撵出气泡后用透析袋专用封口夹封口，置于0.01％的PBS溶液中4℃轻旋透析，每8h更换透析液，更换7次。透析后低温离心15min，转速为12000rpm去除透析过程中出现的蛋白沉淀，蛋白浓缩后稀释抗体至5mg/mL备用。

3.2.3胶体金探针制备

胶体金探针具体制备步骤如下。

1.在2mLEP管中依次加入胶体金溶液1mL、0.2mol/LK₂CO₃10μL，放入37℃恒温摇床震荡30min，转速为170rpm；

2.加入10μgIL-1β-1Ra-2多克隆抗体，37℃恒温摇床震荡30min，转速为170rpm；

3.继续加入10％BSA100μL,37℃恒温摇床170rpm震荡30min；

4.低温离心10min弃杂质，转速为1000rpm；

5. 14 000rpm低温离心40min弃上清；

6.加入1％BSA1mL重悬沉淀物，14000rpm低温离心40min弃上清；加入重悬液100μL，4℃保存。

由于胶体金颗粒粒径较小，易附着在玻璃器皿上不易清洗，因此不能选择pH计测量胶体金溶液pH数值。为确定标记胶体金探针的pH值，梯度设置0.2mol/LK₂CO₃用量，在100μL胶体金溶液中分别加入0.6μL、0.7μL、0.8μL、0.9μL、1.0μL、1.1μL。加入足量抗体后利用高盐破坏法测试胶体金探针最适pH值，上述溶液中加入10μL10％NaCl，涡旋振荡60s使其充分混匀，室温静置4h。肉眼观察溶液颜色变化，选择颜色稳定为红色时最小K₂CO₃用量，确定为标记胶体金探针pH。

确定制备胶体金探针的抗体用量，梯度设置抗体用量，，在100μL胶体金溶液中分别加入抗体0、0.2μg、0.4μg、0.6μg、0.8μg、1.0μg、1.2μg、1.4μg、1.6μg、1.8μg。利用高盐破坏法，条件同上，肉眼观察溶液颜色变化，选择颜色稳定为红色时最小抗体量，确定为标记胶体金探针抗体用量。

3.2.4胶体金试纸条组装

将NC膜、玻璃纤维垫、吸水纸按顺序小心衔接粘贴在PVC板底板上。胶体金试纸条组装流程如下：

1.将硝酸纤维素膜(NC膜)固定在PVC底板上；

2.剪取10cm玻璃纤维垫(上样垫)，一侧与底板边对齐，另一侧与NC膜重叠1mm贴在T1线侧。

3.剪取10cm吸水纸，一侧与底板边对齐，一侧与NC膜C线侧重叠1mm贴在底板上。

粘贴组装完毕后，裁剪试纸条，宽度为3mm。1mL样品与10μL胶体金探针预混，金标探针会与样品中的IL-1β与IL-1Ra结合，14000rpm离心20min，弃上清并用100μL上样缓冲液重悬沉淀，在上样垫上加入样品混合液，样品在侧流层析作用下流动，流经双T线时，金标探针分别与IL-1β与IL-1Ra捕获抗体结合显色，过量的金标探针在C线处与羊抗兔抗体结合显色。样品中检测物含量越大，T线红色越深。C线作为质控线，无论是否在样品中检测到靶标物质，C线都会显色。若C线不显色，则胶体金探针制备失败，不能组成胶体金试纸条。

3.2.5 NC膜

选取sartorius95、millipore135、millipore180和sartorius140四种NC膜，分别喷膜划线后依次组装胶体金试纸条，加入样品并观察划线处颜色变化，选择NC膜。

3.2.6双T线抗体工作浓度

设置双T线抗体浓度为0、1mg/mL、2mg/mL，喷膜划线后依次组装胶体金试纸条，加入样品并观察划线处颜色变化。

3.2.7试纸条标准曲线的建立

1mL标准品与10μL胶体金探针预混并充分结合后，14000rpm离心20min，弃上清并用100μL上样缓冲液重悬沉淀，稀释至250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.625ng/mL、7.813ng/mL、3.906ng/mL、1.953ng/mL、0.976ng/mL共9个浓度，用作标准曲线的建立。样品加在试纸条样品垫上，待试纸条干透，拍照并用ImageJ软件分析处理结果。以上样缓冲液为空白样品做空白对照，以样品预处理后得到的重悬液浓度log值为横坐标，以T线测定灰度值为纵坐标，绘制标准曲线。对测定数据回归分析，并得出回归方程和标准曲线。

3.2.8回收率实验与最低检测限的确定

将IL-1β与IL-1Ra标准品按上述步骤稀释至50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL，按IL-1Ra/IL-1β为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4混合上样，用于检测半定量试纸条检测方法的回收率。

根据标准曲线，以试纸条T线为肉眼可见的最低限度时的重悬样品浓度值确定为最低检测限。

3.2.9重复性试验

用上样缓冲液处理IL-1β标准品至10ng/mL，IL-1Ra标准品至100ng/mL，设置三个重复对照组，检测试纸条重复性。

3.3结果

3.3.1胶体金溶液分析

胶体金溶液澄清透明呈酒红色，置于4℃环境4个月，胶体金颗粒稳定，颜色无改变，底部无沉淀。如图6所示为紫外扫描结果，胶体金具有单一峰，且在520nm处有吸收峰，可知胶体金颗粒大小约为20nm。

3.3.2胶体金探针鉴定

胶体金探针溶液澄清透明，呈酒红色，低速离心无沉淀析出，因此胶体金探针稳定且可用于制备试纸条。组装试纸条结果如图7，上样缓冲液与100ng/mL的IL-1β与IL-1Ra标准品等体积混匀后加样，双T线和C线均显色；上样缓冲液与蒸馏水等体积混匀加样，T1线、T2线均不显色，C线显色；上样缓冲液与100ng/mL的IL-1β标准品等体积混匀后加样，T1线和C线均显色，T2不显色；上样缓冲液与100ng/mL的IL-1Ra标准品等体积混匀后加样，T2线和C线均显色，T1不显色。以上结果证明已成功获得标记完全的胶体金探针。

高浓度盐溶液会影响溶液中电荷情况，使胶体金颗粒有沉淀，而被抗体充分包裹标记的胶体金颗粒不会受到浓度盐溶液的影响。因此，采用高盐破坏法标记胶体金探针pH和胶体金探针中抗体量。结果如图8所示，100μL混合液中加入0.9μLK₂CO₃时为颜色稳定为红色时K₂CO₃最小用量，确定为标记胶体金探针pH。

结果如图9所示，100μL胶体金溶液中加入抗IL-1β-1Ra-2兔源多克隆抗体1.0μg时，胶体金颜色为稳定的粉红色。在实际标记过程中，由于抗体活性不稳定，且为达到抗体的过量标记，因此在抗体量基础上增加2个梯度值，即100μL胶体金溶液的抗体标记用量为1.2μg。

3.3.3NC膜

选取sartorius95、millipore135、millipore180和sartorius140四种NC膜，分别喷膜划线后依次组装胶体金试纸条，加入样品并观察划线处颜色变化。如图10所示。

3.3.4双T线抗体工作浓度优化

设置双T线抗体浓度为0mg/mL、1mg/mL、2mg/mL，喷膜划线后依次组装胶体金试纸条，加入样品并观察划线处颜色变化。如图11所示，两种捕获抗体浓度均为1mg/mL时，双T线与C线颜色均清晰可见。但由于实际样品检测中，β浓度过低，故选择高浓度抗体划线。因此IL-1β捕获抗体浓度为2mg/mLIL-1Ra捕获抗体浓度为1mg/mL。

3.3.5试纸条标准曲线的建立

1mL标准品与10μL胶体金探针预混并充分结合后，14000rpm离心20min，弃上清并用100μL上样缓冲液重悬沉淀,稀释至250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.625ng/mL、7.813ng/mL、3.906ng/mL、1.953ng/mL、0.976ng/mL共9个浓度，用作标准曲线的建立，设立空白对照。

重悬液加入试纸条样品垫上，待试纸条干透，拍照并用ImageJ软件分析处理结果。以上样缓冲液为空白样品做空白对照，以标准品预处理后得到的重悬液浓度log值为横坐标，以T线测定灰度值为纵坐标，对测定数据回归分析，并得出回归方程和标准曲线。

如图12所示，最终确定IL-1β的标准曲线方程为y＝24701x+9679.9，R2为0.9726。如图13所示，最终确定IL-1Ra的标准曲线方程为y＝35117x+3247.9，R2为0.9753。

3.3.6回收率实验与最低检测限的确定

如表1所示，IL-1β的平均回收率为83.52％，IL-1Ra的平均回收率82.44％。检测限为试纸条肉眼可见的最低限度时重悬液浓度，IL-1β检测限为0.7ng/mL，IL-1Ra检测限为1.0ng/mL。

表1 IL-1β与IL-1Ra回收率

3.3.7重复性试验

用上样缓冲液处理IL-1β标准品至10ng/mL，IL-1Ra标准品至100ng/mL，设置三个重复对照组，检测试纸条重复性。如表2所示，计算变异系数得出，IL-1β变异系数为9.36％，IL-1Ra变异系数为4.18％，IL-1Ra/IL-1β变异系数为9.63％。变异系数均小于10％，证明重复性良好。

表2 IL-1β与IL-1Ra重复性试验

3.3.8与市售试剂盒比较

利用本发明的试纸条检测方法抽样检测10个样本IL-1Ra/IL-1β比值，通过市售ELISA试剂盒检测相同样品IL-1Ra和IL-1β含量并求比值作为对照。结果表明，本发明的胶体金试纸条检测方法与市售试剂盒相比，比值差异不显著(p＝0.92,>0.05)，如图14所示，说明本发明的胶体金试纸条方法在测定IL-1Ra/IL-1β比值时结果可靠。

实施例4

IL-1Ra/IL-1β双T线胶体金免疫层析试纸条临床实际样品检测应用分析

4.1材料

4.1.1样品采集

布鲁氏菌相关羊样品：由吉林省、云南省、辽宁省部分地区CDC相关部门提供，其中健康未疫苗免疫羊血清样品40份，布鲁氏菌S2疫苗免疫羊血清样品40份，布鲁氏菌病感染阳性羊血清样品40份。

4.1.2耗材、仪器设备

同实施例3。

4.2方法

4.2.1样品处理

取羊血清样品3mL，加入10μL胶体金探针，混匀后轻摇20min，离心14000rpm离心20min，弃上清并用100μL上样缓冲液重悬沉淀作为上样缓冲液。

4.2.2样品检测与灰度分析

在室内日光灯下，距离桌面15cm处，拍摄干透的试纸条。运用ImageJ软件分析T线处灰度值，并通过标准曲线计算得到4.2.1中取得的重悬液浓度，求得IL-1Ra/IL-1β比值。

4.2.3数据统计学分析

运用SPSS软件分析布鲁氏菌病健康未免疫组、免疫组与感染组IL-1Ra/IL-1β比值统计学差异，并绘制ROC曲线分析其鉴别诊断意义。

4.3结果

4.3.1部分血清样本虎红平板凝集试验结果，如图15。

4.3.2羊血清IL-1β和IL-1Ra及IL-1Ra/IL-1β比值检测分析

表3 健康未疫苗免疫羊血清中IL-1Ra/IL-1β比值

表4 布鲁氏菌S2疫苗免疫羊血清中IL-1Ra/IL-1β比值

表5 布鲁氏菌病感染阳性羊血清中IL-1Ra/IL-1β比值

4.3.3临床样本检测IL-1Ra/IL-1β比值的统计学分析

统计学分析健康组、免疫组、感染组羊样品中IL-1Ra/IL-1β比值的99％置信区间，健康组、免疫组与感染组IL-1Ra/IL-1β比值差异极显著(p<0.01)，说明借助虎红平板凝集试验，IL-1Ra/IL-1β比值可以作为区分免疫组与感染组的有效手段(见表6，图16)。分别绘制免疫组与健康组、健康组与感染组、免疫组与感染组羊血清样本中IL-1Ra/IL-1β比值的ROC曲线，如图17所示，健康组和免疫组曲线下面积AUC为0.382，小于0.5，说明利用IL-1Ra/IL-1β比值在区分健康组与免疫组时没有鉴别诊断参考意义。而免疫组与感染组、健康组与感染组的曲线下面积AUC均为1.000，大于0.5，说明IL-1Ra/IL-1β比值在区别羊布鲁氏菌病弱毒免疫羊与自然感染羊时具有鉴别诊断参考价值。经过SPSS软件分析，为最大限度排除感染组样本，选择免疫组IL-1Ra/IL-1β比值中位数与三倍标准差的差值73.69作为鉴别基准线，即实际检测中，使用虎红平板凝集试验筛选得到阳性样本(感染羊和免疫羊)，进一步检测阳性样本IL-1Ra/IL-1β比值，比值大于73.69为免疫组健康羊，比值小于73.69建议作为扑杀目标。

表6 羊免疫组、健康组和感染组血清样品中IL-1Ra/IL-1β比值统计学分析

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种用于同时检测IL-1β、IL-1Ra含量和IL-1Ra/IL-1β比值的胶体金试纸条，其特征在于，包括玻璃纤维垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；所述玻璃纤维素垫上包被有胶体金标记的同时结合IL-1β和IL-1Ra的抗IL-1β-1Ra-2兔源多克隆抗体；所述硝酸纤维素膜依次包括检测线T1、检测线T2和质控线；所述检测线T1上包被有结合IL-1β的抗IL-1β-1的豚鼠源多克隆抗体；所述检测线T2上包被有结合IL-1Ra的抗IL-1Ra-1的豚鼠源多克隆抗体；所述质控线上包被有羊抗兔抗体。

2.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金标记的抗IL-1β-1Ra-2的兔源多克隆抗体的用量为1.0～1.4μg/100μL。

3.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述检测线T1上包被的抗IL-1β-1的豚鼠源多克隆抗体的浓度为1.8～2.2mg/mL。

4.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述检测线T2上包被的抗IL-1Ra-1的豚鼠源多克隆抗体的浓度为0.8～1.2mg/mL。

5.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述质控线上包被的羊抗兔抗体的浓度为0.6～1.0mg/mL。

6.权利要求1～5任意一项所述的胶体金试纸条在制备检测样品IL-1β、IL-1Ra的浓度的试剂盒中应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将待测样品滴加到玻璃纤维垫；

8.权利要求1～5任意一项所述的胶体金试纸条在制备检测样品IL-1Ra与IL-1β的比值(IL-1Ra/IL-1β比值)的试剂盒中应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述样品包括布鲁氏菌病相关血样，包括布鲁氏菌病感染动物血样、布鲁氏菌病疫苗免疫动物血样、健康未免疫布鲁氏菌病疫苗动物血样。