CN110151742B - 大麦芽碱在制备治疗垂体瘤药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大麦芽碱在制备治疗垂体瘤药物中的用途，涉及生物制药技术领域，具体而言，在该应用中，发明人发现了大麦芽碱能够通过抑制TLR4/NF‑κB/MAPK信号通路，从而有助于治疗泌乳素腺瘤和和促肾上腺皮质激素腺瘤发挥药效作用，解决了泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤患者用药短缺的困境。

Description

大麦芽碱在制备治疗垂体瘤药物中的用途

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，具体而言，涉及大麦芽碱在制备治疗垂体瘤药物中的应用。

背景技术

垂体瘤是常见的颅内良性肿瘤之一，发病率在颅内肿瘤中仅次于脑胶质细胞瘤和脑膜瘤，约占颅内肿瘤的10％，且随着诊断水平的不断提高，发病率有逐年增加趋势。随着肿瘤不断生长，可压迫蝶鞍区周围结构，如视神经、海绵窦、脑底动脉、下丘脑等，甚至累及额叶、脑干，而导致严重的功能障碍。同时，肿瘤生长还可导致垂体激素分泌紊乱。按照外周血激素水平，垂体腺瘤分为无功能型垂体腺瘤(NFPA)和功能型垂体腺瘤，包括：泌乳素腺瘤(PRL)、促肾上腺皮质激素腺瘤(ACTH)、生长激素腺瘤(GH)、促甲状腺激素腺瘤(TSH)、***腺瘤(PGA)及混合激素分泌腺瘤等。

泌乳素腺瘤是最常见的垂体肿瘤，约占垂体腺瘤的80％～85％，是由垂体泌乳素细胞瘤分泌过量泌乳素(prolactin，PRL)引起的下丘脑-垂体疾病中最常见的一种疾病，典型临床表现：女性为闭经、溢乳、不育、高泌乳素血症；男性为阳痿，性功能减退，***发育；肿瘤压迫及侵犯周围结构所引起的症状和体征。有临床症状的泌乳素微腺瘤一般不会长成大腺瘤，部分腺瘤有侵袭性生长，出现腺瘤增大。目前，在临床治疗过程中，约有8％～25％的垂体泌乳素腺瘤患者经溴隐亭治疗后出现耐药现象。目前在国内仅有溴隐亭1种。溴隐亭治疗效果显著，但价格昂贵，且存在一定副作用，例如：溴隐亭对80％～90％的患者可有效降低PRL、恢复性腺功能、缩小或控制肿瘤生长，其副作用主要是胃肠道反应，剂量较大时可有眩晕、***性低血压、头痛、瞌睡与便秘等。对溴隐亭耐药或对其不良反应不耐受的患者，没有可替代治疗的药品。

垂体促肾上腺皮质激素腺瘤(ACTH-Pas)临床又称为库欣病，是一种伴有促肾上腺皮质激素(ACTH)分泌的功能型垂体腺瘤，约占全部垂体腺瘤的14％，约占库欣综合征的70％。该病在欧美国家的发病率为39/百万，我国尚缺乏大规模流行病学数据。由于该病的诊断主要基于实验室激素水平检查、患者临床症状体征、影像学检查及病理学免疫组织化学检测，因此对于库欣病的早期诊断十分困难，容易误诊。患者常常由于高皮质醇血症而引起多种严重并发症，如高血压、糖尿病、高脂血症、骨质疏松及精神抑郁等就诊。在治疗上，对于绝大多数库欣病人而言，经鼻蝶窦入路垂体腺瘤切除术仍然是临床首选治疗方法，放射治疗及帕瑞肽、酮康唑等药物治疗常作为难治性库欣病的术后辅助治疗方式。虽然文献报道外科手术成功率在65％-90％，但是由于肿瘤自身生物学行为的不同及术者操作水平的差异，肿瘤复发率为3％-47％，平均复发时间为16-49个月，复发患者预后较差，病死率高。近年来针对库欣病的分子水平研究主要集中在肿瘤的发生、发展、肿瘤的侵袭性及激素分泌等方面，但目前对于库欣病的发病机制尚不完全清楚。

因此，为保证我国垂体泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤患者的健康，并保障其治疗的安全性，迫切需要研究开发具有我国自主知识产权的新药上市。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种大麦芽碱在制备抑制MAPK信号通路的抑制剂中的应用，发现了大麦芽碱能够通过抑制TLR4/NF-κB/MAPK信号通路从而有助于治疗垂体泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤发挥药效作用，解决了泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤患者用药短缺的困境。

本发明的第二目的在于提供一种MAPK信号通路抑制剂，该抑制剂中发现了一种新的物质用于抑制MAPK信号通路，且该物质对MAPK信号通路的抑制效果显著。

本发明的第三目的在于提供MAPK信号通路抑制剂在制备垂体瘤药物中的应用，该应用提供了一种新的用于治疗泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤药物的物质，发明人发现可以通过抑制MAPK信号通路从而有助于治疗泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤。

本发明是这样实现的：

在本发明实施例提供了一种大麦芽碱在制备抑制MAPK信号通路的抑制剂中的应用。

大麦芽碱，又称hordenine，来源于麦芽。通常，大麦芽碱可用于肾上腺素受体，具有松弛支气管平滑肌、收缩血管、血管加压、升血压和兴奋中枢的效果，可用于缓解支气管炎、支气管哮喘以及增强子宫的紧张和运动等，同时具有放射性损伤的保护作用。

在本发明实施例中，发明人通过付出创造性的劳动后发现，大麦芽碱具有能够抑制TLR4/NF-κB/MAPK信号通路的功能，本申请为与MAPK信号通路相关的相关领域提供了新的研究思路。

具体地，MAPK，英文名为mitogen-activated protein kinase，是信号从细胞表面传导到细胞核内的重要传递者。

本发明实施例还提供一种MAPK信号通路抑制剂，该抑制剂中包括有大麦芽碱。

此外，本发明实施例还提供上述MAPK信号通路抑制剂在制备治疗泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤药物中的应用。发明人通过创造性的劳动发现，MAPK信号通路，尤其是TLR4/NF-κB/MAPK介导的信号通路参与泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤的发生，是泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤治疗的新靶点。

本发明具有以下有益效果：

本发明实施例提供了一种大麦芽碱在制备抑制MAPK信号通路的抑制剂中的应用，发现了大麦芽碱能够通过抑制TLR4/NF-κB/MAPK信号通路从而有助于治疗泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤发挥药效作用，解决了泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤患者用药短缺的困境。

本发明实施例还提供了一种MAPK信号通路抑制剂，该抑制剂中发现了一种新的物质用于抑制MAPK信号通路，且该物质对MAPK信号通路的抑制效果显著。

此外，本发明实施例还提供了一种MAPK信号通路抑制剂在制备治疗泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤药物中的应用，该应用提供了一种新的用于治疗泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤药物的物质，该物质可以通过抑制MAPK信号通路从而有助于泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤的治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1中各组别大鼠的生长曲线图；

图2为本发明实施例1中正常组和模型组大鼠的垂体对比图；

图3为本发明实施例1中Western Blotting检测大鼠PRL、CD68和NLRP3的表达结果图；

图4为本发明实施例1中BioB-BioC-BioD-Cre杂交质控结果图；

图5为本发明实施例1中Pos-Neg阴阳性质控结果图；

图6为本发明实施例1中差异基因统计柱状图；

图7为本发明实施例1中基因聚类图反应差异基因的表达结果图；

图8为本发明实施例1中基因散点图反应差异基因的表达图；

图9为本发明实施例1中基因火山图反应差异基因的表达图；

图10为本发明实施例1中基因功能的显著性分析图；

图11为本发明实施例1中信号通路的显著性分析图；

图12为本发明实施例1中差异基因信号网络图；

图13为本发明实施例1中大鼠生长状态分析图；

图14为本发明实施例1中ELISA测定各组大鼠血清中泌乳素的含量结果图；

图15为本发明实施例1中ELISA测定各组大鼠血清中IL-β的含量结果图；

图16为本发明实施例1中Western blot测定各组大鼠垂体蛋白含量(n＝4)结果图；

图17为本发明实施例1中大麦芽碱对泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤作用的机制图；

图18为本发明实施例1中大鼠体重变化(n＝10)图；

图19为本发明实施例1中大鼠肾功能指标BUN、肌酐检测(n＝10),低剂量组与对照组，高剂量三组两两组间数据对比其差异均无统计学意义(P>0.05)图；

图20为本发明实施例1中各脏器病理切片染色图(n＝3)。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的大麦芽碱在制备抑制MAPK信号通路的抑制剂中的应用进行具体说明。

本发明实施例提供了大麦芽碱在制备抑制MAPK信号通路的抑制剂中的应用。

优选地，上述MAPK信号通路为TLR4/NF-κB/MAPK信号通路。

在本发明的一些实施例中，上述抑制MAPK信号通路用于抑制PRL的表达。具体是指大麦芽碱或MAPK信号通路抑制剂能够垂体瘤患者体内超高的PRL的表达水平恢复或靠近正常水平，垂体瘤具体为泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤，下同。

在本发明的一些实施例中，上述抑制MAPK信号通路用于抑制ACTH的表达。具体是指大麦芽碱或MAPK信号通路抑制剂能够垂体瘤患者体内超高的ACTH的表达水平恢复或靠近正常水平。

进一步地，在本发明的一些实施例中，上述抑制MAPK信号通路用于抑制MAPK12的表达，具体是指大麦芽碱或MAPK信号通路抑制剂能够垂体瘤患者体内超高的MAPK12的表达水平恢复或靠近正常水平。

在本发明的一些实施例中，上述抑制MAPK信号通路用于抑制TLR4的表达，具体是指大麦芽碱或MAPK信号通路抑制剂能够垂体瘤患者体内超高的TLR4的表达水平恢复或靠近正常水平。

在本发明的一些实施例中，上述抑制MAPK信号通路用于抑制TNF-α的表达，具体是指大麦芽碱或MAPK信号通路抑制剂能够垂体瘤患者体内超高的TNF-α的表达水平恢复或靠近正常水平。

在本发明的一些实施例中，上述抑制MAPK信号通路用于抑制IL-β的表达，具体是指大麦芽碱或MAPK信号通路抑制剂能够垂体瘤患者体内超高的IL-β的表达水平恢复或靠近正常水平。

本发明实施例还提供了一种MAPK信号通路抑制剂，所述抑制剂包括大麦芽碱。

进一步地，该MAPK信号通路为TLR4/NF-κB/MAPK介导的信号通路。

进一步地，MAPK信号通路抑制剂用于抑制MAPK12、TLR4、PRL、ACTH、IL-β和TNF-α中的至少一种的表达。

本发明实施例还提供MAPK信号通路抑制剂在制备治疗泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤药物中的应用。

进一步地，MAPK信号通路抑制剂为上述的MAPK信号通路抑制剂。

此外，本发明实施例还提供上述MAPK信号通路抑制剂在制备治疗MAPK信号通路异常相关疾病的药物中的应用。

进一步地，MAPK信号通路异常为TLR4/NF-κB/MAPK信号通路异常。

优选地，所述MAPK信号通路异常包括MAPK12、TLR4、PRL、ACTH、TNF-α和IL-β中的至少一种过度表达。

垂体泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤发生于垂体前叶，垂体前叶整合了控制甲状腺，肾上腺等生殖和生长功能的激素信号通路。垂体通过促进激素分泌来精准的调控内环境的稳态，但所获得的垂体信号也会引起塑形的垂体生长反应，包括功能性垂体细胞发育不良，过度增生和腺瘤形成。目前，对于这种常见肿瘤的具体发病机制的理解尚不完全。本案发明人通过创造性的劳动研究发现了泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤发生与信号蛋白通路的调控相关。具体为MAPK信号通路为，更优选为TLR4/NF-κB/MAPK信号通路。

在抑制剂中，大麦芽碱的剂量为10～40mg。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

一、建立肿瘤模型

1.1.大鼠泌乳素腺瘤模型的建立。

大鼠垂体泌乳素腺瘤模型使用的大鼠品系主要有Fischer344(F344)[34]大鼠，wistar-furth(Wister)大鼠，SD大鼠等。发明人经实验研究发现，与Wister大鼠和SD大鼠相比，F344大鼠更加敏感，诱导形成的泌乳素腺瘤模型成瘤时间短，成瘤率高达100％，操作简单易行，而且不会发生肿瘤转移或产生伴生肿瘤，是一种极为理想的用来研究垂体泌乳素腺瘤的动物模型。

随机将80只F344大鼠分为正常组和模型组，除正常组外其他组别的大鼠均制作为泌乳素腺瘤模型。

模型组需首先进行去卵巢手术：将大鼠麻醉，腹位放置在固定台上，以肋骨稍后方为中心剪除长毛，擦拭碘酒消毒；从腰椎沿背部正中线向下做约1～2cm的纵向切口，切开皮肤，将圆头剪***皮肤和肌肉之间，一边扩张一遍剥离；离脊柱约1cm并沿肩胛线分别于左右两肋下剪开腰肌，长约1cm的切口，立即可见两侧包绕卵巢的脂肪组织，用镊子夹住脂肪组织将其轻轻拉出创口，暴露出淡粉色的卵巢及紧密相连的子宫角；用剪断子宫角并摘除卵巢，检查出血情况，将脂肪组织推回腹腔；用医用胶带将伤口粘合后注射一定量的青霉素，将大鼠放回鼠笼，术后一周正常给食给水。

模型组大鼠去除双侧卵巢一周后，每5天腹腔注射一次苯甲酸***注射液(0.1mg/kg)；正常组不做处理，自由饮食、给水，每天给予12h光照。

1.2.模型动物生存状态观察。

每天观察模型动物的进食及活动状况，每五天称量并记录大鼠的体重。大鼠平均体重正常增长见图1，在用药45天内，模型组大鼠部分出现食欲不振、精神萎靡、消瘦、少动等现象，正常组大鼠未见异常。

1.3.垂体瘤标本的取材。

***注射45天后，将正常组动物及模型组动物各自麻醉，取出垂体。置于-80℃下待用。取F344正常与模型组大鼠各4只。正常组大鼠垂体平均质量为25.5mg，模型组垂体平均质量为39.75mg，模型组大鼠垂体重量约为正常组大鼠垂体的1.5倍大小，见图2。核磁共振成像(MRI)及其数据显示，经***刺激后，模型组大鼠垂体体积显著增大约为正常组的3倍。

1.4.Western blotting分析结果。

Western Blotting法检测正常和模型动物垂体中PRL的蛋白表达情况。

统计学方法应用SPSS22.0软件和GraphPad Prism 5.01进行统计分析和绘图，计量资料以

表示，两组样本均数间的比较采用T检验，P<0.05为差异有统计学意义。与正常组大鼠相比，模型组大鼠垂体中PRL、ACTH蛋白表达明显升高，见图3。

二、分析与垂体瘤相关的通路和基因

采用基因芯片筛选与垂体瘤发生高度相关的信号通路及其相关基因。

2.1选取4只步骤1.1大鼠垂体瘤模型的建立步骤中建立的垂体瘤模型大鼠和4只对照组正常大鼠作为样本。该步骤委托北京中康博生物科技有限公司完成。

样本RNA质控

RNA浓度达到Clariom S芯片实验要求，RNA起始浓度至少>17ng/μL，总量至少>50ng，260/280一般在1.8～2.1范围之间，样品无大分子污染，样品保持完整，无降解见表1。

表1 RNA质控

芯片质控结果良好，请参照附图4和图5。

差异分析

模型组与对照组相比，上调基因数目有1199个，下调基因数有1534个，见图6。

2.2.Western blotting验证基因芯片筛选出的高表达的基因

与正常组相比，垂体瘤模型组大鼠垂体组织MAPK12的表达显著升高(^**P<0.01)。

2.3.统计学方法应用

统计学方法应用SPSS22.0软件和GraphPad Prism 5.01进行统计分析和绘图，计量资料以

表示，两组样本均数间的比较采用T检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2.3.1.差异图分析

聚类图：为了完全和直观地显示样品之间的关系和差异，将差异表达的基因进行分层聚类并以热图的形式显示。通过所选差异基因的表达计算样品之间的相关性，并且可以将相同类型的样品聚集在同一簇中。聚集在同一簇中的基因可能具有相似的生物学功能。见图7。

散点图：横纵坐标分别表示两个样品表达量的log2值，展示了基因上下调分布情况，见图8。

火山图：通过T-Test分析芯片或测序数据以获得P值和FC值。两个因素共同创建了一个Volcano Plot，以显示两组样数据的显著性差异。横轴代表探针的差异倍数(Foldchang)，纵轴代表探针的差异显著程度(-log10P-value)，见图9。

2.3.2.差异基因深入分析

功能的显著性分析—GO Enrichment Analysis

Gene Ontology数据库通称基因本体学数据库，简称GO数据库，它是一个跨物种、综合性、描述性的数据库。其目的是建立一个适用于各种物种的，对基因和蛋白质功能进行限定和描述的，并能随着研究不断深入而更新的语义词汇标准。基因本体涉及的基因和基因产物词汇分为三大类，涵盖生物学的三个方面：细胞组分(cellular component)；分子功能(molecular function)；生物过程(biological process)。GO数据库阐明了基因功能之间的层次关系，能帮助我们更好地理解基因功能之间的关系。基于GO数据库筛选出代表目标基因群显著的、准确的、靶向的基因功能的方法就称为GO Enrichment Analysis。其价值在于发现目标基因所带性状的最重要功能，发现同一基因在这种性状里发挥的主要功能或者非主要功能及判断研究目标在更大量的样本下准确与否。利用Fisher精确检验和多重比较检验计算每个功能的显著性水平(P-value)和误判率(FDR)。从而筛选出基因所体现的显著性功能，显著性筛选的标准：P value<0.01。

经芯片筛选GO数据库分析，模型组与对照组相比高表达基因功能之间的关系前三位为染色体分离，姐妹染色单体分离，细胞***。均涉及细胞***等有关功能。见图10。

信号通路的显著性分析—Pathway Enrichment Analysis

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是京都基因与基因组大百科全书，是***分析基因(及其编码产物)间关系、基因功能、基因组信息的数据库，它有助于研究者把基因及表达信息作为一个整体网络进行研究。基因组信息存储在Genes数据库里，更高级的功能信息存储在Pathway数据库里，包括图解的细胞生化过程如代谢、膜转运、信号传递、细胞周期，还包括同系保守的子通路等信息。KEGG提供的整合代谢途径(pathway)查询十分出色，包括碳水化合物、核苷、氨基酸等的代谢及有机物的生物降解，不仅提供了所有可能的代谢途径，而且对催化各步反应的酶进行了全面的注解。KEGG是进行生物体内代谢分析、代谢网络研究的强有力工具。Pathway Enrichment Analysis方法将以上得到的差异基因基于KEGG数据库进行信号通路注释(Pathway Annotation),得到基因参与的所有信号通路(Pathway)，而后利用Fisher精确检验和多重比较检验计算每个信号通路的显著性水平(P-value)和误判率(FDR)。从而筛选出基因所体现的显著性信号通路(Pathway)，显著性筛选的标准：P value<0.05。

经基因芯片筛选KEGG数据库分析，模型组与正常组相比，筛选出基因所体现的显著性信号通路前三位为细胞循环，内质网蛋白加工，金葡菌感染，见图11。

2.3.3.差异基因的确定

经基因芯片筛选，以及上述差异性分析结果，发现与我们研究方向密切相关且高表达的基因，其中MAPK12显著上调，见图12。

结果分析

导致垂体瘤发病的生物学过程主要为细胞***、蛋白质的加工等涉及细胞增殖的生物学过程，这的确与肿瘤的发生密切相关。在正常组和模型组中差异表达的基因中，发现了MAPK12的高表达和它与其他差异基因表达，发明人推测可能是由于一些刺激物激活垂体中小胶质细胞上的TLR4受体从而激活TLR4/NF-Kb/MAPK12信号通路，进而引起肿瘤细胞增殖。而小胶质细胞是中枢神经***的巨噬细胞。胶质细胞的异常活化和多种促炎症因子的释放所构成的神经炎症反应常常对大脑健康不利。

三、大麦芽碱对垂体泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤的药效作用

3.1.大麦芽碱对大鼠垂体瘤的药效作用

选取70只步骤1.1大鼠垂体瘤模型的建立步骤中建立的泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤模型大鼠和对照组正常大鼠作为样本。

随机将70只F344大鼠分为正常组，手术组，模型组，阳性药组(溴隐亭阳性药组)，大麦芽碱高剂量组，大麦芽碱中剂量组，大麦芽碱低剂量组，每组各8只。除正常组和手术组大鼠外，其他组大鼠均制备成泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤大鼠。

阳性药组大鼠灌胃溴隐亭水溶液，剂量为0.45mg/kg，大麦芽碱水溶液高、中和低剂量组大鼠分别给予口服灌胃大麦芽碱水溶液，剂量分别为40mg/kg、20mg/kg和10mg/kg，正常组和模型组大鼠均灌胃等剂量的蒸馏水。每天1次，持续30天，期间每五天给大鼠称重并记录体重变化情况。

对上述70只样本进行标本采集：

血清采集：大鼠末次给药24h后，禁食12h，自由饮水。于次日上午对各组大鼠行眼球取血，每只取2ml，离心取血清供检测。

组织提取：将各组动物麻醉，同第一章2.2.2项下方法，取出垂体。置于-80℃下待用。

各组别大鼠均正常生长见图13，手术组体重增加较迅速。模型组及各给药组大鼠部分出现食欲不振、精神萎靡、消瘦、少动等现象，正常组大鼠与手术组大鼠未见异常。

采用ELISA法测定各组大鼠血清中PRL、IL-β的含量，按照ELISA试剂盒说明书中操作流程操作。ELISA测定各组大鼠血清中泌乳素(PRL)和IL-β的含量见图14，图15。由图14和图15可知，大麦芽碱能够显著抑制模型组中PRL、IL-β的表达，使PRL、IL-β恢复至或靠近正常水平。

通过Western blotting检测经大麦芽碱作用后给药组大鼠TLR4/NF-κB/MAPK通路的蛋白表达。Western blot检测大麦芽碱对泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤大鼠垂体各蛋白表达见图16，由图16可知，大麦芽碱能够提高显著降低模型组中TLR4、MAPK12、PRL、TNF-α以及ATCH的表达，使其恢复至正常水平。

上述结果研究了大麦芽碱对大鼠泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤的作用，大麦芽碱对泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤作用的机制图见图17。

NF-κB信号通路是肿瘤发生发展的经典通路，通过包括多种病原的组分例如脂多糖，前炎性细胞因子，如TNF、IL-1及丝裂原等在内的多种信号可活化NF-κB通路使NF-κB转位到核内与其相关的DNA基序结合以诱导靶基因的转录。在给药大麦芽碱和溴隐亭的泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤大鼠脑垂体内TLR4、NF-kB、caspase-1、MAPK12、和STAT3蛋白的表达较模型组显著下调，因此，发明人认为是大麦芽碱作用后抑制了该通路的TLR4蛋白的表达从而抑制肿瘤生长。

四、大麦芽碱急性毒性测试

实验动物

40只SPF级SD大鼠，体质量150g，雌雄各半，动物号:No.42010200001245，实验单位许可证编号：SYXK(鄂)2014-0080，实验动物由三峡大学实验动物中心提供(SCXK(鄂)2017-0012)。

随机取5只SPF级SD大鼠进行毒性预测定。另随机选取SPF级SD大鼠30只，雌雄各半，动物买回后适应性饲养一周，实验前一夜停食(不停水)，实验时随机分成3组，分别为对照组、低剂量大麦芽碱给药组(0.035g/kg)、高剂量大麦芽碱给药组(0.07g/kg)。

毒性预测定

用7mg/ml的大麦芽碱溶液(大麦芽碱理论上最大溶解度为7mg/ml)做预实验观察大鼠存活情况，随机选择5只SPF级SD大鼠，以一次最大给药剂量0.07g/kg大麦芽碱灌胃给药，一天内给药两次，间隔不少于4小时，给药1d，观察7天，每天观察记录大鼠的中毒、死亡情况、大鼠饮食饮水量。对于实验过程中死亡的大鼠，立刻解剖寻找死亡原因。实验结束后，解剖所有将死亡大鼠，取出心脏，肝脏，脾脏，肺脏和肾脏进行肉眼观察，并将各脏器制作病理切片，大致确定毒性靶器官。

结果，7d内无大鼠死亡；大鼠一般临床体征:给药后，大鼠活动相对减少，约2h后可恢复；毛发生长正常有光泽，肤色正常，无异常分泌物；行为、饮食均正常、无胀气；未见其他不良反应。

急性毒性实验

若预实验无大鼠死亡，按照急毒性实验方法，采用最大给药量的方法分别以高剂量每次0.07g/kg、低剂量0.035g/kg大麦芽碱灌胃给药，对照组给同体积生理盐水，一日两次(间隔不少于4h)，给药7d，给药后停食3-4h。记录动物即时反应，并仔细观察大鼠的外观、行为、活动、精神、食欲、皮毛、呼吸，体重等，连续观察14d。每天记录大鼠的中毒、死亡情况以及大鼠饮食饮水量，确定LD0(0％死亡率)、LD100(100％死亡率)和相应剂量组间距r值，进行LD50(半数致死量)值的测定。对于在实验过程中死亡的小鼠，应立刻解剖寻找它们的死亡原因。实验结束后，将未死亡大鼠均用乌拉坦腹腔注射麻醉，并立刻解剖，取出心、肝、脾、肺、肾进行肉眼观察有无病变。并将各脏器制作病理切片：将组织经4％多聚甲醛溶液固定，常规取材，脱水，石蜡包埋，制片(4μm厚)，用HE染色法染色，光学显微镜观察并拍照，大致确定毒性靶器官。取所有实验大鼠血清做常规血生化指标测定。

急性毒性实验结果：

7d内无大鼠死亡。因浓度和体积限制，无法确定半数致死量(median lethaldose，LD50)。

大鼠一般临床体征:给药后，大鼠活动相对减少，约2h左右恢复；毛发正常有光泽，肤色正常，无异常分泌物；行为、饮食均正常、肚子无胀气现象，未见其他不良反应。

大鼠体质量：给药后常规饲养1周观察，体质量呈生理性增长见图18。

大鼠肾功能检测，见图19，测定血BUN、CREA的水平。用spss软件统计分析三组大鼠的肾功能差异，三组间两两比较均无统计学意义(P>0.05)，显示该药对大鼠肾功能无明显影响。

大鼠肝功能检测，见表2：测定天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、胆红素(BIL)、碱性磷酸酶(ALP)、血清白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)、总胆汁酸(TBA)、和γ-谷氨酰转肽酶(Γ-GT)。用spss软件统计分析三组大鼠肝功能指标的差异，三组间两两比较均无统计学意义(P>0.05)，显示该药对大鼠肝功能无明显影响。

表2大鼠血清肝功能生化指标

各器官病理切片

解剖大鼠，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾各脏器无异常。分析各脏器的病理切片，结果显示给药组肝，脾，肺，肾有轻微毒性见图20。

(1)低剂量组大鼠肝细胞广泛水肿，细胞肿胀，胞浆疏松淡染，如图20中5图黑色箭头所示，肝组织未见其它明显异常；高剂量组大鼠肝细胞广泛中至重度水肿，细胞肿胀，胞浆疏松淡染或呈空泡状，如图20中6图黑色箭头所示；

(2)低剂量组大鼠脾组织中白髓中可见少量淋巴细胞坏死、凋亡，胞核固缩深染，或碎裂溶解，如图20中8图黑色箭头所示；高剂量组大鼠脾组织白髓局部淋巴细胞减少，该处可见少量疏松的***，如图20中9图黑色箭头(右)所示，并可见少量淋巴细胞坏死凋亡，胞核碎裂，如图20中9图红色箭头(左)所示；

(3)低剂量组大鼠肺组织可见肺泡上皮细胞大量增生，肺泡壁增粗，如图20中11图黑色箭头所示；其他组织均未见明显异常。高剂量组大鼠肺泡上皮细胞增生，肺泡壁增粗，如图20中12图黑色箭头(下)所示，血管周围可见极少量粒细胞浸润，如图20中12图红色箭头(上)所示；

(4)低剂量组大鼠肾组织未见明显异常，高剂量组大鼠肾组织局部肾小管间质***增生，可见较多成纤维细胞，如图20中15图黑色箭头(左下)所示，并伴有少量炎症细胞浸润，如图20中15图红色箭头(最右)所示，少量肾小管管腔轻度扩张，如图20中15图黄色箭头(右二)所示，极少量肾小管上皮细胞坏死凋亡，胞核固缩深染或碎裂溶解，如图20中15图绿色箭头(最上)所示，其他组织均未见明显异常。

大鼠组织炎症评分

组织炎症评分显示，低剂量组大鼠无炎症反应，高剂量组大鼠脾、肺、肾有轻度炎症反应，见表3。

表3大鼠各脏器炎症评分(n＝3)

注：该炎症评分是基于整张切片整体情况进行评分。

炎症程度评分：0分(无或极少炎症)；1分(轻度炎症)；2分(中度炎症)；3分(重度炎症)。

在该急毒性实验中，高剂量组(0.14g/kg)，低剂量组(0.07g/kg)均未观察到大鼠死亡，证明了大麦芽碱致死剂量大于0.14g/kg。与对照组比较，给药组大鼠的生理状况，体重变化，行为活动等均无显著差异；病理切片和生化实验显示高剂量组肝脏，脾脏，肾脏有轻微炎症，证明大麦芽碱毒性较小，可以在此剂量之下使用。此次实验的最大给药量远大于后续进行药效学实验的给药剂量，故后续实验可按药效学给药剂量使用。

综上所述，本发明实施例提供了一种大麦芽碱在制备抑制MAPK信号通路的抑制剂中的应用，发现了大麦芽碱能够通过抑制MAPK信号通路从而有助于治疗泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤发挥药效作用，解决了泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤患者用药短缺的困境。

本发明实施例还提供了一种MAPK信号通路抑制剂，该抑制剂中发现了一种新的物质用于抑制MAPK信号通路，且该物质对MAPK信号通路的抑制效果显著。

此外，本发明实施例还提供了一种MAPK信号通路抑制剂在制备治疗泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤药物中的应用，该应用提供了一种新的用于治疗泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤药物的物质，该物质可以通过抑制MAPK信号通路从而有助于泌乳素腺瘤和促肾上腺皮质激素腺瘤的治疗。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.大麦芽碱在制备用于治疗垂体瘤的药物中的应用，其特征在于，所述垂体瘤为促肾上腺皮质激素腺瘤。

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