CN110146635B - 色谱分析柱、检测假体关节感染的试剂盒及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种色谱分析柱、检测假体关节感染的试剂盒及装置。该色谱分析柱包括:色谱柱管、填充于色谱柱管内的填料;以及与色谱柱管一体化设计的色谱柱尖,色谱柱管的内径为100~200μm。采用内径相对较宽的内径,能够使色谱柱管在提高色谱洗脱流速的时候维持柱压在正常压力范围内,提高了色谱分离的稳定性;同时也有利于增加样本的上样量,提高质谱检测的灵敏度。此外,采用一体化成型的色谱分析柱尖,洗脱时不存在拖尾现象,对蛋白的分离度更好。因此,采用本申请所改进的色谱分析柱对PIJ进行检测时,肽段分离度更好,稳定性更高,进而使得对目标蛋白的定量结果更准确。
Description
技术领域
本发明涉及假体关节感染检测领域,具体而言,涉及一种色谱分析柱、检测假体关节感染的试剂盒及装置。
背景技术
关节假体术后感染(PJI,Prosthetic joint infections)是关节置换术后公认最严重的并发症之一,虽然PJI的发病率并不高,但自抗生素应用以来一直没有显著降低。据报道,髋和肩PJI 的发病率约为1%,膝PJI的发病率约为2%,肘PJI的发病率约为9%。而对于关节翻修术,PJI的发病率甚至高达40%;另外,导致全踝关节置换手术失败的并发症中有33%是PJI。
根据美国骨科医师协会、感染病学会和肌肉骨骼感染学会提出的诊断指南,大部分PJI 可以获得明确的诊断和及时的治疗。但是,也有一些临床表现不典型的病人,诊断十分困难。现有的诊断标准依据临床表现和实验室检查综合判断,后者包括红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C反应蛋白(C-Reactive Protein,CRP)、细菌培养、关节液WBC 计数与分类等。这些指标在诊断PJI的特异性、敏感性方面仍存在一些不足:1)细菌培养是诊断PJI的“金”标准之一,但细菌培养阳性率为60%~70%左右,敏感性不够高。2)关节液白细胞计数与分类是诊断PJI的有效方法,但全身炎症性关节炎病人关节置换后,该指标也会升高,特异性不强。3)现有实验室诊断方法,无法做到即时诊断(Point ofCare Testing,POCT,或称床边诊断)。
因此,如何更准确地对PJI进行检测,现有技术中仍无有效的解决方案。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种色谱分析柱、检测假体关节感染的试剂盒及装置,以提供一种适合利用质谱来对PJI进行检测的产品,从而提高检测的准确性。
为了实现上述目的,根据本发明的一个方面,提供了一种色谱分析柱,该色谱分析柱包括:色谱柱管,色谱柱管的内径为100~200μm;填充于色谱柱管内的填料;以及与色谱柱管一体化设计的色谱柱尖。
进一步地,色谱柱管的长度为100~300mm;更优选为100~150mm,最优为100mm;优选地,色谱柱尖的内径为2~8μm,更优选为3~6μm;优选地,填料为C18填料,更优选填料的粒径为1.5~2.5μm,进一步优选为1.8~2.2μm;优选地,色谱柱管的内径为120μm~180μm,更优选为150μm;优选地,色谱柱管的外径为355~365μm,优选为360μm。
为了实现上述目的,根据本发明的一个方面,提供了一种检测假体关节感染的试剂盒,试剂盒包括上述任一种色谱分析柱。
进一步地,试剂盒还包括重同位素标记的标准肽段,优选地,标准肽段包含来源于蛋白髓性细胞核分化抗原蛋白和成髓细胞素蛋白的肽段序列;更优选地,来源于蛋白髓性细胞核分化抗原蛋白的肽段序列为SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2;更优选地,来源于成髓细胞素蛋白的肽段序列为SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4。
进一步地,重同位素标记位于标准肽段的C-末端的氨基酸上。
进一步地,重同位素标记的标准肽段位于同一试管中;优选地,试管中每一条标准肽段的浓度为100~200fmol,更优选为100~150fmol,进一步优选为100~100fmol。
进一步地,试剂盒还包括上样缓冲液;优选地,上样缓冲液为含0.1~0.5v%甲酸的水溶液;更优选为0.2v%甲酸的水溶液。
根据本发明的另一方面,提供了一种检测假体关节感染的装置,装置包括:色谱分离设备、质谱分离设备以及质谱数据处理设备,色谱分离设备包括色谱分析柱,色谱分析柱为上述任一种色谱分析柱。
进一步地,色谱分析柱中含有重同位素标记的标准肽段;优选地,标准肽段包含来源于蛋白髓性细胞核分化抗原蛋白和成髓细胞素蛋白的肽段序列;更优选地,来源于蛋白髓性细胞核分化抗原蛋白的肽段序列为SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2;更优选地,来源于成髓细胞素蛋白的肽段序列为SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4。
进一步地,重同位素标记位于标准肽段的C-末端的氨基酸上。
进一步地,色谱分析柱中每一条标准肽段的浓度为100~200fmol,更优选为100~150fmol,进一步优选为100fmol。
进一步地,色谱分析柱中还包括上样缓冲液,优选地,上样缓冲液为含0.1~0.5v%甲酸的水溶液,优选为0.2v%甲酸的水溶液。
进一步地,色谱分析柱中还包括关节液肽段溶液,优选关节液肽段溶液的上样量为 0.8~1.2μg,更优选1μg。
进一步地,色谱分析柱中的流动相A为100%色谱级水+0.2%甲酸,流动相B为80%色谱级乙腈+0.2%甲酸;优选地,色谱分析柱的色谱分离梯度为20~40min的梯度分离;更优选为 30min的梯度分离;进一步优选地,30min的梯度分离的参数设置如表1所示。
进一步地,质谱分离设备中,
一级质谱的条件设置如下:扫描范围:150-2000m/z,分辨率:60000(@m/z 200),AGC target:1e6,Maximum IT:40ms,一级质谱结束后根据成分列表触发20个二级 PRM扫描;
二级PRM扫描的条件设置如下:Isolation window(隔离窗口):1Th,分辨率:15000(@m/z 200),AGC target(自动增益目标):5e5,Maximum IT(最大注入时间):100ms,Microscans(微扫描):1,MS2 Activation Type(二级活化类型):HCD(高能碰撞模式),NCE(碰撞能量):27。
进一步地,质谱分离设备中,PRM检测离子的信息设置如表2所示。
应用本发明的技术方案,通过将内径改进为100~200μm,使得色谱分析柱的内径相对较宽,较宽的内径可以保证提高色谱洗脱流速的时候维持柱压在非耐高压常规液相***的正常压力范围内,从而提高了色谱的稳定性;同时也有利于增加样本的上样量,提高质谱检测的灵敏度。此外,本申请采用一体化成型的色谱分析柱尖,洗脱时不存在拖尾现象,对蛋白的分离度更好。因此,采用本申请所改进的色谱分析柱对PIJ进行检测时,肽段分离度更好,稳定性更高,进而使得对目标蛋白的定量结果更准确。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。在附图中:
图1示出了根据本申请一种优选的实施例中所提供的色谱分析柱的结构示意图;
图2示出了单个标准肽段采用本申请的方法所检测的ROC面积,按照灰度深浅所示,ROC 面积由大到小依次是:标准肽段2---标准肽段4---标准肽段1---标准肽段3;
图3示出了组合的标准肽段采用本申请的方法所检测的ROC面积;按照灰度深浅所示, ROC面积由大到小依次是:标准肽段1+2+3+4---标准肽段1+2---标准肽段3+4。
其中,附图标记如下:
1、色谱柱管;2、填料;3、色谱柱尖。
具体实施方式
需要说明的是,在不冲突的情况下,本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
1mol=103mmol;1mmol=103μmol;1μmol=103nmol;1nmol=103pmol;1pmol=103fmol.
蛋白质组学技术生物标志物筛选出了包括蛋白髓性细胞核分化抗原(MNDA:Myeloid Cell Nuclear Differentiation Antigen)和成髓细胞素(PRTN3:Myeloblastin)。前者作为粒细胞核分化的抗原,当产生防御素时会明显升高;后者作为一种丝氨酸蛋白酶会在中性粒细胞的跨内皮细胞迁移过程中发挥重要作用。
PRM平行反应监测(Parallel reaction monitoring)属于质谱靶向分析,在整个液相分离过程中会不断地对每一个目标母离子的全部碎片离子图谱进行记录。相比于传统SRM(selective reaction monitoring,选择反应监测)只检测目标离子对的模式,PRM检测所选择的母离子窗口内的所有碎片信息。PRM主要的优势就是使用了超高分辨率的Orbitrap质量分析器,其能够将干扰信息与真实的信号进行区分,以及相比于传统的SRM方法能够更好的保证分析的选择性。
如背景技术所提到的,现有技术中对PJI的检测准确性较低,为了进一步提高PJI检测的准确性,本申请采用蛋白质组学的研究思路,找到了能够表征假体关节感染的特征蛋白,因而根据该特征蛋白在待检样本中的表达量即可判定待检样本的感染状况。在此研究过程中,为了更有效地从待检样本中将特征蛋白分离出来,从而更准确地检测特征蛋白的表达量,本申请中还对用于分离蛋白的色谱分析柱进行了优化改进,从而使得目标蛋白的分离效果更好。
在上述研究结果的基础上,本申请提出了一种改进的色谱分析柱,如图1所示,该色谱分析柱包括:色谱柱管1,色谱柱管1的内径为100~200μm;填充于色谱柱管1内的填料2;以及与色谱柱管1一体化设计的色谱柱尖3。
目前,在蛋白质组学领域常用的色谱分析柱的内径为75μm。而在本申请中,通过将内径改进为100~200μm,使得色谱分析柱的内径相对较宽,较宽的内径可以保证提高色谱洗脱流速的时候维持柱压在非耐高压常规液相***的正常压力范围内(280bar以内),从而提高了色谱的稳定性;同时也有利于增加样本的上样量,提高质谱检测的灵敏度。此外,现有的色谱分析柱多为平头色谱柱与色谱喷针配合使用的,即是不带有柱尖的,这种色谱分析柱在洗脱过程中,洗脱峰会有拖尾现象,因而柱效相对较差。而本申请改进后的一体化成型的色谱分析柱,洗脱时不存在拖尾现象,对蛋白的分离度更好。因此,本申请所改进的色谱分析柱肽段分离度更好,稳定性更高,进而更有利于对目标蛋白进行定量分析,使得定量结果更准确。
本申请所改进的色谱分析柱,一方面扩大了色谱柱管的内径,另一方面改进了色谱柱尖的结构,使得肽段分得更开,从而分离效果更好。在此基础上,为了进一步提高蛋白的分离效果,在扩大了内径宽度的基础上进一步延长了色谱柱管的长度,在本申请一种优选的实施例中,上述色谱柱管的长度为100~300mm;更优选为100~150mm,最优为100mm。
上述长度范围的色谱分析柱在具体使用中,根据所欲分离的样本中蛋白的丰富程度,以及研究目的的不同,可以在上述范围内进行合理选择。比如,在本申请中,针对关节液中的蛋白进行分离时,需要分离度更好才能更准确地对目的蛋白的表达量进行准确定量,因此,选择长度为100~300mm,更优选为100~150mm,最优选为100mm的色谱柱管长度,分别配合20~150min的梯度分离时长,即可使得肽段的分离效果好,且时间短。更优选地,当色谱柱管长度为100mm时,建议采用30min的分离时长。当色谱柱管长度为150mm时,建议采用70min的分离时长。当色谱柱管长度为300mm时,建议采用150min的分离时长。
上述改进的色谱分析柱中,与色谱柱管一体化成型的色谱柱尖,是通过对色谱柱管的一端进行拉伸得到,随着拉伸的延长,管柱的内径逐渐变小,内外径的厚度也逐渐变薄,所形成的色谱柱尖的内径与外径逐渐趋于接近,此时色谱柱尖的内径(即色谱柱尖的最尖端的开口的内径,图1中未示出)为2~8μm,根据实际样本的不同,可以优选为3~6μm,内径过大,不利于喷雾,内径过小,容易使得色谱柱管压力过大,影响色谱柱管的运行稳定性。
在本申请又一种优选的实施例中,色谱柱管的内径为100μm~200μm(蛋白质组学领域常使用的360μm外径的商业化的色谱柱,其对应的内径分别是20μm、75μm、100μm、150μm、 200μm,具体规格是非连续的),更优选为150μm。上述内径的大小可以根据色谱***的流速以及耐压等情况进行合理选择。
本申请所提到的上述色谱分析柱,除了内径和一体化成型的色谱柱尖外,其余的填料或外径等参数,均可采用与现有的色谱分析柱类似的参数。为了更有效地对关节液中的蛋白进行高效分离,在本申请一种优选的实施例中,上述色谱分析柱中的填料为C18填料,更优选填料的粒径为1.5~2.5μm,进一步优选为1.8~2.2μm。选择粒径在该范围内的C18填料,具有色谱分辨率高同时色谱***压力小等优势。
在本申请中,对上述色谱柱管的外径为特殊要求,只要能够承受相应的压力即可。根据现有的色谱分析柱的外径范围,本申请中色谱柱管的外径可以为355~365μm,优选为360μm。
在上述色谱分析柱改进的基础上,本申请还提供了一种检测假体关节感染的试剂盒,该试剂盒包括上述任一种改进的色谱分析柱。采用本申请上述所改进的色谱分析柱能够对关节液蛋白分离效果更好,使得蛋白间的相互干扰和影响相对更小,进而使得后续质谱定量效果更准确。
为了更准确地对关节炎感染状况进行检测,在本申请一种优选的实施例中,上述试剂盒还包括重同位素标记的标准肽段,该标准肽段是用来对假体关节炎感染的蛋白进行定量的内标,同时也是假体关节炎感染的蛋白标记物。因而,任何能够对假体关节炎感染起到标记物作用的蛋白均适用于本申请。
如前述,本申请的申请人在研究假体关节炎感染的过程中发现了两种新的蛋白标记物,因而在本申请一种优选的实施例中,上述标准肽段包含来源于蛋白髓性细胞核分化抗原蛋白和成髓细胞素蛋白的肽段序列;更优选地,来源于蛋白髓性细胞核分化抗原蛋白(MNDA: Myeloid Cell Nuclear Differentiation Antigen)的肽段序列为SEQ ID NO:1:EASSVSDFNQNFEVPNR和/或SEQ ID NO:2:VFDINLK;更优选地,来源于成髓细胞素蛋白(PRTN3:Myeloblastin)的肽段序列为SEQ ID NO:3:LVNVVLGAHNVR和/或SEQ ID NO:4:LFPDFFTR。
上述标准肽段上的重同位素标记位于标准肽段的C-末端的氨基酸上,上述标准肽段的末端氨基酸为精氨酸(R)或赖氨酸(K),即在R或K上标记(C13和N15)重同位素,具体采用现有的方法进行标记。
上述标准肽段可以选自蛋白髓性细胞核分化抗原蛋白的肽段序列中的任意一条以及成髓细胞素蛋白的肽段序列中的任意一条,也可以其中一个蛋白选择两条肽段序列,另一个蛋白的选自一条肽段序列,还可以两个蛋白均选择两条肽段序列。具体可根据实际样本需要进行合理选择。
在一种优选的实施例中,上述试剂盒中,重同位素标记的标准肽段位于同一试管中,便于加样。
在另一种优选的实施例中,试管中每一条标准肽段的浓度为100~200fmol,更优选为 100~150fmol,进一步优选为100fmol。四条标准肽段为等摩尔数混合添加,由于重标肽段SEQ ID NO:1低浓度保存容易降解,当其浓度低于100fmol时,则可能检测不到该标准肽段的质谱响应信号,发明人曾经尝试过50fmol的混合浓度,在该浓度下有些样本中就检测不到该重标肽段的信号,因此选择100fmol的浓度以使得所检测样本能检测到该标准肽段的质谱反应信号,从而提高检测的灵敏度。若在该浓度基础上提高混合浓度,进一步提高了检测的灵敏度,因而更能鉴定到。本申请通过多次试验确定当每条标准肽段的浓度在上述范围时,能够获得较佳的质谱响应信号强度。具体使用时浓度的高低,可以根据预实验所获得的质谱响应信号强度的强弱来确定,质谱响应信号强度强时,使用时浓度可以相对较低,反之,质谱响应信号强度弱时,则需要浓度相对较高。
为了更便利地进行检测,在本申请一种优选的实施例中,上述试剂盒还包括上样缓冲液;采用现有的上样缓冲液即可。为了相对更充分地溶解所欲检测的蛋白,在一种优选的实施例中,上样缓冲液为含0.1~0.5v%甲酸的水溶液;更优选为0.2v%甲酸的水溶液。发明人发现,一般情况下选择0.1v%的甲酸浓度,但当提高甲酸浓度到0.2v%时,可以降低背景中单电荷的比例。因而为了进一步降低背景中单电荷的比例,本申请优选采用甲酸的体积浓度更好的缓冲液,比如采用0.2v%的甲酸水溶液。
需要说明的是,本申请所提供的上述试剂盒所含的试剂均为蛋白质和一般无机盐水溶液,无挥发性、有毒或有害物质,因而安全性高。因而采用该试剂盒对关节液中的4种标准肽段进行绝对定量分析,特异性强,且实验结果一致性高,具有高灵敏度、高特异性的优点,采用该试剂盒得到的实验结果真实可靠,可重复性强。
在上述改进的色谱分析柱的基础上,本申请还提出了一种检测假体关节感染的装置,该装置包括:色谱分离设备、质谱分离设备以及质谱数据处理设备,色谱分离设备包括色谱分析柱,色谱分析柱为上述任一种色谱分析柱。
通过采用上述所改进的色谱分析柱,本申请的上述装置能够对关节液蛋白分离效果更好,使得蛋白间的相互干扰和影响相对更小,进而使得后续质谱定量效果更准确。相应地,任何含有本申请上述色谱分析柱的用于检测关节感染的装置均在本申请的保护范围内。
上述装置中的色谱分离设备除了采用本申请改进的色谱分析柱外,其他相关的设备采用现有的即可。比如,质谱分离设备可以采用高分辨四级杆质谱仪或者三合一高分辨质谱仪。更优选采用纳升级色谱仪Easy-n LC和高分辨质谱仪Q-Exactive系列,以使分析更加准确。
进一步地,为了更准确地检测假体关节炎感染,在一种优选的实施例中,上述装置的色谱分析柱中含有重同位素标记的标准肽段。该标准肽段是用来对假体关节炎感染的蛋白进行定量的内标,同时也是假体关节炎感染的蛋白标记物。因而,任何能够对假体关节炎感染起到标记物作用的蛋白均适用于本申请。
如前述,本申请的申请人在研究假体关节炎感染的过程中发现了两种新的蛋白标记物,因而在本申请一种优选的实施例中,上述标准肽段包含来源于蛋白髓性细胞核分化抗原蛋白和成髓细胞素蛋白的肽段序列;更优选地,来源于蛋白髓性细胞核分化抗原蛋白的肽段序列为SEQ ID NO:1:EASSVSDFNQNFEVPNR和/或SEQ ID NO:2:VFDINLK;更优选地,来源于成髓细胞素蛋白的肽段序列为SEQ ID NO:3:LVNVVLGAHNVR和/或SEQ ID NO:4:LFPDFFTR。
上述标准肽段上的重同位素标记位于标准肽段的C-末端的氨基酸上,上述标准肽段的末端氨基酸为精氨酸(R)或赖氨酸(K),即在R或K上标记重同位素,具体采用现有的方法进行标记。
上述标准肽段可以选自蛋白髓性细胞核分化抗原蛋白的肽段序列中的任意一条以及成髓细胞素蛋白的肽段序列中的任意一条,也可以其中一个蛋白选择两条肽段序列,另一个蛋白的选自一条肽段序列,还可以两个蛋白均选择两条肽段序列。具体可根据实际样本需要进行合理选择。
在另一种优选的实施例中,色谱分析柱中每一条标准肽段的浓度为100~200fmol,更优选为100~150fmol,进一步优选为100fmol。
本申请通过多次试验确定当每条标准肽段的浓度在上述范围时,能够获得较佳的质谱响应信号强度。具体使用时浓度的高低,可以根据预实验所获得的质谱响应信号强度的强弱来确定,质谱响应信号强度强时,使用时浓度可以相对较低,反之,质谱响应信号强度弱时,则需要浓度相对较高。
为了更便利地进行检测,在本申请一种优选的实施例中,上述装置的色谱分析柱中还包括上样缓冲液;采用现有的上样缓冲液即可。为了相对更充分地溶解所欲检测的蛋白,在一种优选的实施例中,上样缓冲液为含0.1~0.5v%甲酸的水溶液;更优选为0.2v%甲酸的水溶液。
当本申请的装置处于待检状态或检测状态时,上述色谱分析柱中还包括关节液肽段溶液。此处的关节液肽段溶液根据不同的样本略有差异。
为了更准确地对待检测的关节液肽段溶液中的肽段进行检测和定量,在本申请一种优选的实施例中,控制关节液肽段溶液的上样量为0.8~1.2μg,更优选1μg。理论上增加样本的上样量能够提高检测的灵敏度,优选上样量在上述范围内,尤其是1μg时差不多使得质谱的检测信号达到饱和,对于20~40分钟检测梯度来说,1.2μg这个上样量差不多就是上限了。
本申请的上述装置在对含有关节液肽段溶液以及标准肽段的色谱分析柱进行上样分离时,在一种优选的实施例中,该装置的色谱分析柱中的流动相A采用100%色谱级水+0.2%甲酸,流动相B采用80%色谱级乙腈+0.2%甲酸。
在采用上述流动相A和B进行洗脱的过程中,为了更有效地实现蛋白的分离,在另一种优选的实施例中,上述装置上色谱分析柱的色谱分离梯度设置为20~40min的梯度分离;更优选为30min的梯度分离;进一步优选地,30min的梯度分离的参数设置如下表1:
表1:
时间 | 持续时间 | 流速(纳升/分钟) | B% |
0 | 0 | 800 | 5 |
5 | 5 | 800 | 12 |
28 | 23 | 800 | 42 |
29 | 1 | 800 | 95 |
30 | 1 | 800 | 95 |
通过采用上述改进的色谱分析柱,并采用上述20~40min时长的色谱分离梯度,能够实现蛋白更好的分离,从而使得蛋白定量结果更准确。采用上述表1中的色谱分离梯度参数,蛋白分离效果更好。
本申请的上述装置,质谱分离设备中的具体参数的设置可以根据上述改进进行合理调整即可。在本申请一种优选的实施例中,上述装置的质谱分离设备中,一级质谱的条件设置如下:扫描范围:150-2000m/z,分辨率:60000(@m/z 200),AGC target(自动增益目标):1e6, Maximum IT(最大注入时间):40ms,一级质谱结束后根据成分列表触发20个二级PRM扫描;
二级PRM扫描的条件设置如下:Isolation window(隔离窗口):1Th,分辨率:15000(@m/z 200),AGC target(自动增益目标):5e5,Maximum IT(最大注入时间):100ms,Microscans (微扫描):1,MS2 Activation Type(二级活化类型):HCD(高能碰撞模式),NCE(碰撞能量):27。
通过将一级质谱的条件及二级PRM扫描的条件设置为上述条件下,能够更准确对相应的蛋白进行表达量进行分离采集,从而使得最终的定量结果更准确。
上述装置的质谱分离设备中,PRM检测离子的信息设置可以根据标准肽段的具体信息进行设置。在本申请一种优选的实施例中,PRM检测离子的信息设置如下表2:
表2:
上表2中同一蛋白同一肽段序列出现不同规定电荷形式与肽段上出现的碱性氨基酸的个数有关,以实际检测到的肽段的不同电荷形式为准。
需要说明的是,本申请的上述不同参数设置下的装置,均是使用了本申请改进的色谱分析柱及改进的标准肽段的不同检测状态下的各种不同的检测装置的实施例,因而,均在本申请的保护范围内。
相应地,本申请的不同参数设置下、不同状态下的检测装置,同时体现的也是不同的检测方法。因而,在本申请一种典型的实施方式中,还提供了一种检测假体关节感染的方法,该方法包括:将样本关节液肽段溶液上样至色谱分析柱中进行色谱分离检测。采用本申请所改进的色谱分析柱能够对关节液蛋白分离效果更好,使得蛋白间的相互干扰和影响相对更小,进而使得后续质谱定量效果更准确。
在另一实施例中,上述方法在将样本关节液肽段溶液上样至色谱分析柱中时,将重同位素标记的标准肽段与上述样本关节液肽段溶液共同上样至色谱分析柱中。通过在关节液肽段溶液中同时加入重同位素标记的标准肽段,便于对关节液肽段溶液中的相应肽段更准确地定量。
如前述,本申请的申请人在研究假体关节炎感染的过程中发现了两种新的蛋白标记物,因而在本申请一种优选的实施例中,上述标准肽段包含来源于蛋白髓性细胞核分化抗原蛋白和成髓细胞素蛋白的肽段序列;更优选地,来源于蛋白髓性细胞核分化抗原蛋白的肽段序列为SEQ ID NO:1:EASSVSDFNQNFEVPNR和/或SEQ ID NO:2:VFDINLK;更优选地,来源于成髓细胞素蛋白的肽段序列为SEQ ID NO:3:LVNVVLGAHNVR和/或SEQ ID NO:4:LFPDFFTR。
上述标准肽段上的重同位素标记位于标准肽段的C-末端的氨基酸上,上述标准肽段的末端氨基酸为精氨酸(R)或赖氨酸(K),即在R或K上标记重同位素,具体采用现有的方法进行标记。
上述标准肽段可以选自蛋白髓性细胞核分化抗原蛋白的肽段序列中的任意一条以及成髓细胞素蛋白的肽段序列中的任意一条,也可以其中一个蛋白选择两条肽段序列,另一个蛋白的选自一条肽段序列,还可以两个蛋白均选择两条肽段序列。具体可根据实际样本需要进行合理选择。
在一种优选的实施例中,上述方法中,控制上样的色谱分析柱中每一条标准肽段的浓度为100~200fmol,更优选为100~150fmol,进一步优选为100fmol。本申请通过多次试验确定当每条标准肽段的浓度在上述范围时,能够获得较佳的质谱响应信号强度。具体使用时浓度的高低,可以根据预实验所获得的质谱响应信号强度的强弱来确定,质谱响应信号强度强时,使用时浓度可以相对较低,反之,质谱响应信号强度弱时,则需要浓度相对较高。
为了相对更充分地溶解所欲检测的蛋白,在一种优选的实施例中,采用0.1~0.5v%甲酸的水溶液;更优选为0.2v%甲酸的水溶液作为上样缓冲液。
通常情况下,采用0.1v%甲酸水溶液作为上样缓冲液即可满足需求。为了进一步降低背景中单电荷的比例,本申请优选采用甲酸的体积浓度更好的缓冲液,比如采用0.2v%的甲酸水溶液。
在上述方法中,为了更准确地对待检测的关节液肽段溶液中的肽段进行检测和定量,在本申请一种优选的实施例中,控制上样的色谱分析柱中关节液肽段溶液上样量为0.8~1.2μg,更优选1μg。
在对含有关节液肽段溶液以及标准肽段的色谱分析柱进行上样分离时,在一种优选的实施例中,流动相A采用100%色谱级水+0.2%甲酸,流动相B采用80%色谱级乙腈+0.2%甲酸。
在采用上述流动相A和B进行洗脱的过程中,为了更有效地实现蛋白的分离,在另一种优选的实施例中,设置20~40min的色谱分离梯度;更优选为30min的色谱分离梯度进行分离;进一步优选地,30min的色谱分离梯度的参数设置如前述表1所示。
通过采用上述改进的色谱分析柱,并采用上述20~40min时长的色谱分离梯度,能够实现蛋白更好的分离,从而使得蛋白定量结果更准确。采用表1中的色谱分离梯度参数,蛋白分离效果更好。
在本申请一种优选的实施例中,将一级质谱的条件设置如下:扫描范围:150-2000m/z,分辨率:60000(@m/z 200),AGC target:1e6,Maximum IT:40ms,一级质谱结束后根据成分列表触发20个二级PRM扫描;
二级PRM扫描的条件设置如下:Isolation window(隔离窗口):1Th,分辨率:15000(@m/z 200),AGC target(自动增益目标):5e5,Maximum IT(最大注入时间):100ms,Microscans (微扫描):1,MS2 Activation Type(二级活化类型):HCD(高能碰撞模式),NCE(碰撞能量):27。
通过将一级质谱的条件及二级PRM扫描的条件设置为上述条件,能够更准确对相应的蛋白进行表达量进行分离采集,从而使得最终的定量结果更准确。
上述方法中,PRM检测离子的信息设置可以根据标准肽段的具体信息进行设置。在本申请一种优选的实施例中,PRM检测离子的信息设置如表2所示。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
实施例1
采用上样缓冲液(0.2v%的甲酸水溶液)将SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3 及SEQ ID NO:4所示的重同位素标记标准肽段制备成终浓度为100fmol的肽段,然后震荡混匀,在12000g的离心机上离心3分钟,取上清液备用;
对40个来源于安装有假体关节的个体的关节液样品进行蛋白提取,然后进行酶解,每个样本取100μg关节液蛋白酶解肽段加入100μL上样缓冲液,震荡混匀,制成关节液肽段溶液备用;
取1μL关节液肽段溶液,并向其中加入1μL 100fmol的重同位素标记标准肽段溶液,之后加入3uL的上样缓冲液混合均匀后置于96孔上样板进行色谱进样。
将合成的重标肽段按照等摩尔数的比例混合,单条肽段分别按照如下浓度进行混合: 250fmol、62.50fmol、15.63fmol、3.91fmol、0.98fmol,从而形成5个不同浓度的混合标准肽段,然后将混合好的重标肽段掺入多组混合后的关节液肽段中进行质谱靶向定量检测,从而构建标准肽段的稀释标准曲线,以备进行内源性肽段含量的校准。
其中,所使用的色谱分析柱的结构如图1所示,包括色谱柱管,填料以及一体化设计的色谱柱尖,填料填充于色谱柱管内,色谱柱尖一体化设计地设置于色谱柱管的一端,色谱柱管的长度为100mm、外径为360μm、内径为150μm,色谱柱尖的内径为3μm;填料是1.9μm粒径的C18反相填料。
色谱分离梯度设置如下表1:
流动相A:100%色谱级水+0.2v%甲酸,
流动相B:80%色谱级乙腈+0.2v%甲酸,
表1:
时间 | 持续时间 | 流速(纳升/分钟) | B% |
0 | 0 | 800 | 5 |
5 | 5 | 800 | 12 |
28 | 23 | 800 | 42 |
29 | 1 | 800 | 95 |
30 | 1 | 800 | 95 |
PRM检测离子表设置如下表2。
表2:
质谱仪Q-Exactive HF(Thermo)设置如下:
一级质谱,扫描范围:150-2000m/z,分辨率:60000(@m/z 200),AGC target:1e6,Maximum IT:40ms;一级质谱结束后根据成分列表触发20个二级PRM扫描;二级PRM扫描,Isolation window:1Th,分辨率:15000(@m/z 200),AGC target:5e5, Maximum IT:100ms,Microscans:1,MS2 Activation Type:HCD,NCE:27;
最后,对PRM质谱数据进行Skyline分析,并分别计算4条肽段标志物在样品关节液中的浓度。
检测结果见表3:(单位:fmol)
附:表3中的1代表感染,0代表未感染。
表3:
根据不同肽段的检测含量可以预测本申请的方法所检测的ROC面积,具体见图2和图3。其中,图2示出的是单个标准肽段检测的ROC面积,具体为:AUC_1:0.939;AUC_2:0.944;AUC_3:0.891;AUC_4:0.942(其中,AUC_1中的1代表的SEQ ID NO:1的标准肽段,其他序号的分别与序列表中的序列的编号对应)。
从图3可以看出,标准肽段组合SEQ ID NO:1和2,或者SEQ ID NO:3和4均能实现进行检测,但四个肽段同时进行检测的灵敏度和特异性均更优,具体所检测的ROC面积如下:AUC_1&2:0.9514;AUC_3&4:0.9361;AUC_1&2&3&4:0.9616。
从上表3中可以看出,SEQ ID NO:1和2所示的标准肽段的浓度约15fmol以上,或者SEQ ID NO:3和4所示的标准肽段浓度在30fmol以上时感染的风险更高。
实施例2
实施例2与实施例1的区别仅在于:色谱分析柱中,色谱柱管的长度为150mm、外径为 360μm、内径为150μm,填料是1.9μm粒径的C18反相填料。同时,色谱分离时间为75分钟。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于:色谱分析柱中,色谱柱管的长度为300mm、外径为360μm、内径为150μm,填料是1.9μm粒径的C18反相填料。同时,色谱分离时间为150分钟。
实施例2和3均能够有效的鉴定到目的肽段,并进行目标肽段的靶向定量分析,得到的结果也能很好的区分假体关节的感染与否(因与实施例1的数据无明显差异,此处不再具体列出)。但考虑到临床样本检测的时效性以及质谱检测的成本,本申请中实施例1的检测条件为最佳的应用条件。
从以上的描述中,可以看出,本发明上述的实施例实现了如下技术效果:通过采用本申请改进的色谱分析柱,能够对样本蛋白进行快速高效分离,且分离度更好。进一步通过往关节液中掺入本申请所提供的4种重同位素标记标准肽段,使用PRM的分析方法对关节液中的 4个肽段标志物进行绝对定量分析,不仅使得本申请的检测具有操作简单、耗时少、实验周期短,而且还具有特异性强和灵敏度高(蛋白检测可达pg/ml水平)的优点,使得检测结果更准确。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京谷海天目生物医学科技有限公司
<120> 色谱分析柱、检测假体关节感染的试剂盒及装置
<130> PN107753GHTM
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(17)
<223> MNDA-pepetide 1
<400> 1
Glu Ala Ser Ser Val Ser Asp Phe Asn Gln Asn Phe Glu Val Pro Asn
1 5 10 15
Arg
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(7)
<223> MNDA-peptide 2
<400> 2
Val Phe Asp Ile Asn Leu Lys
1 5
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(12)
<223> PRTN3 peptide 1
<400> 3
Leu Val Asn Val Val Leu Gly Ala His Asn Val Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(8)
<223> PRTN3 peptide 2
<400> 4
Leu Phe Pro Asp Phe Phe Thr Arg
1 5
Claims (21)
1.一种检测假体关节感染的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括色谱分析柱,所述色谱分析柱包括:
色谱柱管,所述色谱柱管的内径为100~200μm;
填充于所述色谱柱管内的填料;以及
与所述色谱柱管一体化设计的色谱柱尖;
所述试剂盒还包括重同位素标记的标准肽段,所述标准肽段包含来源于蛋白髓性细胞核分化抗原蛋白和成髓细胞素蛋白的肽段序列;其中,来源于所述蛋白髓性细胞核分化抗原蛋白的肽段序列为SEQ ID NO:1:EASSVSDFNQNFEVPNR和/或SEQ ID NO:2:VFDINLK,
来源于所述成髓细胞素蛋白的肽段序列为SEQ ID NO:3:LVNVVLGAHNVR,和/或SEQ IDNO:4:LFPDFFTR。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述色谱柱管的长度为100~300mm。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述色谱柱管的长度为100~150mm。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述色谱柱管的长度为100mm。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述色谱柱尖的内径为2~8μm。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,所述色谱柱尖的内径为3~6μm。
7.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述填料为C18填料。
8.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述填料的粒径为1.5~2.5μm。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于,所述填料的粒径为1.8~2.2μm。
10.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述色谱柱管的内径为120μm~180μm。
11.根据权利要求10所述的试剂盒,其特征在于,所述色谱柱管的内径为150μm。
12.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述色谱柱管的外径为355~365μm。
13.根据权利要求12所述的试剂盒,其特征在于,所述色谱柱管的外径为360μm。
14.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述重同位素标记位于所述标准肽段的C-末端的氨基酸上。
15.根据权利要求1或14所述的试剂盒,其特征在于,所述重同位素标记的标准肽段位于同一试管中。
16.根据权利要求15所述的试剂盒,其特征在于,
所述试管中每一条所述标准肽段的浓度为100~200fmol。
17.根据权利要求16所述的试剂盒,其特征在于,所述试管中每一条所述标准肽段的浓度为100~150fmol。
18.根据权利要求17所述的试剂盒,其特征在于,所述试管中每一条所述标准肽段的浓度为100fmol。
19.根据权利要求1或14所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括上样缓冲液。
20.根据权利要求19所述的试剂盒,其特征在于,所述上样缓冲液为含0.1~0.5v%甲酸的水溶液。
21.根据权利要求20所述的试剂盒,其特征在于,所述上样缓冲液为0.2v%甲酸的水溶液。
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