CN110078808B - 棉花GhKNAT7-A03蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种棉花GhKNAT7‑A03蛋白及其编码基因和应用。本发明保护GhKNAT7‑A03蛋白或其相关生物材料在调控植物纤维强度中的应用。过表达GhKNAT7‑A03基因的拟南芥茎秆束间纤维次生细胞壁变薄，木质素合成受阻。在棉花纤维发育中，GhKNAT7‑A03同样能够抑制木质素的合成，还可以促进纤维素的合成来调控纤维次生细胞壁的合成，从而影响棉纤维强度的形成。本发明对于棉花育种有重要意义。

Description

棉花GhKNAT7-A03蛋白及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及棉花GhKNAT7-A03蛋白及其编码基因和应用。
背景技术
棉花是一种重要的经济作物，其纤维作为重要的天然纤维，是纺织工业重要的原材料。随着纺织工业的进一步发展，新的纺织技术对纤维的品质要求越来越高。因此，研究棉纤维发育及其相关基因表达调控具有重要的生物学理论意义和实际应用价值。
棉纤维是由胚珠表皮细胞经分化、发育而形成的单细胞纤维。所有的胚珠表皮细胞都具有分化成棉纤维的潜能，但最终只有30％可形成纤维。其发育过程可分为纤维起始、伸长、次生壁增厚和脱水成熟4个时期。这4个时期是许多基因相互作用、互成网络、共同表达调控的复杂过程。纤维发育的各个阶段并没有没有明显的界限，即棉纤维的起始分化与伸长有相互重叠部分，该阶段对纤维的数量与长度影响较大；纤维伸长(初生壁合成)和次生壁加厚这两个时期部分重叠，且这两个时期与纤维品质的形成有密切的关系，在次生壁加厚期，该阶段纤维素的合成则对纤维的强度、马克隆值等性状影响较大。
发明内容
本发明的目的是提供棉花GhKNAT7-A03蛋白及其编码基因和应用。
第一方面，本发明要求保护GhKNAT7-A03蛋白或其相关生物材料在调控植物纤维强度中的应用；
所述相关生物材料为能够表达所述GhKNAT7-A03蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；
所述GhKNAT7-A03蛋白为如下任一所示蛋白质：
(A1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(A2)序列表的序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且有相同功能的由序列1衍生的蛋白质；
(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质；
(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
所述GhKNAT7-A03蛋白来源于棉花。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述蛋白质中，所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
第二方面，本发明要求保护GhKNAT7-A03蛋白或其相关生物材料在如下(A)或(B)或(C)的应用：
(A)调控植物束间纤维细胞次生壁厚度；
(B)调控植物纤维素合成基因的表达量；
(C)调控植物木质素合成基因的表达量；
所述相关生物材料为能够表达所述GhKNAT7-A03蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；所述GhKNAT7-A03蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。
在第一方面中，所述调控植物纤维强度具体可体现为：所述GhKNAT7-A03蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量提高，植物纤维强度增加。
在第二方面中，所述调控植物束间纤维细胞次生壁厚度具体可体现为：所述GhKNAT7-A03蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量提高，植物束间纤维细胞次生壁厚度减少。
在第二方面中，所述调控调控植物纤维素合成基因的表达量具体可体现为：所述GhKNAT7-A03蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量提高，植物纤维素合成基因的表达量增加。
在第二方面中，所述调控植物木质素合成基因的表达量具体可体现为：所述GhKNAT7-A03蛋白或其编码基因在所述植物中的活性和/或表达量提高，植物木质素合成基因的表达量减少。
上述应用中，当所述植物为拟南芥时，所述植物木质素合成基因的表达量具体为木质素合成基因AtPAL1基因和AtCOMT基因的表达量。
上述应用中，当所述植物为棉花时，所述调控具体可发生在棉花纤维次生壁加厚期。当所述植物为棉花时，所述植物纤维素合成基因的表达量具体为棉花纤维次生壁加厚期(20、30DPA)纤维素合成基因GhCESA4基因和GhCESA8基因的表达量。当所述植物为棉花时，所述植物木质素合成基因的表达量具体为棉花纤维次生壁加厚期(20、30DPA)木质素合成基因GhCOMT1基因和GhCAD5基因的表达量。
第三方面，本发明要求保护下述任一方法：
(B1)培育纤维强度提高的植物品种的方法，包括使受体植物中GhKNAT7-A03蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；
(B2)培育植物束间纤维细胞次生壁厚度减少的植物品种的方法，包括使受体植物中GhKNAT7-A03蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；
(B3)培育植物纤维素合成基因的表达量增加的植物品种的方法，包括使受体植物中GhKNAT7-A03蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；
(B4)培育木质素合成基因的表达量减少的植物品种的方法，包括使受体植物中GhKNAT7-A03蛋白的表达量和/或活性提高的步骤；
所述GhKNAT7-A03蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。
进一步地，本发明要求保护下述任一方法：
(C1)培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达GhKNAT7-A03蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物纤维强度大于受体植物；
(C2)培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达GhKNAT7-A03蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物束间纤维细胞次生壁厚度小于受体植物；
(C3)培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达GhKNAT7-A03蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物纤维素合成基因的表达量大于受体植物；
(C4)培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达GhKNAT7-A03蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物木质素合成基因的表达量小于受体植物；
所述GhKNAT7-A03蛋白为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。
所述“向受体植物中导入能够表达GhKNAT7-A03蛋白的核酸分子”是通过向所述受体植物中导入含有所述GhKNAT7-A03蛋白的编码基因的重组表达载体实现的。
可用现有的表达载体构建含有所述GhKNAT7-A03蛋白的编码基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用GhKNAT7-A03蛋白的编码基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin))，或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用。此外，使用GhKNAT7-A03蛋白的编码基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。
在本发明中，所述重组表达载体具体可为将过表达载体pBI121的BamH I和Sac I酶切位点间的片段替换为了序列表的序列2所示的双链DNA分子得到的重组表达载体。
在上述方法中，将携带有所述GhKNAT7-A03蛋白的编码基因的所述重组表达载体导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
转化的细胞、组织或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物，也包含其转基因子代。
上述GhKNAT7-A03蛋白的编码基因是如下任一所述的DNA分子：
(D1)序列表的序列2所示的DNA分子；
(D2)在严格条件下与(D1)限定的DNA分子杂交且编码所述GhKNAT7-A03蛋白的DNA分子；
(D3)与(D1)或(D2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述GhKNAT7-A03蛋白的DNA分子。
上述基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％ SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％ SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％ SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％ SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％ SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％ SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％ SDS各洗膜一次。
上述方法中，当所述植物为拟南芥时，所述植物木质素合成基因的表达量的改变具体为木质素合成基因AtPAL1基因和AtCOMT基因的表达量的改变。
上述方法中，当所述植物为棉花时，所述植物纤维素合成基因的表达量改变具体可发生在棉花纤维次生壁加厚期(20、30DPA)。当所述植物为棉花时，所述植物纤维素合成基因的表达量的改变具体为棉花纤维次生壁加厚期(20、30DPA)纤维素合成基因GhCESA4基因和GhCESA8基因的表达量的改变。当所述植物为棉花时，所述植物木质素合成基因的表达量的改变具体为棉花纤维次生壁加厚期(20、30DPA)木质素合成基因GhCOMT1基因和GhCAD5基因的表达量的改变。
第四方法方面，本发明要求保护上述GhKNAT7-A03蛋白或其相关生物材料，或，以上任一所述的方法在植物育种中的应用。
所述育种的目的是选育纤维强度高的植物。
所述植物具体可表现为束间纤维细胞次生壁厚度较低或纤维素合成基因的表达量较高或木质素合成基因的表达量较低。
当所述植物为拟南芥时，所述植物木质素合成基因的表达量具体为木质素合成基因AtPAL1基因和AtCOMT基因的表达量。
当所述植物为棉花时，所述植物纤维素合成基因的表达量具体为棉花纤维次生壁加厚期(20、30DPA)纤维素合成基因GhCESA4基因和GhCESA8基因的表达量。当所述植物为棉花时，所述植物木质素合成基因的表达量具体为棉花纤维次生壁加厚期(20、30DPA)木质素合成基因GhCOMT1基因和GhCAD5基因的表达量。
在上述各方面中，所述植物可为(C1)或(C2)或(C3)：
(C1)双子叶植物或单子叶植物；
(C2)锦葵科植物或十字花科植物；
(C3)棉花或拟南芥。
所述棉花具体可为陆地棉TM-1、垦N27-3或苏优6108。
所述拟南芥具体可为哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)。
本发明从陆地棉中克隆出棉花GhKNAT7-A03基因，表达模式发现其在棉纤维次生细胞壁加厚期(20-30DPA,days post anthesis)优势表达；构建该基因的过表达载体，蘸花法转化拟南芥，组织化学染色发现拟南芥过表达株系的茎秆束间纤维次生细胞壁变薄，主要是木质素合成受阻的原因；在纤维强度差异的陆地棉材料中，检测纤维次生细胞壁加厚期该基因的表达情况，发现该基因在纤维强度高的材料中表达量要高于纤维强度低的材料，且其表达趋势与纤维素合酶GhCESA4、GhCESA8的表达趋势相同，与木质素合成相关基因GhCAD5、GhCOMT1表达趋势相反，说明在棉花纤维发育中，GhKNAT7-A03同样能够抑制木质素的合成，与拟南芥不同的是，棉纤维中GhKNAT7-A03可能还可以促进纤维素的合成来调控纤维次生细胞壁的合成，从而影响棉纤维强度的形成。本发明对于棉花育种有重要意义。
附图说明
图1为GhKNAT7-A03片段的电泳图。
图2为转GhKNAT7-A03基因植株的PCR鉴定结果。
图3为转GhKNAT7-A03基因拟南芥的表型观察统计结果。
图4为转GhKNAT7-A03基因拟南芥不同株系中GhKNAT7-A03的表达水平鉴定，以及木质素、纤维素合成相关基因的表达模式分析。
图5为不同纤维强度的棉花材料中GhKNAT7-A03基因表达模式分析。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
Figure BDA0002061270830000061
Ultra One Step Cloning Kit试剂盒：Vazyme公司，货号：C115-01。
过表达载体pBI121：北京华越洋生物科技有限公司，货号：DWF9808。
根癌农杆菌LBA4404：上海唯地生物技术有限公司，货号：AC1030。
KOD FX Neo酶：Toyobo公司，货号：KFX-201。
陆地棉TM-1：记载于文献“LI F G,FAN GY,LU C R,XIAO G H,ZOU C S,KOHEL RJ,MA ZY,SHANG H H,MA X F,WU J Y,LIANG X M,HUANG G,PERCYR G,LIUK,YANG W H,CHEN WB,DU X M,SHI C C,YUAN YL,YE W W,LIU X,ZHANG XY,LIU W Q,WEI H L,WEI S J,ZHU SJ,ZHANG H,SUN F M,WANG X F,LIANG J,WANGJ H,HE Q,HUANG L H,CUI J,SONG G L,WANGK B,XU X,YU J Z,ZHU Y X,YU SX.Genome sequence of cultivated Upland cotton(Gossypium hirsutum TM-1)provides insights into genome evolution.NatureBiotechnology,2015,33(5):524-530.”中；公众可以从中国农业科学院棉花研究所获得。
垦N27-3：记载于文献“宿俊吉,陈红,余渝,林海,宁新柱,李吉莲,刘萍,刘丽,相吉山,邓福军.陆地棉遗传距离与纤维品质性状中亲优势及F_1、F_2表现的相关性研究[J].棉花学报,2013,25(02):142-147.”中；公众可以从中国农业科学院棉花研究所获得。
苏优6108：记载于文献“孙君灵,周忠丽,贾银华,潘兆娥,何守朴,庞保印,王立如,杜雄明.“十一五”棉花优异创新种质简介[J].江西棉花,2011,33(04):55-57.”中；公众可以从中国农业科学院棉花研究所获得。
哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)：北京华越洋生物科技有限公司，货号：NRR00220。
实施例1、GhKNAT7-A03蛋白及其编码基因的获得
提取陆地棉TM-1棉花纤维的总RNA，并反转录为cDNA。经过大量序列分析、表达量分析与功能验证，从cDNA中发现了一个DNA编码序列，如序列表的序列2所示，其编码的蛋白质如序列表的序列1所示。
将序列表的序列1所示的蛋白质命名为GhKNAT7-A03蛋白，由299个氨基酸残基组成。将编码GhKNAT7-A03蛋白的基因命名为GhKNAT7-A03基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示。
实施例2、重组表达载体构建和重组农杆菌的获得
一、重组表达载体的构建
1、提取陆地棉TM-1棉花纤维的总RNA并反转录为cDNA,以cDNA为模板，采用OE-GhKNAT7-A03F和OE-GhKNAT7-A03R组成的引物对进行PCR扩增，回收约900bp的PCR扩增产物(GhKNAT7-A03片段)，如图1的泳道1所示。
OE-GhKNAT7-A03F:5’-GAACACGGGGGACTCTAGAATGCAAGAACCAGGTGGG-3’；
OE-GhKNAT7-A03R:5’-gatcggggaaattcgagctcCTACCTTTTCCGCTTGGA-3’。
2、用限制性内切酶酶BamH I和Sac I酶切过表达载体pBI121，回收约14700bp的载体骨架。
3、将步骤1得到的PCR扩增产物和步骤2得到的载体骨架采用
Figure BDA0002061270830000071
UltraOne Step Cloning Kit试剂盒连接，得到重组质粒pBI121-GhKNAT7-A03。
将PCR扩增产物(GhKNAT7-A03片段)与载体骨架按照2:1的摩尔比例配置体系(表1)，50℃反应10min。
表1连接反应体系
试剂名称 试剂用量
2x ClonExpress Mix 2μl
载体骨架 0.5μl
GhKNAT7-A03片段 4μl
dd H<sub>2</sub>O up to 10μl
根据测序结果，对重组质粒pBI121-GhKNAT7-A03进行结构描述如下：将过表达载体pBI121的BamH I和Sac I酶切位点间的片段替换为了序列表的序列2所示的双链DNA分子。
二、重组农杆菌的获得
1、将重组质粒pBI121-GhKNAT7-A03导入根癌农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌，将其命名为重组农杆菌LBA4404/pBI121-GhKNAT7-A03。
2、将过表达载体pBI121导入根癌农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌，将其命名为重组农杆菌LBA4404/pBI121。
实施例3、GhKNAT7-A03蛋白在拟南芥中的功能验证
一、转基因植株的获得
采用花序浸染法用重组农杆菌LBA4404/pBI121-GhKNAT7-A03侵染哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)，获得纯合的转GhKNAT7-A03基因株系，具体步骤如下：
1、将重组农杆菌LBA4404/pBI121-GhKNAT7-A03接种于LB液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养至菌液OD值为1.2-1.6时，3000rpm离心菌液收集菌体。
2、采用含有5％(质量百分含量)蔗糖和0.03％(体积百分含量)silwet L-77的1/2MS液体培养基重悬步骤1得到的菌体，调OD600＝0.8，得到侵染悬液。
3、将哥伦比亚生态型拟南芥花序在步骤2得到的侵染悬液中浸泡30-50s，然后用保鲜膜将拟南芥包起来，暗培养24h后置于正常条件下培养，待成熟后收获种子。
4、将步骤3收获的种子后用0.1％HgCl溶液对种子进行消毒，然后在4℃条件下春化3-4天后，种植于含100mg/L卡那霉素的1/2MS固体培养基上(琼脂浓度0.6％)，10天左右会观察到阳性、阴性植株区别，能够正常生长的可能为阳性株。
5、取步骤4中正常生长的植株叶片，采用引物F1和引物R1组成的引物对进行PCR扩增(反应体系见表2，反应程序见表3)，设置采用步骤1中的重组农杆菌菌液作为模板的阳性对照，设置采用灭菌水作为模板的阴性对照。
F1：5’-GACGCACAATCCCACTATCC-3’；
R1：5’-CGAACCCTCTCCATTAAAGAT-3’。
表2 PCR的反应体系
试剂名称 试剂用量
2×PCR Buffer 25μl
2mM dNTPs 10μl
F1(10μM) 1μl
R1(10μM) 1μl
KOD FX Neo(1U/μl) 1μl
2mm正方形叶片 适量
灭菌蒸馏水 up to 50μl
表3 PCR的扩增程序
Figure BDA0002061270830000091
将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，如果得到约680bp的扩增产物，则待测植株为转GhKNAT7-A03基因植株。PCR鉴定的部分结果如图2的泳道1-7所示，泳道8为阴性对照，泳道9为阳性对照。
根据电泳结果筛选出转GhKNAT7-A03基因阳性株系共7株，收获T0代种子。
将T0代种子播种传代，每一代的植株都采用上述方法进行阳性株系的检测，直至繁殖至T3代，获得纯合转基因拟南芥株系。
二、转空载体植株的获得
用重组农杆菌LBA4404/pBI121代替重组农杆菌LBA4404/pBI121-GhKNAT7-A03，其他同步骤一，得到T3代纯合转空载体拟南芥株系。
三、表型鉴定
待测植株：T3代纯合转基因拟南芥株系、T3代纯合转空载体拟南芥株系和野生型拟南芥。
1、对待测植株做表型观察，同时选取茁壮生长的待测植株，抽薹两周后，分别对其下胚轴进行徒手切片，然后对切片进行间苯三酚溶液染色，显微镜观察。
每个株系选取10株进行检测。
结果如图3所示。图3中，a为野生型拟南芥(Wild-type)的表型观察；b和c为转基因拟南芥35S::GhKNAT7-A03的表型观察；d为野生型拟南芥及转基因拟南芥35S::GhKNAT7-A03茎秆束间纤维(if)的表型观察；e为野生型拟南芥及转基因拟南芥35S::GhKNAT7-A03茎秆束间纤维细胞次生壁厚度的统计分析；比例尺＝1cm(图3a-c)，＝10μm(图3d)。
表4引物信息
Figure BDA0002061270830000092
Figure BDA0002061270830000101
结果表明，在转基因拟南芥35S::GhKNAT7-A03中发现有一定比例的植株存在分枝对生或茎秆分叉的表型，而野生型没有(图3a-c)，因此推测GhKNAT7-A03可能调控拟南芥茎秆的生长发育；对野生型及转基因拟南芥35S::GhKNAT7-A03的下胚轴进行切片染色观察发现，转基因拟南芥35S::GhKNAT7-A03茎秆的束间纤维细胞的次生壁厚度较野生型显著变薄(图3d,e)。纯合转空载体拟南芥株系和野生型拟南芥的表型无显著差异。
2、取待测植株生长6周植株的茎秆，提取总RNA并反转录为cDNA，以该cDNA为模板，采用表4所示的引物对拟南芥中木质素及纤维素合成相关基因AtPAL1、AtCOMT进行表达量的分析(以AtActin2为内参基因)。
结果如图4所示。结果表明，在过表达转基因拟南芥(OE-L1，OE-L4，OE-L5)中，木质素合成相关基因AtPAL1与AtCOMT表达显著下调。纯合转空载体拟南芥株系和野生型拟南芥的表型无显著差异。
上述结果表明GhKNAT7-A03主要通过抑制木质素的合成来调控拟南芥次生细胞壁的生长。
实施例4、GhKNAT7-A03在不同纤维强度材料中的表达模式分析
待测材料：陆地棉TM-1、垦N27-3和苏优6108。
1、对待测材料成熟纤维的纤维长度及强度进行统计。
2、取待测材料不同发育时期(10DPA、20DPA和30DPA)的纤维，提取总RNA并反转录为cDNA，以该cDNA为模板，采用表5所示的引物通过实时荧光定量PCR扩增检测GhKNAT7-A03基因、纤维素合成相关基因GhCESA4、GhCESA8和木质素合成相关基因GhCOMT1、GhCAD5的表达情况(以GhHis3为内参基因)。
表5引物信息
Figure BDA0002061270830000102
Figure BDA0002061270830000111
结果如图5所示。图5中，a为三个纤维品质差异材料的纤维长度及强度数据统计；b为基因GhKNAT7-A03在三个材料纤维不同发育时期的表达量；c为基因GhCESA4、GhCESA8、GhCOMT1、GhCAD5在三个材料纤维不同发育时期的表达量。结果表明，在纤维品质存在差异的三个陆地棉材料中，纤维素合成相关基因的转录水平与纤维强度呈正相关关系，即纤维强度越高的材料中，其次生壁加厚期(20、30DPA)GhCESA4、GhCESA8的表达量越高；而木质素合成相关基因GhCOMT1、GhCAD5表现出相反的趋势；目的基因GhKNAT7-A03在次生壁加厚期(20-30DPA)优势表达，且表现出与纤维素合成相关基因相似的结果，说明在棉纤维的生长发育过程中，GhKNAT7-A03可能主要在次生壁加厚期，通过抑制木质素合成基因的表达及促进纤维素合成基因的表达来调控棉纤维的生长发育。
序列表
<110> 中国农业科学院棉花研究所
<120> 棉花GhKNAT7-A03蛋白及其编码基因和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 299
<212> PRT
<213> 棉花(Gossypium spp)
<400> 1
Met Gln Glu Pro Gly Gly Leu Gly Met Met Ser Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Glu Thr Ile Gly Gly Leu Ser Ser Gly Glu Val Ser Val Thr Gly Asp
20 25 30
Gln Asn Cys His Leu Lys Ala Glu Ile Ala Thr His Pro Leu Tyr Glu
35 40 45
Gln Leu Leu Ala Ala His Val Ser Cys Leu Arg Val Ala Thr Pro Ile
50 55 60
Asp Gln Leu Ser Leu Ile Asp Ala Gln Leu Ala Glu Ser His Asn Ile
65 70 75 80
Leu Arg Ser Tyr Ala Ser Gln Gln Gln Gly His Ser Leu Ser Pro His
85 90 95
Glu Arg Gln Glu Leu Asp Asn Phe Leu Ala Gln Tyr Leu Ile Val Leu
100 105 110
Cys Thr Phe Lys Glu Gln Leu Gln Gln His Val Arg Val His Ala Val
115 120 125
Glu Ala Val Met Ala Cys Arg Glu Ile Glu Asn Asn Leu Gln Ala Leu
130 135 140
Thr Gly Val Thr Leu Gly Glu Gly Thr Gly Ala Thr Met Ser Asp Asp
145 150 155 160
Glu Asp Glu Leu Gln Met Asp Phe Ser Met Asp Gln Ser Gly Pro Glu
165 170 175
Gly His Asp Leu Met Gly Phe Gly Pro Leu Leu Pro Thr Glu Ser Glu
180 185 190
Arg Ser Leu Met Glu Arg Val Arg Gln Glu Leu Lys Ile Glu Leu Lys
195 200 205
Gln Gly Phe Lys Ser Arg Ile Glu Asp Val Arg Glu Glu Ile Leu Arg
210 215 220
Lys Arg Arg Ala Gly Lys Leu Pro Gly Asp Thr Thr Thr Val Leu Lys
225 230 235 240
Asn Trp Trp Gln Gln His Ser Lys Trp Pro Tyr Pro Thr Glu Asp Asp
245 250 255
Lys Ala Lys Leu Val Glu Glu Thr Gly Leu Gln Leu Lys Gln Ile Asn
260 265 270
Asn Trp Phe Ile Asn Gln Arg Lys Arg Asn Trp His Ser Asn Ser Gln
275 280 285
Ser Val Thr Ser Leu Lys Ser Lys Arg Lys Arg
290 295
<210> 2
<211> 900
<212> DNA
<213> 棉花(Gossypium spp)
<400> 2
atgcaagaac caggtgggtt aggtatgatg agtagtggtg gtggaagtga aacgattgga 60
gggttaagta gcggtgaagt gtcagttacc ggtgaccaga actgtcatct caaggcggag 120
atagctacac atccacttta tgaacaactt ttagcagctc atgtgtcttg tcttcgtgtt 180
gctacaccga ttgatcagtt gtctttgatt gatgcacagt tagcggagtc gcataacatt 240
ttgagatcct atgcttcaca acaacaaggt cactctttat caccacatga aagacaagag 300
cttgataact tcttggcaca atatttgata gtgttgtgta ctttcaaaga acagcttcaa 360
caacatgtca gagtccatgc cgttgaagct gtcatggctt gccgtgaaat tgaaaataac 420
ttacaagcgc tcactggagt aaccttgggt gaaggcacag gtgcaacaat gtcagacgat 480
gaggatgaac ttcaaatgga cttctccatg gatcaatctg ggcccgaagg ccatgattta 540
atgggttttg gtcccttact tcccacagaa tctgaaagat ctttaatgga gagggttcgt 600
caagagctca agattgaact caaacagggt ttcaaatcaa gaattgagga tgtgagggag 660
gaaatattac gcaaaagaag ggctggaaaa ttaccaggtg acaccactac agtgctcaag 720
aactggtggc aacagcactc aaagtggcca tacccaactg aagatgacaa ggccaaactt 780
gtggaggaaa ctggattgca actaaagcaa atcaacaact ggttcatcaa ccaaaggaag 840
cgcaattggc acagcaattc tcagtcggtc acctccttga agtccaagcg gaaaaggtag 900

Claims (11)

1.GhKNAT7-A03蛋白或其相关生物材料在调控拟南芥束间纤维细胞次生壁厚度中的应用：
所述相关生物材料为能够表达所述GhKNAT7-A03蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；
所述GhKNAT7-A03蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；
所述应用的体现如下：
所述GhKNAT7-A03蛋白或其编码基因在所述拟南芥中的表达量提高，拟南芥束间纤维细胞次生壁厚度减少。
2.GhKNAT7-A03蛋白或其相关生物材料在调控植物纤维素合成基因的表达量中的应用：
所述相关生物材料为能够表达所述GhKNAT7-A03蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；
所述GhKNAT7-A03蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；
所述应用的体现如下：
所述GhKNAT7-A03蛋白或其编码基因在所述植物中的表达量提高，植物纤维素合成基因的表达量增加；
所述植物为棉花；
所述植物纤维合成基因为GhCESA4基因和/或GhCESA8基因。
3.GhKNAT7-A03蛋白或其相关生物材料在调控植物木质素合成基因的表达量中的应用：
所述相关生物材料为能够表达所述GhKNAT7-A03蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；
所述GhKNAT7-A03蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；
所述应用的体现如下：
所述GhKNAT7-A03蛋白或其编码基因在所述植物中的表达量提高，植物木质素合成基因的表达量减少；
当所述植物为拟南芥时，所述植物木质素合成基因为AtPAL1基因和/或AtCOMT基因；
当所述植物为棉花时，所述植物木质素合成基因为GhCOMT1基因和/或GhCAD5基因。
4.培育植物束间纤维细胞次生壁厚度减少的植物品种的方法，包括使受体植物中GhKNAT7-A03蛋白的表达量提高的步骤；所述GhKNAT7-A03蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述植物为拟南芥。
5.培育植物纤维素合成基因的表达量增加的植物品种的方法，包括使受体植物中GhKNAT7-A03蛋白的表达量提高的步骤；
所述GhKNAT7-A03蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；
所述植物为棉花；
所述植物纤维合成基因为GhCESA4基因和/或GhCESA8基因。
6.培育木质素合成基因的表达量减少的植物品种的方法，包括使受体植物中GhKNAT7-A03蛋白的表达量提高的步骤；
当所述植物为拟南芥时，所述植物木质素合成基因为AtPAL1基因和/或AtCOMT基因；
当所述植物为棉花时，所述植物木质素合成基因为GhCOMT1基因和/或GhCAD5基因；
所述GhKNAT7-A03蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示。
7.培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达GhKNAT7-A03蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物束间纤维细胞次生壁厚度小于受体植物；所述GhKNAT7-A03蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述植物为拟南芥。
8.培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达GhKNAT7-A03蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物纤维素合成基因的表达量大于受体植物；所述GhKNAT7-A03蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示；
所述植物为棉花；
所述植物纤维合成基因为GhCESA4基因和/或GhCESA8基因。
9.培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达GhKNAT7-A03蛋白的核酸分子，得到转基因植物；所述转基因植物木质素合成基因的表达量小于受体植物；
当所述植物为拟南芥时，所述植物木质素合成基因为AtPAL1基因和/或AtCOMT基因；
当所述植物为棉花时，所述植物木质素合成基因为GhCOMT1基因和/或GhCAD5基因；
所述GhKNAT7-A03蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示。
10.如权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于：所述“向受体植物中导入能够表达GhKNAT7-A03蛋白的核酸分子”是通过向所述受体植物中导入含有所述GhKNAT7-A03蛋白的编码基因的重组表达载体实现的。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：所述“GhKNAT7-A03蛋白的编码基因”的核苷酸序列如序列表的序列2所示。
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