CN109251931B - 青虾Rev3基因及其编码蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了青虾Rev3基因及其编码蛋白和应用，Rev3基因部分cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，其中3’端为完整序列。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明所述青虾Rev3基因在青虾雄性分化及发育过程中的重要作用，为青虾雄性分化及其发育机制的研究提供理论依据和思路；(2)本发明所述青虾Rev3基因能够调控青虾免疫应答机制；(3)本发明所述青虾Rev3基因能够用于青虾全雄群体选育中，在青虾养殖过程中具有显著的经济价值和应用前景。

Description

青虾Rev3基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及青虾的发育调控，具体为青虾Rev3基因及其编码蛋白和应用。

背景技术

青虾，学名日本沼虾(Macrobrachium nipponense)，俗称河虾，隶属十足目(Decapoda)、长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属(Macrobrachium)，广泛分布于我国各地水域，生长快、适应性强、养殖经济效益高，是我国重要的淡水养殖虾类。据2012年《中国渔业年鉴》记载，全国养殖青虾年产量超过23万吨，年产值超过150亿元，是目前淡水养殖业中最有发展前途的品种之一。在青虾养殖过程中存在着显著的雌雄生长差异现象，即雄性青虾的生长速度显著快于雌性青虾，在收获季节，雄性青虾的个体大小为雌性青虾的2-2.5倍，青虾全雄群体选育具有显著的经济价值以及应用前景。因此，全面了解青虾雄性分化以及发育机制，建立青虾性别选育技术刻不容缓。

促雄腺是甲壳类动物特有的内分泌腺，其分泌的激素对甲壳类动物雄性分化及雄性特征维持起重要的作用。先前研究结果表明，在雄性罗氏沼虾中拔除促雄腺，可诱使雄性罗氏沼虾分化出雌性特征；在雌性罗氏沼虾中植入促雄腺，可诱使雌性罗氏沼虾分化出雄性特征。基于促雄腺在甲壳类动物雄性分化及发育过程中的重要作用，对促雄腺中表达基因的研究成为近些年来的热点。本课题组从青虾转录组文库及青虾蛋白质文库中筛选得到编码Rev3基因的mRNA序列以及蛋白质序列。Rev3基因在人类中证明参与免疫应答***。Rev3基因可促进DNA合成，降低UV照射对培养的人类纤维原细胞突变。但Rev3基因在甲壳类动物中研究尚未见报道，其功能未知。

原位杂交(In situ hybridization)技术是一种广泛存在于真核生物中的高效的序列特异性基因定位技术。原位杂交技术是透过靶基因序列设计带有荧光信号的特异性序列探针，通过与组织学切片杂交，从而对基因在组织中进行准确定位以及功能研究。近年开始在甲壳动物基因功能研究中使用。目前，关于Rev3基因的原位杂交研究尚未见报道。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，阐明Rev3基因在青虾雄性分化及发育过程中的重要作用，为青虾雄性分化及其发育机制的研究提供理论依据和思路，本发明提供了青虾Rev3基因及其编码蛋白和应用。

技术方案：青虾Rev3(DNA polymerase zeta catalytic subunit，Rev3)基因，Rev3基因部分cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，其中3’端为完整序列。SEQ ID NO:1序列如下：

GGAATTGTACCCTGTATAACAGGAATTAAAGTTTGTAATGAAAAGATTCCTGATTCCAAAAAAATTGATAAAAAAAGAACAGACTTAAAAGTCAATAAGGGAAATACGGAAAAACTAATTTGTAGTACAAGTAAAGATAAAACAAAAGGAACCAACAGTGAATCTTCAGAGAAATTAAGTCAGTCAGAAAATAAAAAACACAACAAAGAGATGCTTGACAAACAAAAACCACAGTTAGGATCCAAGATGAAAGACCATGGAAAAAGTTTTGATAAAAAGGAGAAAGACAGCAAAGCCAGAGATTTTGTGACACCTTTAGGAAAGGCAGATCAGAATGTATGTGGTAATTCTAGCTCAGAAGGGAATCCTATGAAAATTCACAATACAGAGAATAAAAATGATAGTGAAGAGGTCTCAGTCCCAGACAAAAAAGATTTCTTGTCTGTAGCTGACAAGAACAAAAACAAAACAAGCACAAAAAAGACACACAGACAAGAAAGTTTGAAGGAGCCCCTTGCTCAGAAAAAAAATAAAAATCCTTCAGAAAATTCTTGCAGAAATCCTAGTGTGAATTCGTGTAGCAAAGCTAAAGTATTTACAACATCCAAAGAAAAACACCATTCATGTATGCAGGAGCCCAGCAGAGATAAGATTGATTTGGATAAAAGTGGCGTCACGAGTGTACATCCAGCAAAAATTGAAAGCCATGATACTTTGCCATTGACTCAGAAGAATGAAATGCCCTTGGAACCTTGCAAGGGGCCATTAGGGGAATTGTCTTCCTTGGCTGCAAAGAGTGATTGCACTTCAACACATGACCCTAAAGTCACAGATTATGAAAACGTGAGTATTGAAAACTTGCGCAAATCCTCAGATAAGATTAATCCACCAGAAAAGCTCAGTAGTGTTCAAGGATGTTTTGAAAAACGTGGTGATGTTACTGGTGGTGCCAACTTGCCACCTAAGTTTGATTCTAGCCAAAATGGGGATGGAAAAATACTCTTAGTAACCACAGAGAATAGTTCTGTTAGCAAAGGCAAAAAGCGAATTAGTCGTTGGGATGTTAAGGATAAAAATTCAAGTATAACAGCAGTGACAAAGAAAAGTCGTTGGGATCAAAGTGACAGCAACGCTAGTGGCCAAGAGGCAGCAAAACAAGAGGCAGCAAGTGAAAAAAGAAAAAGATTAAAGCAGATGGTTGCCAACTTGTTTGAAGATTGTGAAAATGAAAATCCCTCGTGTAGACAACAAATGCGTGGCTCAAGTTTGAGGAAGCAGCTGACAGAGTTGTTTGGCCATTCATCCCTTGCTGAAAAGAATGAAGTTTCTGAGGAATACAAACCTCAACCTTCAACATCTAAAGATAAAGTAGGATCGAAGACCATGTTCAAGGAATCCTTAGAGTCTTTATTTGAACCTAGCTCCACTTTTGGTGTAAAGGAAACCAACATGAGATCTAATTGGAAAGAGGATACAGAAAATGAATATCAGCCAACAACAATAGTTAAATCATGTACAAAGGCTGAATACAACCCTTCTTCAATATCTAAGGAAAGGTTAGAAGTAGAGTATAAACCAACATCCTCTACTAAAGTAAGAGTTAAACCTGATGATAAAGGGAGACCACATGTCCTGAATGATGACACAAAGGGAAAATATAAATCTAGCATGAAGCCTAACTCCAAAACTACTTCAGACACACTTGATAAAAAGTCATTGAAATATAGTAAAACAAAGTGTGATTCTATGCGTAAAAAATGCCTGGGACTGGGAGATGTCTCCAGCATAAAAGATGCCAAGACTGTGTGTAGTGCTACCGATGATGAATATTGCCCTCTTCCATTTGGTCTTGGTAAACCTTGTCCTGAATACATTCCAAGTGATATATCTGATATTAAATCCAACAAGCCTTTAGATGACTTGGAAAGTCATGAAGAATATGTTCCTCTACCAGCAAAGGCAATTTCATATGGAATTAGTTACAATGCATCTGGTGAAGAAAAACCATCAAAAATTTCTGTCCCTGAGGCAAACACTTTAGTACCCATTTCTTATGGTGCGGGAAGTACTGGCTTGGGTTTCTACCGTGAGCAGGGTAACAGTGAGAGTACTCAGAGTAAAGAAGGGGAAAGTTCTGTCAAAGATAAAGGAAGATCAAGTAAAAAGAGACAAGAACCATACAAGAACCTTGGAAATAACAAACCTAAGTTGAAAACTTCATTTTCTTCTACAAACGCTTCAGATTCAGTTGTTCTGGTTTACTGTCCACCCCCACCAAGTTGTGATGATATCATTAATAGCCTTGCAGATTATAATATTCCAGATGTTATAAATCCAGGTGCATTTTGTAGTAACAGACTTGATATTCCTGCCAAACCAATGGAAGTTGGAGGGCAAGTTCTGAAGTTAAAATCCAAAGAAGTTTCAGATTTTGAAAGTTTTGAGGGTCCTCATCAAAATAATGGGCTTTACAACTGGCGTTTATTGCTGAGCAGCATGAATTCTGATTGTGCTGGACCATCTACTCAGGAATTAAGTGTGAATAAAAAGGACAAAAATACTTCAAAGTCTATCATGACTCCTGTAAAAGTTCCACCTTCGCCATCAGAGGTGATGAAGTGGGCGGAAGCTCGCAAGATACTAAAGTCTATGAAAAAGAAGGATGAAGATGGAGATGATGGTGGCTCATCCTCAAAATCTGACAAAAAGGTGGATTCAAATAAAAAATCATCCACTTCACTGCCTCCTGGTTCCAATGGTGTTGGTAATGGAAGTATGCAGAAAAATTCAAGTGGACAAAATAACCAACAGTCTAGAGATGGTAATGTCTCTCTGACTCAAAGTTTATCAAGCAGTGCTTTATCCCAGCAGCGTCACCACACAAGTACACCACAGCCACAGAAATTCTCAAAGTTAACACCTCTTCATTTAACACCCATTGGTGGAGACTCCTCTGGTAATGAGAAGACCCCATCTCCTGCATTTCTTAGCAAGAGAAAACCAAAGCGCAGAGTCTCATGGGAAGATGGTAGCCCATCTGTAAAGCCTTCTTTGTTGAAGAAGAGGAGGATCTCTTATGAGGGCTTGCCTGTTTTACATGAAGAAACTCCAGAAGTCAGTGAACCAAAGAAAAGTTTGGTGAGGCGTGTGTCTTTTTCTGGCATAACTCAACCAGCAGGTGGTTTCAAAGTTACAGAAGTTCAAGATCACAGTAAAGCTGAAGAACTGAAGCCCATGCCAGAGAGTCCTGAATCTGCTAAAGAGTGCACAAGTGAGAAAGGTGAAGATTTGGATTCAACTTTAGTGACCCAAGTTGCTGACCCAGACATAGAATCAAGCCCTGAAACTATAATAAGTTCATCACGCTCATTAGATTTAACACTCTCATTGTCTACTAAGGCAGCTTCACAACCATCTAGTCAGATGTCTGACTCTTCTTTAAGACGTCAACTGATGGACACTCAGTTCCGACAACAGTTCCTTAGCTTCTCACAAGTTCCTTCAGGCTCTTCGCAGGGATTAGATGGCCCAACCTTGAACAACACTTATGGCTTTAAATTCTCAAATCATAACCTGCGTGAGGCTAAAGCTTTGCATGAGATCCCCTCATAGAGAAAAGTGGCAATGAAGGTGCATGCGTGAGAAGATTACCTGGGGAAGGGAAATCGAGAGGTCCAGAACGACCTTGACCTGTGTGTCCAAATGGAAAATAGGCAGCTGCAGAATCTTGACCGCCACTTCACTTTTTCCTCCATTTTCATGCATGAATATCTAACCACCATGTGCATCGAGTGTCATGTTACAACACGACCTTCTTTGTTGCCTGACCCATTGTATGATCCCATCTCGGCTGTTATTTTCACCATCATTCAAGATGTACCAGATGATCACCCCTCTCCTCAGAAACTCAAAGGTGCAATAGTGGTTAGTAGTAGCAGCGGAGATCTGATATCTCATAGTGGCATTTGTGGCCTTTACGTGCTTCATGTTGATGATGAGAAGGCTCTCCTAAATGAAGTAGTCACTATTGTCACTACTTGGGATCCAGATATGCTTGTTGGATATGAGGTTCAGATGTCATCTTGGGGATACCTGCTGGAACGAGGATCAGCACTGAACTTAGAAATTATAGCCAGGCTCTCACGAGTGCCAGAAGGAACAGGCAGTCATTATGAAGAAGAGTATGATGAATATGGAGCTGCTCACACTTCTCAGATTCATATTACTGGCCGAATTGTTCTCAATGTTTGGAGAATAATGAGAGCAGAGGTAGCACTGAGGAGTTACACACTTGACAATGTTGCTTATAATGTCTTGCACACTCGGATACCGTCCTTTTCCCATGACAGCCTCAGAGATTGGTGGATTCATGATGCAACAAGGTGGAGGACCTTGGAGCATTATTCAACTCGCTGTGACTTGACTATTGACCTCCTACACAGATTAGATCTTATCCACCGCACAGCTGAGCTGGCACGTCTCTTTGGCATCCAGTTCTATGATGTTCTGGCTCGTGGCTCACAGTATCGTGTGGAATCCATGATGTTGCGTCTTTCTCGTGCTGCTAACATGGTGGCAGTTTCCCCAAGCATACAGCAGCGTGGAGCCATGAAGTCACCTGAATGGTTTGCCCTAACTTTGGAACCAAAGTCAAGATTCTACAGTGATCCTGTGGTGGTGTTAGATTTCCAGTCCTTATACCCATCAATGATGATTGCTTACAATTACTGCTATTCCACTTGTTTGGGACGAATTGATATGATAAATGGATCTGCACCCATGGAATTTGGAGCTACCCATCTACGAGTTCTTCCAGAGGATCTCTTGAAATTTGCTGATGAGATCAATATCTCTCCTTGTGGAGTGGCTTTTGTACCCCATAAAATAAGGCGAGGAGTTTTACCACAGATGCTTGAAGAAATACTCAATACAAGGATTATGGTGAAGCGAATGATGAAGGAGTACAAAGACGATTCATCCCTTCAGCGTGTGCTACATTCACGACAGCTTGGTCTGAAACTTATTGCGAATGTCACATATGGGTACACCAGTGCAAACTTCTCTGGTCGAATGCCTTGTTCTGAGATTGGTGACAGTGTTGTAAGCAAAGGAAGAGAGACTTTAGAACGTTGTATTCAACATGTCAATAAGCACCCTACTTGGAAAGCAGAGGTGGTGTATGGAGATACAGATTCACTCTTCGTACACTTACCTGGACGGTCTAAGGATCAAGCATTTAAAATTGGAAATGAGATTGCTGATGAAGTAACTCAGATGTATCCTAAACCGGTGAAACTTAAATTTGAAAAAGTTTACTTACCCTGCATTTTACAGACCAAGAAACGTTACGTTGGATATATGTATGAGTCCACAACCCAGGAGACCCCAGAGTTTGATGCTAAAGGCATTGAGACTGTTCGTAGAGATGGATGCCCAGCAATGGCAAAGGTTCTTGAAAAATCCTTGCGTATTCTCTTTGAAACAAAGGATATTTCAAAAGTAAAAGACTATATTCAGCGTCAGTTTGTGAAACTTCTACAAGGACAGGTGTCTCTCCAGGATTTGATATTTGCAAAAGAGTATAGAGGAGCCTCTGGCTATAAGCCAGGTGCATGCGTCCCTGCTCTAGAATTAGCAAGAAAATGGACTCGCAAAGATCCTAGAAAAGAACCAAGAGTTGGTGAGCGTGTACCATATGTAATAGTCTATGGTGCTCCAGGCTTACCTTTAATCCAATTAGTAAGATCACCAGATGCTGTTCTAGCAAATCCAGCACTTCGTGTAAATGCAACATACTATATCACAAGAGCAATAATGCCACCTTTAGAAAGATGTTTCTCTCTTCTTGGTGTAGATATTGCTGCTTGGTATAATGACTTGCCAAGATCATCAAGTACAAATGCTTCCCTGGTGAGAGAAATAGCAAATAATCAGAAAGGATCAAGCAACTGGGAAAAACCATCTACTTCCCATGGTATGTCCATTGTTCGTTACTTCACTCCATCAGCATGCATTGTTTGTGGAGCTGCAACTGTTCTAACTGGTGCAGGGGGTGGAGTTGCGTTATGTTCAGACTGCAAGACTACCCCACAAGACACTGTCCTTGCTCTTAATGAGAAAATTCGCCATTATGATAGAGCACTTGACAATATACAAAAGGTTTGCCAGGCATGCCTTGGATGTAGACTGGAAAAGGTGGAGTGCATATCCATTGACTGCCCTATCATTTACCAGCGTAACCAAGCAAACATTGACCAACTTTTAACTGGACAGCTGCAAGAGCTTATTCAAAGATTTACTAGTGTGATATAAAATTTATAAATTCCAGCAGGATAATGGAGAGCTTTTGTGTAACAATATTAAGATTTAAGAGTAAATTATGACTGCAGATCCAGACTGACTTAGTGATGCTGTTAAGTGATTGTTGAATAAGAAAACAAATAAGTTCAGTACCTTCCTTTGGCACTGATATAAGATGGCTTAAGTGCATTAATGTTATAAGATAACTGAATGCAGAGTATTATTAGTGAAATTATTAAATCAAATTTTGTATATATTGAGCTATATAATAGTTCAAGAAATTTATTTTGAAAACACAGAATTATATATGTACATTTAGTGAAAAACCCTTATGTGAATATATAAATAGTACGTATAAAACAAAGCTTTCTGTGGTAAAAGTTTGCATCTATGCATAAAAAAAAACGGTTTTTTATGAAGACTTCAGATTTAGTTTAAATGGCAAGGTAGATGTGAAGATGGAAGGACGACTATTTTAAAGGTGGTTTGGGTCTTTCAAGAGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

优选的，Rev3基因cDNA序列克隆的3’端特异性正向引物为：

3Rev3-F1(SEQ ID NO:3)：CCATCTACTTCCCATGGTATGT；和

3Rev3-F2(SEQ ID NO:4)：ATCCATTGACTGCCCTATCATT。

优选的，Rev3基因的荧光定量PCR引物为：

Rev3-RTF(SEQ ID NO:5)：AGTGACAGCAACGCTAGTGG；

Rev3-RTR(SEQ ID NO:6)：GGCCAAACAACTCTGTCAGC。

优选的，Rev3基因的原位杂交试验中，正义原位杂交探针为(SEQ ID NO:7)：CATCTAATCCCTGCGAAGAGCCTGAAGGAACTTGTGAG，反义原位杂交探针为(SEQ ID NO:8)：CTCACAAGTTCCTTCAGGCTCTTCGCAGGGATTAGATG。

由青虾Rev3基因编码的蛋白，该编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。SEQID NO:2序列如下：

GIVPCITGIKVCNEKIPDSKKIDKKRTDLKVNKGNTEKLICSTSKDKTKGTNSESSEKLSQSENKKHNKEMLDKQKPQLGSKMKDHGKSFDKKEKDSKARDFVTPLGKADQNVCGNSSSEGNPMKIHNTENKNDSEEVSVPDKKDFLSVADKNKNKTSTKKTHRQESLKEPLAQKKNKNPSENSCRNPSVNSCSKAKVFTTSKEKHHSCMQEPSRDKIDLDKSGVTSVHPAKIESHDTLPLTQKNEMPLEPCKGPLGELSSLAAKSDCTSTHDPKVTDYENVSIENLRKSSDKINPPEKLSSVQGCFEKRGDVTGGANLPPKFDSSQNGDGKILLVTTENSSVSKGKKRISRWDVKDKNSSITAVTKKSRWDQSDSNASGQEAAKQEAASEKRKRLKQMVANLFEDCENENPSCRQQMRGSSLRKQLTELFGHSSLAEKNEVSEEYKPQPSTSKDKVGSKTMFKESLESLFEPSSTFGVKETNMRSNWKEDTENEYQPTTIVKSCTKAEYNPSSISKERLEVEYKPTSSTKVRVKPDDKGRPHVLNDDTKGKYKSSMKPNSKTTSDTLDKKSLKYSKTKCDSMRKKCLGLGDVSSIKDAKTVCSATDDEYCPLPFGLGKPCPEYIPSDISDIKSNKPLDDLESHEEYVPLPAKAISYGISYNASGEEKPSKISVPEANTLVPISYGAGSTGLGFYREQGNSESTQSKEGESSVKDKGRSSKKRQEPYKNLGNNKPKLKTSFSSTNASDSVVLVYCPPPPSCDDIINSLADYNIPDVINPGAFCSNRLDIPAKPMEVGGQVLKLKSKEVSDFESFEGPHQNNGLYNWRLLLSSMNSDCAGPSTQELSVNKKDKNTSKSIMTPVKVPPSPSEVMKWAEARKILKSMKKKDEDGDDGGSSSKSDKKVDSNKKSSTSLPPGSNGVGNGSMQKNSSGQNNQQSRDGNVSLTQSLSSSALSQQRHHTSTPQPQKFSKLTPLHLTPIGGDSSGNEKTPSPAFLSKRKPKRRVSWEDGSPSVKPSLLKKRRISYEGLPVLHEETPEVSEPKKSLVRRVSFSGITQPAGGFKVTEVQDHSKAEELKPMPESPESAKECTSEKGEDLDSTLVTQVADPDIESSPETIISSSRSLDLTLSLSTKAASQPSSQMSDSSLRRQLMDTQFRQQFLSFSQVPSGSSQGLDGPTLNNTYGFKFSNHNLREAKALHEIPS

以上任一所述青虾Rev3基因在调控青虾雄性分化及其发育过程中的应用。

以上任一所述青虾Rev3基因在调控青虾免疫应答机制中的应用。

以上任一所述青虾Rev3基因在青虾全雄群体选育中的应用。

有益效果：(1)本发明所述青虾Rev3基因在青虾雄性分化及发育过程中的重要作用，为青虾雄性分化及其发育机制的研究提供理论依据和思路；(2)本发明所述青虾Rev3基因能够调控青虾免疫应答机制；(3)本发明所述青虾Rev3基因能够用于青虾全雄群体选育中，在青虾养殖过程中具有显著的经济价值和应用前景。

附图说明

图1是青虾Rev3基因在不同成体组织中的相对表达量结果图；

图2是青虾Rev3基因在***、促雄腺和肝胰腺中的原位杂交结果图；其中ST为***，SC为***细胞，SP为***，M为肌肉，C为促雄腺细胞，FS为索状结构，LG为脂肪粒细胞，HC为肝胰腺细胞，该图标尺为50μm。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1：青虾Rev3基因部分CDNA(3’端完整)的获得

总RNA提取：选取10只健康成熟的雄性青虾促雄腺，迅速放入盛有液氮的预冷研钵中，迅速的研磨。总RNA的提取使用Takara公司的RNAiso Plus提取试剂结合传统的酚仿抽提法进行，提取方法参照使用说明书。经过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，分光光度计分析该样品OD260/280比值在1.8～2.0之间，并测定RNA的浓度。

从青虾促雄腺转录组中获得Rev3基因cDNA中间片段序列。根据Rev3基因cDNA中间片段序列，设计特异性正向引物3Rev3-F1(SEQ ID NO:3)、3Rev3-F2(SEQ ID NO:4)；分别进行cDNA 3’端快速扩增，操作步骤按TaKaRa 3’-RACE试剂盒说明书进行。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。利用上海生工生物工程有限公司(Sangon)的柱式DNA胶回收试剂盒进行目的片段的回收，将产物连接到pMD18-T载体(Takara)，并转化入大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选，挑取单克隆白斑扩增培养后，将***目的片段的阳性克隆送至上海铂尚生物公司进行测序分析。将得到的几段产物进行拼接，得到青虾Rev3基因部分cDNA序列(3’端完成)。经过序列比对显示，青虾Rev3基因与其他物种的同源性为41％，但覆盖度达到35％，其原因为青虾Rev3基因cDNA序列不完整。其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

实施例2：青虾Rev3基因组织表达

以SEQ ID NO:1核苷酸序列为依据，在开放阅读框以内采用NCBI在线引物设计软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计青虾Rev3基因的荧光定量PCR的引物(Rev3-RTF、SEQ ID NO:5-Rev3-RTR、SEQ ID NO:6)。从健康成熟的青虾中获取***、促雄腺、卵巢、肝胰腺、肠以及心脏等组织(N≥3)，并将组织保存在RNA保存液中(Takara)。按实施例1所述提取各组织总RNA并使用iScriptTM cDNA Synthesis Kitperfect Real Time(Bio-Rad)试剂盒将总RNA反转成cDNA，采用Bio-Rad iCycler iQ5荧光定量PCR分析***检测Rev3基因在青虾各组织中的相对表达量。结果如图1所示，青虾Rev3基因在肝胰腺中的表达量最高，且与其他组织表达量差异极显著，表明Rev3基因参与青虾免疫应答机制。Rev3基因在***及促雄腺中的表达量较高，因此推测该基因可能在青虾雄性分化及其发育过程中起重要的作用。

实施例3：青虾Rev3基因的原位杂交研究

以SEQ ID NO:1核苷酸序列为依据，在开放阅读框内采用Primer5引物设计软件设计制备青虾Rev3基因的原位杂交正义探针序列和反义探针序列，并委托采用上海生工生物工程有限公司(Sangon)合成标有地高辛信号的正义原位杂交探针和反义原位杂交探针(SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:8)。从健康成熟的雄性青虾中获取***、促雄腺和肝胰腺组织，并保存在4％多聚甲醛溶液中固定。制备各组织的冰冻切片。使用Zytofast PLUS CISHimplementation kit(ZytoVision GmBH,Germany)原位杂交试剂盒对各组织进行组织学定位，并在显微镜下观察定位结果。结果如图2所示，青虾Rev3基因在青虾***中的***、***细胞以及镜子中均观察到了较强的地高辛信号，因此该基因在***整个发育过程中均起重要的作用。该基因在青虾促雄腺中的索状结构中观察到了较强的地高辛信号，但并未直接在促雄腺细胞中观察得到地高辛信号。促雄腺索状结构的形成对促雄腺细胞的形成起重要的促进和支撑作用。因此，该基因并不是促雄腺细胞所分泌，但该基因在促雄腺索状结构的形成过程中重要作用，为促雄腺细胞的形成起到促进和职称的作用。该基因还在青虾肝胰腺细胞中观察到较强的地高辛信号，证明该基因还参与青虾免疫应答机制。结果证明，青虾Rev3基因在青虾雄性分化及其发育过程中起重要的作用，为该基因的新功能，未在其他物种中报道，这一研究结果为青虾雄性分化及其发育机制的研究提供了理论依据，也为后续青虾全雄群体选育提供指导意义。

序列表

<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心

<120> 青虾Rev3基因及其编码蛋白和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6832

<212> DNA

<213> 青虾(shrimp)

<400> 1

ggaattgtac cctgtataac aggaattaaa gtttgtaatg aaaagattcc tgattccaaa 60

aaaattgata aaaaaagaac agacttaaaa gtcaataagg gaaatacgga aaaactaatt 120

tgtagtacaa gtaaagataa aacaaaagga accaacagtg aatcttcaga gaaattaagt 180

cagtcagaaa ataaaaaaca caacaaagag atgcttgaca aacaaaaacc acagttagga 240

tccaagatga aagaccatgg aaaaagtttt gataaaaagg agaaagacag caaagccaga 300

gattttgtga cacctttagg aaaggcagat cagaatgtat gtggtaattc tagctcagaa 360

gggaatccta tgaaaattca caatacagag aataaaaatg atagtgaaga ggtctcagtc 420

ccagacaaaa aagatttctt gtctgtagct gacaagaaca aaaacaaaac aagcacaaaa 480

aagacacaca gacaagaaag tttgaaggag ccccttgctc agaaaaaaaa taaaaatcct 540

tcagaaaatt cttgcagaaa tcctagtgtg aattcgtgta gcaaagctaa agtatttaca 600

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gataaaagtg gcgtcacgag tgtacatcca gcaaaaattg aaagccatga tactttgcca 720

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aagaggagga tctcttatga gggcttgcct gttttacatg aagaaactcc agaagtcagt 3120

gaaccaaaga aaagtttggt gaggcgtgtg tctttttctg gcataactca accagcaggt 3180

ggtttcaaag ttacagaagt tcaagatcac agtaaagctg aagaactgaa gcccatgcca 3240

gagagtcctg aatctgctaa agagtgcaca agtgagaaag gtgaagattt ggattcaact 3300

ttagtgaccc aagttgctga cccagacata gaatcaagcc ctgaaactat aataagttca 3360

tcacgctcat tagatttaac actctcattg tctactaagg cagcttcaca accatctagt 3420

cagatgtctg actcttcttt aagacgtcaa ctgatggaca ctcagttccg acaacagttc 3480

cttagcttct cacaagttcc ttcaggctct tcgcagggat tagatggccc aaccttgaac 3540

aacacttatg gctttaaatt ctcaaatcat aacctgcgtg aggctaaagc tttgcatgag 3600

atcccctcat agagaaaagt ggcaatgaag gtgcatgcgt gagaagatta cctggggaag 3660

ggaaatcgag aggtccagaa cgaccttgac ctgtgtgtcc aaatggaaaa taggcagctg 3720

cagaatcttg accgccactt cactttttcc tccattttca tgcatgaata tctaaccacc 3780

atgtgcatcg agtgtcatgt tacaacacga ccttctttgt tgcctgaccc attgtatgat 3840

cccatctcgg ctgttatttt caccatcatt caagatgtac cagatgatca cccctctcct 3900

cagaaactca aaggtgcaat agtggttagt agtagcagcg gagatctgat atctcatagt 3960

ggcatttgtg gcctttacgt gcttcatgtt gatgatgaga aggctctcct aaatgaagta 4020

gtcactattg tcactacttg ggatccagat atgcttgttg gatatgaggt tcagatgtca 4080

tcttggggat acctgctgga acgaggatca gcactgaact tagaaattat agccaggctc 4140

tcacgagtgc cagaaggaac aggcagtcat tatgaagaag agtatgatga atatggagct 4200

gctcacactt ctcagattca tattactggc cgaattgttc tcaatgtttg gagaataatg 4260

agagcagagg tagcactgag gagttacaca cttgacaatg ttgcttataa tgtcttgcac 4320

actcggatac cgtccttttc ccatgacagc ctcagagatt ggtggattca tgatgcaaca 4380

aggtggagga ccttggagca ttattcaact cgctgtgact tgactattga cctcctacac 4440

agattagatc ttatccaccg cacagctgag ctggcacgtc tctttggcat ccagttctat 4500

gatgttctgg ctcgtggctc acagtatcgt gtggaatcca tgatgttgcg tctttctcgt 4560

gctgctaaca tggtggcagt ttccccaagc atacagcagc gtggagccat gaagtcacct 4620

gaatggtttg ccctaacttt ggaaccaaag tcaagattct acagtgatcc tgtggtggtg 4680

ttagatttcc agtccttata cccatcaatg atgattgctt acaattactg ctattccact 4740

tgtttgggac gaattgatat gataaatgga tctgcaccca tggaatttgg agctacccat 4800

ctacgagttc ttccagagga tctcttgaaa tttgctgatg agatcaatat ctctccttgt 4860

ggagtggctt ttgtacccca taaaataagg cgaggagttt taccacagat gcttgaagaa 4920

atactcaata caaggattat ggtgaagcga atgatgaagg agtacaaaga cgattcatcc 4980

cttcagcgtg tgctacattc acgacagctt ggtctgaaac ttattgcgaa tgtcacatat 5040

gggtacacca gtgcaaactt ctctggtcga atgccttgtt ctgagattgg tgacagtgtt 5100

gtaagcaaag gaagagagac tttagaacgt tgtattcaac atgtcaataa gcaccctact 5160

tggaaagcag aggtggtgta tggagataca gattcactct tcgtacactt acctggacgg 5220

tctaaggatc aagcatttaa aattggaaat gagattgctg atgaagtaac tcagatgtat 5280

cctaaaccgg tgaaacttaa atttgaaaaa gtttacttac cctgcatttt acagaccaag 5340

aaacgttacg ttggatatat gtatgagtcc acaacccagg agaccccaga gtttgatgct 5400

aaaggcattg agactgttcg tagagatgga tgcccagcaa tggcaaaggt tcttgaaaaa 5460

tccttgcgta ttctctttga aacaaaggat atttcaaaag taaaagacta tattcagcgt 5520

cagtttgtga aacttctaca aggacaggtg tctctccagg atttgatatt tgcaaaagag 5580

tatagaggag cctctggcta taagccaggt gcatgcgtcc ctgctctaga attagcaaga 5640

aaatggactc gcaaagatcc tagaaaagaa ccaagagttg gtgagcgtgt accatatgta 5700

atagtctatg gtgctccagg cttaccttta atccaattag taagatcacc agatgctgtt 5760

ctagcaaatc cagcacttcg tgtaaatgca acatactata tcacaagagc aataatgcca 5820

cctttagaaa gatgtttctc tcttcttggt gtagatattg ctgcttggta taatgacttg 5880

ccaagatcat caagtacaaa tgcttccctg gtgagagaaa tagcaaataa tcagaaagga 5940

tcaagcaact gggaaaaacc atctacttcc catggtatgt ccattgttcg ttacttcact 6000

ccatcagcat gcattgtttg tggagctgca actgttctaa ctggtgcagg gggtggagtt 6060

gcgttatgtt cagactgcaa gactacccca caagacactg tccttgctct taatgagaaa 6120

attcgccatt atgatagagc acttgacaat atacaaaagg tttgccaggc atgccttgga 6180

tgtagactgg aaaaggtgga gtgcatatcc attgactgcc ctatcattta ccagcgtaac 6240

caagcaaaca ttgaccaact tttaactgga cagctgcaag agcttattca aagatttact 6300

agtgtgatat aaaatttata aattccagca ggataatgga gagcttttgt gtaacaatat 6360

taagatttaa gagtaaatta tgactgcaga tccagactga cttagtgatg ctgttaagtg 6420

attgttgaat aagaaaacaa ataagttcag taccttcctt tggcactgat ataagatggc 6480

ttaagtgcat taatgttata agataactga atgcagagta ttattagtga aattattaaa 6540

tcaaattttg tatatattga gctatataat agttcaagaa atttattttg aaaacacaga 6600

attatatatg tacatttagt gaaaaaccct tatgtgaata tataaatagt acgtataaaa 6660

caaagctttc tgtggtaaaa gtttgcatct atgcataaaa aaaaacggtt ttttatgaag 6720

acttcagatt tagtttaaat ggcaaggtag atgtgaagat ggaaggacga ctattttaaa 6780

ggtggtttgg gtctttcaag agtaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 6832

<210> 2

<211> 1203

<212> PRT

<213> 青虾(shrimp)

<400> 2

Gly Ile Val Pro Cys Ile Thr Gly Ile Lys Val Cys Asn Glu Lys Ile

1 5 10 15

Pro Asp Ser Lys Lys Ile Asp Lys Lys Arg Thr Asp Leu Lys Val Asn

20 25 30

Lys Gly Asn Thr Glu Lys Leu Ile Cys Ser Thr Ser Lys Asp Lys Thr

35 40 45

Lys Gly Thr Asn Ser Glu Ser Ser Glu Lys Leu Ser Gln Ser Glu Asn

50 55 60

Lys Lys His Asn Lys Glu Met Leu Asp Lys Gln Lys Pro Gln Leu Gly

65 70 75 80

Ser Lys Met Lys Asp His Gly Lys Ser Phe Asp Lys Lys Glu Lys Asp

85 90 95

Ser Lys Ala Arg Asp Phe Val Thr Pro Leu Gly Lys Ala Asp Gln Asn

100 105 110

Val Cys Gly Asn Ser Ser Ser Glu Gly Asn Pro Met Lys Ile His Asn

115 120 125

Thr Glu Asn Lys Asn Asp Ser Glu Glu Val Ser Val Pro Asp Lys Lys

130 135 140

Asp Phe Leu Ser Val Ala Asp Lys Asn Lys Asn Lys Thr Ser Thr Lys

145 150 155 160

Lys Thr His Arg Gln Glu Ser Leu Lys Glu Pro Leu Ala Gln Lys Lys

165 170 175

Asn Lys Asn Pro Ser Glu Asn Ser Cys Arg Asn Pro Ser Val Asn Ser

180 185 190

Cys Ser Lys Ala Lys Val Phe Thr Thr Ser Lys Glu Lys His His Ser

195 200 205

Cys Met Gln Glu Pro Ser Arg Asp Lys Ile Asp Leu Asp Lys Ser Gly

210 215 220

Val Thr Ser Val His Pro Ala Lys Ile Glu Ser His Asp Thr Leu Pro

225 230 235 240

Leu Thr Gln Lys Asn Glu Met Pro Leu Glu Pro Cys Lys Gly Pro Leu

245 250 255

Gly Glu Leu Ser Ser Leu Ala Ala Lys Ser Asp Cys Thr Ser Thr His

260 265 270

Asp Pro Lys Val Thr Asp Tyr Glu Asn Val Ser Ile Glu Asn Leu Arg

275 280 285

Lys Ser Ser Asp Lys Ile Asn Pro Pro Glu Lys Leu Ser Ser Val Gln

290 295 300

Gly Cys Phe Glu Lys Arg Gly Asp Val Thr Gly Gly Ala Asn Leu Pro

305 310 315 320

Pro Lys Phe Asp Ser Ser Gln Asn Gly Asp Gly Lys Ile Leu Leu Val

325 330 335

Thr Thr Glu Asn Ser Ser Val Ser Lys Gly Lys Lys Arg Ile Ser Arg

340 345 350

Trp Asp Val Lys Asp Lys Asn Ser Ser Ile Thr Ala Val Thr Lys Lys

355 360 365

Ser Arg Trp Asp Gln Ser Asp Ser Asn Ala Ser Gly Gln Glu Ala Ala

370 375 380

Lys Gln Glu Ala Ala Ser Glu Lys Arg Lys Arg Leu Lys Gln Met Val

385 390 395 400

Ala Asn Leu Phe Glu Asp Cys Glu Asn Glu Asn Pro Ser Cys Arg Gln

405 410 415

Gln Met Arg Gly Ser Ser Leu Arg Lys Gln Leu Thr Glu Leu Phe Gly

420 425 430

His Ser Ser Leu Ala Glu Lys Asn Glu Val Ser Glu Glu Tyr Lys Pro

435 440 445

Gln Pro Ser Thr Ser Lys Asp Lys Val Gly Ser Lys Thr Met Phe Lys

450 455 460

Glu Ser Leu Glu Ser Leu Phe Glu Pro Ser Ser Thr Phe Gly Val Lys

465 470 475 480

Glu Thr Asn Met Arg Ser Asn Trp Lys Glu Asp Thr Glu Asn Glu Tyr

485 490 495

Gln Pro Thr Thr Ile Val Lys Ser Cys Thr Lys Ala Glu Tyr Asn Pro

500 505 510

Ser Ser Ile Ser Lys Glu Arg Leu Glu Val Glu Tyr Lys Pro Thr Ser

515 520 525

Ser Thr Lys Val Arg Val Lys Pro Asp Asp Lys Gly Arg Pro His Val

530 535 540

Leu Asn Asp Asp Thr Lys Gly Lys Tyr Lys Ser Ser Met Lys Pro Asn

545 550 555 560

Ser Lys Thr Thr Ser Asp Thr Leu Asp Lys Lys Ser Leu Lys Tyr Ser

565 570 575

Lys Thr Lys Cys Asp Ser Met Arg Lys Lys Cys Leu Gly Leu Gly Asp

580 585 590

Val Ser Ser Ile Lys Asp Ala Lys Thr Val Cys Ser Ala Thr Asp Asp

595 600 605

Glu Tyr Cys Pro Leu Pro Phe Gly Leu Gly Lys Pro Cys Pro Glu Tyr

610 615 620

Ile Pro Ser Asp Ile Ser Asp Ile Lys Ser Asn Lys Pro Leu Asp Asp

625 630 635 640

Leu Glu Ser His Glu Glu Tyr Val Pro Leu Pro Ala Lys Ala Ile Ser

645 650 655

Tyr Gly Ile Ser Tyr Asn Ala Ser Gly Glu Glu Lys Pro Ser Lys Ile

660 665 670

Ser Val Pro Glu Ala Asn Thr Leu Val Pro Ile Ser Tyr Gly Ala Gly

675 680 685

Ser Thr Gly Leu Gly Phe Tyr Arg Glu Gln Gly Asn Ser Glu Ser Thr

690 695 700

Gln Ser Lys Glu Gly Glu Ser Ser Val Lys Asp Lys Gly Arg Ser Ser

705 710 715 720

Lys Lys Arg Gln Glu Pro Tyr Lys Asn Leu Gly Asn Asn Lys Pro Lys

725 730 735

Leu Lys Thr Ser Phe Ser Ser Thr Asn Ala Ser Asp Ser Val Val Leu

740 745 750

Val Tyr Cys Pro Pro Pro Pro Ser Cys Asp Asp Ile Ile Asn Ser Leu

755 760 765

Ala Asp Tyr Asn Ile Pro Asp Val Ile Asn Pro Gly Ala Phe Cys Ser

770 775 780

Asn Arg Leu Asp Ile Pro Ala Lys Pro Met Glu Val Gly Gly Gln Val

785 790 795 800

Leu Lys Leu Lys Ser Lys Glu Val Ser Asp Phe Glu Ser Phe Glu Gly

805 810 815

Pro His Gln Asn Asn Gly Leu Tyr Asn Trp Arg Leu Leu Leu Ser Ser

820 825 830

Met Asn Ser Asp Cys Ala Gly Pro Ser Thr Gln Glu Leu Ser Val Asn

835 840 845

Lys Lys Asp Lys Asn Thr Ser Lys Ser Ile Met Thr Pro Val Lys Val

850 855 860

Pro Pro Ser Pro Ser Glu Val Met Lys Trp Ala Glu Ala Arg Lys Ile

865 870 875 880

Leu Lys Ser Met Lys Lys Lys Asp Glu Asp Gly Asp Asp Gly Gly Ser

885 890 895

Ser Ser Lys Ser Asp Lys Lys Val Asp Ser Asn Lys Lys Ser Ser Thr

900 905 910

Ser Leu Pro Pro Gly Ser Asn Gly Val Gly Asn Gly Ser Met Gln Lys

915 920 925

Asn Ser Ser Gly Gln Asn Asn Gln Gln Ser Arg Asp Gly Asn Val Ser

930 935 940

Leu Thr Gln Ser Leu Ser Ser Ser Ala Leu Ser Gln Gln Arg His His

945 950 955 960

Thr Ser Thr Pro Gln Pro Gln Lys Phe Ser Lys Leu Thr Pro Leu His

965 970 975

Leu Thr Pro Ile Gly Gly Asp Ser Ser Gly Asn Glu Lys Thr Pro Ser

980 985 990

Pro Ala Phe Leu Ser Lys Arg Lys Pro Lys Arg Arg Val Ser Trp Glu

995 1000 1005

Asp Gly Ser Pro Ser Val Lys Pro Ser Leu Leu Lys Lys Arg Arg Ile

1010 1015 1020

Ser Tyr Glu Gly Leu Pro Val Leu His Glu Glu Thr Pro Glu Val Ser

1025 1030 1035 1040

Glu Pro Lys Lys Ser Leu Val Arg Arg Val Ser Phe Ser Gly Ile Thr

1045 1050 1055

Gln Pro Ala Gly Gly Phe Lys Val Thr Glu Val Gln Asp His Ser Lys

1060 1065 1070

Ala Glu Glu Leu Lys Pro Met Pro Glu Ser Pro Glu Ser Ala Lys Glu

1075 1080 1085

Cys Thr Ser Glu Lys Gly Glu Asp Leu Asp Ser Thr Leu Val Thr Gln

1090 1095 1100

Val Ala Asp Pro Asp Ile Glu Ser Ser Pro Glu Thr Ile Ile Ser Ser

1105 1110 1115 1120

Ser Arg Ser Leu Asp Leu Thr Leu Ser Leu Ser Thr Lys Ala Ala Ser

1125 1130 1135

Gln Pro Ser Ser Gln Met Ser Asp Ser Ser Leu Arg Arg Gln Leu Met

1140 1145 1150

Asp Thr Gln Phe Arg Gln Gln Phe Leu Ser Phe Ser Gln Val Pro Ser

1155 1160 1165

Gly Ser Ser Gln Gly Leu Asp Gly Pro Thr Leu Asn Asn Thr Tyr Gly

1170 1175 1180

Phe Lys Phe Ser Asn His Asn Leu Arg Glu Ala Lys Ala Leu His Glu

1185 1190 1195 1200

Ile Pro Ser

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccatctactt cccatggtat gt 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atccattgac tgccctatca tt 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agtgacagca acgctagtgg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggccaaacaa ctctgtcagc 20

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

catctaatcc ctgcgaagag cctgaaggaa cttgtgag 38

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctcacaagtt ccttcaggct cttcgcaggg attagatg 38

Claims (5)

1.青虾Rev3基因的部分cDNA序列片段，其特征在于，Rev3基因部分cDNA序列如SEQ IDNO:1所示，其中3’端为完整序列。

2.根据权利要求1所述的青虾Rev3基因的部分cDNA序列片段，其特征在于，Rev3基因cDNA序列克隆的3’端特异性正向引物为：3 Rev3-F1，其序列为SEQ ID NO:3和3 Rev3-F2，其序列为SEQ ID NO:4。

3.根据权利要求1所述的青虾Rev3基因的部分cDNA序列片段，其特征在于，Rev3基因的荧光定量PCR引物为：Rev3-RTF，其序列为SEQ ID NO:5和Rev3-RTR，其序列为SEQ ID NO:6。

4.根据权利要求1所述的青虾Rev3基因的部分cDNA序列片段，其特征在于， Rev3基因的原位杂交试验中，正义原位杂交探针为SEQ ID NO:7，反义原位杂交探针为SEQ ID NO:8。

5.由青虾Rev3基因的部分cDNA序列片段编码的蛋白，其特征在于，该编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

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