CN109152404B - 来自盐生植物的功能增强的脱盐营养组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

公开了一种功能增强的脱盐营养组合物、脱盐提取物和冷水提取的盐替代物，其源自在高盐度条件下的沿海地区生长并因此保持高盐浓度的盐生植物，以及公开了脱盐营养组合物在用于对抗肥胖中的用途。更具体地，本发明涉及从盐生植物中冷水提取的功能增强的脱盐营养组合物、脱盐提取物和盐替代物，所述盐生植物在高盐胁迫下生长在高盐度的极端环境中，基于盐的水溶度随温度变化而不同，通过在低温下的冷水提取工艺以仅使氯化钠被选择性地去除而使盐生植物脱盐，因此所述组合物具有降低的钠含量以及具有增加含量的有用矿物质，例如钾以及盐生植物中天然含有的营养素和生理活性物质。

Description

来自盐生植物的功能增强的脱盐营养组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及功能增强的脱盐营养组合物、脱盐提取物和冷水提取的盐替代物，其源自在高盐条件下的沿海地区生长并因此保持高盐浓度的盐生植物，并且本发明还涉及脱盐营养组合物在用于对抗肥胖中的用途。更具体地，本发明涉及从盐生植物中冷水提取的功能增强的脱盐营养组合物、脱盐提取物和盐替代物，所述盐生植物在高盐胁迫下生长在高盐度的极端环境中，基于盐的水溶度随温度变化而不同，通过在低温下的冷水提取工艺以仅使氯化钠被选择性地去除而使盐生植物脱盐，并且因此所述组合物具有降低的钠含量以及具有增加含量的有用矿物质例如钾以及盐生植物中天然含有的营养素和生理活性物质。
背景技术
盐生植物是在盐水生境中例如在沿海地区和盐田周围中自然生长的植物，由于土壤的高盐度，大多数陆生植物在这些地方无法生存。盐生植物通过使其克服盐胁迫的代谢反应，可以在其细胞和组织中保持高盐浓度，并且由于其高渗透势可以吸收海水。当食用时，这些植物味道非常咸，因为它们含有高的盐浓度。发现盐生植物在全世界范围内生长在盐沼的高盐地区群落中。这种盐生植物物种的代表性实例包括海篷子(Salicorniaeuropaea)、天门冬碱蓬(Suaeda asparagoides)和七面草(Suaeda japonica)。
海篷子(Salicornia europaea)是属于藜科(Chenopodiaceae)的一年生盐生植物，在包括韩国、欧洲和北美的全世界范围内广泛分布于盐水生境如盐沼或沿海地区中，农作物在这些地方一般不能很好地生长。这种植物有连接的茎，茎厚、肉质、膨大，且是深绿色，这种植物长到20至40厘米高。这种肉质药草在中药草“神农本草经”的经典手册中由于其咸味而被称为“Hamcho”和“Yeomcho”，意为咸草，也被称为“Shincho”，意为非常罕见的发酵药草。在北美，该植物被称为厚岸草(glasswort)。它在欧洲也被称为“圣彼得草(Samphire)”，在日本被称为“Aatkaeso Sangoso”。由于海篷子(S.europaea)生长在高盐度的盐沼中，因此，它可以在其组织中积累高浓度的盐，从而适应渗透压。因此，海篷子粉末已被用作植物食盐替代物。最近的研究表明，除了钠(Na)之外，海篷子(S.europaea)相对于其他植物物种保留较高水平的钙(Ca)、钾(K)、镁(Mg)和铁(Fe)，同时含有丰富量的必需氨基酸、食用纤维、生理活性营养素等。此时，据报道，肉质药草具有多种有益的生理作用，例如抗血栓形成、抗糖尿病、降血脂、抗高血压和抗氧化作用，以及黑色素合成抑制效果。由于其咸味和各种生理作用，海篷子(S.europaea)已被用于民间医学中，并且已知用作生活方式相关疾病的药草。根据韩国本土药用植物研究协会，海篷子(S.europaea)对循环***和胃肠***有益。日本Ohara Sanso不治之症研究所发现，海篷子(S.europaea)对几种癌症、鼻窦感染、关节炎、高血压、低血压、腰痛、肥胖、痔疮、糖尿病等具有极好的疗效。在关于药草“Daehwaboncho”的日本古代书籍中，海篷子(S.europaea)被称为“Shincho”、“Bokcho”，意为一种带来好运的药草，或称为“Yeomcho”，海篷子被描述为消除体内累积的毒素和粪便，并对各种不治之症例如癌症、子宫肌瘤和鼻窦感染等具有卓越的疗效。此外，海篷子改善血液循环，强化血管，对高血压和低血压两者以及鼻窦感染、肾炎、关节炎等具有疗效。此外，由于海篷子有效治疗化脓性炎症并且具有多种抗菌活性，因此其已用于治疗炎症、关节炎引起的肿胀等。此外，海篷子有助于缓解慢性疲劳，使大脑清晰以使精神集中。
海滩滨藜(Seablite)，其植物学名称为“天门冬碱蓬(Suaeda asparagoides)”，是属于藜科的一年生盐生植物，广泛分布于盐水生境如韩国、日本、中国等的沿海地区中。这种植物也称为“碱蓬(Suaeda glauca)”，有如松针的窄而细的叶子，在韩国，通常被称为“Gaetsolnamul”，意为具有如松针的细叶的沿海草本植物。天门冬碱蓬(Suaedaasparagoides)可以食用，但由于其高含盐量而摄入量有限，因此仅用作植物盐替代物。天门冬碱蓬(Suaeda asparagoides)具有降低发热、缓解高血压和差肝功能的优异效果，同时降低肠内积聚的粪便和废物，并将粪便和废物***到体外，因此可用于便秘、肥胖等。此外，该植物含有生理活性物质如多酚化合物，因此具有抗氧化活性并抑制毛细血管的渗透性而导致血管强化，以及具有活性氧清除活性和抑制脂质过氧化。因此，当脱盐时，天门冬碱蓬(Suaeda asparagoides)有可能发展成功能性食品。
七面草是属于藜科的一年生盐生植物，是耐盐植物，与海篷子(S.europaea)一样，其在组织中保留了大量的盐，并且可以在高盐度土壤中生长良好。这种植物生长在韩国、日本等，长到20至50厘米高，先是绿色，后来变成***。该植物也可以食用，但由于其高含盐量而使其摄入量受到限制，因此仅用作植物盐替代物。在中药草中，除了根之外的植物的整个部分已经被用作草药并且已知在治疗发烧、高血压、消化不良、便秘、肥胖等方面是有效的。该植物含有大量的天然矿物质，富含具有很高生物利用度的次生代谢产物如多酚、黄酮和皂苷。因此，当脱盐时，七面草具有很高的潜力可用作功能材料。七面草具有生理活性，包括抗氧化活性和对α-葡糖苷酶的抑制活性，α-葡糖苷酶与餐后血糖升高有关。对七面草成分的一些研究表明，该植物含有甘氨酸甜菜碱(其涉及盐胁迫耐受性)、2'-羟基-6,7-亚甲二氧基-异黄酮、黑麦草内酯、去氢催吐萝芙木醇、尿苷等。
同时，与全球变暖有关的极端异常天气事件的增多发生已经影响粮食安全。气候变化导致农作物生产力下降。这一因素和其他因素正在恶化全球粮食形势，其他因素包括随着中国和印度等新兴工业化国家的经济增长由对动物饲料的巨大需求造成的饲料需求增加以及生物燃料生产中食物资源的使用。为了应对气候变化和水资源短缺，人们对海水农业的发展越来越感兴趣，海水农业是一种基于利用海水来确保稳定的食物资源供应的未来核心技术。目前世界上一些面临长期缺水的地区即使供人食用也几乎没有淡水可用，更不用说农业用了。因此，由于目前仅依赖于淡水的农业生产***具有与缺水相关的大风险，因此在利用海水方面已经引起了极大的兴趣。地球上超过97％的水是海水，这种巨大量的海水可以用于减轻干旱和沙漠化，以及用于创造新的食物资源。在这方面，可以通过海水农业种植的盐生植物可能是在水和食品短缺的情况下克服营养和食品危机的潜在良好替代物。
迄今为止，盐生植物已知主要用作食物来源，如沙拉和蔬菜食用盐的替代物。许多研究表明，来自盐生植物的粉末或提取物具有有益功能，但尚未开发盐生植物产品作为功能性食品或材料。这是因为盐生植物的高盐度限制了它们作为咸源或大豆来源的利用。
韩国专利号10-0724705(标题为“包含海篷子(S.europaea)提取物的可食用液体型组合物”)公开了一种制备含有厚岸草作为有效成分的液体型组合物的方法，包括提取包含厚岸草的原料盐生植物材料并将提取物与食品添加剂及其他混合以生产饮料，其中饮料混合物可以进一步干燥得到固体。该专利还描述了一种食品的制造方法，其特征在于以规定的比例捏和可饮用组合物。然而，由于这些产品未脱盐并因此具有高含量的氯化钠，因此当添加或食用时它们的量受到限制。当盐生植物以足够大量摄取以吸收其中的有效成分时，摄入过量的钠会增加患高血压、心血管疾病等的风险，从而引起健康问题。
为了解决这些问题，已经进行了一些研究以消除盐生植物中的盐。代表性的脱盐方法如下。
(1)韩国专利号10-1218355公开了一种从红色厚岸草(S.europaea)制备β-花青苷的方法。制备的天然食用色素β-花青苷的方法基于提取红色厚岸草，通过电渗析使提取物脱盐，和干燥脱盐提取物。然而，该方法只用于从已经变成红色的厚岸草获得红色颜料，并且厚岸草必定由于生理变化变为红色，因为叶绿素在厚岸草枯萎前被破坏。此外，在电渗析过程期间，除了钠盐，可能会发生对人体有用的矿物质(如钾、钙、镁、铁)以及其他有用的低分子量成分的一些损失。
(2)韩国公开专利号10-2006-0110023描述了用热水或乙醇提取海篷子的方法，该提取物粉末然后与淀粉糊和其他成分混合以制成丸。该方法的问题在于，热水和乙醇提取物不能含有所有的厚岸草营养物，并且不能去除提取物的高盐浓度。
(3)韩国专利号10-1095619公开了一种用于降低厚岸草的盐含量的方法和用于脱盐厚岸草的储存方法。该方法包括将厚岸草切成约0.5cm长，在0.1％至1.0％NaCl溶液中搅拌该药草片10至40分钟，并在35℃和50℃下储存盐减少的厚岸草提取物。然而，该方法具有以下问题：由于新鲜药草被切割、浸入盐溶液中并在高于室温的高温下长时间搅拌，因此，除了水不溶性膳食纤维之外，包含在厚岸草中的大多数有机化合物丢失，并且盐溶液并不能确保很强的脱盐效果。
(4)韩国专利号10-1287065公开了一种用于制备具有改善的卫生和可消化性的厚岸草粉末的方法。该方法包括洗涤新鲜的厚岸草药草，从药草中提取汁液，在90至110℃下灭菌厚岸草汁液5至60分钟，加热汁液到50至70℃，减压和浓缩汁液，通过酶处理降解喷雾干燥的粉末并剩下汁液残渣，并粉碎所得到的产品。然而，由于该方法不包括实质的脱盐过程，因此高盐浓度仍然存在于厚岸草粉末中。
除了盐生植物之外，还对其他材料进行了脱盐研究，代表性的工作如下。
(1)韩国专利号10-1289769描述了一种基于消除牛奶中含有的带单电荷的矿物质而制备脱盐牛奶的方法。为了从生牛奶中消除带单电荷的钠离子，该方法包括使生牛奶通过氯阴离子交换树脂，和通过膜分离消除带单电荷的矿物质。这种方法仅适用于不含有不溶性固体的液相样品，并且存在另一问题，即牛奶的酸度在牛奶通过阴离子交换树脂时增加。此外，阴离子交换树脂可吸收非矿物的有机物质，例如，必需氨基酸和生物碱，由此引起的各种这样的生理活性离子物质的损失。
(2)电渗析是从溶液中分离离子成分的过程。这个过程在理论上基于质量转移理论，其中通过施加到电场的电压使溶液中的离子成分选择性地通过阳离子交换树脂膜和阴离子交换树脂膜。此外，电渗析是最常与反渗透和超滤一起使用的膜过程。这种电渗析方法主要用于使用带电膜进行脱盐。韩国专利号10-0561103公开了一种降低韩国传统酱油的食盐浓度的电渗析方法。在该专利中，电渗析过程导致酱油的盐度从23.67％降低到20.46％、15.2％和10.81％。然而，由于电渗析脱盐需要液相样品的连续循环，因此不可能从液体中完全去除盐。而且，该方法不适用于液体以外的样品。
(3)与电渗析相同，超滤不能选择性地仅消除钠盐，并且其在去除钠与有用矿物质如钾、钙和镁方面也是不利的。超滤方法还有其他缺陷：少于200道尔顿的低分子量的有机化合物在样品中损失，并且维护和管理设备需要很高的成本。
(4)渗透是一个自然过程。当具有不同溶质浓度的两种溶液用半透膜隔开时，溶剂从低溶质浓度一侧穿过膜隔离移动到高溶质浓度一侧。用于溶剂移动的驱动力是由溶质浓度差引起的化学势。当溶剂移动到更高浓度的溶液中时，压力产生并施加到更高浓度的溶液，该压力称为渗透压。在反向中，当施加高于渗透压的外部压力时，溶剂被迫从高溶液浓度移动到低溶液浓度，这种现象称为反渗透。已经使用通常在30至100倍大气压之间的压力梯度作为通过半透膜去除各种盐或有机物质的驱动力来应用反渗透的原理，并且该过程被称为反渗透分离过程。该方法主要用于海水脱盐以获得淡水，半导体工业的去离子水制备，各种工业废水处理过程等。韩国公开号10-2005-0122447描述了使用反渗透来浓缩酱油并降低其盐浓度。然而，在该公布文件中，由于使用溶质浓度梯度来实现脱盐，因此不能从溶液中选择性地去除钠盐，因此其他有用的矿物质、低分子量营养素和有机化合物与钠一起被去除。因此，这种脱盐过程不适用于盐生植物。
(5)韩国专利号10-1102259公开了一种使用酒精对盐腌和发酵食品脱盐的方法。在该专利中，脱盐通过以下步骤实现：以原料的0.5至10倍以上的量向盐腌和发酵食品中加入酒精以降低盐的溶解度并因此使盐沉淀，然后通过物理过程去除盐。用这种方法，可以沉淀和去除少量的盐。然而，添加酒精而不是除盐效果会导致蛋白质凝结和变性，并且还会降低多糖的溶解度，从而导致沉淀。特别是，大量的酸性多糖和蛋白质结合的多糖迅速沉淀，因此导致原料中含有的营养物的损失非常大。
在这方面，为了解决上述脱盐问题，本发明人对能够从盐生植物中有效地去除钠盐(NaCl)而不损失有用矿物质(例如钾、钙和铁)和营养素(例如碳水化合物和蛋白质)以及有用的生理活性物质(例如叶绿素、多酚和黄酮)的方法进行了彻底和深入的研究。该研究使用盐的水溶度随温度变化而不同开发了脱盐方法(参见图1)。具体而言，当在低温(9℃或更低)的冷水中搅拌提取干燥的盐生植物粉末时，与使用室温水和热水的情况相比，发现除了钠盐之外的有用矿物质和有机可溶性组分以非常低的水平洗脱，而钠盐的洗脱程度没有大的差异。此外，与脱盐前相比，发现脱盐粉末的膳食纤维含量以及多酚、黄酮和叶绿素含量显著增加。而且，脱盐盐生植物粉末与脱盐前相比具有显著改善的活性，例如抗氧化、抗血栓形成、抗高血压和抗糖尿病活性。此外，与常规的厚岸草盐不同，发现在盐生植物脱盐过程中获得的冷水搅拌的提取物具有高含量的氯化钠和有咸味(鲜味)的清咸味，因此有潜力用作100％纯植物盐替代物。
肥胖是由多种因素例如能量摄入过量、遗传易感性和身体活动减少引起的代谢紊乱。肥胖是指不仅以过重而且以体脂含量增加为特征的病症。在现代，由于营养摄入过量，许多人变得肥胖，而肥胖是当今日益严重的社会经济健康问题。在过去的几个世纪中，肥胖的患病率主要在发达国家上升，但近年来，超重人的人口在韩国迅速增加。肥胖已被认为是许多代谢紊乱例如心血管疾病、糖尿病、非酒精性肝炎、癌症、阿尔茨海默病和骨关节炎的风险因素，因此它被归类为严重的现代疾病。此外，肥胖增加细胞内氧化应激，其促进从脂肪组织释放的脂肪细胞因子失调，这有助于发展几种疾病，例如代谢综合征(包括动脉粥样硬化和糖尿病)以及缺血性心脏病。体育锻炼、饮食限制、药物和外科手术是治疗肥胖症的主要预防或治疗方法。然而，已知作为化学合成物质的抗肥胖药物具有强烈的抗肥胖作用，但也具有许多副作用。在这方面，最近，人们越来越关注安全且具有轻微副作用的天然植物材料。这种抗肥胖天然植物材料的代表性实例包括抑制脂肪合成和脂肪细胞分化的多酚，通过激活身体能量代谢来减少体脂的辣椒辣椒素，以及抑制脂肪吸收并产生饱足感的植物膳食纤维。
已经进行了许多以前的研究来调查厚岸草的抗肥胖功效。总的来说，已经使用通过用水或酒精(含水)提取厚岸草获得的提取物和未脱盐的厚岸草粉末进行实验。
基于样品中含有的盐含量(热水提取物的NaCl含量：约55-65％，酒精(含水)提取物的NaCl含量：约30-40％，厚岸草粉末的NaCl含量：约35-40％)，向高脂饮食诱导的肥胖对照组加入与厚岸草粉末相同量的氯化钠。发现上述研究的厚岸草样品具有抗肥胖作用，但仍保留原料中含有的氯化钠，因此限制了它们直接发展成功能性材料。由于这个原因，建议厚岸草样品仅用作具有抗肥胖功效的食盐替代物(Journal of the Science of FoodAgriculture,2015,95:3150-3159)。
相反，在本发明开发的源自盐生植物的功能增强的脱盐营养组合物中，氯化钠可以有效地从厚岸草中单独去除。因此，本发明人认为他们能够克服先前研究中遇到的问题，并且研究以确定脱盐营养组合物的抗肥胖效果。发现功能增强的脱盐营养组合物与脱盐前相比具有非常优异的抗肥胖和减少体脂的效果，确保作为有效预防和/或治疗肥胖的功能性食品和功能性饲料的应用潜力，从而产生了本发明。
发明内容
技术问题
因此，本发明的一个目的是提供一种来自盐生植物的功能增强的脱盐营养组合物、来自盐生植物的脱盐提取物及其方法，所述功能增强的脱盐营养组合物具有低钠含量以及增加含量的盐生植物中天然含有的营养素和功能性生理活性物质，例如不溶性膳食纤维、碳水化合物、钾(K)、镁(Mg)、多酚、黄酮和叶绿素。
本发明的另一目的是提供一种从盐生植物中冷水提取的盐替代物及其方法，该盐替代物在盐生植物脱盐过程中获得。
本发明的另一个目的是提供用于对抗肥胖和减少体脂的药物组合物和功能性食品。
问题的解决方案
为了实现上述目的，本发明提供了一种从盐生植物制备功能增强的脱盐营养组合物的方法，包括以下步骤：(a)将盐生植物的干燥粉末与9℃或更低的水混合并搅拌混合物；(b)离心搅拌后的混合物并去除具有高盐含量的上清液以回收脱盐沉淀物；和(c)干燥脱盐沉淀物。
本发明还提供了一种来自盐生植物的功能增强的营养组合物，基于干重，其包含0.04至6.8wt％的钠和61wt％或更高的碳水化合物。
此外，本发明提供一种从盐生植物制备功能增强的脱盐提取物的方法，包括以下步骤：(a)将盐生植物的干燥粉末与9℃或更低的水混合并搅拌该混合物；(b)离心搅拌后的混合物并去除具有高盐含量的上清液以回收脱盐沉淀物；(c)在液相中提取脱盐沉淀物以获得提取物；和(d)干燥液相提取物。
从盐生植物制备功能增强的脱盐提取物的方法的特征在于，其还包括在脱盐沉淀物的液相提取步骤之前干燥脱盐沉淀物。
此外，本发明提供一种来自盐生植物的功能增强的脱盐提取物，其特征在于从盐生植物的脱盐产物中提取并且基于干重其总的盐含量小于11.0wt％且不溶性膳食纤维小于3.2wt％。
根据本发明的来自盐生植物的功能增强的脱盐营养组合物的特征在于，其包含基于干重0.1至3.0wt％的钾(K)、0.1至2.0wt％的钙(Ca)和0.1至1.5wt％的镁(Mg)。
根据本发明的来自盐生植物的功能增强的脱盐提取物的特征在于，其包含基于干重0.1至10.0wt％的多酚和0.1至7.0wt％的黄酮。
源自盐生植物的功能增强的脱盐提取物的特征在于，其包含基于干重0.3至10.0wt％的叶绿素。
源自盐生植物的功能增强的脱盐营养组合物的特征在于，其包含反式阿魏酸。
此外，本发明提供一种从盐生植物制备冷水提取的盐替代物的方法，其包括以下步骤：(a)将盐生植物的干燥粉末与9℃或更低的水混合并搅拌该混合物；(b)离心搅拌后的混合物，得到上清液；(c)浓缩上清液并用活性炭纯化浓缩物；和(d)喷雾干燥纯化的浓缩物。
根据本发明，源自盐生植物的冷水提取的盐替代物的特征在于，其总的盐含量为50.0wt％或更高，并且具有钾与钠的重量比(K:Na)范围为1:10.1至1:19.0的盐组合物。
更进一步地，本发明提供一种来自盐生植物的冷水提取的盐替代物，其特征在于，其总的盐含量为50.0wt％或更高，并且具有钾与钠的重量比(K:Na)范围为1:10.1至1:19.0的盐组合物。
根据本发明的源自盐生植物的冷水提取的盐替代物的特征在于，其包含0.1至50mg/g的谷氨酸。
本发明还提供用于对抗肥胖和减少体脂的药物组合物，其包含源自盐生植物的功能增强的脱盐营养组合物或源自盐生植物的反式阿魏酸。
本发明进一步提供用于对抗肥胖和减少体脂的功能性食品，其包含源自盐生植物的功能增强的脱盐营养组合物或源自盐生植物的反式阿魏酸。
本发明还进一步提供了一种用于对抗肥胖和减少体脂的饲料，其包含源自盐生植物的功能增强的脱盐营养组合物或源自盐生植物的反式阿魏酸。
有益效果
根据本发明的从盐生植物制备功能增强的脱盐营养组合物或脱盐提取物的方法，通过基于盐的水溶度随温度变化而不同的冷水脱盐方法，能够有效地仅去除氯化钠，而不损失有用矿物质(例如钾、钙和镁)、营养素(例如碳水化合物和蛋白质)和有用的生理活性物质(叶绿素、多酚和黄酮)。去除的氯化钠溶液由于其高含量的氯化钠和谷氨酸，可以用作食盐替代物。
附图说明
通过以下结合附图的详细描述，将更清楚地理解本发明的上述和其他目的、特征和其他优点，其中：
图1是显示根据本发明的实施方案制备源自盐生植物的功能增强的脱盐营养组合物、脱盐提取物和盐替代物的方法的流程图；
图2是显示盐的水溶度随变化的温度的曲线图；
图3是显示脱盐前后海篷子(Salicornia europaea)粉末的外观的照片；
图4是未脱盐的海篷子粉末(SP)、冷水脱盐的海篷子粉末(CW-DSP)和热水脱盐的海篷子粉末(HW-DSP)相互比较叶绿素含量的照片；
图5是显示根据本发明的一个实施方案的未脱盐的盐生植物干燥粉末的热水提取物和冷水脱盐的盐生植物干燥粉末的热水提取物的总多酚、总黄酮和总蛋白质的比色分析结果的照片；
图6是显示根据本发明的一个实施方案的未脱盐的盐生植物干燥粉末的热水提取物和冷水脱盐的盐生植物干燥粉末的热水提取物的总糖和总酸性糖的比色分析结果的照片；
图7是显示取决于浓度的本发明的一个实施方案的未脱盐的盐生植物干燥粉末的热水提取物和冷水脱盐的盐生植物干燥粉末的热水提取物的抗氧化活性的图；
图8是显示取决于浓度的根据本发明的一个实施方案的未脱盐的盐生植物干燥粉末的热水提取物和冷水脱盐的盐生植物干燥粉末的热水提取物的对血管紧张素-I-转化酶(ACE)的抑制活性的图；
图9是显示取决于浓度的根据本发明的一个实施方案的未脱盐的盐生植物干燥粉末的热水提取物和冷水脱盐的盐生植物干燥粉末的热水提取物对α-葡糖苷酶的抑制活性。
图10是显示脱盐海蓬子粉末(DSP)在由高脂饮食诱导的肥胖大鼠中的体重减轻效果的图(NC：正常对照，HFD：高脂饮食(HFD)诱导的肥胖对照组，HFD+SP200：给予高脂饮食(HFD)+200mg/kg海蓬子粉末(SP)，HFD+DSP200：给予高脂饮食(HFD)+200mg/kg脱盐海蓬子粉末(DSP)，HFD+GE200：高脂饮食(HFD)+200mg/kg藤黄提取物(GE)；平均值±SD(n＝10)，*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001)；
图11显示在6周和12周时脱盐海蓬子粉末(DSP)在高脂饮食诱导的肥胖大鼠中的体脂减少效果(G1：正常对照组，G2：由高脂饮食诱导的肥胖对照组，G3：给予高脂饮食+200mg/kg海蓬子粉末(SP)，G4：给予高脂饮食+200mg/kg脱盐海蓬子粉末(DSP)，G5：给予高脂饮食+200mg/kg藤黄提取物(GE)；平均值±SD(n＝10)，*：p<0.05，**：p<0.01，#：p<0.05，##：p<0.01)；
图12显示脱盐海蓬子粉末(DSP)在高脂饮食诱导的肥胖大鼠中的腹部脂肪减少效果(NC：正常对照，HFD：高脂饮食(HFD)诱导的肥胖对照组，HFD+SP200：给予高脂饮食(HFD)+200mg/kg海蓬子粉末(SP)，HFD+DSP200：给予高脂饮食(HFD)+200mg/kg脱盐海蓬子粉末(DSP)，HFD+GE200：高脂饮食(HFD)+200mg/kg藤黄提取物(GE)；总脂肪量，VFV：内脏脂肪量，SFV：皮下脂肪量；平均值±SD(n＝10)，*：p<0.05，**：p<0.01，#：p<0.05，##：p<0.01)；
图13显示反式阿魏酸的HPLC色谱的结果，反式阿魏酸是脱盐海蓬子粉末(DSP)中含有的标志物(A：DSP-EW的分析型HPLC谱，B：真实反式阿魏酸的分析型HPLC谱，C：DSP-EW的多重制备型HPLC谱；1：咖啡酸，2：对香豆酸，3：反式阿魏酸，4：异鼠李素-3-β-D-葡萄糖苷)；
图14是显示从脱盐海蓬子粉末(DSP)分离的反式阿魏酸(TFA)对3T3-L1细胞中细胞内脂质积累和甘油三酯形成的抑制作用的照片和图(单向ANOVA测试；*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001，#：p<0.05，##：p<0.01，###：p<0.001)；和
图15显示用于确定从脱盐海蓬子粉末(DSP)分离的反式阿魏酸(TFA)对SREBP1、c/EBPα、PPARγ和FAS基因表达的影响的实时RT-PCR的结果(单向ANOVA测试；*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001，#：p<0.05，##：p<0.01，###：p<0.001)。
具体实施方式
含有各种有用物质(例如膳食纤维、必需氨基酸、植物矿物质和生理活性物质)的盐生植物因其高盐含量而适用性受到限制。根据本发明，基于盐的水溶度随温度变化而不同，当盐生植物的干燥粉末低温下在冷水中搅拌提取短时间时，与用室温水和热水进行提取的情况相比较，除钠之外的有用矿物质和有机可溶成分的洗脱显著减少，而钠盐的洗脱没有太大差异。
根据本发明，向盐生植物中分别加入冷水、室温水和热水，然后搅拌和离心以去除上清液。回收所得的脱盐提取物并干燥，以产生源自盐生植物的功能增强的脱盐营养组合物。发现用冷水提取能够有效地去除钠盐，同时使有机物质的洗脱最小化。
本发明的一个方面，本发明涉及从盐生植物制备功能增强的脱盐营养组合物的方法和来自盐生植物的功能增强的脱盐提取物，所述方法包括以下步骤：(a)将盐生植物的干燥粉末与9℃或更低的水混合并搅拌混合物，(b)离心搅拌后的混合物并去除具有高盐含量的上清液以回收脱盐沉淀物，和(c)干燥脱盐沉淀物，所述功能增强的脱盐提取物包含基于干重0.04至6.8wt％的钠和61wt％或更高的碳水化合物。
盐生植物是在盐水生境中例如沿海地区和盐田周围中自然生长的植物。盐生植物的实例包括但不限于海篷子(Salicornia Spp.)、天门冬碱蓬(Suaeda asparagoides)和七面草(Suaeda japonica)。
盐生植物干燥粉末可以通过洗涤盐生植物以去除杂质然后干燥来制备。可以使用干燥产品本身，但是粉末形式对于更有效的提取是优选的。
如图1所示，源自盐生植物的功能增强的脱盐营养组合物如下制备。首先，将干燥的盐生植物产品与9℃或更低，优选0.1至4℃的水混合，然后搅拌。优选的水是非盐水，例如自来水或蒸馏水。如果在约10℃或更高的温度下进行搅拌，则与0.1至9℃的条件相比，钠盐的洗脱程度没有太大变化，但其他有机可溶性组分和矿物质如钾被洗脱，导致脱盐干燥产品的营养物质大量损失。
盐生植物的干燥产物优选以每1L为40至70g的量用于提取。当使用小于40g时，溶剂量相对较大，增加了待离心的总量。这使得提取过程无效。另一方面，大于70g的量不能确保有效搅拌。
搅拌优选进行1至5分钟。搅拌少于一分钟导致盐生植物的脱盐效率降低。当搅拌时间超过5分钟时，可溶性有机组分以及钠盐的洗脱增加。
搅拌后，将搅拌的混合物离心，然后去除具有高盐含量的上清液以回收脱盐沉淀物。
沉淀物可以根据本领域公知的方法获得，并且方法没有特别限制，只要其可以将搅拌的混合物分离成上清液和沉淀物即可。例如，可以使用过滤方法来获得沉淀物。
根据预期需要，可以进一步搅拌脱盐沉淀物，以进一步降低剩余的少量盐含量。
回收并干燥最终脱盐的沉淀物。
由于根据本发明的从盐生植物制备功能增强的脱盐营养组合物的方法能够有效去除仅氯化钠而不损失有用的生理活性物质，因此根据本发明制备的脱盐营养组合物可以包含基于干重0.04-6.8wt％的钠(Na)、61wt％或更高的碳水化合物、0.1-3.0wt％的钾(K)、0.1-2.0wt％的钙(Ca)、0.1-1.5wt％的镁(Mg)、0.1-10.0wt％的多酚、0.1-7.0wt％的黄酮类和0.3-10.0wt％的叶绿素。
当通过用冷水脱盐盐生植物得到的脱盐沉淀物及其干燥粉末用水或乙醇提取时，与未脱盐的盐生植物的提取物相比，发现它们的盐含量显著降低，并且功能成分和营养素的含量显著增加。
另一方面，本发明提供一种从盐生植物制备功能增强的脱盐提取物的方法和一种来自盐生植物的功能增强的脱盐提取物，所述方法包括以下步骤：(a)将盐生植物的干燥粉末与9℃或更低的水混合并搅拌该混合物；(b)离心搅拌后的混合物并去除具有高含盐量的上清液以回收脱盐沉淀物；(c)在液相中提取脱盐沉淀物以获得提取物；和(d)干燥液相提取物，所述功能增强的脱盐提取物的特征在于其从盐生植物的脱盐产物中提取，并且基于干重其总的盐含量小于11.0wt％且不溶膳食纤维小于3.2wt％。
使用与上述相同的方法回收来自盐生植物的脱盐沉淀物。为了洗脱生理活性功能组分，脱盐沉淀物可以用水提取，或者可以将其干燥，然后用有机溶剂如甲醇、乙醇、丁醇、乙酸乙酯、丙酮或***提取，从而得到所需的提取物。当用有机溶剂进行液相提取时，脱盐沉淀物优选在进行液相提取之前进行干燥。
用有机溶剂液相提取脱盐的盐生植物沉淀物可以在室温下或在有机溶剂变得易挥发的温度附近通过回流提取进行。在这种情况下，脱盐沉淀物的用量优选为每升提取溶剂40-75g。小于40g的量增加了提取溶剂的成本。当溶剂的量超过75g时，提取效率降低。额外的液相提取过程具有提高提取产率的优点。
根据本发明制备的源于盐生植物的功能增强的脱盐提取物的特征在于，其总的盐含量小于11.0wt％，不溶性膳食纤维小于3.2wt％，并且可以包含0.1-10.0wt％的多酚、0.1-7.0wt％的黄酮和0.3-10.0wt％的叶绿素。
由于源自盐生植物的功能增强的脱盐提取物具有各种体内生理活性例如抗氧化、抗血栓、抗高血压和抗糖尿病活性，因此它有可能作为食品、化妆品、药品等的原料应用。
此外，源自盐生植物的功能增强的脱盐营养组合物包含作为有效成分的反式阿魏酸，反式阿魏酸抑制脂肪细胞分化和参与脂质合成的基因，以及包含比脱盐前更大量的膳食纤维。因此，该组合物具有良好的抗肥胖和减少体脂的效果。
又另一方面，本发明涉及用于抗肥胖和减少体脂效果的药物组合物和功能性食品和饲料，其包含上述功能增强的脱盐盐生植物干燥产品。
同时，在冷水中搅拌盐生植物干燥粉末并通过离心回收脱盐沉淀物后，发现剩余的上清液具有高含量的氯化钠，同时具有低含量的钾和高含量的谷氨酸，并且因此，可用作具有清咸味和美味(鲜味)的植物盐替代物。
因此，在又另一方面，本发明涉及一种从盐生植物制备冷水提取的盐替代物的方法和根据该方法制备的源自盐生植物的冷水提取的盐替代物，所述方法包括以下步骤：(a)将盐生植物的干燥粉末与9℃或更低的水混合并搅拌混合物；(b)离心搅拌后的混合物以得到上清液；(c)浓缩上清液并用活性炭纯化浓缩物；和(d)喷雾干燥纯化的浓缩物，所述冷水提取的盐替代物的特征在于，其总的盐含量为50.0wt％或更高并且具有钾与钠的重量比(K:Na)范围为1:10.1-1:19.0的盐组合物。
回收脱盐沉淀后剩余的冷水搅拌的上清液可以浓缩至盐度为15-19％和总的固体含量为20％或更高。因此，可以使用基于浓缩物的总的固体含量3-5％的活性炭来纯化上清液，然后喷雾干燥，得到源自盐生植物的冷水提取盐。可以改变纯化中使用的活性炭的量以控制有机物质的含量和盐的颜色。
冷水搅拌上清液的浓缩方法没有特别限制，只要其可以浓缩上清液即可。优选的是真空浓缩。
发明模式
通过以下用于说明的实施例可以更好地理解本发明，但不应解释为限制本发明。
实施例1：评价冷水提取海蓬子的脱盐效果
向100g海蓬子(Salicornia europaea)干燥粉末中分别加入2升冷水(4℃和9℃)、室温水(20℃)和热水(100℃)。在低温(4℃和9℃)和室温(20℃)下搅拌(300rpm)进行提取。使用100℃回流冷凝器进行热水提取。
为了确定最大化脱盐的最佳条件，将搅拌的混合物以5分钟的时间间隔以10,000rpm离心20分钟。将上清液通过膜滤器(0.45μm孔径)真空过滤，然后分析盐度(ATAGOES-421，ATAGO Co.LTD.日本)和白利糖度(Brix)(ATAGO PAL-1，ATAGO Co.LTD.日本)。此外，将上清液真空浓缩，冷冻干燥(EYELA FDU-2200，ETELA，日本)，然后分析总的固体含量。测量的总的固体含量，以及总固体中的盐百分比和除盐之外的固体含量，在下表1中给出。
表1
Figure GDA0001877036770000151
Figure GDA0001877036770000161
如表1所示，发现盐的洗脱程度随温度的变化几乎没有差异。供参考，图2显示了在不同温度下盐的水溶解度。表1中所示的结果对应于NaCl根据温度的恒定水溶解度，如图2所示。
当用水(2L)(4℃、9℃、20℃和100℃)提取100g海蓬子(S.europaea)干燥粉末30分钟时，还发现洗脱量的盐在所有试验温度下几乎相同(分别为28.5g、28.6g、28.7g和28.9g)。因此，认为海蓬子中包含的所有盐在30分钟内洗脱。
相反，发现除盐之外的可溶性有机固体的洗脱随温度升高而大大增加。提取30分钟后，发现固体在室温(20℃)下洗脱相比在4℃萃取时高2.47倍，在100℃洗脱时高3.28倍。
作为脱盐效果的理想指标，测量可溶性固体含量(白利糖度，％)/盐度(％)指数。即，白利糖度/盐度比越低，假定的由于脱盐导致的有机固体损失越低。发现该指数在所有温度条件下随时间逐渐增加。
此外，关于白利糖度/盐度指数的差异，在0.1至9℃的冷水提取导致低指数值在1.26至1.36之间；即发现轻微差异。相反，当提取在20℃或更高温度下进行时，测量到超过1.5的高指数值，而指数范围为1.5-2.02，并且随着温度的升高，发现指数也逐渐增加。因此，优选的是脱盐的提取在9℃或更低的温度下进行尽可能短的时间。即，这些结果表明，当用4℃或更低的冷水提取4分钟或更短时，有机物质的洗脱最小化，同时有效地除去盐。
实施例2：从海蓬子、天门冬碱蓬和七面草制备脱盐营养组合物
使用三种植物(海蓬子、天门冬碱蓬和七面草)制备脱盐营养组合物，已知它们是在韩国自然生长的极端盐生植物。用自来水洗涤新鲜植物并冷冻干燥以粉化。基于实施例1的结果，其中当用4℃或更低的冷水进行提取4分钟或更短时，有机物质的提取最小化，同时有效地除去盐，加入100g干燥粉末在2L冷水(4℃)中，在4℃下搅拌4分钟，并以10,000rpm离心20分钟。然后，除去具有高盐含量的上清液，并回收脱盐沉淀物。通过与上述相同的方法再次将回收的沉淀物脱盐，以使剩余的钠盐最少化。将由此获得的沉淀物冷冻干燥，得到源自盐生植物的脱盐营养组合物(脱盐粉末)。
试验例1：分析源自盐生植物的脱盐营养组合物的组分
对来自海蓬子、天门冬碱蓬和七面草的未脱盐盐生植物干粉和实施例2中制备的来自相同盐生植物的脱盐营养组合物(脱盐粉)分析其钠、营养素和功能组分的含量，结果列于下表2中。根据韩国食品标准法典(韩国食品工业协会)的一般分析方法进行卡路里碳水化合物和蛋白质含量的分析。通过湿法分析使用硝酸的酸性消化法然后通过电感耦合等离子体光谱法(ICPS)测量钠、钾、镁、铁和钙的含量。
其它组分，即多酚、黄酮类和叶绿素的量如下测定。
1-1：总多酚含量分析
根据改进的Folin-Davis方法在96孔微孔板中测定总多酚含量。用70％甲醇提取未脱盐和脱盐的盐生植物粉末，干燥并溶于蒸馏水中。将20μl每种样品与250μl的2％碳酸钠和15μl 50％Folin-Ciocalteu试剂(Sigma Co.，USA)混合，使溶液在室温下反应30分钟。然后，使用微量阅读器(Bio-RAD，x-Mark，USA)在725nm处测量吸光度。作为标准，使用0至500μl/mL的单宁酸溶液(Sigma Co.，USA)代替样品，并且从由此获得的校准曲线计算提取样品中包含的总多酚的量。
1-2：总黄酮含量的分析
根据改良的Abdel-Hameed方法在96孔微孔板中测定总黄酮含量。用70％甲醇提取未脱盐和脱盐的盐生植物粉末，干燥并溶于蒸馏水中。向30μl的每个样品中加入200μl的90％二甘醇和5μl的1N NaOH。使溶液在37℃下反应1小时。然后，使用微量阅读器(Bio-RAD，x-Mark，USA)在420nm下测量吸光度。作为标准，使用0至500μl/mL的芦丁溶液(Sigma Co.，USA)代替样品，并且从由此获得的校准曲线计算提取样品中包含的总黄酮的量。
1-3：总叶绿素含量分析
在室温下用50mL 80％丙酮提取各1g的未脱盐和脱盐的盐生植物粉末直至颜色消失。然后，分离上清液，并使用微量阅读器(Bio-RAD，x-Mark，USA)在645nm和663nm下测量吸光度。使用以下等式计算叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的浓度。
叶绿素a(mg/mL)＝12.72OD663-2.58OD645
叶绿素b(mg/mL)＝25.88OD645-5.50OD663
总叶绿素(mg/mL)＝7.22OD663+20.3OD645
表2
Figure GDA0001877036770000191
如表2所示，与脱盐前相比，发现脱盐盐生植物样品中碳水化合物和粗蛋白含量增加。在脱盐过程中去除的主要成分是钠(Na)，而脱盐后其它矿物质如钾、钙、镁和铁的浓度增加。
此外，预期在盐生植物中具有有用的生理活性的多酚、黄酮类和叶绿素的浓度在脱盐后大大增加。这些结果表明，脱盐盐生植物粉末可用作具有增加的有用生理活性物质含量的功能性营养组合物。
图3显示脱盐前后海蓬子粉(5g)的外观。如图3所示，当海蓬子粉在冷水中短时间脱盐时，叶绿素仅少量洗脱，几乎全部残留，而脱盐粉末通过脱盐减轻，因此其体积增加。
将未脱盐海蓬子粉(SP)、冷水脱盐海蓬子粉(CW-DSP)和热水脱盐海蓬子粉(HW-DSP)相互比较叶绿素含量，结果如图4所示。叶绿素是一种绿色色素，在发生光合作用的植物叶绿体中含量丰富，并与蛋白质的相关性较弱。叶绿素具有独特的化学结构，其具有中心带有镁原子的卟啉(四吡咯)环，并且是具有与卟啉环连接的长烃尾的疏水化合物(Rudiger,W.and Schoch,S.,"Chlorophylls",In:Plant Pigments,1988.AcademicPress,London)。由于这种结构特征，叶绿素被认为不会被洗脱，而是在用冷水脱盐期间保留。因此，发现冷水脱盐的海蓬子粉末(CW-DSP)的叶绿素含量高于未脱盐的海蓬子粉末(SP)。
由于作为保健功能食品法中指定的功能性原料的叶绿素是用于提高抗氧化活性和免疫力的功能性物质，因此冷水提取的盐生植物粉末具有作为功能增强的营养组合物的潜力。相反，由于叶绿素对热的抵抗力弱并因此容易因热而降解，因此热水脱盐盐生植物粉末具有非常低的叶绿素含量。
实施例3：从盐生植物(热水提取物和乙醇提取物)制备功能增强的脱盐提取物
将来自实施例2中制备的来自海蓬子、天门冬碱蓬和七面草的100g功能增强的脱盐营养组合物(脱盐粉末)各自加入2L蒸馏水中，在100℃下回流提取2或4小时，离心，过滤，在压力下浓缩，并冷冻干燥，从而得到源自盐生植物的功能增强的脱盐热水提取物。
将来自实施例2中制备的来自海蓬子、天门冬碱蓬和七面草的100g功能增强的脱盐营养组合物(脱盐粉末)各自加入2L的95％乙醇中，在75±1℃下回流提取。2或4小时，冷却至室温，并离心。将上清液过滤并在压力下浓缩并冷冻干燥，从而得到源自盐生植物的功能增强的脱盐乙醇提取物。
对比例1：从未脱盐的盐生植物制备热水提取物和乙醇提取物
根据与实施例3中相同的方法制备从2小时提取获得的热水提取物和乙醇提取物，不同之处在于使用未脱盐盐生植物(海蓬子、天门冬碱蓬和七面草)代替来自海蓬子、天门冬碱蓬和七面草的功能增强的脱盐营养组合物(脱盐粉末)。
试验例2：评价热水提取物和乙醇提取物的组分
对于在实施例3和对比例1中提取2小时的样品，使用改进的苯酚-硫酸法测量总糖(碳水化合物)(Kweon et.al.,1996.Agric.Chem.Biotech.39.15-164)使用间羟基联苯法(Blumenkrantz et.al.,1973.Analytical Biochem.54.484-489)测量酸性糖。根据与试验例1中相同的方法测量总多酚、总黄酮和总叶绿素，并将该测试重复三次。脱盐前后盐生植物的热水提取物和乙醇提取物的组分分析结果示于表3和4中。
表3
Figure GDA0001877036770000211
Figure GDA0001877036770000221
如表3所示，发现来自未脱盐盐生植物(海蓬子、天门冬碱蓬和七面草)的比较例1的热水提取物具有55.8至62.0％的总盐、25.8至33.3％的总碳水化合物和1.6至2.1％的不溶性膳食纤维。此外，发现酸性糖含量为11.6-17.8％，与其它一般植物相比相对较高，表明酸性糖主要由葡糖醛酸和半乳糖醛酸组成。
与比较例1(脱盐前的干燥粉末的热水提取物)相比，实施例3中制备的冷水脱盐干燥粉末的热水提取物显示出总的盐含量显著降低超过约90％，总的糖含量(51.0-63.0％)显著增加，特别是总的酸含量(22.2-32.8％)显著增加。许多研究报道，在糖类中，酸性糖尤其具有良好的免疫增强、抗凝血、抗血栓和抗癌活性。因此，通过用冷水脱盐获得的盐生植物粉末的热水提取物可用于功能增强的营养组合物中，因为它们含有高浓度的酸性糖。与比较例1(脱盐前的干燥粉末的热水提取物)相比，实施例3的热水提取物显示总多酚浓度(高达40.8mg/g)、总黄酮含量(高达31.0mg/g)和总蛋白质(高达15.9wt％)增加50％至100％。在4小时的热水提取的情况下，从三种脱盐盐生植物获得的热水提取物显示出比2小时热水提取的样品更高的总盐含量(9.6至10.8％)。
表4
Figure GDA0001877036770000222
Figure GDA0001877036770000231
如表4所示，发现来自未脱盐盐生植物(海蓬子、天门冬碱蓬和七面草)的比较例1的乙醇提取物具有显著高的30.6至35.4％的总的盐、16.3至18％的总碳水化合物和0.14至0.18％的不溶性膳食纤维。此外，发现总的中性糖含量为6.5-10.3％，而总的酸性糖含量为5.9-8.8％，所有这些都低于热水提取物(见表3)。
与比较例1(脱盐前的干燥粉末的乙醇提取物)相比，实施例3中制备的冷水脱盐干燥粉末的乙醇提取物的总的盐含量显著降低超过约90％，同时显示总的中性糖和总酸性糖浓度显著增加。特别是，与热水提取物相比，发现乙醇提取物含有大量的多酚、黄酮类和叶绿素，并且与比较例1(脱盐前的干燥粉末的乙醇提取物)相比，总的多酚(76.7至90.8mg/g)，总的黄酮(52.6至66.4mg/g)和总的叶绿素(85.3至98.2mg/g)含量显著增加。在4小时乙醇提取的情况下，从三种脱盐盐生植物获得的乙醇提取物显示出比2小时乙醇提取的样品更高的总的盐含量(5.5至6.9％)。
这些结果表明，根据本发明的制备功能增强的脱盐营养组合物和来自盐生植物的脱盐提取物的方法，通过基于盐的水溶性随温度变化的差异的冷水脱盐方法，使得能够实现有效去除氯化钠而不会使有用的功能性植物化合物被洗脱，与未脱盐的情况相比，其含量显著增加。因此，根据本发明的功能增强的脱盐营养组合物和来自盐生植物的脱盐提取物具有作为功能增强的良好营养物质应用的潜力。
试验例3：评价盐生植物的热水提取物的药物活性
评价在比较例1和实施例3中制备的脱盐前后盐生植物的热水提取物(样品)的抗氧化剂、抗血栓形成、血管紧张素-I-转换酶(ACE)抑制和α-葡糖苷酶抑制活性。将测试重复三次，结果在表5和图7到9中给出。
3-1：抗氧化活性
基于Blois的方法(Chen,et.al.,1999.J.Agric.Food Chem.47.2226-2228)，使用1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH，Sigma Co.，USA)测定抗氧化活性。
简言之，将4mg DPPH溶于50ml乙醇中，并将180μl所得DPPH溶液加入96孔微孔板中。然后，以各种浓度(25、50和100μl/ml)加入各样品，混合5秒，并使其在室温下反应20分钟。相对于不含样品的对照，DPPH自由基的减少通过读取517nm处的吸光度来确定。自由基清除活性表示为样品对自由基的抑制百分比。IC50值定义为清除50％DPPH自由基所需的样品浓度。
当我们自己的新陈代谢产生的活性氧(ROS)和自由基过量产生时，它们会在我们身体的各个部位产生氧化应激，从而难以维持细胞内的内稳态，最终导致多种疾病，包括癌症、脑部疾病如中风和帕金森病、心脏病、局部缺血、动脉硬化、皮肤病、消化***疾病、炎症、类风湿性关节炎、自身免疫性疾病和衰老。因此，除去活性氧物质或抑制自由基产生的抗氧化剂化合物可用于预防和/或治疗由细胞内氧化应激引起的各种疾病和抑制皮肤老化。
已经报道了许多抗氧化多酚和黄酮类化合物从包括海蓬子在内的盐生植物中分离。如图7所示，与比较例1(未脱盐的热水提取物)的样品相比，实施例3中制备的样品(冷水脱盐的热水提取物)被发现具有更强的抗氧化活性(100μg/ml，抗氧化活性从34.7％(来自未脱盐海蓬子的热水提取物)增加约2.3倍达到79.17％(来自冷水中脱盐的海蓬子的热水提取物))。该结果与在冷水中脱盐之前和之后盐生植物粉末的热水提取物中存在的总多酚和总黄酮含量的变化显著相关。
3-2：抗血栓形成活性
通过使用先前已知的方法测定抗凝血活性来评估抗血栓形成活性(Sohn et al.,2004.Kor.J.Pharmacogn 35.52-61；Kwon et al.,2004.J.Life Science,14.509-513；Ryuet al.,2010.J.Life Science,20.922-928)和凝血酶原时间(PT)和活化的部分凝血活酶时间(aPTT)。使用的是市售的对照血浆(MD Pacific Technology Co.,Ltd,HuayuanIndustrial Area,China)，并且如下测量PT和aPTT水平。
3-2-1：凝血酶原时间(PT)
将30μl对照血浆(MD Pacific Co.，中国)和5μl浓度(2.5和5.0mg/ml)的每种样品加入Genius半自动凝血计CA 51-52(中国深圳)的试验比色皿中。将比色皿在37℃加热3分钟，加入40μl PT试剂(Diagon，Hungary)。然后，记录凝血时间。计算四次重复的平均凝固时间。作为阳性对照，使用阿司匹林(Sigma Co.，USA)，并且使用DMSO代替样品作为溶剂对照。DMSO显示出18.1秒的凝固时间。凝血酶原抑制活性表示为样品的凝固时间(Ts)除以溶剂对照的凝固时间(Tc)，即Ts/Tc，结果列于下表5中。
3-2-2：活性化的部分凝血活酶时间(aPTT)
将30μl血浆和5μl浓度(2.5和5.0mg/ml)的每种样品加入Genius半自动凝血计CA51-52(中国深圳)的测试比色皿中。将比色皿在37℃加热3分钟，加入20μl aPTT试剂(Diagon，Hungary)，再将比色皿在37℃下静置3分钟。加入20μl CaCl2(35mM)并记录凝固时间。代替样品，使用DMSO作为溶剂对照，并显示出58.0秒的凝固时间。计算四次重复的平均凝固时间。对凝血因子的抑制活性表示为样品的凝固时间(Ts)除以溶剂对照的凝固时间(Tc)，即Ts/Tc，结果列于下表5中。
表5
Figure GDA0001877036770000261
血液是人体组成部分，具有多种关键功能，如输送氧气、营养物质和废物，充当缓冲剂，维持体温，调节渗透压，维持离子平衡，保持水含量恒定，体液调节，维持和调节血压，以及保护身体。在正常血液循环下，血液凝固***和凝块溶解***以互补的方式调节以促进血液循环。正常的血液凝固过程如下发生。血小板粘附在受损血管的壁上并聚集，促进血小板栓(初级凝块)的形成。然后，激活血液凝固***，并在血小板凝块周围形成纤维蛋白凝块。抑制凝血酶活性的物质可用于预防和治疗由异常过度凝血引起的各种凝血障碍。而且，内源性凝血途径导致纤维蛋白凝块的形成。通过逐步激活凝血因子XII、XI、IX和X，以逐步的顺序激活内源性途径，以将凝血酶原转化为活性凝血酶。凝血因子的特异性抑制也是开发凝血障碍治疗剂的主要目标。
如表5所示，与对照相比，比较例1中制备的海蓬子样品(未脱盐的热水提取物)在5mg/ml时显示出PT和aPTT值略微增加，分别为1.08倍和1.21倍，而发现在实施例3中制备的海蓬子样品(冷水脱盐热水提取物)，在相同浓度下，PT和aPTT显著延长，分别增加1.85倍和2.22倍，表明优异的抗血栓形成活性。
3-3：ACE抑制活性
通过略经改良的Cushman和Cheung方法测量对血管紧张素-I-转化酶(ACE)的抑制活性。将25μl各种浓度(0.25、0.5和1.0mg/ml)的每种样品与25μl的ACE(2.5单位)上清液混合，该上清液通过将1g兔肺丙酮粉末(Sigma Co.，USA)溶解在含有0.3M NaCl的10ml 0.1M硼酸钠缓冲液和含有0.3M NaCl的50μl 0.1M硼酸钠缓冲液(pH8.3)中制备。然后，将混合物在37℃下预温育10分钟。
随后，加入50μl Hip-His-Leu作为底物，使混合物在37℃反应30分钟。加入100μl1N HCl终止反应。然后，加入1ml乙酸乙酯，将反应混合物涡旋1分钟，并以3,000g离心15分钟。回收分离的乙酸乙酯上清液(提取物)，其量为0.8ml。将上清液在通风橱下加热并蒸发至干。完全干燥后，将其溶于1ml硼酸钠缓冲液中。然后，在228nm处测量吸光度，并测定ACE抑制活性。结果在图8中给出。0至1μg/ml的卡托普利(Sigma Co.，USA)用作阳性对照。
血管紧张素-I-转换酶(ACE)从十肽血管紧张素I切割C-末端二肽His-Leu，从而将血管紧张素I转化为活性血管紧张素II，其刺激血管收缩。由ACE引起的血管紧张素II水平升高导致血压急剧升高。血管紧张素II还刺激抗利尿激素醛固酮的分泌，并促进肾脏的水和钠潴留，从而增加血容量和血压。此外，ACE降解并因此使缓激肽失活，缓激肽导致血管松弛并因此导致血压下降，导致血压升高。ACE活性的抑制可以预防血管收缩，从而降低血压。因此，可以开发具有针对ACE的抑制活性的化合物作为高血压的预防和/或治疗剂。
如图8所示，比较例1中制备的盐生植物样品(未脱盐的热水提取物)在1mg/ml下均显示出低于30％的低ACE抑制活性。相反，在相同浓度下，实施例3中制备的盐生植物样品(冷水脱盐热水提取物)在相同浓度下，均发现具有显著增加的ACE抑制活性(来自海蓬子、天门冬碱蓬和七面草的样品分别具有65.3％、59.7％和56.9％的抑制。这些结果表明，当盐生植物粉末在冷水中短时间脱盐时，ACE抑制物质不会被洗脱，而是残留，并且在最终提取物中以高浓度存在，表明冷水脱盐热水提取物可用作具有抗高血压功效的功能增强的营养组合物。
3-4：α-葡糖苷酶抑制活性
碳水化合物消化酶麦芽糖酶、蔗糖酶和葡糖淀粉酶存在于小肠的刷状缘中，其也称为α-葡糖苷酶。抑制这些酶的过量活性阻断了二糖和多糖分解成单糖，从而延迟了血糖水平的过度升高。α-葡糖苷酶活性的抑制已被用作测量抗糖尿病功效的工具。
使用略经改良的Ove方法(Ove,N.；Cowell,G.M.；Tranum-Jenser,J.Hansen,O.；Welinder,K.G.J.Biol.Chem.261:12306-12309,1986)测定α-葡糖苷酶活性。
向96孔微孔板中加入20μl各种浓度(0.25、0.5和1.0mg/ml)的每种样品，20μlα-葡糖苷酶(Sigma Co.，USA，2单位/ml)和180μl 100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，然后在37℃预温育10分钟。然后，加入30μl 20mM对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖的底物溶液，使混合物在37℃反应30分钟。为了评价α-葡糖苷酶活性的抑制，将葡萄糖氧化酶-过氧化物酶试剂加入到96孔板中的180μl反应混合物中以产生过氧化氢，其与ο-联茴香胺反应形成有色产物。在540nm处测量颜色强度，并将反应混合物的吸光度与不含样品的对照物的吸光度进行比较。作为阳性对照，使用0至10μg/ml的阿卡波糖(Sigma Co.，USA)。
α-葡糖苷酶活性的抑制(％)＝(1-As/Ac)×100(％)
Ac：对照的540nm吸光度
As：样品的540nm吸光度
哺乳动物α-葡糖苷酶是消化酶，其存在于沿小肠绒毛排列的分化肠细胞的刷状缘膜上。α-葡糖苷酶刺激低聚糖和多糖形式的膳食碳水化合物水解成单糖，以使它们被吸收。α-葡糖苷酶的活性升高增加了这种消化，从而增加了葡萄糖吸收速率，引起高血糖症。α-葡糖苷酶抑制剂延缓小肠中碳水化合物的消化，从而降低餐后血糖水平，同时延迟由高血糖水平诱导的胰岛素分泌。
市售的α-葡糖苷酶抑制剂包括阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖，它们已用于治疗2型糖尿病。据报道，异鼠李素-β-D-吡喃葡萄糖苷是从海蓬子提取物中分离的抗氧化剂黄酮类葡萄糖苷，具有抗糖尿病功效。
如图8所示，比较例1的盐生植物样品(未脱盐的热水提取物)表现出约15.2-40.2％的α-葡糖苷酶抑制作用，而发现实施例3的盐生植物样品(冷水脱盐的热水提取物)对α-葡糖苷酶的抑制活性显著增加(来自海蓬子、天门冬碱蓬和S.japonica的样品分别有70.8％、76.3％和65.2％的抑制)。这些结果表明，当盐生植物粉末在冷水中短时间脱盐时，α-葡糖苷酶抑制物质(可能主要以黄酮类葡萄糖苷和皂苷的形式存在)不会被洗脱而是残留，并且以高浓度存在于最终提取物中，表明冷水脱盐的热水提取物可用作具有抗糖尿病功效的功能增强的营养组合物。
实施例4：从盐生植物中冷水提取的盐替代物的制备
将100g盐生植物干燥粉末(海蓬子、天门冬碱蓬和七面草)加入2升冷水(4℃)中，以300rpm搅拌4分钟，并以10,000rpm离心20分钟。分离出含盐量高的上清液，同时从中回收脱盐沉淀物。根据与上述相同的方法，将沉淀物再次在冷水中再次脱盐，并回收第二脱盐沉淀物。将第二上清液与第一上清液合并，并在90℃下真空浓缩，以获得18至19％的盐度，并且总固体含量为约26至28％。之后，以基于总固体含量的5％的量使用活性炭来纯化浓缩物，并使用喷雾干燥器(EYELA Spray Dryer SD1-1000，日本)喷雾干燥，从而产生盐生植物来源的冷水提取盐替代物。然后评价冷水提取盐替代物的总盐、阳离子和谷氨酸含量，结果列于下表6中(该分析在韩国食品工业协会的研究所进行)。
与韩国专利号10-0784229的热水提取盐相比，发现了冷水提取的盐替代物具有低有机物含量同时具有高含量的氯化钠和谷氨酸，这有助于获得具有可口(鲜味)的清爽咸味。特别是，在阳离子中，钠与钾的比例大于10:1(Na:K)，因此发现本发明的冷水提取盐替代物具有高的钠/钾比。这些结果表明，短时间的冷水提取仅促进钠，与其它盐不同，其水溶性不受水温的影响，同时允许其它阳离子保留在脱盐粉末中(参见表2)。而且，与常规的热水提取盐相比，发现谷氨酸含量显著增加。该结果来自于其性质，由于谷氨酸是高度水溶性的酸性氨基酸，因此与包括其它氨基酸的其它有机物质不同，即使在冷水中短时间搅拌的条件下也容易洗脱。除此结果外，它还是在纯化过程中不吸附在活性炭上的极性化合物。因此，本发明只从盐生植物中有效地除去氯化钠组分，以获得来自盐生植物的功能增强的脱盐营养组合物，并使脱盐残渣能够产生具有带可口(鲜味)味道的清爽咸味的纯植物盐。因此，本发明是一种能够完全(100％)利用盐生植物的创新方法。
表6
Figure GDA0001877036770000301
试验例4：评价来自盐生植物的功能增强的脱盐营养组合物的抗肥胖作用
参见表2，发现通过盐生植物的脱盐在脱盐营养组合物(脱盐粉末)中总碳水化合物含量增加约1.85-2.06倍。分析这些碳水化合物，发现其在海蓬子、天门冬碱蓬和七面草粉末中由约95％或更多的膳食纤维组成。下表7显示了脱盐前后盐生植物粉末的膳食纤维含量。膳食纤维含量包括可溶性和不溶性膳食纤维(该分析在韩国食品工业协会的研究所进行)。
表7
Figure GDA0001877036770000311
研究了源自海蓬子的脱盐营养组合物(脱盐粉末)的抗肥胖功效，其具有大量膳食纤维以及多酚和黄酮类。
试验例4-1：由高脂肪饮食诱导的肥胖的Sprague-Dawley大鼠中源自海蓬子的脱盐营养组合物的体重减轻效果的评价
通过冷水脱盐工艺，除去95％或更多的钠并且富含膳食纤维、多酚和黄酮类的海蓬子的脱盐粉末(脱盐营养组合物)被评价为具有抗肥胖功效。使用实施例2中制备的脱盐海蓬子粉(DSP)在高脂肪饮食诱导的肥胖Sprague-Dawley(SD)大鼠中进行评价，未脱盐的海蓬子粉(SP)作为比较对照，并且作为阳性对照的是常用的天然抗肥胖物质藤黄提取物(GE)，它是一种来自藤黄果的根提取物。SD大鼠随机分为5组，每组10只，如下：G1：正常对照组，G2：高脂肪饮食诱导的肥胖对照组，G3：使用200mg/kg海蓬子粉(SP)，G4：使用200mg/kg脱盐海蓬子粉(DSP)，和G5：使用200mg/kg藤黄提取物(GE)阳性对照组。
图10显示了经12周后五组中大鼠的平均体重的变化。图11显示了在6周和12周时大鼠体重的统计分析结果。如图10所示，与正常对照组相比，喂食高脂肪饮食的肥胖对照组大鼠在3周或4周开始体重增加，并且在6周时，肥胖对照组的体重相比正常对照组显著增加(p<0.05)。发现使用200mg/kg脱盐海蓬子粉(DSP)的组的体重显著低于肥胖对照组的体重(p<0.05)。相反，在6周时，发现使用200mg/kg未脱盐海蓬子粉(SP)的组的体重显著高于正常对照组(p<0.05)。这些结果表明，与未脱盐海蓬子粉(SP)相比，脱盐海蓬子粉(DSP)具有非常优异的抗肥胖效果。
在使用后第8、9和10周，与正常对照组相比，肥胖对照组体重显著增加(p<0.001)，并且接受脱盐海蓬子粉(DSP)的组的体重为与肥胖对照组相比，保持在显著低水平(p<0.001)，而接受藤黄提取物(GE)的阳性对照组的体重也明显较低(p<0.05)。相比之下，与正常对照组相比，接受未脱盐海蓬子粉(SP)组的大鼠的体重显著高，其中未诱导肥胖(p<0.01)，同时与诱导肥胖的对照组相比体重降低。在给药后第11周和第12周，肥胖对照组、使用200mg/kg未脱盐海蓬子粉(SP)的组和阳性对照组中的大鼠的体重与正常对照相比明显较高(p<0.01或p<0.05)，而与诱导肥胖的对照组相比，使用200mg/kg脱盐海蓬子粉(DSP)组和阳性对照组的大鼠体重明显较低(分别为p<0.001和p<0.01)。总之，对于测试样品在高脂肪饮食诱导的肥胖SD大鼠中的体重减轻效果，脱盐海蓬子粉(DSP)表现出最优异的减轻体重的作用，其在统计学上比阳性藤黄提取物(GE)对照组明显更高(p<0.001)。相反，未脱盐海蓬子粉(SP)显示肥胖大鼠体重略有下降，但这种下降明显低于DSP。这些结果被认为是由于与脱盐的海蓬子粉相比，未脱盐的海蓬子粉被发现具有低含量的抑制脂质合成的膳食纤维以及多酚和黄酮类，同时具有高含量氯化钠，氯化钠和这种成分可以作为诱导肥胖的潜在因素。因此，氯化钠被除去并富含膳食纤维和功能性化合物的脱盐海蓬子粉可以是对抑制肥胖非常有效的功能性物质。
试验例4-2.在由高脂肪饮食引起的肥胖的SD大鼠中源自海蓬子的脱盐营养组合物的体脂减少效果的评价
4-2-1.生化血液测试和体脂分析
诱导肥胖12周后，从所有大鼠的颈静脉采集约1ml的血液样品，注入含有凝块活化剂的真空管中，并在室温下保持15至20分钟以使凝固。然后将血液样品以3,000rpm离心10分钟以获得血清。此后，使用血液生化分析仪(7020 hitachi，日本)分析血清的丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和动脉粥样硬化指数(AI)。结果列于下表8中。
表8
Figure GDA0001877036770000331
数据表示为平均值±SD(n＝10)。通过单向ANOVA和Dunnett多重比较分析NC组和HFD组之间以及HFD+SP200、HFD+DSP200和HFD+GE200之间差异的显著性。
*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001
如表8所示，在使用后12周，用高脂肪饮食(HFD)诱导的肥胖对照组(HFD)和HFD+SP200组(其使用HFD加200mg/kg未脱盐海蓬子粉(SP))的AST水平，显著高于正常对照组的AST水平(NC)(p<0.01和p<0.001)。HFD+DSP200组使用HFD加200mg/kg脱盐海蓬子粉(DSP)，与HFD组相比，其显示出显著较低的AST水平(p<0.01)。在TG和TC的血清水平中，HFD组、HFD+SP200组和阳性对照组(HFD+GE200)与正常对照组(NC)相比显示出显著增加(p<0.001，p<0.01和p<0.05)，而HFD+DSP200组和阳性对照组(HFD+GE200)与HFD组相比显示出显著降低(p<0.001和p<0.01)。在LDL水平中，HFD组、HFD+SP200组和阳性对照组(HFD+GE200)与正常对照组(NC)相比显示出显著增加(p<0.001和p<0.01)。在VLDL和ALT水平中也类似地观察到这种趋势。也就是说，在高脂肪饮食诱导的肥胖大鼠中，发现脱盐海蓬子粉(DSP)的使用显著降低由高脂肪饮食引起的血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和LDL的高血浆水平增加以及肝脏脂肪变性引起的ALT和AST水平升高，这些降低高于阳性对照藤黄提取物(GE)。减少在血中的脂肪水平和ALT与AST水平的这种效应与使用未脱盐海蓬子粉(SP)的组中也观察到，但是相比于脱盐海蓬子粉(DSP)的作用是显著较低。
4-2-2.使用Micro-CT测量腹部脂肪量
在诱导肥胖后12周，在尸体解剖之前，通过Micro-CT(vivaCT 80，SCANCOMedical，瑞士)扫描所有大鼠以测定腹部脂肪体积(图12A)。为了测量腹部脂肪，在第二腰椎的上边缘和第五腰椎的下边缘之间的空间中存在的腹部区域(L2-L5)进行扫描。在使用后12周，高脂肪饮食诱导的肥胖对照组(HFD)和使用未脱盐海蓬子粉(SP)的HFD+SP200组的总腹部脂肪量显著增加，正常对照组(NC)(p<0.01和p<0.05)与使用脱盐海蓬子粉(DSP)的HFD+DSP200组和阳性对照组(HFD+GE200)中总腹部脂肪体积显著降低(p<0.01和p<0.05)(图12A和12B)。
如图12C所示，与正常对照组(NC)相比，HFD组、HFD+SP200组和阳性对照组(HFD+GE200)中内脏脂肪体积被发现显著增加(p<0.01)，而与HFD组和HFD+SP200组相比，HFD+DSP200组中内脏脂肪体积显著降低(p<0.01)。如图12D所示，与正常对照组(NC)相比，HFD组和HFD+SP200组中皮下脂肪体积被发现显著增加(p<0.01和p<0.05)，而与HFD组相比HFD+DSP200组和阳性对照组(HFD+GE200)中皮下脂肪体积显著减少(p<0.01和p<0.05)。
4-2-3.统计分析
对于本实验的结果，在假设数据正态性的情况下应用参数单向ANOVA检验。通过Levene检验测试方差的同质性。使用ANOVA结果显著且方差相等的Duncan多范围检验和方差不相等的Dunnett T3检验确定测试组之间的显著差异。统计分析通过SPSS Statistics18.0K进行，P<0.05的值被认为具有统计学意义。
综合高脂肪饮食诱导的肥胖SD大鼠的实验结果，a)与肥胖诱导的对照组相比，脱盐海蓬子粉(DSP)显著降低了体重；b)有效降低血脂水平(TG、TC、LDL和VLDL)，血ALT和AST水平以及动脉粥样硬化指数(AI)；c)如测试动物的Micro-CT扫描结果所示，与诱导肥胖的对照组相比，显著降低了体脂、腹脂和皮下脂肪。因此，与未脱盐海蓬子粉(SP)相比，发现脱盐海蓬子粉(DSP)具有显著优异的减轻体重和抑制体脂积累的作用，并且这种作用高于阳性对照藤黄提取物(GE)的作用。
试验例5：有效抑制源自海蓬子的脱盐营养组合物中脂肪细胞分化的标记化合物的测定
5-1.从源自海蓬子的脱盐营养组合物中分离主要有效标记化合物
向100g根据实施例2的方法制备的来自海蓬子的脱盐营养组合物(脱盐粉末)中加入1L蒸馏水和两种消化酶，即淀粉酶和蛋白酶。在37℃温育6小时后，将组合物以10,000g离心25分钟。将上清液真空浓缩并冷冻干燥。将通过用消化酶处理脱盐的海蓬子粉末得到的15.9g样品(DSP-EW)溶解在甲醇中，然后通过高效液相色谱(Agilent HPLC，USA)分析甲醇可溶性组分。如图13A所示，在保留时间11.3分钟附近观察到主峰化合物(化合物1)。该峰组分的UV光谱(λmax：218-220,240,285-290sh,325)显示出典型的苯丙烷酚酸性质。因此，将HPLC保留时间和UV光谱与几种苯丙烷酚酸(Sigma Co.,USA)的标准进行比较。结果，化合物1被鉴定为反式阿魏酸(图13B)。
之后，从1g DSP-EW样品的甲醇可溶性组分中，通过制备型高效液相色谱(YMC-HPLC，日本)纯化反式阿魏酸，并用于3T3-L1细胞的实验中。在该实验中使用的分析型HPLC***是配备有Zorbax Eclipse C18柱(5μm，4.5×250mm，Agilent)和1200DAD检测器的1260型(Infinity，Agilent，USA)。在制备型HPLC中使用配备有制备柱(Triart C18,20mm×150mm,5μm,YMC,YMC，日本)的模型(Triart C18,20mm×150mm,5μm,YMC,日本)。在流速为15ml/min的甲醇和三蒸水作为流动相的梯度条件下进行制备型HPLC，使用设置在三个波长(即210、254和320nm)的YMC UV-3400UV检测器，并且纯化四个级分。如图13C所示，发现主峰(化合物3)是反式阿魏酸，并且最终得到230mg。发现另外三个峰1、2和4分别为咖啡酸、对香豆酸和异鼠李素-3-β-D-葡萄糖苷。
5-2.源自海蓬子的脱盐营养组合物中纯化的反式阿魏酸的脂肪细胞分化抑制作用
5-2-1.3T3-L1前脂肪细胞的分化
使用3T3-L1细胞作为脂肪细胞分化的体外模型，评价脱盐的海蓬子粉末的主要标记物组分反式阿魏酸(TFA)对脂肪细胞分化的抑制作用。每8小时检查3T3-L1前脂肪细胞的污染，以提高实验的可信度。繁殖初级前脂肪细胞，然后用含有3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、***和胰岛素的培养基诱导分化。在分化诱导期间，培养基每三天更换两次。
5-2-2.油红O染色和检测细胞内甘油三酯的形成
诱导分化后，对3T3-L1细胞进行油红O染色，以检测细胞内脂滴的存在。首先，从每个孔中弃去培养基，并用4％多聚甲醛固定细胞。随后，用100％1,2-丙二醇脱水溶液洗涤细胞5分钟，然后用油红O染色溶液染色。在油红O染色后，向每个孔中加入85％1,2-丙二醇染色差异溶液用于细胞洗涤。最后，向每个孔中加入蒸馏水以防止染色的细胞干燥，并在显微镜下观察细胞以确定脂质积累。
图14A显示油红O染色的结果，以确定在3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化期间脂滴的形成，从而研究反式阿魏酸(TFA)对脂肪细胞分化的抑制作用。如图14A所示，发现TFA在所用浓度内以剂量依赖性方式抑制脂肪细胞分化和脂滴形成。特别地，在5μM和10μM的浓度下，与脂肪细胞分化诱导的对照(MDI)相比，TFA表现出非常显著的抑制(##p<0.01和###p<0.001，参见图14B)。
另外，作为脂肪细胞分化的标记，研究了细胞内甘油三酯的形成。如图14C所示，TFA以各种浓度，即1、2、5和10μM，以剂量依赖性方式减少细胞内甘油三酯的形成。特别是，在浓度为5μM和10μM的TFA时，与分化诱导的对照(MDI)相比，甘油三酯的形成被非常显著地抑制(###p<0.001)。这些结果表明TFA通过抑制分化相关蛋白表达抑制脂肪细胞分化，并最终减少由脂肪细胞分化引起的脂质合成。
5-2-3.用于检测参与脂质代谢的转录因子实时RT-PCR
PPARγ、FAS、SREBP-1和C/EBPα是参与脂质代谢的转录因子，并且在3T3-L1前脂肪细胞分化成成熟脂肪细胞时产生。C/EBPα和PPARγ协同加速脂肪生成。当前脂肪细胞增殖至早期分化阶段时，诱导C/EBPα并刺激PPARγ以诱导成熟的分化阶段。PPARγ主要存在于脂肪组织中并调节整体脂质形成，其在脂肪细胞分化中的能力比其它转录因子好得多。当脂肪细胞分化到达晚期时，FAS可用作标记基因，并且它是参与脂质代谢的脂质合成酶。FAS在脂肪组织中表达最强，是脂肪分化的最后的因子。因此，FAS是抗肥胖效应的代表性标志物，并且由SREBP-1诱导，SREBP-1是早期的转录因子。
进行实时RT-PCR以研究反式阿魏酸(TFA)对涉及脂质代谢的转录因子在mRNA表达水平方面的影响。从对照组中分离总RNA，每个测试组用不同浓度的TFA(easy-Blue，iNtRon，INC，Daejeon，韩国)处理，并以相同浓度稀释，并使用稀释的RNA样品进行cDNA合成(cDNA逆转录试剂盒，Applied Biosystems，CA，USA)。使用下表9中列出的引物，通过实时RT-PCR分析合成的cDNA的基因表达。
表9
Figure GDA0001877036770000371
简而言之，在用不同浓度(即1、2、5和10μM)的TFA处理3T3-L1前脂肪细胞后，使用表9的引物，进行实时qRT-PCR(CFX96实时PCR检测***，Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)。PCR条件包括在5℃下变性3分钟，45次95℃下5秒和60℃下20秒的循环，并加热至95℃(通过以0.2℃/15秒的速度升温)终止反应。如图15所示，与分化诱导的对照(MDI)相比，FAS和SREBP-1基因表达以剂量依赖性方式降低，在10μM的TFA下达到最大降低，在2μM和5μM的TFA下显著降低。与分化诱导的对照(MDI)相比，在5μM和10μM的TFA下，C/EBPα基因表达以剂量依赖性方式显著降低。此外，PPARγ基因表达在10μM的TFA下显著降低。总之，发现TFA有效抑制参与脂质代谢的四种转录因子PPARγ、FAS、SREBP-1和C/EBPα的基因表达(***p<0.001)，从而抑制脂肪细胞分化和脂质积累。因此，含有TFA作为有效成分的脱盐海蓬子粉末(DSP)可以通过抑制脂肪细胞分化和脂滴形成来有效地减少体脂，并且可能最终导致体重降低，因此具有作为用于预防和/或治疗肥胖症的功能性食品和饲料应用的潜力。
5-2-4.统计分析
使用单向ANOVA分析分析数据，并且P<0.05的值被认为是统计学显著的。
在上文中，本发明已经参考其具体实例详细描述。尽管为了说明的目的公开了本发明的优选实施方案，但是本领域技术人员将理解，在不脱离所附权利要求中公开的本发明的范围和精神的情况下，可以进行各种修改、添加和替换。因此，本发明的实际范围将由所附权利要求及其等同物限定。
工业适用性
源自盐生植物的功能增强的脱盐营养组合物可以开发为药物组合物和功能性食品和饲料，用于对抗肥胖和减少体脂肪。

Claims (11)

1.一种从盐生植物制备功能增强的脱盐营养组合物的方法，包括以下步骤：
(a)将所述盐生植物的干燥粉末与4～9℃的水混合并搅拌所得混合物；
(b)离心搅拌的混合物并去除具有高盐含量的上清液以回收脱盐沉淀物；以及
(c)干燥所述脱盐沉淀物。
2.一种由权利要求1所述的方法制备的来自脱盐的盐生植物的功能增强的营养组合物，基于干重包含：
反式阿魏酸、
0.1～3.0wt％的钾、
0.1～2.0wt％的钙、
0.1～1.5wt％的镁、
0.04～6.8wt％的钠、和
61wt％或更高的碳水化合物。
3.根据权利要求2所述的来自脱盐的盐生植物的功能增强的营养组合物，其特征在于，基于所述干重包含0.1-10.0wt％的多酚和0.1-7.0wt％的黄酮。
4.根据权利要求2所述的来自脱盐的盐生植物的功能增强的营养组合物，其特征在于，基于所述干重包含0.3-10.0wt％的叶绿素。
5.一种从盐生植物制备功能增强的脱盐提取物的方法，包括以下步骤：
(a)将所述盐生植物的干燥粉末与4～9℃的水混合并搅拌所得混合物，
(b)离心搅拌的混合物并去除具有高盐含量的上清液以回收脱盐沉淀物；
(c)在液相中提取所述脱盐沉淀物以获得提取物；和
(d)干燥液相提取物。
6.根据权利要求5所述的从盐生植物制备功能增强的脱盐提取物的方法，其特征在于，还包括在液相中提取脱盐沉淀物之前干燥所述脱盐沉淀物。
7.一种由权利要求5所述的方法制备的来自盐生植物的功能增强的脱盐提取物，从所述盐生植物的脱盐产物中提取，并且基于干重，
总的盐含量小于6.0wt％，
不溶性膳食纤维小于3.2wt％，且
包含0.1-10.0wt％的多酚和0.1-7.0wt％的黄酮。
8.根据权利要求7所述的来自盐生植物的功能增强的脱盐提取物，其特征在于，基于所干重包含0.3-10.0wt％的叶绿素。
9.一种用于对抗肥胖和减少体脂的药物组合物，包含权利要求2～4之任一项所述的来自脱盐的盐生植物的功能增强的营养组合物。
10.一种用于对抗肥胖和减少体脂的功能性食品，包含权利要求2～4之任一项所述的来自脱盐的盐生植物的功能增强的营养组合物。
11.一种用于对抗肥胖和减少体脂的饲料，包含权利要求2～4之任一项所述的来自脱盐的盐生植物的功能增强的营养组合物。
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