CN108588072B - 一种棉铃虫CYP4L11基因的dsRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及农业害虫防治领域，具体地，涉及一种棉铃虫CYP4L11基因的dsRNA及其应用。本发明的棉铃虫CYP4L11基因的dsRNA，其中一条链的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有至少80％的同源性。本发明还提供了所述dsRNA的编码基因。本发明还提供了所述dsRNA或其编码基因在防治棉铃虫方面的应用。本发明通过RNAi手段干扰细胞色素P450酶，增加棉铃虫对棉酚的敏感性，可以做到对棉铃虫特异、绿色防控。
Description
技术领域
本发明涉及农业害虫防治领域，具体地，涉及一种棉铃虫CYP4L11基因的dsRNA及其应用。
背景技术
棉铃虫是世界范围内的一种杂食性害虫，严重危害了我国农作物的产量和质量。目前控制棉铃虫主要是通过种植转基因棉以及施用农药这两种手段，但是随着转基因棉种植范围的扩大，许多地区的棉铃虫已经对转基因棉花产生抗性，防治棉铃虫仍然要依赖化学农药。然而大量化学农药的施用会引起害虫抗药性增强，同时污染环境、破坏生态甚至会带来一系列的食品安全问题。所以发展环境友好型、靶标特异的害虫防治策略已经迫在眉睫。
双链RNA(dsRNA)介导的基因沉默通常称为RNA干扰(RNAi)，其作用机制是通过阻止同源基因的翻译或者转录而实现基因沉默。RNAi技术具有特异性高、操作方便等特点，已经在农业害虫防治中得到了应用。例如：Baum等(2007)通过转基因玉米表达液泡ATP酶基因dsRNA，导致取食转基因玉米的玉米根叶甲发育迟缓、死亡率升高；Mao等(2007)研究发现棉铃虫取食表达dsCYP6AE14的转基因棉花后，幼虫出现生长发育迟缓，最后死亡的现象。由此可见RNAi技术防治农业害虫具有可行性。
棉酚是棉花产生的植物次生代谢物之一，对许多生物体具有毒性。在棉酚胁迫下，棉铃虫通过诱导高表达包括细胞色素P450在内的解毒代谢酶等方式来进行自我保护。细胞色素P450酶系是一种广泛存在于生物体中的多功能氧化酶，可以代谢多种内源、外源化合物。因此，通过干扰关键CYP基因的表达，增加棉铃虫对棉酚的敏感性，可以达到防控棉铃虫的目的。
发明内容
针对现有技术不足，本发明的一个目的是提供一种棉铃虫CYP4L11基因的dsRNA。
本发明的棉铃虫CYP4L11基因的dsRNA，其特征在于，所述dsRNA的其中一条链的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有至少80％的同源性。进一步优选地，所述dsRNA的其中一条链的核苷酸序列与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有至少95％的同源性。
本发明还提供了上述dsRNA的编码基因。例如但不限于，核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示的编码基因。
本发明还提供了含上述dsRNA或其编码基因的重组表达载体、重组微生物(例如重组菌株)、转基因细胞系、转基因植物或试剂盒(例如含上述dsRNA或其编码基因表达盒的表达试剂盒)等产品。
本发明还提供了上述dsRNA的制备方法，包括以下步骤：
1)取棉铃虫总RNA，通过RT-PCR得到cDNA；
2)通过PCR技术扩增目的基因片段：设计带有T7序列的特异性引物，以第一步得到的cDNA为模板，得到带有T7序列和目的基因片段的PCR产物；
3)采用试剂盒T7High Yield RNA Transcription Kit制备dsRNA。
具体地，本发明中利用生物信息学技术，分析了棉铃虫不同寄主处理下的转录组，并获得了CYP4L11基因然后按下面循序进项(1)取棉铃虫总RNA，通过RT-PCR得到cDNA；(2)设计带有T7序列的特异性引物；(3)通过PCR技术扩增目的基因片段：以第一步得到的cDNA为模板，第二步设计的特异引物扩增，得到带有T7序列和目的基因片段的PCR产物；(4)采用试剂盒T7High Yield RNA Transcription Kit制备dsRNA；(5)进行显微注射实验把靶标dsRNA传递到体内；(6)人工饲料的配制；(7)将注射后棉铃虫幼虫饲喂到含有棉酚的人工饲料中，测量体重变化。
本发明通过注射法将dsRNA传递到棉铃虫幼虫体内，绿色荧光蛋白(GFP)作为对照，注射后幼虫饲喂在含有0.1％棉酚的人工饲料上，记录3天后体重增长变化。结果发现实验组幼虫体重增长明显受到抑制，荧光定量PCR结果证实靶标基因明显被沉默，另外通过试验也证实沉默靶标基因并不会影响昆虫自身的生长发育。本发明为将来棉铃虫RNA干扰(RNAi)介导的害虫防治策略提供了效果较好的候选基因，同时本发明为将来的田间应用提供理论依据。
本发明的另一目的是提供上述dsRNA或上述编码基因在防治棉铃虫方面的应用。该应用优选通过注射法将dsRNA注射到棉铃虫的幼虫体内实现。优选注射计量为每只幼虫约2.5-5μg。
本发明的应用除注射外，还可以通过其它方式实现。例如但不限于通过饲喂的方式导入虫体，饲喂包括直接dsRNA饲喂，也包括饲喂表达该dsRNA的菌液。再或者，可以将dsRNA导入转基因棉花，做成植物源表达的dsRNA。
本发明的另一目的是提供上述重组表达载体、重组微生物、转基因细胞系、转基因植物或试剂盒在防治棉铃虫方面的应用。
现有技术主要是通过化学农药对棉铃虫进行防治，一方面容易引发害虫的抗药性，另一方面污染环境。棉酚作为自然界本身存在的植物次生物质，利用其具有毒性的特点进行害虫防治，可以做到绿色无公害。本发明通过RNAi手段干扰细胞色素P450酶，增加棉铃虫对棉酚的敏感性，可以做到对棉铃虫特异、绿色防控。
附图说明
图1为本发明实施例中dsRNA(dsCYP4L11)注射后，饲喂0.1％棉酚3天后体重增长变化，以注射dsGFP为对照。
图2为本发明实施例中棉铃虫CYP4L11基因dsRNA对其靶标基因的干扰效率。
图3为本发明dsRNA(dsCYP4L11)注射后，饲喂正常饲料3天后体重增长变化，以注射dsGFP为对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1CYP4L11基因克隆
1.利用本实验室已经测定的棉铃虫取食不同寄主植物的转录组，结合NCBI Blast等程序，确定了棉铃虫CYP4L11基因。
2.供试昆虫
棉铃虫室内饲养品系(96S)最初于1996年采集自中国农业科学院新乡实验基地，人工饲料饲养至今。饲养条件为温度27±2℃，相对湿度75％±10％，光周期14L：10D，成虫羽化后饲喂配制的10％糖水。
3.RNA提取
将收集的幼虫、蛹和成虫，液氮研磨，取50-100mg粉末转移至1.5ml RNase-free离心管中，加入1mL Trizol，充分混匀。将收集到的组织放入离心管中，加入200μL Trizol，然后用塑料研磨棒进行研磨，研磨彻底后补加800μL Trizol。
室温孵育5min，以利于匀浆样品中核蛋白体完全分离。加入200μL氯仿，震荡15s，室温静置5min。然后在12000rpm、4℃条件下离心15min；取上清400μL于新的离心管中，随后加入等体积的异丙醇，上下颠倒至充分混匀，室温静置10min，在12000rpm、4℃条件下离心10min；弃上清，加入1mL 75％乙醇轻轻洗涤，随后12000rpm、4℃条件下离心5min；去除上清液，室温干燥沉淀后，加入50-150μL无核酶水充分溶解。
4.第一链cDNA的合成
使用反转录试剂盒TransScript One-step gDNA Removal and cDNA SynthesisSuperMix，按照其操作说明对提取的总RNA合成第一链cDNA。具体操作如下：
配置体系如下表1所示：
表1
轻轻混匀，42℃下孵育15分钟；85℃加热5秒失活反转录酶。反应完毕后，于-80℃超低温冰箱保存。
实施例2dsCYP4L11的制备
5.靶标基因dsRNA的制备
选取GFP基因(绿色荧光蛋白)作为对照基因，该基因在昆虫体内并不存在，且大量研究均采用GFP作为对照基因合成dsRNA。
1)靶标基因引物的设计：
利用BLAST检索数据库，搜索棉铃虫相近物种同一靶标基因的氨基酸序列，通过对实验室测定的转录组数据进行本地比对，确定所选基因的序列。所选CYP4L11基因序列如SEQ ID NO.3所示。
SEQ ID NO.3：
根据靶标基因的序列，采用引物设计软件Primer Premier 5设计带有T7启动子的引物，送至上海生工进行引物合成。靶标基因引物序列如下表2所示：
表2
2)目的片段PCR扩增及dsRNA的制备
以棉铃虫cDNA为模板，用FastPfu酶扩增基因。反应体系如下表3所示：
表3
以上反应液混匀之后，短暂离心，然后于PCR仪中按如下程序(见表4)进行反应：
表4
PCR扩增完成后，按照Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒说明书回收PCR产物。随后，参照南京诺唯赞公司的T7High Yield RNA Transcription Kit使用说明书合成dsRNA，反应体系如下表5所示：
表5
移液枪轻轻混匀各组分，短暂离心，37℃孵育4h。在反应体系中加入1μL的DNaseI，37℃孵育15min，消化转录的DNA模板。合成的dsRNA经电泳分析、纯化后保存备用。合成的RNA序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
编码其的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2：
实施例3dsCYP4L11的注射实验
6.dsRNA注射
挑选同一天体型均匀的3龄幼虫，置于冰上。通过拉针仪拉出的毛细管将2.5μg的dsRNA注射到幼虫的腹部倒数第二与第三足节间处。每处理注射24头幼虫，三次重复，注射dsGFP作为对照。
6.1注射dsRNA后棉铃虫取食棉酚饲料体重增长测定
注射后的幼虫单头放置在装有正常饲料的24孔板中恢复24小时，然后称取体重记录M1，转移至含有0.1％的棉酚饲料中，72小时后称取M2。结果发现，注射dsCYP4L11的幼虫体重增长与对照组(dsGFP)相比明显受到抑制(p<0.05)(图1)。
6.2沉默效率检测
dsRNA注射24小时、72小时后，准备样品并利用qPCR技术检测标靶基因的沉默效率，CYP4L11的荧光定量引物设计如下：q-CYP4L11-F：CGCTAATATAACTGCTCTT；q-CYP4L11-R：ACCTTCATCGTCTATCTT，内参基因选择β-actin：q-β-actin-F：CCTGGTATTGCTGACCGTATGC；q-β-actin-R：CTGTTGGAAGGTGGAGAGGGAA。所有检测包括3个生物学重复，每个重复包含5个样品，利用SPSS软件的独立样本t测验进行差异显著性分析(图2)。
结果显示，dsRNA注射24小时后，靶标基因沉默效率达到50％，针对鳞翅目来讲，沉默效率良好。dsRNA注射72小时后，无显著沉默效应。
6.3目的基因对昆虫生长发育的影响
靶标基因dsRNA注射后，同dsGFP一起饲喂正常饲料，观察体重变化，3天后发现两种体重增长无显著差异，排除了靶标基因自身参与调节棉铃虫幼虫生长发育的可能(图3)。上述结果表明，棉铃虫基因CYP4L11参与了棉酚的解毒代谢过程。
当然，本发明还可以有多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明的公开做出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明的权利要求的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院深圳农业基因组研究所
<120> 一种棉铃虫CYP4L11基因的dsRNA及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 448
<212> RNA
<213> Artificial
<400> 1
gcauccaagg caacaauagg ggucauauca auugguuguc cguuggccag accccgcagu 60
uuaucuguca aauaucucug auucuugcaa aauacuggca agaaguuuug caguauauug 120
aaguggaagg cggguguuaa gaaucuccuu ugagucuucc acaucuggcc ugucgauguc 180
aguagaccua gaccaagcca guuuaauagg aagucguagg uccugccuuu ugugaugugc 240
uccgugcuug auauuagugc cucaacauau cuagaguggg uuacaaucac gacaggagug 300
gugaauaaau gcacucugaa cgcaccgcca uacuugcucg ccagucucgc uaacaagucc 360
aacauuucug uugauuuaac aauaaacaga ugugcauuuc ccaauauagg caaaggcgug 420
gguccauuca gguuaaaccg ucggcuuu 448
<210> 2
<211> 448
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
aaagccgacg gtttaacctg aatggaccca cgcctttgcc tatattggga aatgcacatc 60
tgtttattgt taaatcaaca gaaatgttgg acttgttagc gagactggcg agcaagtatg 120
gcggtgcgtt cagagtgcat ttattcacca ctcctgtcgt gattgtaacc cactctagat 180
atgttgaggc actaatatca agcacggagc acatcacaaa aggcaggacc tacgacttcc 240
tattaaactg gcttggtcta ggtctactga catcgacagg ccagatgtgg aagactcaaa 300
ggagattctt aacacccgcc ttccacttca atatactgca aaacttcttg ccagtatttt 360
gcaagaatca gagatatttg acagataaac tgcggggtct ggccaacgga caaccaattg 420
atatgacccc tattgttgcc ttggatgc 448
<210> 3
<211> 1497
<212> DNA
<213> 棉铃虫(Helicoverpa armigera)
<400> 3
aatttttatt ttttcaaaaa aatgattaca ttattaatat gtacggtttt agtgtttgtt 60
ttgttattat catggataaa tttggtgaag gaaagccgac ggtttaacct gaatggaccc 120
acgcctttgc ctatattggg aaatgcacat ctgtttattg ttaaatcaac agaaatgttg 180
gacttgttag cgagactggc gagcaagtat ggcggtgcgt tcagagtgca tttattcacc 240
actcctgtcg tgattgtaac ccactctaga tatgttgagg cactaatatc aagcacggag 300
cacatcacaa aaggcaggac ctacgacttc ctattaaact ggcttggtct aggtctactg 360
acatcgacag gccagatgtg gaagactcaa aggagattct taacacccgc cttccacttc 420
aatatactgc aaaacttctt gccagtattt tgcaagaatc agagatattt gacagataaa 480
ctgcggggtc tggccaacgg acaaccaatt gatatgaccc ctattgttgc cttggatgct 540
cttgataacg tgacagaatc cataatggga gtatgcgtgg atgcacagaa acatcagtct 600
gaatacgtga aaagtatcga agaactgtcc gcaatagtaa cgatgaggat gcaaaatcct 660
ttcatgggcc aagacgctat tttcaatttg ctgccttaca agaagaaaca agagaaagct 720
ttgaagattg tacatggaca gacccataaa gtaattgaag caagacgagc ggaactaaga 780
cgcgctaata taactgctct tcccgacagc aatgatattg gtattaagaa caagcacgca 840
ttcttggacc tgttgctatt agctgaaatg gacggcaaaa agatagacga tgaaggtgtg 900
agggaacagg tcgacacatt catgtttgag ggtcacgaca cgacgacttc aggcattgtg 960
tacacactct actgtctgtc gaaacacaga gatatccaag aaaaaatcta cgaagagctt 1020
caaacaatat tcggcagtga aatggaaaga gaccctacat ataccgaact caaccaaatg 1080
aagtatctgg aattggtgct caaggaatca atgcggctgt tcccaccagt gccactcatc 1140
gagaggaaaa ttttgaggga ttgtgagatt ggaggcttaa cactagtaaa aggcacatcg 1200
gtactgatca acatctacca gatccagagg cagccagagt tgtatgaaaa tcctttagag 1260
ttccggccgg agaggttcga agctccactg aagaacccct tcagttggct ggcatttagt 1320
gctggtccga gaaattgtat aggtcaaaag ttcgcgatga tggaactgaa aataactatc 1380
tctgaaatga tcaaaaactt ctacatactg ccagcacctc aagagcctga actgagcgca 1440
gacctcgtgc taagatctaa gaatggagtc cacatcaaac ttatgcctag gaaataa 1497
Claims (8)
1.一种棉铃虫CYP4L11基因的dsRNA，其特征在于，所述dsRNA的其中一条链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述dsRNA的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
4.含权利要求1所述dsRNA或权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体、重组微生物、转基因细胞系或试剂盒。
5.一种权利要求1所述dsRNA的制备方法，包括以下步骤：
1)取棉铃虫总RNA，通过RT-PCR得到cDNA；
2)通过PCR技术扩增目的基因片段：根据棉铃虫CYP4L11基因序列设计带有T7序列的特异性引物，以第一步得到的cDNA为模板，得到带有T7序列和目的基因片段的PCR产物；
3)采用试剂盒T7 High Yield RNA Transcription Kit制备dsRNA。
6.权利要求1所述dsRNA或权利要求2或3所述编码基因在防治棉铃虫方面的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用通过利用注射法将dsRNA注射到棉铃虫的幼虫体内实现，或者，通过给棉铃虫幼虫饲喂实现。
8.权利要求4所述重组表达载体、重组微生物、转基因细胞系或试剂盒在防治棉铃虫方面的应用；
或者，含权利要求1所述dsRNA或权利要求2或3所述编码基因的转基因植物在防治棉铃虫方面的应用。
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| 利用RNA干扰技术改良植物对昆虫的抗性;毛颖波等;《自然杂志》;20071215(第6期);全文 * |
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