CN108452010A - 一种抗缺血性心脑血管病药丹酚的生产工艺、药物制剂、含量测定法与临床应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了全水溶性丹酚的生产工艺：用5倍量于25℃/80～85℃水快搅拌提取3次(10、5、5min)，合并提取液，精滤，滤液用稀盐酸调至pH3.0‑4.0，静置2～4h，精滤，滤液用氢氧化钠液调pH为5.0‑6.0，过分离2号大孔树脂，水、纯化水、注射水、低浓度乙醇依次洗涤，稀乙醇洗脱，洗脱液调pH为2.0‑2.5，过色谱3号大孔树脂，洗涤后50％乙醇洗脱，喷雾干燥得类白至淡黄色丹酚；公开了注射用丹酚、系列新剂型；用6个对照品按外标法计算含量，其余峰面积之和以丹酚酸B做参照物计算含量，两者之和为丹酚含量；还公开了15mg/kg丹酚预防和治疗缺血性脑卒中疗效明显优于20mg/kg尼莫地平的疗效。

Description

一种抗缺血性心脑血管病药丹酚的生产工艺、药物制剂、含量 测定法与临床应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种抗脑缺血再灌注损伤药丹酚的制备、药物组合物及其含量测定方法与临床应用。

背景技术

近年来，脑卒中发病率逐年升高，是目前三大致死性疾病之一，具有高发病率、高患病率、高死亡率、高致残率、高复发率的特点。脑卒中分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，缺血性卒中发病率远高于出血性卒中，占脑卒中的70％以上，缺血脑组织在一定条件下恢复血液流动，出现了更加严重的脑功能障碍和结构损伤，称之为脑缺血再灌注损伤(Ischemia-Reperfusion Injury，IRI)。治疗缺血性脑卒中的主要途径是疏通脑血管恢复血液供应，而减轻缺血再灌注损伤已成为治疗环节中不可缺少的重要部分。

丹参为唇形科植物丹参(Salviae miltiorrhiza Bunge)干燥根和根茎。味苦，性微寒，归心、肝经。具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈之功效。用于胸痹心痛，脘腹胁痛，瘕瘕积聚，热痹疼痛，心烦不眠，***，痛经经闭，疮疡肿痛。有预防和/或治疗脑缺血、心肌缺血、抑制白内障形成等作用。

发明人已经获得“一种丹参提取物的制备、药物制剂和含量测定方法”专利(专利号：ZL200510037786.5)，该专利工艺沿用了“水煮醇沉”经典工艺中的“水煮”，革除了“醇沉”。因此，本品的质、量和生产工艺等诸方面均与丹参制剂有很大区别，专利提取工艺省，纯度好，得量高、成本低，药品审评中心发文要求重新命名，并要求制定丹酚含量的上下限，经国家食品药品监督管理局核准本品名称定为“丹酚”，以示与已有的丹参制剂区别。但是，工艺中的长时间水煮，不仅耗用大量能源，而且还造成主成分降解。对此，发明人经多年不懈研究和创新，取得了突破性进展：室温/80～85℃超短时间快搅拌提取，首次10min，第2、3次各提取5min，主成分降解减少10～15％，收率提高10％以上，优化了提取用水量，提取效率提高到2.4倍；优化了树脂型号，使纯度提高了20％以上；改变精滤方式，过滤效率提高40倍；改减压热浓缩为稀的纯化液室温过柱富集，进一步节省能源，提取、分离纯化、浓缩全过程都不和/或很少加热，据不完全统计，按全国年产丹参注射剂计算，可节省标准煤58.368万吨，节省人民币63.037亿元，减少排放二氧化碳152.92416万吨、二氧化硫4962.816吨、氮氧化物4319.232吨，大大地降低中药制药行业对环境的污染，产量是原专利的近3倍，实现了丹酚提取工艺绿色化。本专利是前专利的续篇和补充。新专利与原专利相比，主要特点见表1。

表1新专利与原专利的主要区别

丹酚的生产工艺已经试生产放大验证，各关键技术参数重复性好，可行性高，新专利工艺在节能减排，产品纯度，生产周期、成本、质量标准等诸方面取得重大进展，为中药现代化迈出了坚实的一步。

发明内容

本发明已经查明丹参中丹酚各成分及其主成分的生成与转化，不同地域、相似地域不同栽培条件、不同采收季节、不同干燥方式或不同炮制方法生产的丹参，其丹酚各成分的比例和含量是不同的，甚至是大不相同。丹参中主要活性成分丹酚酸B及其相关的大部分成分都是在和/或仅仅在“丹参光合作用终止”即采集后，丹参中某些“小分子底物”在“某种酶”的作用下生成“大分子”丹酚酸B，亦或丹酚酸B再降解生成丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、紫草酸、丹酚酸A等。其合成条件和方法有或利用太阳光强晒，或加热烘干，或加强炮制，或调整提取工艺，改冷提为熱提，可使目标成分达到要求。在诸方法中调整提取温度是最有效、最便捷、最经济的方法。凡此操作均应适度，不能过度，过度了会使相关成分降解而降低。因此，在生产丹酚前进行预试验是必要的，即采集具有代表性的小样适量，粉碎成细粉，秤取丹参粉20g，加水/80～85℃热水100g，室温/低温快速搅拌提取10min，过滤，取滤渣1加水/80～85℃热水100g，室温/低温快速搅拌提取5min，过滤，滤渣2加水/80～85℃热水80g，室温/低温快速搅拌提取5min，过滤，合并三次滤液，放置3～4小时，使冷至室温，精密过滤，精滤液用18％盐酸调pH为3.5～4.0，放置6～15小时，精密过滤，取续滤液20μl注入HPLC色谱仪，记录色谱图，计算丹参中丹酚含量应不低于3.0％，并与对照丹参HPLC指纹图谱比较，相似度应不低于90.0％，符合丹参的企业内控质量标准。

如果丹参粉在80～85℃热搅拌提取结果有明显改善，但仍不符合企业内控标准，则可或适当提高热提温度，或适当延长热提时间，使之达到要求。即使仍达不到企业内控质量标准，如继续处理也可获得合格的丹酚，但收率会明显降低，从经济学考虑，则该丹参不适于作为制备丹酚的原料，甚至不能供药用。

能否获得合格提取液是制备丹酚重要的一步，进一步的工作就是纯化、浓缩和干燥。

一次过柱纯化 上述丹参提取液过2号大孔树脂柱(径高比＝325∶1200)，依次用5BV纯化水、3BV3％乙醇、3BV10％乙醇洗涤，再用3～5BV20％乙醇洗脱，流速为0.3～0.5BV/h，收集含丹酚的洗脱液，用18％盐酸调pH为2.00～2.50，必要时精滤，供二次过柱富集；

二次过柱富集 上述pH为2.00～2.50纯化液过3号树脂柱(径高比＝325∶300)富集(浓缩)，5BV注射用水洗，沥干柱中水，用0.8BV30％醇洗，沥干后，再用2BV50％醇洗脱，收集洗脱液至完，稍浓缩，使丹酚浓度为150～200mg/ml，精密过滤，待喷雾干燥；

喷雾干燥上述浓缩纯化液采用负压喷雾干燥，进风温度为105～110℃，出风温度为75±5℃，喷头转速250～300HZ，进料速度15～30rp/min，得微黄色～黄色粉末状丹酚，秤重，计算收率。

本发明还公开了一组丹参全水溶性成分“丹酚”，而不是丹参中的少数几种含量很少的成分。

本发明还公开了超短时间室温/低温搅拌提取、高效分离纯化、不加热过树脂柱富集，减少热敏药物降解，亦或使制备热敏的纯品成为可能，最大限度使丹酚工艺绿色化。

本发明还公开了如何从一定的不同质量丹参能制备HPLC指纹图谱与对照的丹参HPLC指纹图谱相似度大于90.0％的丹酚的新方法。

本发明公开的丹酚制备方法重现性好，试生产的产品用《中药色谱指纹图谱相似度判断软件》计算，丹酚的指纹图谱与丹参的指纹图谱相似度大于90.0％，而不是几个标志性成分的保留时间或相对保留时间相近似。

本发明还公开了采用不少于6～8个对照品测定丹酚含量的方法，6～8个成分含量之和不少于95％。

本发明还公开了丹酚的新药物组合物及其制备新工艺和新技术。

本发明公开了“丹酚”的新药物组合物在预防和治疗缺血性心血管疾病、脑血管疾病及脑卒中恢复期等方面的临床应用。

附图说明

图1、新鲜丹参室温快速搅拌提取液HPLC图谱(与对照图谱比，明显不相似，未列入计算相似度)。

图2、新鲜丹参加80～85℃热水快速搅拌提取液的HPLC图谱。

图3、丹参煮沸快速搅拌提取液的HPLC图谱。

图4、试生产的“丹酚”HPLC图谱，拟作为说明书摘要附图。

图5、试生产的“丹酚滴丸”的HPLC图谱。

图6、试生产的“注射用丹酚”的HPLC图谱。

图7、丹参水提取液、80～85℃热水快速搅拌提取液、丹参煮沸快速搅拌提取液、丹酚、丹酚滴丸、注射用丹酚的HPLC图谱相似度分析报告。

图8、丹参水煮提液、80～85℃热水快速搅拌提取液、丹酚、注射用丹酚、丹酚滴丸的HPLC图谱相似度计算结果。

注：标准对照HPLC图谱是由9张图谱合成，无法打印，不能提供。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1丹酚的制备

预试验：取青岛产丹参(春季采挖，经加温闷热烘干处理过，放置，粉碎)粉20g，加水100g，室温快速搅拌10min，过滤，滤渣1加水100g，室温快速搅拌5min，过滤，滤渣2加水80g，室温快速搅拌5min，过滤，合并三次滤液，精密过滤，取续滤液20μl注入HPLC色谱仪，记录色谱图，外标法计算丹酚含量为3.35％，并与对照丹参HPLC指纹图谱比较，相似度为98.6％。符合丹参的内控质量标准。

提取 取上述预试验同批的丹参粉50kg，加水250kg，快速搅拌10min，离心甩滤，滤渣1加水250kg，，快速搅拌5min，离心甩滤，滤渣2加水200kg，快速搅拌5min，离心甩滤，合并三次滤液，放置4h，使冷至室温，精密过滤，精滤液用18％盐酸调pH为3.65，放置15h，精密过滤，滤液用10％氢氧化钠液调pH为5.61，待一次过柱纯化。

一次过柱纯化 上述提取液过2号大孔树脂柱(径高比＝325∶1200)，依次用5BV纯化水3BV3％醇、3BV10％醇洗涤，2BV18％醇洗脱，流速500±100ml/min，收集稀醇洗脱液160L，用18％盐酸调节pH为2.2，待二次过柱富集

二次过柱富集 上述纯化液过3号树脂柱(径高比＝325∶300)富集，用5BV注射用水洗涤，沥干柱中水，用0.8BV30％醇洗涤，沥干后，再用1BV50％醇洗脱，收集20L洗脱液，稍浓缩，使丹酚浓度为188mg/ml，精密过滤，待喷雾干燥。

喷雾干燥 上述纯化液负压喷雾干燥，喷雾干燥参数设计：进风温度105℃～110℃，出风温度70±5℃，喷头转速250～300HZ，进料速度15～30rp/min，得黄色粉末，重1.265kg，收率为2.53％。

实施例2丹酚的制备

预试验：取青岛产丹参(秋季采挖，烘干，粉碎)粉20g，加水100g，室温快速搅拌10min，过滤，滤渣1加水100g，室温快速搅拌5min，过滤，滤渣2加水80g，室温快速搅拌5min，过滤，合并三次滤液，精密过滤，取续滤液20μl注入HPLC色谱仪，记录色谱图，外标法计算丹酚含量为2.53％，并与对照丹参HPLC指纹图谱比较，明显不相似。丹酚酸B的含量也明显偏低，不符合丹参的内控质量标准。

另取与预试验同批的青岛产丹参粉20g加80～85℃热水100g，快速搅拌10min，过滤，滤渣1加80～85℃热水100g，快速搅拌5min，过滤，滤渣2加80～85℃热水80g，快速搅拌15min，过滤，合并三次滤液，放冷3～4h，冷至室温，精密过滤，取续滤液20μl注入HPLC色谱仪，记录色谱图，用外标法计算丹参中丹酚含量为3.49％，并与标准对照丹参HPLC指纹图谱比较，相似度为99.83％，符合丹参内控质量标准。

提取 取上述预试验同批的丹参粉50kg，加80～85℃热水250kg，快速搅拌10min，离心甩滤，滤渣1加80～85℃热水250kg，，快速搅拌5min，离心甩滤，滤渣2加80～85℃热水200kg，快速搅拌5min，离心甩滤，合并三次提取滤液，放置4h，使冷至室温，精密过滤，精滤液用18％盐酸调pH为3.65，放置15h，精密过滤，滤液用10％氢氧化钠液调pH为5.62，待一次过柱纯化。

一次过柱纯化 上述提取液过2号大孔树脂柱(径高比＝325∶1200)，依次用5BV纯化水、3BV3％醇、3BV10％醇洗涤，3BV18％醇洗脱，流速500±100ml/min，收集稀醇洗脱液160L，用18％盐酸调节pH为2.2，待二次过柱富集

二次过柱富集 上述纯化液过3号树脂柱(径高比＝325∶300)，用5BV注射用水洗涤，沥干柱中水，用0.8BV30％醇洗涤，沥干后，再用1BV50％醇洗脱，收集20L洗脱液，稍浓缩，使丹酚浓度为188mg/ml，必要时，精密过滤，待喷雾干燥。

喷雾干燥 上述浓缩纯化液用负压喷雾干燥，喷雾干燥参数设计：进风温度105℃～110℃，出风温度70±5℃，喷头转速250～300HZ，进料速度15～30rp/min，得黄色粉末，重1.275kg，收率为2.55％。

实施例3丹酚的制备

提取 取实施例2丹参粉50.1kg，加80～85℃热水250kg，快速搅拌10min，离心甩滤，滤渣1加80～85℃热水250kg，快速搅拌5min，离心甩滤，滤渣2加80～85℃热水200kg，快速搅拌5min，离心甩滤，合并三次滤液，放置4h，使冷至室温，精密过滤，精滤液用18％盐酸调pH为3.61，放置15h，精密过滤，滤液用10％氢氧化钠液调pH为5.63，待一次过柱纯化。

一次过柱纯化 上述提取液过2号大孔树脂柱(径高比＝325∶1200)，依次用5BV纯化水、3BV3％醇、3BV10％醇洗涤，2BV18％醇洗脱，流速500±100ml/min，收集稀醇洗脱液160L，用18％盐酸调pH为2.2，待二次过柱富集

二次过柱富集 上述纯化液过3号树脂柱(径高比＝325∶300)，用5BV注射用水洗涤，沥干柱中水，用0.8BV30％醇洗涤，再沥干后，用1BV50％醇洗脱，收集20L洗脱液，稍浓缩，使丹酚浓度为191mg/ml，必要时精滤，待喷雾干燥。

喷雾干燥 上述浓缩纯化液用负压喷雾干燥，喷雾干燥参数设计：进风温度105℃～110℃，出风温度70±5℃，喷头转速250～300HZ，进料速度15～30rp/min，得黄色粉末，重1.287kg，收率为2.574％。

实施例4丹酚的制备

提取 取实施例2丹参粉50.2kg，加80～85℃热水250kg，快速搅拌10min，离心甩滤，滤渣1加80～85℃热水250kg，快速搅拌5min，离心甩滤，滤渣2加80～85℃热水200kg，快速搅拌5min，离心甩滤，合并三次滤液，放置4h，使冷至室温，精密过滤，精滤液用18％盐酸调pH为3.61，放置11小时，精密过滤，滤液用10％氢氧化钠液调pH为5.7，待一次过柱纯化。

一次过柱纯化 上述提取液过2号大孔树脂柱(径高比＝325∶1200)，依次用5BV纯化水、3BV3％醇、3BV10％醇洗涤，2BV18％醇洗脱，流速500±100ml/min，收集稀醇洗脱液160L，用18％盐酸调pH为2.3，待二次过柱富集

二次过柱富集 上述纯化液过3号树脂柱(径高比＝325∶300)，用5BV注射用水洗涤，沥干柱中水，用0.8BV30％醇洗涤，沥干后，用1BV50％醇洗脱，收集20L洗脱液，稍浓缩，使丹酚浓度为177mg/ml，必要时精滤，待喷雾干燥。

喷雾干燥 上述纯化液用负压喷雾干燥，喷雾干燥参数设计：进风温度105℃～110℃，出风温度70±5℃，喷头转速250～300HZ，进料速度15～30rp/min，得黄色粉末，重1.259kg，收率为2.518％。

实施例2～4结果显示其纯度与收率的相对偏偏差较小

实施例5丹酚的制备

预试验：取丹参(青岛产，春季采挖，烘干，粉碎)粉20g，加水100g，室温快速搅拌10min，过滤，滤渣1加水100g，室温快速搅拌5min，过滤，滤渣2加水80g，室温快速搅拌5min，过滤，合并三次滤液，放置4h，精密过滤，取续滤液20μl注入HPLC色谱仪，记录色谱图，按外标法计算丹酚含量为2.89％，并与标准对照丹参HPLC指纹图谱比较，明显不相似。丹酚酸B的含量也明显偏低，不符合丹参的内控质量标准。

另取与预试验同批的青岛产丹参粉20g加80～85℃热水100g，快速搅拌10min，过滤，滤渣1加80～85℃热水100g，快速搅拌5min，过滤，滤渣2加80～85℃热水80g，快速搅拌5min，过滤，合并三次滤液，放置4h，使冷至室温，精密过滤，取续滤液20μl注入HPLC色谱仪，记录色谱图，用外标法计算丹参中丹酚含量为3.68％，并与对照丹参HPLC指纹图谱比较，相似度为99.88％，符合丹参内控质量标准。

提取 取与预试验同批的青岛产丹参粉50kg，加80～85℃热水250kg，快速搅拌10min，离心甩滤，滤渣1加80～85℃热水250kg，，快速搅拌5min，离心甩滤，滤渣2加80～85℃热水200kg，快速搅拌5min，离心甩滤，合并三次滤液，放置4h，使冷至室温，精密过滤，精滤液用18％盐酸调pH为3.65，放置15h，精密过滤，滤液用10％氢氧化钠液调pH为5.62，待一次过柱纯化。

一次过柱纯化 上述提取液过2号大孔树脂柱(径高比＝325∶1200)，依次用5BV纯化水、3BV3％醇、3BV10％醇、2BV18％醇洗，流速500±100ml/min，收集稀醇洗脱液160L，用18％盐酸调节pH为2.2，待二次过柱富集

二次过柱富集 上述纯化液过3号树脂柱(径高比＝325∶300)，用5BV注射用水洗涤，沥干柱中水，用0.8BV30％醇洗涤，沥干后，用1BV50％醇洗脱，收集20L洗脱液，稍浓缩，使丹酚浓度为188mg/ml，精密过滤，待喷雾干燥。

喷雾干燥 上述纯化液用负压喷雾干燥，喷雾干燥参数设计：进风温度105℃～110℃，出风温度70±5℃，喷头转速250～300HZ，进料速度15～30rp/min，得黄色粉末，重1.275kg，收率为2.55％。

实施例6丹酚的制备

提取 取实施例5的丹参粉50kg，加80～85℃热水250kg，快速搅拌10min，离心甩滤；取滤渣1加80～85℃热水250kg，快速搅拌5min，离心甩滤，取滤渣2加80～85℃热水200kg，搅拌5min，离心甩滤，合并三次滤液，放置4h，使冷至室温，精密过滤，精滤液用18％盐酸调pH为3.65，放置16小时(放置过夜)，精密过滤，滤液用10％氢氧化钠液调pH为5.6，待一次过柱纯化用。

一次过柱纯化 上述提取液过2号大孔树脂柱(径高比＝325∶1200)，依次用5BV纯化水、3BV3％乙醇、3BV10％乙醇洗涤，用4BV20％乙醇洗脱，流速为0.3～0.5BV/h，收集洗脱液160L，用18％盐酸调pH为2.35，得纯化液，供二次过柱富集。

二次过柱富集 取上述纯化液过3号树脂柱(径高比＝325∶300)，5BV纯化水/注射用水洗涤，沥干，用0.8BV30％醇洗涤，沥干后，用2BV50％醇洗脱脱，收集洗脱液20L，稍浓缩，使丹酚浓度为150～200mg/ml，放冷至室温，必要时精密过滤，待喷雾干燥；

喷雾干燥浓缩纯化液用负压喷雾干燥，进风温度为105～110℃，出风温度为70±5℃，喷头转速250～300HZ，进料速度15～30rp/min，得淡黄色粉末，重1.205kg收率为2.41％

实施例7丹酚的制备

提取 取实施例5丹参粉50kg，加250kg，在室温下快速搅拌10min，离心甩滤，滤渣1加水250kg，室温快速搅拌5min，离心甩滤，滤渣2加水250kg，室温快速搅拌5min，离心甩滤，合并三次滤液，精密过滤，精滤液用18％盐酸调pH为3.5～4.0，放置6～11小时，精密过滤，滤液用10％氢氧化钠液调pH为5.5～6.0，待一次过柱纯化。

一次过柱纯化 上述提取液过2号大孔树脂柱(径高比＝325∶1200)，依次用5BV纯化水、3BV3％醇、3BV10％醇、2BV18％醇洗，流速500±100ml/民，收集稀醇洗液约160L，用18％盐酸调节pH为2.00～2.50，待二次过柱。

二次过柱富集 上述纯化液过3号树脂柱(径高比＝325∶300)，5BV注射用水洗，沥干柱中水，用0.8BV30％醇洗，沥干后，用1BV50％醇洗，初10L弃去，接收20L洗脱液，稍浓缩使丹酚浓度为175mg/ml，放冷至室温，待喷雾干燥。

喷雾干燥 上述浓缩纯化液用负压喷雾干燥，喷雾干燥参数设计：进风温度105℃～110℃，出风温度70±5℃，喷头转速250～300HZ，进料速度15～30rp/min，得淡黄色粉末，重1.231kg收率为2.462％。

实施例5～7结果显示其纯度与收率的相对偏差较小；2～7显示同一产地，不同采收季节，获得的产品纯度与收率的相对偏差也较小。

实施例8注射用丹酚的制备

处方

注：以下实施例所用丹酚是以上实施例2～7所得丹酚充分混合均匀，过80目筛，经检测，丹酚含量为98.55％，水分为1.43％，据此折纯称取丹酚投料。

工艺过程：

取丹酚和甘露醇置烧杯中。

加新鲜制备的注射用水溶解并稀释至1500ml。

加0.05％针用活性炭，搅拌10min，过0.2μl微孔滤膜过滤。

分装于10ml西林瓶中，每瓶1.5ml，虚塞胶塞。

置-50℃温度下预冷冻3h

将预冷的样品置冷冻干燥箱中冷冻干燥16h后，然后逐渐升温至25℃，继续干燥3h。

在真空下将胶塞压紧，取出，扎盖，贴标签，包装，装箱，入库。

取样全检。

实施例9丹酚滴丸的制备

丸芯处方

包衣液处方

丸芯 5000丸

欧巴代15.0g

纯化150ml

制备过程

原辅料预处理：丹酚过100目筛后烘干，PEG6000、PEG4000分别研细过100目筛，欧巴代用纯化水搅拌45分钟以上，制成10％的混悬液备用。

熔融：按处方比例称取丹酚、PEG6000、PEG4000，混合均匀，于72℃±2℃水浴熔融，电动搅拌使药液混合均匀。

药液转移：将上述均匀药液迅速转移至70℃预热的料液灌中。

滴制：调控滴速，使药液匀速滴入0℃的200cs甲基硅油中，集丸。

除油：擦拭除油。

包衣：取丸芯，置包衣锅中，锅转速15-20r/min，用喷枪将欧巴代液均匀地喷洒到丸芯表面，暖风加热，使丸芯干燥(丸芯温度在30～35℃)，滴丸包薄膜衣增重1～3％，即成。

包装：将包衣好的丹酚滴丸，用高密度聚乙烯瓶包装，每瓶150丸，每瓶连同使用说明书装入小盒，按拟订的要求包装后，入库。

全检：取样按拟定的丹酚滴丸质量标准全检

实施例10复方丹酚滴丸的制备

丸芯处方

包衣处方

丸芯 10000粒

欧巴代 32g

制备过程

原辅料预处理：聚乙二醇6000研细后过100目筛；三七总皂苷、天然冰片研细后过100目筛，作为原料药。欧巴代用纯化水搅拌45分钟以上，制成10％的混悬液备用。

熔融：按处方比例称取丹酚、三七总皂苷、天然冰片、PEG6000置75℃化料罐中，于72℃±2℃水浴，熔融电动搅拌使药液混合均匀。

制丸：滴丸机装12孔滴盘，滴头内径1.5mm，滴盘温度75℃，保温75℃，滴距4cm，冷凝液为200cs二甲基硅油，冷凝液温度0℃，管口温度510℃，正常滴制。

除油：取上述滴丸包裹于除油布中除油。

筛丸：将不合要求的滴丸筛除。

包衣：取外观圆整丸重合格的滴丸，置包衣锅中，锅转速5-15r/min，用喷枪将欧巴代液均匀地喷洒到丸芯表面，热风加热，使丸芯干燥(保持丸芯温度在3035℃)即成。滴丸包衣增重23％。

分装、包装、入库：按每瓶70粒，每盒装10瓶，每箱装100盒，贴标签，入库。

全检：取样按拟定的复方丹酚滴丸质量标准全检。

实施例11丹酚软胶囊的制备

囊壳处方(重量比，囊壳壁厚0.60.8)：

内容物处方：

制备过程

主要参数设定

工艺过程

原辅料预处理

按囊壳处方准备好相关辅料。按内容物处方准备好相关原辅料，并将其中固体原辅料粉碎，过120目筛。

囊壳制备

溶胀，取明胶置熔胶罐中，加水和甘油，室温溶胀2h。

熔胶，向熔胶罐夹层通80℃热水，待熔胶罐内容物达70℃时，维持30分钟。

加入富马酸和尼泊金乙酯，搅拌均匀

水循环式抽气泵减压脱气15分钟，以保证做成的囊壳无气泡。

开启软胶囊机，调节囊壳的相关参数，开启空压机，使胶液进入软胶囊机制胶皮，并微调相关技术参数，使制得胶皮的厚度为0.80±0.05mm，并使左右两边的胶皮厚度一致。

调节两压制滚轮的相对位置，以便压制胶囊。

内容物制备按处方比例，取丹酚、癸酸钠、焦亚硫酸钠充分混匀，加入吐温80的1，2-丙二醇的混合物，搅匀，再加入PEG400，充分搅匀后，加到内容物储槽，待用。

压制软胶囊 开始喷体开关，并调节流量使符合设定要求，即进行制备丹酚软胶囊。

筛选与除油 剔除外形不整，充填不满等不合要求的软胶囊后，包裹于除油布中除油。

分装与包装 经筛选与除油的软胶囊进行分装、贴标签、包装，入库。

全检 取样按拟定的丹酚软胶囊质量标准进行全检。

实施例12丹酚缓控释微丸的制备

处方1正常溶出度的微丸

工艺过程

预处理 取丹酚过100目筛。

混料 丹酚(过100目筛)、淀粉、预胶化淀粉、羧甲淀粉钠(内加2.5g)、微晶纤维素按照等量递增的原则混合均匀。

制软材 用70％的乙醇润湿制成软硬适度的软材。

挤压与滚圆 将软材通过挤压成条，再经过切割滚圆，即成微丸。

干燥 将微丸置真空干燥箱中于35℃真空干燥。

包衣 取微丸包绿色胃溶薄膜衣，即得。

全检 取样按临床研究用质量标准全检，各检测指标应符合规定。

处方2缓释6h的微丸

工艺过程

原辅料预处理 取丹酚、乳糖、环拉酸钠、羟丙甲纤维素、卡波姆分别过80目筛，聚维酮K₃₀用75％乙醇配制成5％(w/v)溶液。

制软材 称取丹酚、乳糖、羟丙甲纤维素、卡波姆，混匀，加入聚维酮K₃₀液制成软材。

挤压与滚圆 将软材通过挤压成条，再经切割、滚圆。

干燥 将微丸置真空干燥箱中于35℃真空干燥，去除细粉，即得微丸。

包衣 取微丸包黄色丙烯酸树脂IV薄膜衣，即得。

全检 取样按临床研究用质量标准全检，各检测指标应符合规定。

处方3 缓释12h的微丸

*：乙基纤维素用80％乙醇制成6％的溶液，作粘合剂。80％乙醇用量可以按需要适当调整。

工艺过程

原辅料预处理丹酚过80目筛，羟丙甲纤维素K100M CR(HPMC K100M CR)过80目筛；乙基纤维素(EC)用80％乙醇浸泡溶解制成6％(w/v)的溶液，备用。

制软材 按处方称取丹酚和羟丙基甲基纤维素K100M混合均匀，加入6％的EC液，反复搓揉使成均匀的软材

挤压滚圆 通过挤压滚圆机，挤压成条、切割、滚圆，即得湿微丸。

微丸干燥 将湿微丸置干燥箱中干燥。

包衣 取微丸包红色丙烯酸树脂I薄膜衣，即得。

全检 取样按临床研究用质量标准全检，各检测指标应符合规定。

丹酚缓控释微丸胶囊/片

混丸 分别称取处方1、2、3微丸100g、90g、120g，充分混匀。

装胶囊 取混合微丸装入适宜囊壳内，每丸内容物重310mg，标示量为150mg。

分装与包装 分装，贴标签、包装、入库。

全检 取样按临床研究用质量标准全检，各项指标均应符合规定。

含量测定方法

本发明涉及丹酚的含量测定方法是应用UHPLC与高精度质谱连用，对丹酚的各成分按分子量定位，选择含量和活性相对较高的成分作为选择对照品的依据。用丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A 6个对照品，分别按外标法计算各成分含量，6个成分的含量约占标示量的93-97％。其余小峰面积之和，以丹酚酸B作参照品，按外标法计算含量，约占标示量的2-6％。两部分含量之和即为丹酚含量，丹酚的含量为标示量的98％以上。

丹酚的临床应用

本发明还涉及丹酚制剂在制备抗脑缺血再灌注损伤的新用途：通过大鼠动脉栓塞模型(MCAO)建立脑缺血再灌注动物模型，观察行为学、脑梗死面积、脑含水量、脑组织中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)、IL-6、IL-1β、TNF-α水平，HE染色观察MCAO造模以及给药后大鼠皮层损伤情况。结果均证明给大鼠用丹酚ip15mg/kg具有显著的抗脑缺血再灌注损伤的作用，且明显优于缺血性脑卒中一线治疗化药尼莫地平ip 20mg/kg的疗效，可以用于制备抗脑缺血再灌注损伤的预防和/或治疗缺血性脑卒中的药物。

Claims (4)

1.一种抗脑缺血再灌注损伤药丹酚的制备具体涉及一组全水溶性成分”丹酚”的生产工艺

(1)权利要求1丹酚的生产工艺具体涉及丹参的预处理及其粉碎，特别涉及药材的HPLC指纹图谱的预测定，预测定值涉及到提取操作的具体实施方案的选择。

(2)权利要求1丹酚的生产工艺具体涉及取丹参粉末加5倍量25℃/85℃的水快搅拌提取，第一次提取10分钟，第二次、第三次各提取5分钟。优化的提取温度与时间随丹参的HPLC指纹图谱提示的成分及其含量状况而选择。

(3)权利要求(2)丹酚生产工艺的提取温度与时间是根据预试验的结果选择，当25℃提取液HPLC谱的峰数、峰强度与对照丹参的HPLC谱比较有明显的差别，则应另取丹参粉在80℃～85℃提取，则可能获得满意的结果，必要时可以适当提高提取温度，或适当延长提取时间。

(4)权利要求1丹酚的生产工艺具体涉及合并提取液，放置3～4h，使冷至室温，精密过滤，精滤液用稀盐酸酸化pH为2.5.～5.5，优化的pH为3.5.～4.0。然后将酸化液放置沉淀，放置时间为4～16h，优化的是放置4～6h，再精密过滤后供纯化。

(5)权利要求1丹酚的生产工艺具体涉及到过树脂柱分离纯化前，精滤液应调节pH为5.0～6.4，优化的应调节pH为5.5～5.9。。

(6)权利要求1丹酚的生产工艺具体涉及将pH为5.5～5.9精滤液过D101、D301、分离2号、色谱3号大孔树脂进行分离纯化，优选的树脂为分离2号、分析色谱3号大孔树脂，然后依次用水、纯化水、注射水、0.5％～25％药用乙醇梯度洗涤，优化的梯度洗涤药用乙醇浓度为1％～12％。

(7)权利要求1丹酚的生产工艺具体涉及用12％～30％的药用乙醇洗脱，优化的洗脱液为14％～22％乙醇。

(8)权利要求1丹酚的生产工艺具体涉及用D101、D301、分离2号、色谱3号大孔树脂将稀药用乙醇洗脱液富集，优化的树脂为色谱3号、分离2号大孔树脂，过树脂柱前应将稀药用用乙醇洗脱液调节pH为1.5～3.0，优化的pH为2.0～2.5。

(9)权利要求1丹酚的生产工艺具体涉及取样用HPLC检测各丹酚中间体含量，以确定各阶段工作目标。

(10)权利要求1丹酚的生产工艺具体涉及合并符合要求的丹酚乙醇液，调节其含药用乙醇浓度为60％左右后，精密过滤。

(11)权利要求1丹酚的生产工艺具体涉及取60％药用乙醇丹酚精滤液喷雾干燥，控制进风温度为80℃～130℃，出风温度为50～60，得类白色或微黄色或黄色粉末状丹酚。

(12)权利要求1制得的“丹酚”是指丹酚含有的有效成分是丹参药材中全部水溶性成分，而不是少数几种成分，按照国家食品药品监督管理局颁布的《中药色谱指纹图谱相似度判断软件》计算，丹酚的指纹图谱与对照丹参水提取液指纹图谱比较，其相似度大于95％。

2.权利要求1一种抗脑缺血再灌注损伤药丹酚的生产工艺具体涉及一组丹酚药物组合物制备

(13)权利要求2的丹酚药物组合物含有权利要求1从丹参中生产的全水溶性成分丹酚和药学上可以接受的药物载体。

(14)权利要求2药物组合物含有可供注射用的注射剂，如注射用丹酚，丹酚注射液，丹酚滴注液等。

(15)权利要求2药物组合物含有可供口服用的系列固体制剂和新剂型，如丹酚片，丹酚胶囊，丹酚颗粒剂，丹酚软胶囊，丹酚滴丸，丹酚缓控释微丸，丹酚微囊，丹酚微乳和复方丹酚各剂型等。

(16)权利要求2药物组合物含有可供外用的各种制剂，如丹酚膏剂、丹酚搽剂、丹酚滴眼剂、丹酚滴鼻剂、丹酚气雾剂，丹酚凝胶剂等。

(17)权利要求2药物组合物还含有各种药学上可以接受的其他剂型和新剂型等。

(18权利要求2药物组合物还含有各种药学上可以接受的各种规格，如30mg，60mg，120mg，240mg等。

(19)权利要求2药物组合物的药物载体可以是一种或多种能相容的固体、液体和气雾剂溶剂等，剂型取决于给药方式；制剂工艺也可以多种多样。这些对本领域技术人员来说是显而易见的，都在本专利保护的范围之内。

3.权利要求1一种抗脑缺血再灌注损伤药丹酚的制备具体涉及丹酚及其制剂的含量测定方法

(20)权利要求3丹酚的含量是一组多成分的有效部位，其含量测定方法包括用多个对照品对照，按外标法计算；对照品以外的部分峰面积之和以丹酚酸B做参照物，按外标法计算含量，两部分含量之和即为丹酚含量。对照品个数越多，含量测定值越接近真实值。

(21)权利要求3丹酚的含量测定方法中主要部分是用6～8个对照品对照，按外标法计算含量，其总含量为92％～97％。

(22)权利要求3丹酚的含量测定方法中对照品对照的部分以外的峰面积之和以丹酚酸B做参照物，按外标法计算的含量，其总含量为3％～6％。

(23)权利要求3丹酚的含量应不低于98.5％。

4.权利要求1一种抗脑缺血再灌注损伤药丹酚的生产工艺具体涉及丹酚制剂的临床应用

(24)权利要求4丹酚临床应用主要涉及缺血性心、脑血管疾病和脑卒中恢复期得临床应用。

(25)权利要求4丹酚的临床应用具体涉及丹酚系列各制剂用于心、脑血管疾病、妇科、儿科、烫伤科、五官科以及糖尿病、肿瘤、抗菌、消炎、抗氧化、增强免疫、改善记忆等应用。

(26)权利要求4丹酚的临床应用具体涉及活血化瘀、祛瘀止痛、通脉舒络、清心除烦、扩张血管、增加冠脉和脑部血流等“功能与主治”各临床上相关疾病的预防与治疗。