CN106970167A - 一种测定两面针牙膏中氯化两面针碱含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定两面针牙膏中氯化两面针碱含量的方法，该方法准确、简单、便捷，可以用于控制两面针牙膏中氯化两面针碱的含量。属于化学检测领域。该方法依次包括下述子步骤：步骤1：采用甲醇提取两面针中的氯化两面针碱，并收集甲醇提取液；步骤2：采用HPLC法测定甲醇提取液中的氯化两面针的含量。本发明可用于对两面针牙膏中氯化两面针碱的含量进行测定。

Description

一种测定两面针牙膏中氯化两面针碱含量的方法

技术领域

本发明属于化学检测领域，尤其是一种测定两面针牙膏中氯化两面针碱含量的方法。

背景技术

两面针别名入地金牛、双面刺、山椒、下山虎，为芸香科植物两面针ZanthorμLumnitidum(Roxb.)DC.的干燥根。味苦、辛，性平，有小毒，归肝、胃经。有行气止痛、活血化瘀、祛风通络的功效，用于气滞血瘀引起的跌打损伤、风湿痹痛、胃痛、牙痛。两面针的主要活性成分是氯化两面针碱，现在两面针也被广泛应用于中成药中，如复方风湿宁胶囊、妇炎净片。临床试验研究表明在牙膏中加入两面针，能舒缓牙痛、缓解炎症、减少牙菌斑及牙龈炎、有助于预防牙龈出血和牙龈萎缩等多种口腔疾病。

根据《功效型牙膏QB/T 2966-2014》规定功效牙膏应该按照相关标准要求对其功效成分的定性或定量测定，目前已经有对牙膏中氟含量的测定、丹皮酚含量的测定、三七(田七)皂苷含量的测定、草珊瑚有效成分的测定、木糖醇含量等对功效成分进行检测，也有学者对牙膏中总黄酮苷、九里香酮、青藤碱、延胡索乙素、柚皮苷和葛根素的含量测定进行研究^[1-4]，但是作为功效性牙膏的两面针牙膏尚未有检测方法，不利于产品的质量控制。

发明内容

针对上述不足，本发明旨在提供一种测定两面针牙膏中氯化两面针碱含量的方法，该方法准确、简单、便捷，可以用于控制两面针牙膏中氯化两面针碱的含量。

为了实现上述技术效果，本发明提供的技术方案是这样的：一种测定两面针牙膏中氯化两面针碱含量的方法，依次包括下述子步骤：

步骤1：采用甲醇提取两面针中的氯化两面针碱，并收集甲醇提取液；

步骤2：采用HPLC法测定甲醇提取液中的氯化两面针的含量。

优选地，所述的步骤1具体为：将3g两面针牙膏与30mL甲醇混合，依次通过搅拌、超声、冷却、离心，收集上清液。

优选地，所述的搅拌时间为30min。

优选地，所述的超声处理时间为30min，温度为50℃。

优选地，所述的离心时间为15min，速度为4000r/min。

优选地，所述的上清液需用0.22μm滤膜过滤.

优选地，所述的HPLC法的色谱条件为：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱；流动相为0.2％磷酸-乙腈；流速为1.0mL/min；检测波长为328nm；进样量2μL。

优选地，所述的色谱柱的规格为4.6mm×250mm，5μm。

优选地，所述的色谱柱的温度为35℃。

优选地，所述的流动相为体积比等于65：35的0.2％磷酸-乙腈。

和传统方法相比，本发明有以下优势：

1、本发明将氯化两面针碱对照品，用70％甲醇溶解并稀释至适合的浓度，在190～400nm下进行紫外扫描。结果显示氯化两面针碱在271nm、292nm、328nm均有较大的响应(见图1)，但是两面针牙膏样品的组分有粉状摩擦剂、湿润剂、表面活性剂、粘合剂、香料、甜味剂及其它特殊成分等，基质比较复杂，在273nm和292nm干扰相对较大，为了准确测定供试品中氯化两面针的含量，所以选择328nm作为本发明紫外检测器的检测波长。

2、在高效液相色谱分析中C18色谱柱是最常用的反相色谱柱，长碳链的色谱柱填料更有利于保留，因而适合痕量分析^[5]。由于牙膏组分比较复杂，保留时间越长，各组分与目标物的分离度相对较高。我们尝试用1.8μm的超高压液相色谱柱，如Welch UPLCAQ-C18色谱柱(2.1mm×50mm，1.8μm)，结果发现不是由于保留时间太早而导致样品峰没分开，就是样品峰在后面分开后严重拖尾的情况。后面换用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)，氯化两面针碱色谱峰既有很好的保留且峰型较好，还可以将牙膏中氯化两面针碱与其他杂质分离开，并且理论塔板数达到药典要求。所以本法选用5μm粒径250mm长的C18色谱柱。

3、选择适宜的流动相对制定一个高效液相色谱方法显得非常重要，其决定了目标物的分离和检测时间。氯化两面针碱为生物碱，极性较强，容易拖尾，药典多用三乙胺作为流动相的防拖尾剂，而有三乙胺离子对流动相的色谱条件需要较久时间的平衡，且容易对仪器的其他试验有影响，我们尝试用0.2％甲酸(用氨水调PH到4.5)-乙腈(65:35)为流动相，发现可以改善拖尾情况，但是保留时间太早，样品干扰大；采用0.2％磷酸-乙腈(65:35)为流动相，峰形好且保留时间适宜，所以采用其作为本法流动相。

附图说明

图1为氯化两面针碱HLPC紫外等值图/3D图；

图2为氯化两面针碱对照品的HPLC指纹图谱图；

图3为供试品的HPLC指纹图谱图；

图4为阴性样品的HPLC指纹图谱图；

图5为以氯化两面针碱的浓度(μg/mL)-峰面积进行的线性回归曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求保护范围内所做的有限次修改，仍在本发明的权利要求保护范围内。

实施例1

1、仪器与试药

1.1仪器

Agilent 1260生物惰性四元液相色谱仪；

Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；

德国IKA C-MAG HS 7加热磁力搅拌器；

美国贝克曼公司AllegraX-15R高性能通用台式离心机；

德国Sigma 3K15台式冷冻离心机；

赛多利斯科学仪器(北京)有限公司Quintix224-1CN电子天平；精度0.1mg；

隔膜真空泵GM-0.33。

1.2试药

氯化两面针碱对照品；含量(中国食品药品检定研究院，批号：110848-200502)；

两面针牙膏样品(柳州两面针股份有限公司，产品批号：B20190216A1、G20190524B1、F20190612B1，本文中方法学采用产品批号为B20190216A1样品)；

阴性牙膏样品(柳州两面针股份有限公司，产品批号：A20190527B1)；

甲醇(OMNICHEM，色谱纯)；

乙腈(OMNICHEM，色谱纯)；

盐酸(西陇化工股份有限公司，分析纯)；

磷酸(广东光华科技股份有限公司，分析纯)；

超纯水；

Nylon66 0.22μm滤膜。

2、方法与结果

2.1色谱条件及色谱条件选择

2.1.1色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；

以0.2％磷酸-乙腈(65:35)为流动相；

流速：1.0mL/min；

色谱柱温度为35℃；

检测波长为328nm；

进样量2μL。

2.1.2检测波长的选择

将氯化两面针碱对照品，用70％甲醇溶解并稀释至适合的浓度，在190～400nm下进行紫外扫描。结果显示氯化两面针碱在271nm、292nm、328nm均有较大的响应(见图1)，但是两面针牙膏样品的组分有粉状摩擦剂、湿润剂、表面活性剂、粘合剂、香料、甜味剂及其它特殊成分等，基质比较复杂，在273nm和292nm干扰相对较大，为了准确测定供试品中氯化两面针的含量，所以选择328nm作为本法紫外检测器的检测波长。

2.1.3色谱柱的选择

在高效液相色谱分析中C18色谱柱是最常用的反相色谱柱。长碳链的色谱柱填料更有利于保留，因而适合痕量分析^[5]。由于牙膏组分比较复杂，保留时间越长，各组分与目标物的分离度相对较高。我们尝试用1.8μm的超高压液相色谱柱，如Welch UPLCAQ-C18色谱柱(2.1mm×50mm，1.8μm)，结果发现不是由于保留时间太早而导致样品峰没分开，就是样品峰在后面分开后严重拖尾的情况。后面换用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)，氯化两面针碱色谱峰既有很好的保留且峰型较好，还可以将牙膏中氯化两面针碱与其他杂质分离开，并且理论塔板数达到药典要求。所以本法选用5μm粒径250mm长的C18色谱柱。

2.1.4流动相的选择

选择适宜的流动相对制定一个高效液相色谱方法显得非常重要，其决定了目标物的分离和检测时间。氯化两面针碱为生物碱，极性较强，容易拖尾，药典多用三乙胺作为流动相的防拖尾剂，而有三乙胺离子对流动相的色谱条件需要较久时间的平衡，且容易对仪器的其他试验有影响，我们尝试用0.2％甲酸(用氨水调PH到4.5)-乙腈(65:35)为流动相，发现可以改善拖尾情况，但是保留时间太早，样品干扰大；采用0.2％磷酸-乙腈(65:35)为流动相，峰形好且保留时间适宜，所以采用其作为本法流动相。

2.2对照品与供试品的制备

2.2.1对照品溶液的制备

精密称取氯化两面针碱对照品适量，加入70％甲醇配制成每1mL含4μg的溶液，即得。

2.2.2供试品溶液的制备

取供试品约3g，精密称定，置塞具锥形瓶中，精密加入甲醇30mL，磁力搅拌30min使之充分溶散，50℃超声处理30min，放冷，4000r/min离心15min，取上清液经0.22μm滤膜过滤，即得。

2.2.3阴性样品溶液的制备

取阴性样品约3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇30mL,磁力搅拌30min使之充分溶散，50℃超声处理30min，放冷，4000r/min离心15min，取上清液经0.22μm滤膜过滤，即得。

2.3专属性考察

分别吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各2μL进样。按2.1项下的色谱条件对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液进行测定，得到色谱图(见图2、图3和图4)。结果表明：两面针牙膏供试品溶液中氯化两面针碱色谱峰与氯化两面针碱对照品色谱峰保留时间一致，并与其他共存成分最小分离度为3.43(大于1.5)，理论塔板数为13958(大于3000)，主峰与杂质峰达到基线分离，且阴性样品在相应的位置没有色谱峰干扰，说明本方法专属性良好。

2.4线性关系考察

取氯化两面针碱对照品11.29mg，精密称定，加70％甲醇25mL(浓度：0.4516mg/mL)作为储备液，再精密吸取1mL置10mL容量瓶中，加70％甲醇稀释至刻度(浓度：45.16mg/mL)，然后分别精密吸取该溶液0.125mL、0.25mL、0.5mL、1mL、2mL置10mL容量瓶中，加入70％甲醇稀释至刻度，摇匀，并依照上述方法测定，结果详见表1。

以浓度(μg/mL)-峰面积进行线性回归，求得回归方程：y＝0.1803x+0.0122，R＝0.9998。氯化两面针碱在1.129～18.064μg/mL范围内呈良好的线性关系，详见图5。

表1 线性实验结果

2.5精密度实验

取浓度为4.517μg/mL的对照品溶液，按上述色谱条件连续测定6次，所得平均峰面积为0.9147，RSD＝0.29％，详见表2。

结果表明，本方法的精密度较好。

表2 精密度实验结果

2.6稳定性试验

取同批号的样品(批号：B20190216A1)约3g，精密称定，按2.2.2项下的供试品制备方法制备供试品溶液。以2μL为进样量，测定样品中氯化两面针碱的峰面积。然后每隔一定的是时间测定一次，共测5次，详见表3。

结果表明，在8小时内，被测物稳定。

表3 稳定性实验结果

2.7重复性实验

取同批号的样品(批号：B20190216A1)约3g，精密称定，按上述供试品制备方法制备供试品溶液。以2μL为进样量，以上述的色谱条件平行试验，测得样品中氯化两面针碱的含量为46.4863μg/g，RSD为0.07％。

结果表明本方法重复性良好，结果详见表4。

表4 重复性实验结果

2.8回收率实验

精密称取已知含量两面针牙膏(批号：B20190216A1，氯化两面针碱含量为46.4863μg/g)3g，共取6份，置具塞锥形瓶中，精密加入氯化两面针碱对照品溶液(浓度为4.517μg/mL，)3mL，再精精密加入甲醇30mL,磁力搅拌30min使之充分溶散，50℃超声处理30min，放冷，4000r/min离心15min，取上清液经0.22μm滤膜过滤，即得供试品溶液。按上述方法测定，结果显示本方法回收率较好，详见表5。

表5 回收率实验结果

2.9含量测定

取本品3批(批号分别为：B20190216A1、G20190524B1、F20190612B1)各3g，精密称定，按2.2.2项下的方法制备供试品溶液，进样2μL，测定氯化两面针碱的含量，结果详见表6。

表6 含量测定结果(n＝3)

3讨论

3.1提取溶剂的选择

由于氯化两面针碱溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，故本文分别用了甲醇、70％甲醇、1％盐酸甲醇^[6]三种溶剂对样品进行提取，结果分析表明，用甲醇和70％甲醇的提取效果差别不大，因为牙膏中的水溶性杂质较多，所以用甲醇作为提取溶剂，杂质峰明显比其余两者的少，而其余两者均存在不同程度的干扰，容易影响测定结果，所以选用甲醇作为提取溶剂。结果详见表7。

表7 不同提取溶剂结果比较

3.2提取方法的选择

由于牙膏是韧性极强的一种均质胶体，当遇到甲醇的时候，表面会形成硬壳。为了能够让提取液成分浸润到样品，人工搅拌和旋涡震荡只能让样品更加凝聚在一块，我们采用了磁力搅拌的方式，使之能够充分溶散到溶剂当中，结合超声处理样品，能更有效的将氯化两面针碱提取出来。

在确定提取方法为磁力搅拌结合超声处理后，进一步比较了超声30min、超声40min、超声50min与超声60min三者的峰面积的差别，结果显示，超声20min得到的峰面积较小，而超声30min、超声40min、超声50min与超声60min所得的峰面积无明显区别，在提取时间上考虑，确定选用超声30min作为提取方法，详见表8。

表8 不同超声时间的结果比较

3.3含量测定结果分析

两面针中药提取物有消炎、镇痛、抗菌、解痉、止血等方面的作用，在口腔护理用品中进行了应用^[7]。但是，两面针中药提取物的质量控制指标尚未完善，提取方法不同以及在提取时选用的两面针质量参差也会有所差别，所以影响两面针牙膏发挥功效的因素有较多。

将两面针提取物加入到牙膏中，作为镇痛、消炎、抗菌的口腔保健用品已有三十多年历史^[8]，但是目前还尚没有一个标准。从表6中三批样品中氯化两面针含量的结果可以看出，不同批号的两面针牙膏测定出的氯化两面针碱的含量也大有不同。原因可能是侧重的功效不同，亦可能是在放置与储存当中氯化两面针碱有所降解从而导致含量降低。因此，为了避免两面针牙膏在使用中因氯化两面针碱含量的降低而影响功效，我们可以通过测定两面针牙膏中氯化两面针碱的含量，严格控制两面针牙膏的质量。

本实验采用高效液相色谱的方法测定两面针牙膏中功效成分氯化两面针碱含量，对于不同色谱柱进行了实验对比，发现了5μmC18色谱柱在对于氯化两面针碱的检测中效果要优于1.8μmC18色谱柱；通过对不同样品处理方式，采用了水与甲醇先后处理样品，并采用先搅拌后超声的方式，可以使样品更好的分散；通过对于流动相的条件的选择与讨论，找到了合适的流动相，得到较好的保留时间，且附近干扰较少，最终确定了最佳条件。在此条件下，实验结果表明此方法的重复性、精密度和稳定性良好，出峰位置干扰少，测量结果线性关系良好，回收率高，可用于两面针牙膏中氯化两面针碱含量的质量控制方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

参考文献

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[2]黄光伟，韦宝韩，黄晓燕.HPLC法测定牙膏中银杏叶提取物总黄酮的含量[J].香料香精化妆品.2009,6(3):25-27.

[3]唐红艳，张进源.HPLC法测定牙膏中葛根素的含量[J].口腔护理用品工业.2015,25(2):23-24.

[4]黄光伟，韦宝韩，黄晓燕.高效液相色谱法测定牙膏中九里香酮的量[J].日用化学工业.2009,39(5):365-367

[5]赵珊珊,徐春生,高志强,等.高效液相色谱法测定牙膏中长梗冬青苷的含量[J].口腔护理用品工业，2016，26(3)：25.

[6]曾淼洋,韦藤幼,童张法.加酸内部沸腾法提取氯化两面针碱及其纯化研究[J].高校化学工程学报，2014，28(4)：719-724.

[7]杨卫豪，覃青云，黄光伟.两面针在口腔护理用品中的应用研究[J].牙膏工业，2002，24(11)：868.

[8]万呼春，胡德渝，刘春红，等.含中药两面针提取液牙膏对牙菌斑和牙龈炎的观察[J].中国中西医结合杂质，2005，25(11)：1024-1026。

Claims (10)

1.一种测定两面针牙膏中氯化两面针碱含量的方法，其特征在于，依次包括下述子步骤：

步骤1：采用甲醇提取两面针中的氯化两面针碱，并收集甲醇提取液；

步骤2：采用HPLC法测定甲醇提取液中的氯化两面针的含量。

2.根据权利要求1所述的一种测定两面针牙膏中氯化两面针碱含量的方法，其特征在于，所述的步骤1具体为：将3g两面针牙膏与30mL甲醇混合，依次通过搅拌、超声、冷却、离心，收集上清液。

3.根据权利要求2所述的一种测定两面针牙膏中氯化两面针碱含量的方法，其特征在于，所述的搅拌时间为30min。

4.根据权利要求2所述的一种测定两面针牙膏中氯化两面针碱含量的方法，其特征在于，所述的超声处理时间为30min，温度为50℃。

5.根据权利要求2所述的一种测定两面针牙膏中氯化两面针碱含量的方法，其特征在于，所述的离心时间为15min，速度为4000r/min。

6.根据权利要求2所述的一种测定两面针牙膏中氯化两面针碱含量的方法，其特征在于，所述的上清液需用0.22μm滤膜过滤。

7.根据权利要求1所述的一种测定两面针牙膏中氯化两面针碱含量的方法，其特征在于，所述的HPLC法的色谱条件为：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱；流动相为0.2％磷酸-乙腈；流速为1.0mL/min；检测波长为328nm；进样量2μL。

8.根据权利要求7所述的一种测定两面针牙膏中氯化两面针碱含量的方法，其特征在于，所述的色谱柱的规格为4.6mm×250mm，5μm。

9.根据权利要求8所述的一种测定两面针牙膏中氯化两面针碱含量的方法，其特征在于，所述的色谱柱的温度为35℃。

10.根据权利要求8所述的一种测定两面针牙膏中氯化两面针碱含量的方法，其特征在于，所述的流动相为体积比等于65：35的0.2％磷酸-乙腈。