CN106636148B - 一种飞蝗细胞色素P450还原酶基因dsRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种飞蝗细胞色素P450还原酶基因dsRNA及其应用。具体是一种飞蝗细胞色素P450还原酶基因，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，基于SEQ ID NO：1，设计合成基因片段SEQ ID NO：7和相应的dsRNA。设计合成的dsRNA注射入飞蝗体内，飞蝗细胞色素P450还原酶基因表达水平下调，细胞色素P450还原酶酶活力下降，并导致西维因对飞蝗致死率提高至1.73倍‑2.3倍。本发明筛选获得的细胞色素P450基因可作为西维因抗性防治的分子靶标，为飞蝗西维因抗性治理提供新的途径。

Description

一种飞蝗细胞色素P450还原酶基因dsRNA及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于细胞色素P450还原酶基因片段合成的dsRNA及其在提高西维因防治飞蝗效果中的应用。
技术背景
西维因是一种用途极为广泛的氨基甲酸酯类杀虫剂，具有对人、畜毒性低，稳定性好，药效持久，起效迅速等优点，广泛使用在作物和森林的多种害虫的日常防治工作中。长期以来，反复使用以西维因为代表的氨基甲酸酯类杀虫剂防治飞蝗，已使得飞蝗对西维因产生较为严重的抗性，导致西维因防治剂量加大，蝗灾防治成本提高，过量使用西维因也对人类身体健康、对生态平衡造成潜在危害。目前已有通过传统的农药混配，交替轮换使用、开发新型杀虫剂等途径应用于飞蝗防治，但目前田间飞蝗抗药性危害依然十分严重。因此迫切需要研发一种新型的增强西维因对飞蝗防治效果的技术。
RNA干扰是指内源或外源双链RNA，在诱导沉默复合物与Dicer酶的作用下，专一性的诱导靶基因表达沉默的现象。由于RNA干扰可以沉默害虫农药抗性或抗性基因，对环境和高等动物安全，所以该技术被广泛地应用于害虫抗药性防治。
经检索发现，目前已有的飞蝗dsRNA相关专利申请如下：专利申请号201610316474.6，名称为“一种飞蝗肠道核酸水解酶基因在害虫防治中的应用”；专利申请号201610186141.6，名称为“飞蝗翅表皮蛋白基因及其在害虫防治中的应用”；专利申请号201610186149.2，名称为“飞蝗翅特异表皮蛋白基因及其dsRNA的应用”；专利申请号201510160191.2，名称为“Knickkopf基因dsRNA在害虫防治中的应用”；专利申请号201510160194.6，名称为“Retroactive基因及其dsRNA在害虫防治中的应用”；专利申请号201510118799.9，名称为“一种昆虫细胞色素P450基因及其应用”；专利申请号201510080636.6，名称为“昆虫几丁质去乙酰基酶基因1及其在害虫防治中的应用”；专利申请号201410647729.8，名称为“一种东亚飞蝗ATP合酶β亚基基因及其dsRNA在害虫防治中的应用”；专利申请号201410665503.0，名称为“一种东亚飞蝗ATP合酶α亚基基因及其dsRNA在害虫防治中的应用”；专利申请号201410292658.4，名称为“昆虫Ⅱ型几丁质酶基因特异性dsRNA的应用”；专利申请号201410069843.7，名称为“蝗虫Ⅰ型几丁质酶基因的序列及其dsRNA的应用”,专利申请号201310023385.9，名称为“昆虫UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶基因及其dsRNA的应用”；专利申请号201210356675.0，名称为“昆虫β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因及其应用”；专利申请号201010163625.1，名称为“一种昆虫几丁质合成酶1基因片段及其dsRNA和应用”；专利申请号201010163645.9，名称为“一种昆虫几丁质合成酶1A基因片段及其dsRNA和应用”；专利申请号201010163618.1，名称为“一种昆虫几丁质合成酶2基因和应用”；专利申请号201010163634.0，名称为“一种昆虫几丁质合成酶1B基因片段及其dsRNA和应用”，专利申请号201010136330.5，名称为“昆虫几丁质酶基因及其dsRNA的应用”。
上述18个专利申请的核心内容均涉及利用注射法dsRNA沉默飞蝗某个关键基因/致死基因引起飞蝗致死表型，然而上述关键基因/致死基因沉默后，飞蝗死亡现象显现较慢，需要等待多日或一个发育龄期才能逐步观察到致死效果，这非常不利于蝗灾集中爆发后的应急防控。更为重要的是飞蝗不仅仅是一种农业害虫，更是食物链中的重要环节。在农业生产经济阈值以下，应当保持一定数量的飞蝗种群数量，以维持生态平衡。若上述飞蝗关键基因/致死基因序列在生产过程中人工大量扩增或者通过植物转基因手段转入农作物，就有发生关键基因/致死基因非受控转移的潜在风险，进而可能引起飞蝗种群数量急剧减少，导致天敌动物数量降低，最终危害农田生态平衡，诱发其它昆虫灾害。
细胞色素P450是昆虫三大代谢解毒酶系之一，该酶参与包括西维因在内的多种农药的代谢解毒。细胞色素P450的活力严格依赖与细胞色素P450还原酶提供电子。因此将昆虫细胞色素P450还原酶干扰，就可以降低昆虫细胞色素P450对农药的解毒能力，从而达到提高农药对害虫的防治效果。通常昆虫仅含有一个细胞色素P450还原酶基因，dsRNA介导的细胞色素P450还原酶干扰多数不会直接引起昆虫死亡。这大大方便了研究者通过干扰细胞色素P450还原酶，同时调节多个细胞色素P450酶活力，进而提高害虫对农药的敏感性。目前尚未见通过dsRNA干扰技术，针对飞蝗细胞色素P450还原酶提高飞蝗西维因致死率的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于飞蝗细胞色素P450还原酶基因片段合成的dsRNA及其在提高西维因防治飞蝗效果中的应用。
本发明提供的一种飞蝗细胞色素P450还原酶基因，该基因的核苷酸序列为SEQ IDNO：1所示的序列；该基因核苷酸序列的获得是依据非冗余蛋白数据库，采用blastx软件对飞蝗转录组数据库进行比对注释；针对搜索注释获得的待定飞蝗细胞色素P450还原酶基因，采用Oligo软件设计全长上游引物SEQ ID NO：3和全长下游引物SEQ ID NO：4；以飞蝗cDNA为模板，通过PCR扩增获得一条长度为2043bp的DNA片段；将经过琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收试剂盒纯化后的PCR产物与pEASY-T1载体连接，热激法转入Trans1-T1感受态细胞，在琼脂平板挑取菌落，在含有氨苄霉素-卡那霉素双抗性的LB液体培养基中培养12小时后，送上海生工公司测序；测序获得细胞色素P450还原酶基因全长为2043bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。
本发明提供一种飞蝗细胞色素P450还原酶基因编码的氨基酸序列，其特征在于氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列；该氨基酸序列的获得是根据三联密码子原则，将SEQID NO：1通过Translate tool软件翻译为相应的氨基酸，并对其相对分子量和等电点进行预测，预测结果表明细胞色素P450还原酶基因编码680个氨基酸，相对分子量为77.1KD，理论等电点为5.49。
本发明提供一种两端均融合有T7启动子的飞蝗细胞色素P450还原酶基因片段，以及基于该片段合成的dsRNA和基于该片段合成的dsRNA在提高西维因防治飞蝗效果中的应用；基于飞蝗细胞色素P450还原酶基因序列，设计5’端含有T7启动子的上游引物SEQ IDNO：5和5’端含有T7启动子的下游引物SEQ ID NO：6，以飞蝗细胞色素P450还原酶基因DNA为模板，通过PCR反应扩增获得目的片段SEQ ID NO：7；将该目的片段通过琼脂糖凝胶电泳分离，紫外切胶纯化后，用T7RNA聚合酶体外转录试剂盒合成dsRNA；之后用玻璃针将该dsRNA注射入飞蝗腹部第二腹节，检测飞蝗细胞色素P450还原酶mRNA表达水平和酶活力水平的下降程度，以及该dsRNA提高西维因对飞蝗防治效果的能力。
本发明的有益效果：将一种基于飞蝗细胞色素P450还原酶基因片段合成的dsRNA，用玻璃针将该dsRNA注射入飞蝗腹部第二腹节，可检测到飞蝗细胞色素P450还原酶mRNA表达水平下降64.3％-81.1％，且细胞色素P450还原酶活力水平降低18.4％-27.2％，注射该dsRNA后可将西维因对3龄飞蝗的致死率提高至1.73倍-2.3倍。
附图说明
图1：飞蝗细胞色素P450还原酶基因全长克隆的PCR扩增产物电泳图(泳道1所示为DL5000DNA Marker，条带大小从上到下依次为5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp，泳道2所示为飞蝗细胞色素P450还原酶基因全长扩增产物条带)。
图2：dsRNA对飞蝗细胞色素P450还原酶基因表达影响(dsGFP为注射dsGFP的对照组，dsCPR为注射飞蝗细胞色素P450还原酶基因片段dsRNA的处理组)，β-actin为内参基因，其中**P<0.01。
图3：dsRNA对飞蝗细胞色素P450还原酶酶活力影响(dsGFP为注射dsGFP的对照组，dsCPR为注射飞蝗细胞色素P450还原酶基因片段dsRNA的处理组)，其中*P<0.05。
图4：注射dsRNA对西维因对飞蝗致死率的影响。(dsGFP为注射dsGFP的对照组，dsCPR为注射飞蝗细胞色素P450还原酶基因片段dsRNA的处理组)，其中*P<0.05。
具体实施方式
实施例1：飞蝗细胞色素P450还原酶基因全长cDNA获得以及氨基酸序列预测。
1.飞蝗细胞色素P450还原酶基因生物信息学搜索。
用Formatdb程序将飞蝗转录组Unigene序列转化为比对数据库，通过blastx软件将比对数据库与非冗余蛋白数据库进行逐条比对注释，搜索注释结果获得2条飞蝗细胞色素P450还原酶序列。
2.飞蝗细胞色素P450还原酶基因全长cDNA获得。
2.1)PCR全长扩增所需全长引物设计：
采用Sequencher软件将比对注释得到的2条飞蝗细胞色素P450还原酶基因进行比对，拼接为1条全长序列；并采用Oligo软件分别设计全长上游引物ATGGAGGCAGAGGCAGGCAACGAG(SEQ ID NO:3)和全长下游引物TCAGCTCCATACATCTGAAGAAT(SEQ ID NO:4)；将设计好的一对全长引物发往生工生物工程(上海)股份有限公司。
2.2)PCR扩增所需模板制备：
选取生长状况良好、跳跃有力的飞蝗3龄若虫，置于液氮中研磨，参照英骏Trizol试剂盒提取总RNA；采用Oligotex mRNA Mini Kit提取试剂盒和RevertAidTMH MinusReverse Transcriptase逆转录酶反转录cDNA，从而获得PCR反应所需模板。
2.3)PCR扩增反应：
PCR扩增获得飞蝗细胞色素P450还原酶cDNA通过琼脂糖凝胶进行检测分离(图1)；通过切胶回收，胶回收试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)纯化后，与pEASY-T1载体链接，再转入Trans-T1感受态细胞中培养，琼脂平板培养挑取饱满白斑，并接入含有氨苄青霉素和卡那霉素的液体培养基中培养，采用质粒小提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取质粒后，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序；测序获得的基因全长cDNA的DNA序列为2043bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列。
3.飞蝗细胞色素P450还原酶基因氨基酸序列预测。
采用Translate tool对飞蝗细胞色素P450还原酶基因所编码的氨基酸进行预测，结果表明飞蝗细胞色素P450还原酶基因编码680个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的序列，预测相对分子量为77.1KD，理论等电点为5.49；采用SMART在线软件对其功能域进行预测，结果显示飞蝗细胞色素P450基因具有信号肽，含有FMN、FAD和NADP结构域。飞蝗细胞色素P450还原酶编码的氨基酸与黑腹果蝇细胞色素P450基因编码的氨基酸序列相似性达到70％。
实施例2：飞蝗细胞色素P450还原酶基因片段dsRNA的合成。
1.飞蝗细胞色素基因片段dsRNA合成所需模板制备。
基于测序获得的飞蝗细胞色素P450还原酶基因的DNA序列SEQ ID NO：1，采用Oligo软件设计一对合成dsRNA所需引物；序列taatacgactcactatagggTATGAAATGGGTCTTGGGGA(SEQ ID NO:5)和taatacgactcactatagggGGGTGCTTCTTCGTTGACTC(SEQ ID NO:6)所示分别为dsRNA合成所需上下游引物(下划线部分为T7启动子)；将设计好的dsRNA引物送往生工生物工程(上海)股份有限公司。
将设计合成的用于合成dsRNA的所需引物(均含有T7启动子序列)进行PCR扩增，获得一段长度为519bp的片段；其DNA序列为SEQ ID NO：7所示的序列；经过凝胶分离、纯化后使用紫外酶标仪进行检测，并作为dsRNA合成的模板。
2.飞蝗细胞色素P450还原酶基因片段dsRNA的合成。
基于上述制备用于合成dsRNA的模板，采用T7RiboMAXTM Express RNAi System(Promega)试剂盒，通过T7RNA聚合酶体外转录合成dsRNA。通过微量紫外分光光度计对合成好的dsRNA进行定量，最终使其浓度达到1.0μg/μL，并将其保存于-20℃冰箱中备用。
实施例3：飞蝗细胞色素P450还原酶基因片段dsRNA提升西维因对飞蝗死亡率。
1.飞蝗细胞色素P450还原酶基因片段dsRNA的注射。
挑取100头雌雄各半的3龄第2天若虫，用于dsRNA注射。将注射dsGFP的3龄若虫作为对照组，将dsCPR基因片段合成的dsRNA作为处理组。采用玻璃针将3μL(3μg/每只若虫)的dsCPR注射入飞蝗腹部第二腹节，同时挑取相同数量的若虫注射相同量的dsGFP。待注射完毕后，将两组若虫置于相同条件下(光照：黑暗时间＝14:10小时，温度32±3℃，湿度50％)。饲喂足量的新鲜麦苗、燕麦、麦麸。
2.飞蝗细胞色素P450还原酶基因mRNA的表达检测。
将注射dsGFP和细胞色素P450还原酶基因片段dsRNA的飞蝗，继续饲养24小时、48小时和72小时，并储存于液氮中；采用TAKARA Trizol试剂盒提取RNA，并采用RevertAidTMHMinus Reverse Transcriptase逆转录成第一链cDNA；采用Real-time PCR技术检测细胞色素P450还原酶基因和β-actin的mRNA表达，从而对细胞色素P450还原酶基因沉默效率进行比较；结果显示，以对照dsGFP组作为基准，实验组中的细胞色素P450还原酶的mRNA极度显著降低p<0.01(图2)。
3.注射细胞色素P450还原酶基因片段的dsRNA后，对细胞色素P450还原酶活力的影响。
将注射了dsGFP和细胞色素P450还原酶基因片段dsRNA的飞蝗，继续饲养24小时和48小时，每1份虫体添加10份pH＝7.8的磷酸缓冲液，玻璃匀浆器充分匀浆；虫体匀浆液经10,000转/分离心30分钟，获得上清酶液，将950微升工作液(每毫升含0.45毫克细胞色素C)，与30微升上清酶液和100微升NADPH和20微升***混合均匀，25℃条件下恒温反应；酶标仪记录550nm处吸光值的增加值，酶活力计算公式为：细胞色素450还原酶活力(单位/毫克)＝(550nm吸光度增加值/每分钟×稀释因子×1.1倍)/(21.1×样品体积×样品蛋白浓度)；结果如图3所示，注射dsRNA后，飞蝗细胞色素P450还原酶活性显著下降。
4.注射细胞色素P450还原酶基因片段的dsRNA后，影响西维因对3龄飞蝗的死亡率。
将注射dsGFP和细胞色素P450还原酶基因片段dsRNA后的飞蝗，继续饲养24小时，在飞蝗腹部第三腹节，点滴3微升含有10微克每毫升的丙酮溶液和3微升含有15微克每毫升西维因的丙酮溶液，24小时后统计西维因对飞蝗的致死率；结果如图4所示，注射细胞色素P450还原酶的dsRNA后可将西维因对3龄飞蝗的致死率提高至1.73倍-2.3倍。
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<212> DNA
<213> Locusta migratoria
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atcattggag aaaacaatgg tcacttatat gtttgtggtg atgcaaaaaa tatggcacgt 1920
gatgtgcatg acattgttgt gaaagttgta atggaaaaag gaaatatgtc ggaatcggaa 1980
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<211> 680
<212> PRT
<213> Locusta migratoria
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Met Glu Ala Glu Ala Gly Asn Glu Leu Gly Ala Gln Pro Leu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Pro Leu Leu Gly Ala Val Asp Ile Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu
20 25 30
Ala Leu Ala Val Trp Tyr Leu Arg Ser Arg Lys Ala Lys Lys Glu Ala
35 40 45
Gln Leu Asn Ala Phe Ser Thr Lys Ser Tyr Thr Ile Gln Pro Thr Ala
50 55 60
Met Thr Ala Pro Ala Ser Asp Gln Ser Phe Ile Gln Lys Leu Lys Thr
65 70 75 80
Ser Gly Arg Ser Leu Val Val Phe Tyr Gly Ser Gln Thr Gly Thr Ala
85 90 95
Glu Glu Phe Ala Gly Arg Leu Ala Lys Glu Gly Ala Arg Tyr Arg Leu
100 105 110
Lys Gly Met Val Ala Asp Pro Glu Glu Cys Asp Met Glu Glu Leu Thr
115 120 125
Ser Leu Lys Asp Ile Pro Asn Ser Leu Ala Val Phe Cys Met Ala Thr
130 135 140
Tyr Gly Glu Gly Asp Pro Thr Asp Asn Ala Met Glu Phe Tyr Glu Trp
145 150 155 160
Leu Gln Asn Gly Asp Pro Asp Leu Ser Gly Leu Asn Tyr Ala Val Phe
165 170 175
Gly Leu Gly Asn Lys Thr Tyr Glu His Tyr Asn Glu Val Ala Lys Tyr
180 185 190
Ile Asp Lys Arg Leu Glu Asp Leu Gly Ala Thr Arg Val Tyr Glu Met
195 200 205
Gly Leu Gly Asp Asp Asp Ala Asn Ile Glu Asp Asp Phe Ile Thr Trp
210 215 220
Lys Asp Gln Phe Trp Pro Ala Val Cys Glu Phe Phe Gly Ile Glu Ser
225 230 235 240
Thr Gly Glu Asp Val Ser Val Arg Gln Tyr Arg Leu Thr Glu His Asp
245 250 255
Ser Ile Ser Ser Asp Lys Ile Tyr Thr Gly Glu Val Ala Arg Leu His
260 265 270
Ser Leu Ala Asn Gln Arg Pro Pro Tyr Asp Ala Lys Asn Pro Phe Leu
275 280 285
Ala Pro Val Lys Val Asn Lys Glu Leu His Lys Ala Gly Asp Arg Ser
290 295 300
Cys Met His Ile Glu Phe Asp Ile Glu Gly Ser Lys Met Arg Tyr Asp
305 310 315 320
Ser Gly Asp His Val Ala Val Tyr Pro Met Asn Asp Glu Ala Leu Val
325 330 335
Asn Arg Ile Gly Glu Leu Leu Asn Ile Asp Leu Asp Thr Val Ile Thr
340 345 350
Leu Thr Asn Thr Asp Glu Glu Ser Thr Lys Lys His Pro Phe Pro Cys
355 360 365
Pro Cys Ser Tyr Arg Thr Ala Leu Arg His Tyr Leu Asp Ile Thr Ser
370 375 380
Asn Pro Arg Thr His Ile Leu Lys Glu Leu Ile Glu Tyr Thr Lys Asp
385 390 395 400
Pro Gln Glu Gln Glu Lys Leu Lys Leu Met Ser Ser Thr Ser Pro Glu
405 410 415
Gly Lys Ser Leu Tyr Asn Gln Trp Ile Ile Lys Asp Asn Arg Asn Ile
420 425 430
Val His Ile Leu Glu Asp Leu Pro Ser Cys Lys Pro Ala Leu Asp His
435 440 445
Leu Cys Glu Leu Leu Pro Arg Leu Gln Ala Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser
450 455 460
Ser Ser Pro Lys Val Tyr Pro Asn Ser Val His Val Thr Ala Val Leu
465 470 475 480
Val Asp Tyr Thr Thr Pro Thr Gly Arg His Asn Lys Gly Val Ala Thr
485 490 495
Ser Trp Leu Lys Lys Lys Gln Pro Lys Glu Asp Phe Thr Pro Thr Thr
500 505 510
Pro Ile Tyr Ile Arg Arg Ser Gln Phe Arg Leu Pro Thr Arg Thr Gln
515 520 525
Thr Pro Ile Ile Met Ile Gly Pro Gly Thr Gly Leu Ala Pro Phe Arg
530 535 540
Gly Phe Ile Gln Glu Arg His Leu Ser Arg Lys Glu Gly Lys Pro Val
545 550 555 560
Gly Asp Thr Ile Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Lys Lys Ser Glu Asp Phe
565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
Asn Asn Gly His Leu Tyr Val Cys Gly Asp Ala Lys Asn Met Ala Arg
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Asp Val His Asp Ile Val Val Lys Val Val Met Glu Lys Gly Asn Met
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Ser Glu Ser Glu Ala Met Ala Tyr Val Lys Lys Met Glu Asn Gln Lys
660 665 670
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cctctgataa gatatacaca ggggaagttg caaggctgca ttcacttgca aaccagagac 240
cgccatatga tgcaaagaac ccatttcttg ctccagttaa agtcaacaaa gaacttcata 300
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atgattcagg tgaccatgta gctgtatacc ccatgaatga tgaagctctt gtcaacagga 420
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agtcaacgaa gaagcacccc cctatagtga gtcgtatta 519

Claims (1)

1.一种两端均融合有T7启动子的飞蝗细胞色素P450还原酶基因片段合成的dsRNA在提高西维因防治飞蝗效果中的应用；
所述的两端均融合有T7启动子的飞蝗细胞色素P450还原酶基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO：7所示的序列。
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