CN106456660A - 用于色素性视网膜炎的基因疗法 - Google Patents

用于色素性视网膜炎的基因疗法 Download PDF

Info

Publication number
CN106456660A
CN106456660A CN201580026274.0A CN201580026274A CN106456660A CN 106456660 A CN106456660 A CN 106456660A CN 201580026274 A CN201580026274 A CN 201580026274A CN 106456660 A CN106456660 A CN 106456660A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mir
rhodopsin
raav
nucleic acid
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201580026274.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106456660B (zh
Inventor
C·奥赖尔登
M·亚当莫维兹
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genzyme Corp
Original Assignee
Genzyme Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=52829343&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN106456660(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genzyme Corp filed Critical Genzyme Corp
Priority to CN202210690697.4A priority Critical patent/CN115252823A/zh
Publication of CN106456660A publication Critical patent/CN106456660A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106456660B publication Critical patent/CN106456660B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0058—Nucleic acids adapted for tissue specific expression, e.g. having tissue specific promoters as part of a contruct
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/34—Allele or polymorphism specific uses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell
    • C12N2330/51—Specially adapted vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本文提供使用编码miR‑708的AAV颗粒治疗色素性视网膜炎的方法。在一个方面，将病毒颗粒施用至人受试者的眼部；例如，通过视网膜下注射。包含AAV5衣壳或其突变体的病毒颗粒在考虑之列。

Description

用于色素性视网膜炎的基因疗法
本申请要求保护2014年3月21日提交的美国临时申请系列号61/969,027的优先权利益，其在本文以其整体通过提述并入。
序列表
通过提述将如下以ASCII文本文件提交的内容整体并入本文：电脑可读形式(CRF)的序列表(文件名：159792010040SeqList.txt，记录日期：2015年3月17日，大小：63KB)。
发明领域
本发明涉及AAV载体和使用AAV载体治疗色素性视网膜炎的方法。
发明内容
色素性视网膜炎(RP)是遗传性视网膜变性(inherited retinal degeneration)的最常见病因，其临床上的特征是夜盲症(night blindness)和周边视觉(peripheralvision)的丧失。视杆色素视紫红质(rod visual pigment rhodopsin)公认为体染色体显性RP(ADRP)的最常见原因，尽管已经提出了许多针对视紫红质RP的治疗方法并在动物模型和临床研究中进行了测试，该疾病仍然无法治愈(Kalloniatis,M.等(2004)Clin.Exp.Optom.87(2):65-80)。许多数据支持这样的观点，即视紫红质RP是一种蛋白质错误折叠疾病，其中突变体蛋白的错误折叠或错误装配改变其细胞命运并诱发细胞死亡(Gregersen,N.等(2006)Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.7:103-24)。视紫红质基因中已知的RP突变包括无义和短小、读框内缺失突变，其中视紫红质基因在密码子23(P23H)处的单一碱基取代占美国全部显性色素性视网膜炎病例的～7％(Dryja,T.P.等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(22):10177-81)。在培养的细胞中，与野生型(WT)蛋白不同，P23H突变体蛋白保留在ER中，这导致对未折叠蛋白质反应(unfolded proteinresponse；UPR)的诱导、对蛋白酶体的抑制且突变体蛋白聚集成寡聚、高分子量形式(oligomeric,high molecular weight species)，这种寡聚、高分子量形式形成胞内包含体(intracellular inclusion)(Saliba,R.S.等(2002)J.Cell Sci.115:2907-18)。类似地，P23H视紫红质错误定位和/或聚集在动物RP模型的视杆细胞中(Olsson,J.E.等(1992)Neuron 9(5):815-30)，表明细胞培养物模型可以预测这种疾病的体内模型。需要的是一种缓解RP症状的手段。
本文描述的发明提供用于治疗哺乳动物中色素性视网膜炎的方法，包括将包含编码miR-708的载体的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus；rAAV)病毒颗粒施用至所述哺乳动物的眼部。在一些实施方案中，所述rAAV载体包含编码miR-708和视紫红质的核酸。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗色素性视网膜炎的方法，包括将包含第一rAAV载体的第一rAAV病毒颗粒和包含第二rAAV载体的第二rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物的眼部，所述第一rAAV载体包含编码miR-708的核酸，所述第二rAAV载体包含编码视紫红质的核酸。在其他实施方案中，本发明提供用于治疗色素性视网膜炎的方法，包括将包含rAAV载体的rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物的眼部，所述rAAV载体编码miR-708和视紫红质的核酸。在一些实施方案中，治疗色素性视网膜炎包括减少或预防与色素性视网膜炎相关的症状。在一些实施方案或本发明中，治疗色素性视网膜炎的方法包括减少与RP有关的症状的方法，预防视网膜变性的方法，用于阻滞RP进展的方法，提高感光细胞功能的方法，等等。RP的症状和/或病理包括但不限于失明、夜间视觉丧失、周边视野损失、ERG功能丧失；视觉敏锐度和对比敏感度损失；视觉引导行为的丧失，视杆细胞功能下降，视杆细胞死亡，降低的暗视觉(scotopic vision)，视网膜细胞变化减少，感光细胞结构或功能的丧失；外核层(ONL)变薄或变厚；外网层(OPL)变薄或变厚；杆状和锥状外段的瓦解和之后的丧失(disorganization followed by loss of rod and cone outer segments)；杆状和锥状内段变短；双极细胞树突的回缩；视网膜内层包括内核层、内网层、神经节细胞(ganglion cell)层和神经纤维层的变薄或变厚；视蛋白错误定位；神经丝的过度表达；等等。在一些实施方案中，本发明提供预防视杆细胞功能退化和视杆细胞死亡和视锥细胞功能退化和视锥细胞死亡的方法。
在一些方面，本发明提供治疗细胞中内质网(ER)应激的方法，包括将包含rAAV载体的rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物，所述rAAV载体包含编码miR-708的核酸。在一些实施方案中，所述哺乳动物患有或有风险罹患RP。在一些实施方案中，所述哺乳动物是患有RP或处于罹患RP的风险的人。在一些实施方案中，将所述rAAV颗粒施用至哺乳动物的眼部。在一些实施方案中，所述细胞是眼细胞。在进一步的实施方案中，所述细胞是感光细胞。在更进一步的实施方案中，所述细胞是视杆细胞。在一些实施方案中，所述方法包括减少ER应激的一种或多种细胞标记物。在进一步的实施方案中，所述ER应激的一种或多种细胞标记物是剪接的XBP-1、CHOP或Grp78。在一些实施方案中，所述rAAV载体包含编码miR-708和视紫红质的核酸。在其他实施方案中，本发明提供用于治疗细胞中内质网(ER)应激的方法，包括将包含编码miR-708的核酸的第一rAAV载体和包含含有编码视紫红质的核酸的第二rAAV载体的第二rAAV病毒颗粒施用至哺乳动物。
在本发明的一些实施方案中，所述编码miR-708的核酸可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，所述启动子能够在感光细胞(例如，视杆细胞)中表达miR-708。在进一步的实施方案中，所述启动子包括视紫红质激酶(RK)启动子或视蛋白启动子。在本发明的其他实施方案中，所述编码视紫红质的核酸可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，所述启动子能够在感光细胞(例如，视杆细胞)中表达视紫红质。在进一步的实施方案中，所述启动子包括RK启动子或视蛋白启动子。
在一些实施方案中，本发明提供治疗RP和/或ER应激的方法，包括向哺乳动物施用包含rAAV载体的rAAV颗粒，所述rAAV载体包含编码miR-708和视紫红质的核酸。在一些实施方案中，所述编码miR-708的核酸和编码视紫红质的核酸可操作地连接至一个RK启动子。在其他实施方案中，所述编码miR-708的核酸可操作地连接至第一RK启动子或第一视蛋白启动子，而所述编码视紫红质的核酸可操作地连接至第二RK启动子或第二视蛋白启动子。在一些实施方案中，所述第一和/或第二视蛋白启动子包括MVM内含子(例如，SEQ ID NO:23的内含子)。在一些实施方案中，所述编码miR-708的核酸在所述编码视紫红质的核酸的5’。在其他实施方案中，所述编码miR-708的核酸在所述编码视紫红质的核酸的3’。在一些实施方案中，所述编码miR-708的核酸可操作地连接至鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。在一些实施方案中，所述编码视紫红质的核酸可操作地连接至鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。在一些实施方案中，源自小鼠细小病毒(MVM)内含子的序列位于所述启动子的3’。在一些实施方案中，所述MMV内含子包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述启动子还包含：i)CMV增强子；ii)源自光感受器特异性转录因子的序列；iii)源自视杆细胞特异性转录因子的序列；iv)源自神经视网膜碱性拉链因子(basic zipper factor)的序列；v)源自含视锥视杆同源框(cone rod homebox)的转录因子序列的序列；vi)CMV增强子，和源自光感受器特异性转录因子的序列、源自视杆细胞特异性转录因子的序列、源自神经视网膜碱性拉链因子的序列、源自含视锥视杆同源框的转录因子序列的序列中的至少一种或多种；vii)神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、CMV增强子和视蛋白启动子(-500至+17)；viii)神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、CMV增强子、视蛋白启动子(-500至+17)和MVM内含子；ix)包含SEQ IDNO:29的CMV增强子；x)包含SEQ ID NO:30的神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子序列；xi)包含SEQ ID NO:28的源自含视锥视杆同源框的转录因子序列的序列；xii)包含SEQ ID NO:29的CMV增强子，和源自光感受器特异性转录因子的序列、源自视杆细胞特异性转录因子的序列、包含SEQ ID NO:30的源自神经视网膜碱性拉链因子的序列、包含SEQ ID NO:28的源自含视锥视杆同源框的转录因子序列的序列中的至少一种或多种；xiii)包含SEQ ID NO:30的神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、包含SEQ ID NO:29的CMV增强子和包含SEQ ID NO:22的视蛋白启动子(-500至+17)；或xiv)包含SEQ ID NO:28的神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、包含SEQ ID NO:29的CMV增强子、包含SEQ ID NO:22的视蛋白启动子(-500至+17)和包含SEQ ID NO:23的MVM内含子。在一些实施方案中，所述编码miR-708的核酸嵌入在内含子中。在一些实施方案中，所述编码miR-708的核酸包含内源性miR-708支架或miR-155支架。
在一些实施方案中，本发明提供治疗RP和/或ER应激的方法，包括向哺乳动物施用包含rAAV载体的rAAV颗粒，所述rAAV载体包含编码miR-708的核酸。在一些实施方案中，所述编码miR-708的核酸包含SEQ ID NO:1的核酸。在一些实施方案中，所述编码miR-708的核酸包含与SEQ ID NO:1具有约至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸。
在一些实施方案中，本发明提供治疗RP和/或ER应激的方法，包括向哺乳动物施用包含rAAV载体的rAAV颗粒，所述rAAV载体包含编码视紫红质的核酸。在一些实施方案中，所述视紫红质是哺乳动物视紫红质或其功能等同物。在一些实施方案中，所述视紫红质是人视紫红质或其功能等同物。在一些实施方案中，所述视紫红质缺少3’非翻译区(UTR)miR-708靶序列。在一些实施方案中，所述编码视紫红质的核酸在miR-708靶序列中包含核酸的取代、***或缺失。在一些实施方案中，所述取代、***或缺失降低或阻止miR-708进行的识别。在一些实施方案中，所述编码视紫红质的核酸在miR-708靶序列中包含核酸的取代、***或缺失，其中所述miR-708靶序列是SEQ ID NO:19。在一些实施方案中，所述视紫红质的表达难以受到miR-708的抑制。在一些实施方案中，所述视紫红质包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质包含与SEQ ID NO:2具有约至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码视紫红质的核酸包含SEQ ID NO:3的核酸。在一些实施方案中，所述编码视紫红质的核酸包含与SEQ ID NO:3具有约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸。
在一些实施方案中，本发明提供治疗RP和/或ER应激的方法，包括向哺乳动物施用包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的多核苷酸的rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述AAV病毒颗粒包含重组病毒基因组，所述重组病毒基因组包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27具有约至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸。
在一些实施方案中，本发明提供治疗RP和/或ER应激的方法，包括向哺乳动物施用rAAV颗粒，其中所述AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合型、牛AAV或小鼠AAV衣壳rAAV2/HBoV1血清型衣壳。在一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒包含AAV血清型5衣壳。在一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒包含AAV血清型5酪氨酸突变体衣壳。
在一些实施方案中，本发明提供治疗RP和/或ER应激的方法，包括向哺乳动物施用包含编码miR-708的核酸的第一rAAV病毒颗粒和编码视紫红质的第二rAAV病毒颗粒。在一些实施方案中，所述第一rAAV颗粒和/或所述第二rAAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合型、牛AAV或小鼠AAV衣壳rAAV2/HBoV1血清型衣壳。在一些实施方案中，所述第一rAAV病毒颗粒和/或所述第二rAAV病毒颗粒包含AAV血清型5衣壳。在一些实施方案中，所述第一rAAV病毒颗粒和/或所述第二rAAV病毒颗粒包含AAV血清型5酪氨酸突变体衣壳。
在一些实施方案中，本发明提供治疗RP和/或ER应激的方法，包括向哺乳动物施用rAAV颗粒，其中所述AAV载体包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。在一些实施方案中，本发明提供治疗RP和/或ER应激的方法，包括向哺乳动物施用包含第一rAAV载体的第一rAAV病毒颗粒和包含第二rAAV载体的第二rAAV病毒颗粒，所述第一rAAV载体包含编码miR-708的核酸，所述第二rAAV载体编码视紫红质。在一些实施方案中，所述第一rAAV载体和/或所述第二rAAV病毒载体包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAVDJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。
在本发明的一些实施方案中，所述方法的rAAV载体包含AAV血清型2ITR。在一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳来自相同的AAV血清型。在其他实施方案中，所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自不同的AAV血清型。在一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒包含AAV-5衣壳，并且其中所述载体包含AAV2 ITR。在一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒包含AAV-5酪氨酸突变体衣壳，并且其中所述载体包含AAV2 ITR。
在一些实施方案中，本发明提供治疗哺乳动物中RP和/或ER应激的方法，其中将rAAV颗粒注射至所述哺乳动物视网膜的视网膜下间隙中。在一些实施方案中，将所述rAAV施用至所述哺乳动物视网膜的视网膜下间隙中超过一个位置。在其他实施方案中，将所述rAAV颗粒玻璃体内(intravitreally)注射至所述哺乳动物。在一些实施方案中，至少10-30％的感光细胞(例如，视杆细胞)由所述AAV转导。
在一些实施方案中，本发明提供治疗哺乳动物中RP和/或ER应激的方法，其中所述哺乳动物在内源视紫红质基因中具有突变。在一些实施方案中，所述内源视紫红质基因中的突变是体染色体显性突变。在一些实施方案中，所述色素性视网膜炎是体染色体显性色素性视网膜炎。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述人具有内源性视紫红质基因中的P23H突变。
在一些实施方案中，本发明提供治疗RP和/或ER应激的方法，包括向哺乳动物施用包含编码miR-708的核酸的第一rAAV病毒颗粒和编码视紫红质的第二rAAV病毒颗粒，其中将所述编码miR-708的第一rAAV病毒颗粒和所述编码视紫红质的第二rAAV病毒颗粒同时施用哺乳动物。在一些实施方案中，将所述编码miR-708的第一rAAV病毒颗粒和所述编码视紫红质的rAAV病毒颗粒连续施用至哺乳动物。在一些实施方案中，首先将编码miR-708的rAAV病毒颗粒施用至哺乳动物，其次再将编码视紫红质的rAAV病毒颗粒施用至哺乳动物。在一些实施方案中，首先将编码视紫红质的rAAV病毒颗粒施用至哺乳动物，其次再将编码miR-708的rAAV病毒颗粒施用至哺乳动物。
在本发明的一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒在药物组合物中。在一些实施方案中，所述药物组合物进一步包含药物上可接受的载剂。在一些实施方案中，本发明提供包含rAAV颗粒的组合物，所述rAAV颗粒包含rAAV载体，所述rAAV载体包含编码miR-708的核酸，其用于本文所述的方法中。在一些实施方案中，本发明提供包含rAAV载体的rAAV颗粒，所述rAAV载体包含编码miR708的核酸，用于根据本文所述的任何方法治疗色素性视网膜炎或降低ER应激。在一些实施方案中，本发明提供第一rAAV颗粒和第二rAAV颗粒，所述第一rAAV颗粒包含含有编码miR708的核酸的rAAV载体，所述第二rAAV颗粒包含含有编码视紫红质的核酸的rAAV载体，用于根据本文所述的任何方法治疗色素性视网膜炎或降低ER应激。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含含有编码miR708和视紫红质的核酸的rAAV载体，用于根据本文所述的任何方法治疗色素性视网膜炎或降低ER应激。
在一些方面，本文描述的发明提供用于治疗哺乳动物中色素性视网膜炎的组合物，其包含重组腺相关病毒(rAAV)病毒颗粒，所述病毒颗粒包含编码miR-708的载体。在一些实施方案中，所述包含编码miR-708的核酸的rAAV载体还包含编码视紫红质的核酸。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗色素性视网膜炎的组合物，其包含第一rAAV病毒颗粒和第二rAAV病毒颗粒，所述第一rAAV病毒颗粒包含含有编码miR-708的核酸的第一rAAV载体，所述第二rAAV病毒颗粒包含含有编码视紫红质的核酸的第二rAAV载体。在其他实施方案中，本发明提供用于治疗色素性视网膜炎的组合物，其包含含有rAAV载体的rAAV病毒颗粒，所述rAAV载体包含编码miR-708和视紫红质的核酸。
在一些方面，本发明提供用于治疗细胞中内质网(ER)应激的组合物，其包含含有rAAV载体的rAAV病毒颗粒，所述rAAV载体包含编码miR-708的核酸。在一些方面，本发明提供用于治疗细胞中内质网(ER)应激的组合物，其包含含有rAAV载体的rAAV病毒颗粒，所述rAAV载体包含编码miR-708和视紫红质的核酸。在一些实施方案中，具有ER应激的哺乳动物患有或有风险罹患RP。在一些实施方案中，具有ER应激的哺乳动物是患有或有风险罹患RP的人。在一些实施方案中，将所述rAAV颗粒施用至所述哺乳动物的眼部。在一些实施方案中，所述细胞是眼细胞。在进一步的实施方案中，所述细胞是感光细胞。在更进一步的实施方案中，所述细胞是视杆细胞。在一些实施方案中，所述组合物减少ER应激的一种或多种细胞标记物。在进一步的实施方案中，所述ER应激的一种或多种细胞标记物是剪接的XBP-1、CHOP或Grp78。在一些实施方案中，所述rAAV载体包含编码miR-708的核酸，进一步包含编码视紫红质的核酸。在其他实施方案中，本发明提供用于治疗细胞中内质网(ER)应激的组合物，其包含第一rAAV载体和包含第二rAAV载体的第二rAAV病毒颗粒，所述第一rAAV载体包含编码miR-708的核酸，所述第二rAAV载体包含编码视紫红质的核酸。
在本发明的一些实施方案中，所述编码miR-708的核酸可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，所述启动子能够在感光细胞(例如，视杆细胞)中表达miR-708。在进一步的实施方案中，所述启动子包括视紫红质激酶(RK)启动子或视蛋白启动子。在本发明的其他实施方案中，所述编码视紫红质的核酸可操作地连接至启动子。在一些实施方案中，所述启动子能够在感光细胞(例如，视杆细胞)中表达视紫红质。在进一步的实施方案中，所述启动子包括RK启动子或视蛋白启动子。
在一些实施方案中，本发明提供组合物以治疗RP和/或ER应激，其包含rAAV颗粒，所述rAAV颗粒包含含有编码miR-708和视紫红质的核酸的rAAV载体。在一些实施方案中，所述编码miR-708的核酸和编码视紫红质的核酸可操作地连接至一个RK启动子。在其他实施方案中，所述编码miR-708的核酸可操作地连接至第一RK启动子或第一视蛋白启动子，而所述编码视紫红质的核酸可操作地连接至第二RK启动子或第二视蛋白启动子。在一些实施方案中，所述第一和/或第二视蛋白启动子包括MVM内含子(例如，SEQ ID NO:23的内含子)。在一些实施方案中，所述编码miR-708的核酸在所述编码视紫红质的核酸的5’。在其他实施方案中，所述编码miR-708的核酸在所述编码视紫红质的核酸的3’。在一些实施方案中，所述编码miR-708的核酸可操作地连接至鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。在一些实施方案中，所述编码视紫红质的核酸可操作地连接至鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。在一些实施方案中，所述第一和/或第二视蛋白启动子包括MVM内含子(例如，SEQ ID NO:23的内含子)。在一些实施方案中，编码miR-708的核酸在编码视紫红质的核酸的5’。在其他实施方案中，编码miR-708的核酸在编码视紫红质的核酸的3’。在一些实施方案中，编码miR-708的核酸可操作地连接至鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。在一些实施方案中，编码视紫红质的核酸可操作地连接至鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。在一些实施方案中，源自小鼠细小病毒(MVM)内含子的序列位于所述启动子的3’。在一些实施方案中，所述MMV内含子包含SEQ ID NO:23的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述启动子还包含i)CMV增强子；ii)源自光感受器特异性转录因子的序列；iii)源自视杆细胞特异性转录因子的序列；iv)源自神经视网膜碱性拉链因子的序列；v)源自含视锥视杆同源框的转录因子序列的序列；vi)CMV增强子，和源自光感受器特异性转录因子的序列、源自视杆细胞特异性转录因子的序列、源自神经视网膜碱性拉链因子的序列、源自含视锥视杆同源框的转录因子序列的序列中的至少一种或多种；vii)神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、CMV增强子和视蛋白启动子(-500至+17)；viii)神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、CMV增强子、视蛋白启动子(-500至+17)和MVM内含子；ix)包含SEQ ID NO:29的CMV增强子；x)包含SEQ ID NO:30的神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子序列；xi)包含SEQID NO:28的源自含视锥视杆同源框的转录因子序列的序列；xii)包含SEQ ID NO:29的CMV增强子，和源自光感受器特异性转录因子的序列、源自视杆细胞特异性转录因子的序列、包含SEQ ID NO:30的源自神经视网膜碱性拉链因子的序列、包含SEQ ID NO:28的源自含视锥视杆同源框的转录因子序列的序列中的至少一种或多种；xiii)包含SEQ ID NO:30的神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、包含SEQ ID NO:29的CMV增强子和包含SEQ ID NO:22的视蛋白启动子(-500至+17)；或xiv)包含SEQ ID NO:28的神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、包含SEQ ID NO:29的CMV增强子、包含SEQ ID NO:22的视蛋白启动子(-500至+17)和包含SEQ IDNO:23的MVM内含子。在一些实施方案中，所述编码miR-708的核酸嵌入在内含子中。在一些实施方案中，所述编码miR-708的核酸包含内源性miR-708支架或miR-155支架。
在一些实施方案中，本发明提供组合物以治疗RP和/或ER应激，其包含rAAV颗粒，所述rAAV颗粒包含含有编码miR-708的核酸的rAAV载体。在一些实施方案中，所述编码miR-708的核酸包含SEQ ID NO:1的核酸。在一些实施方案中，所述编码miR-708的核酸包含与SEQ ID NO:1具有约至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸。
在一些实施方案中，本发明提供组合物以治疗RP和/或ER应激，其包含rAAV颗粒，所述rAAV颗粒包含含有编码视紫红质的核酸的rAAV载体。在一些实施方案中，所述视紫红质是哺乳动物视紫红质或其功能等同物。在一些实施方案中，所述视紫红质是人视紫红质或其功能等同物。在一些实施方案中，所述视紫红质缺少3’非翻译区(UTR)miR-708靶序列。在一些实施方案中，所述编码视紫红质的核酸在miR-708靶序列中包含核酸的取代、***或缺失。在一些实施方案中，所述取代、***或缺失降低或阻止miR-708进行的识别。在一些实施方案中，所述编码视紫红质的核酸在miR-708靶序列中包含核酸的取代、***或缺失，其中所述miR-708靶序列是SEQ ID NO:19。在一些实施方案中，所述视紫红质的表达难以受到miR-708的抑制。在一些实施方案中，所述视紫红质包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质包含与SEQ ID NO:2具有约至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码视紫红质的核酸包含SEQ ID NO:3的核酸。在一些实施方案中，所述编码视紫红质的核酸包含与SEQ ID NO:3具有约85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸。
在一些实施方案中，本发明提供组合物以治疗RP和/或ER应激，其包含rAAV颗粒，所述rAAV颗粒包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的多核苷酸。在一些实施方案中，所述AAV病毒颗粒包含重组病毒基因组，所述重组病毒基因组包含与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27具有约至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的多核苷酸。
在一些实施方案中，本发明提供组合物以治疗RP和/或ER应激，其包含rAAV颗粒，其中所述AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合型、牛AAV或小鼠AAV衣壳rAAV2/HBoV1血清型衣壳。在一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒包含AAV血清型5衣壳。在一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒包含AAV血清型5酪氨酸突变体衣壳。
在一些实施方案中，本发明提供用于治疗RP和/或ER应激的组合物，其包含含有编码miR-708的核酸的第一rAAV病毒颗粒和编码视紫红质的第二rAAV病毒颗粒。在一些实施方案中，所述第一rAAV颗粒和/或所述第二rAAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合型、牛AAV或小鼠AAV衣壳rAAV2/HBoV1血清型衣壳。在一些实施方案中，所述第一rAAV病毒颗粒和/或所述第二rAAV病毒颗粒包含AAV血清型5衣壳。在一些实施方案中，所述第一rAAV病毒颗粒和/或所述第二rAAV病毒颗粒包含AAV血清型5酪氨酸突变体衣壳。
在一些实施方案中，本发明提供组合物以治疗RP和/或ER应激，其包含rAAV颗粒，其中所述AAV载体包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗RP和/或ER应激的组合物，其包含第一rAAV病毒颗粒和第二rAAV病毒颗粒，所述第一rAAV病毒颗粒包含含有编码miR-708的核酸的第一rAAV载体，所述rAAV病毒颗粒包含编码视紫红质的第二载体。在一些实施方案中，所述第一rAAV载体和/或所述第二rAAV病毒载体包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11或AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR。。
在本发明的一些实施方案中，所述组合物的rAAV载体包含AAV血清型2 ITR。在一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自相同的AAV血清型。在其他实施方案中，所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自不同的AAV血清型。在一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒包含AAV-5衣壳，并且其中所述载体包含AAV2 ITR。在一些实施方案中，所述rAAV病毒颗粒包含AAV-5酪氨酸突变体衣壳，并且其中所述载体包含AAV2 ITR。
在一些实施方案中，本发明提供组合物以在哺乳动物中治疗RP和/或ER应激，其中所述哺乳动物具有内源性视紫红质基因中的突变。在一些实施方案中，所述内源性视紫红质基因中的突变是体染色体显性突变。在一些实施方案中，所述色素性视网膜炎是体染色体显性色素性视网膜炎。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述人具有内源性视紫红质基因中的P23H突变。
在一些实施方案中，本发明提供试剂盒以在哺乳动物中治疗RP或降低ER应激，其包含有效量的根据本文描述的方法的rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含有效量的如本文所述的组合物。在一些实施方案中，所述试剂盒包含有效量的rAAV颗粒，所述rAAV颗粒包含含有编码miR-708的核酸的rAAV载体。在一些实施方案中，所述试剂盒包含有效量的rAAV颗粒，所述rAAV颗粒包含含有编码miR-708和视紫红质的核酸的rAAV载体。在一些实施方案中，所述试剂盒包含有效量的第一rAAV颗粒和有效量的第二rAAV颗粒，所述第一rAAV颗粒包含含有编码miR-708的核酸的rAAV载体，所述第二rAAV颗粒包含含有编码视紫红质的核酸的第二rAAV载体。在进一步的实施方案中，所述试剂盒包含将所述rAAV颗粒用于治疗色素性视网膜炎和/或降低ER应激的说明书。在进一步的实施方案中，所述试剂盒包含关于在本文所述的任一方法中使用的说明书。
在一些方面，本发明提供包含根据本文所述方法的有效量的rAAV颗粒的制品。在一些实施方案中，所述制品包含有效量的本文所述的任一组合物。在一些实施方案中，所述制品包含有效量的rAAV颗粒，所述rAAV颗粒包含含有编码miR-708的核酸的rAAV载体。在一些实施方案中，所述制品包含有效量的rAAV颗粒，所述rAAV颗粒包含含有编码miR-708和视紫红质的核酸的rAAV载体。在一些实施方案中，所述制品包含有效量的第一rAAV颗粒和有效量的第二rAAV颗粒，所述第一rAAV颗粒包含含有编码miR-708的核酸的rAAV载体，所述第二rAAV颗粒包含含有编码视紫红质的核酸的第二rAAV载体。
在一些方面，本发明提供包含源自MVM的内含子的核酸。在一些实施方案中，所述MVM内含子包含SEQ ID NO:23。在一些实施方案中，所述核酸还包含启动子。在一些实施方案中，所述核酸还包含增强子。在一些实施方案中，所述启动子位于所述MVM内含子的5’。在一些实施方案中，本发明提供包含所述核酸的表达构建体。在一些实施方案中，本发明提供包含所述核酸或所述表达构建体的载体。在一些实施方案中，本发明提供包含核酸、表达构建体或载体的细胞。
附图简述
图1A和1B显示野生型(图1A)和P23H突变型(图1B)视紫红质在人视网膜色素上皮细胞中的定位。将细胞针对视紫红质(绿色)、α-微管蛋白(红色)和DNA(蓝色)进行染色。野生型视紫红质的染色样式的特征在于膜定位(实心箭头)，而P23H突变视紫红质的染色样式的特征在于绕核(perinuclear)/网状(reticular)定位(虚线箭头)。
图2A和2B显示P23H突变视紫红质形成非天然寡聚体并保留ER特异性寡糖。(图2A)来自表达野生型(“wt”)或P23H突变视紫红质的细胞的洗涤剂可溶性提取物的蛋白质印迹。(图2B)来自表达野生型(“wt”)或P23H突变视紫红质的细胞的洗涤剂可溶性提取物的蛋白质印迹。提取物用内切糖苷酶H(Endoglycosidase H)(“Endo-H”)处理或不经处理。
图3A和3B显示表达P23H视紫红质的细胞具有较高的UPR标记物表达和较高的凋亡倾向。(图3A)C/EBP同源蛋白(CHOP；即Ddit3)、结合免疫球蛋白(BiP；即Hspa5)和视紫红质基因在表达野生型(“wt”)或P23H突变视紫红质的细胞中的相对表达。使用ΔΔCt方法将各个基因的相对表达与β-葡糖醛酸糖苷酶(beta-glucoronidase)表达比较。(图3B)表达对照(pcDNA)、野生型视紫红质或P23H突变视紫红质的细胞中凋亡细胞的百分比，通过TUNEL染色测量。
图4显示用于在泛素启动子(鸡β-肌动蛋白，CBA)或感光特异性(photoreceptor-specific)启动子(视紫红质激酶，RK)调控下表达miR-708的表达载体的构建的示意图。合成了编码miR-708的茎和环序列的DNA并克隆至5’和3’miR-155支架序列之间。这种支架序列含有Drosha在核中将pri-miR-708加工成pre-miR-708所需的靶位点，允许后续通过Dicer在细胞质中对pre-miR-708进行加工。
图5显示相对于未转染的细胞，视紫红质蛋白在表达miR-708或对照miRNA的细胞中的表达。所有细胞均为表达具有3’UTR miR708靶序列的mP23H视紫红质的HEK-293细胞。将视紫红质蛋白表达相对于hGAPDH表达标准化。视紫红质蛋白水平在miR708存在时与对照miR相比有所减少。
图6显示与表达对照miRNA(“乱序(Scramble)”)的细胞相比，表达mP23H视紫红质的HEK-293细胞在表达miR-708时具有降低的UPR标记物基因CHOP和BiP的RNA水平。
图7A和7B显示通过内源miR-708下调视紫红质依赖于视紫红质3’UTR中miR-708靶序列的存在。将HEK-293细胞用包括miR-708靶序列的小鼠P23H视紫红质基因(图7A)，或用缺少miR-708靶序列的人P23H视紫红质基因(图7B)转染。还将细胞用对照pre-miRNA或抗miR-708 pre-miRNA转染以抑制内源miR-708。相对于hGAPDH蛋白测量视紫红质蛋白，并且相对于hGAPDH mRNA测量视紫红质mRNA。还显示内源miR-708的水平(图7A和7B中的右侧轴和最右两栏)。
图8描绘用于在视杆感光细胞中表达miR-708的AAV载体的示意图。对相关的载体特征进行标示。
图9A和9B显示使用AAV载体表达miR-708下调P23H突变视紫红质。(图9A)在转染编码由RK启动子驱动的miR-708或对照miRNA(“乱序(scramble)”)的载体时，WERI或RPE细胞中miR-708的表达。表达相对于miR-16描绘。(图9B)相对于用对照质粒转染的细胞，在用pRK-miR-708质粒转染的WERI细胞中P23H视紫红质mRNA的表达。
图10A-10C显示AAV5 miR-708载体的视网膜下递送导致小鼠视紫红质的敲低(knockdown)。(图10A)m视紫红质在注射AAV5 miR-708或AAV5 miR-对照的小鼠视网膜中的表达。(图10B)RdCVF在注射AAV5 miR-708或AAV5 miR-对照的小鼠视网膜中的表达。(图10C)miR-708在注射AAV5 miR-708或AAV5 miR-对照的小鼠视网膜中的表达。
图11A和11B显示用AAV5 miR-708处理眼降低视杆细胞介导、但视锥细胞不介导的反应。(图11A)***性视网膜电图，代表在接受AAV5 miR-708或AAV5 miR-对照(“Scram”)的眼中的暗视反应(scoptopic response)。(图11B)***性视网膜电图，代表在与(图11A)相同的接受AAV5 miR-708或AAV5 miR-对照(“Scram”)的眼中的明视反应(photopic response)。
图12提供miR-708内含子嵌入h视紫红质抑制/替代载体的示意图。
图13显示如与miR-对照载体比较，内含子嵌入的miR-708载体降低m视紫红质、hCHOP和hBiP在用P23H m视紫红质转染的WERI细胞中的表达。
图14显示在WERI中miR-708由内含子嵌入载体的表达比非嵌入载体具有降低的表达，事先声明的是内含子嵌入载体pRK-hRHO-内含子miR-708也共表达h视紫红质。全部使用RK启动子驱动miR-708表达的载体比使用CBA启动子的载体具有低几个数量级的表达。
图15显示h视紫红质由内含子嵌入抑制/替代载体的表达难以通过共表达的miR-708敲低。h视紫红质RNA的水平在用表达miR-708或miR-对照的载体转染的细胞中是相同的。
图16显示在表达突变视紫红质的WERI细胞中，miR-708抑制/替代载体降低XBP-1剪接(一种ER应激的标记物)。这种降低仅在视紫红质转录物中存在3’UTR miR-708靶序列的条件下被观察到。
图17显示在视紫红质cDNA的3’UTR中具有miR-708人β-球蛋白内含子支架的载体的示意图。
图18显示在视紫红质cDNA的3’UTR中具有miR-708人β-球蛋白内含子支架的载体比在5’UTR具有支架的载体产生更高的h视紫红质和miR-708表达。
图19显示另一种载体设计的示意图，其使用单独的启动子来驱动miR-708(RK启动子)和h视紫红质(小鼠视蛋白启动子)的表达。
图20显示用指定载体转染的WERI细胞中h视紫红质(左)和miR-708(右)表达。将表达表示为针对DNA标准品计算的拷贝数。
图21A-C显示在视网膜下注射以使用视蛋白启动子在miR-708支架中驱动人视紫红质和miR-708(miR 708/708)或人视紫红质和对照miRNA(miR-对照)表达的AAV5衣壳载体之后三周，小鼠视网膜中miR-708(图21A)、小鼠视紫红质(图21B)和人视紫红质(图21C)的水平。对于每个实验，将表达作为与对侧、未经注射的眼的表达倍数显示。
图22显示视蛋白启动子构建体的示意图，包括神经视网膜碱性拉链因子序列(NRL)、CMV增强子、视蛋白启动子和MVM内含子序列，其包括来自CBA外显子1和来自小鼠细小病毒的内含子的杂合内含子序列(MVM)。
图23A显示嵌入β-球蛋白内含子中的miR-708序列的示意图。
图23B和23C显示在miR-708内源性支架(图23B)或在miR-155支架(图23C)背景(context)下的miR-708序列的示意图，其嵌入在β-球蛋白内含子中。在图23C中标记出5’和3’miR侧翼序列之间的miR-155“环序列”。
图24显示对候选载体的评估，所述候选载体含有由视紫红质激酶(GRK1)启动子或视蛋白(Ops)启动子驱动的在miR-155或miR-708支架(嵌入β-球蛋白内含子中)中的miR-708序列和人视紫红质编码序列(人视紫红质；也缺乏3’UTR miR-708靶序列)。如图所示，测试了所有四种组合对miR-708和人视紫红质表达的作用。
发明详述
本发明提供了用于治疗哺乳动物中的色素性视网膜炎(RP)的方法，包括将包含编码miR-708的载体的重组腺相关病毒(rAAV)病毒颗粒施用至所述哺乳动物的眼部。所述miR-708靶向视紫红质基因的3’非翻译区中的区域，并且因此可抑制突变视紫红质与RP相关的活性。在一些方面，本发明提供用于治疗哺乳动物中色素性视网膜炎的方法，包括将包含编码miR-708和野生型视紫红质核酸的载体的重组腺相关病毒(rAAV)病毒颗粒施用至所述哺乳动物的眼部。如此，所述载体可抑制突变视紫红质与RP相关的活性，同时用野生型视紫红质替代突变视紫红质。在一些实施方案中，编码野生型视紫红质的核酸不包括miR-708的3’UTR靶，因此miR-708将仅靶向突变视紫红质的表达。本发明还提供包含编码miR-708的rAAV颗粒并包含编码视紫红质的rAAV颗粒的组合物。在一些实施方案中，本发明提供包含编码miR-708和视紫红质二者的rAAV颗粒的组合物。
I.通用技术
本文描述或引用的技术和流程通常是本领域技术人员充分理解的并使用常规方法学通常采用的，例如，举例来说，广泛使用的方法学描述在Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Sambrook等,第4版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,2012)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,等编,2003)；the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；PCR 2:APractical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编,1995)；Antibodies,ALaboratory Manual(Harlow和Lane编,1988)；Culture of Animal Cells:A Manual ofBasic Technique and Specialized Applications(R.I.Freshney,第6编,J.Wiley andSons,2010)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984)；Methods in MolecularBiology,Humana Press；Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编,AcademicPress,1998)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts,Plenum Press,1998)；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,和D.G.Newell编,J.Wiley and Sons,1993-8)；Handbook ofExperimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编,1996)；Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编,1987)；PCR:The Polymerase ChainReaction,(Mullis等编,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等编,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等编,J.Wiley and Sons,2002)；Immunobiology(C.A.Janeway等,2004)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:APractical Approach(D.Catty编,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:APractical Approach(P.Shepherd和C.Dean编,Oxford University Press,2000)；UsingAntibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编,Harwood AcademicPublishers,1995)；和Cancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVita等编,J.B.Lippincott Company,2011)中。
II.定义
“载体”，如用于本文，指重组质粒或病毒，其包含在体外或在体内递送至宿主细胞的核酸。
术语“多核苷酸”或“核酸”如用于本文指任何长度的核苷酸(或者是核糖核苷酸或者是脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。因此，该术语包括，但不限于，单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体，或包含嘌呤和嘧啶碱基的聚合物，或其他天然的、经化学或生物修饰的、非天然的或衍生化的核苷酸碱基。所述多核苷酸的主链可以包含糖和磷酸基团(如通常可见于RNA或DNA中)，或经修饰或取代的糖或磷酸基团。或者，所述多核苷酸的主链可包含合成亚基如氨基磷酸酯的聚合物，并因此可以是寡聚脱氧核糖核苷胺基磷酸酯(oligodeoxynucleoside phosphoramidate)(P-NH2)或混合型氨基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。此外，双链多核苷酸可以获得自化学合成的单链多核苷酸产物，或者通过合成互补链并在合适条件下将链退火，或者通过使用DNA聚合酶以合适的引物从头(de novo)合成互补链。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，用于指氨基酸残基的聚合物，并且不限制最小长度。这样的氨基酸残基的聚合物可以含有天然的或非天然的氨基酸残基，并且包括但不限于肽、寡肽、氨基酸残基的二聚体、三聚体和多聚体。全长蛋白质及其片段二者均涵盖在该定义内。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如，糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。另外，就本发明而言，“多肽”涉及包括对天然序列进行修饰如缺失、添加和取代(通常在性质上是保守的)的蛋白质，只要所述蛋白质保留了预期的活性。这些修饰可以是有意的，如通过定点诱变，或者可以是意外的，如通过产生蛋白质的宿主的突变或因PCR扩增而产生的错误。
“重组病毒载体”指包含一个或多个异源序列(即，非病毒来源的核酸序列)的重组多核苷酸载体。在重组AAV载体的情况下，所述重组核酸的侧翼有至少一个、优选两个反向末端重复序列(ITR)。
“重组AAV载体(rAAV载体)”指包含一个或多个异源序列(即非AAV来源的核酸序列)的多核苷酸载体，所述异源序列的侧翼有至少一个，优选两个，AAV反向末端重复序列(ITR)。当存在于已经用合适的辅助病毒感染(或表达合适的辅助功能)并表达AAV rep和cap基因产物(即AAV Rep和Cap蛋白)的宿主细胞中时，这种AAV载体可以被复制并包装在感染性病毒颗粒中。当将rAAV载体纳入更大的多核苷酸中(例如，染色体中或另一载体如用于克隆或转染的质粒)时，那么所述rAAV载体可以称作“原-载体(pro-vector)”，其可以在AAV包装功能和合适的辅助功能存在下通过复制和被衣壳包装而被“拯救”。rAAV载体可以是多种形式中的任何一种，所述形式包括但不限于质粒、线性人工染色体、与脂质复合的、封装在脂质粒内的，和最优选被衣壳包装(encapsidate)在病毒颗粒特别是AAV颗粒中的。rAAV载体可以包装在AAV病毒衣壳中以生成“重组腺相关病毒颗粒(rAAV颗粒)”。
“异源”意指衍生自与跟其进行比较的其余实体或者其所***或并入其中的其余实体在基因型上不同的实体。例如，通过基因工程技术引入不同细胞类型中的多核苷酸是异源多核苷酸(并且，在表达时，能够编码异源多肽)。类似地，并入病毒载体中的细胞序列(例如，基因或其部分)相对于载体是异源核苷酸序列。
术语“转基因”指引入细胞中并且能够转录成RNA并且任选地在适当条件下转译和/或表达的多核苷酸。在多个方面中，其赋予其被引入的细胞预期的性质，或者以其他方式产生预期的治疗或诊断结果。在另一方面，其可以转录成介导RNA干扰的分子，如siRNA。
术语“基因组颗粒(gp)”、“基因组等同物”或“基因组拷贝”如在涉及病毒滴度时使用，指含有重组AAV DNA基因组的病毒体(virion)的数目，无关乎感染力或功能性。特定载体制备物中的基因组颗粒数能够通过例如本文实施例中或例如Clark等(1999)Hum.GeneTher.,10:1031-1039；Veldwijk等(2002)Mol.Ther.,6:272-278中描述的流程来测量。
术语“感染单元(iu)”、“感染颗粒”或“复制单元”，如在涉及病毒滴度时使用，指感染性且有复制能力的重组AAV载体颗粒的数目，如通过感染中心测定(infectious centerassay)，也称作复制中心测定(replication center assay)，所测量的，如例如McLaughlin等(1988)J.Virol.,62:1963-1973中所述。
术语“转导单元(tu)”如在涉及病毒滴度时使用，指导致功能性转基因产物产生的传染性重组AAV载体颗粒的数目，如在功能性测定(例如描述于本文实施例或例如Xiao等(1997)Exp.Neurobiol.,144:113-124；或Fisher等(1996)J.Virol.,70:520-532(LFU测定)中)所测量的。
“反向末端重复”或“ITR”序列是本领域中被充分理解的术语，并且指病毒基因组末端存在的方向相反的相对较短的序列。
“AAV反向末端重复(ITR)”序列是本领域中充分理解的术语，是一种大约145个核苷酸的序列，其存在于天然单链AAV基因组的两个末端。ITR最外侧的125个核苷酸可以以两种可选的方向中的任何一种存在，导致不同AAV基因组之间以及单个AAV基因组的两端之间的异质性。所述最外侧的125个核苷酸还含有自我互补的几个较短区域(指名为A、A'、B、B'、C、C'和D区)，使得在ITR的这个区域内链内部的碱基配对得以发生。
“末端解析序列(terminal resolution sequence)”或“trs”是AAV ITR的D区中在病毒DNA复制过程中被AAV rep蛋白切割的序列。突变的末端解析序列难以受到AAV rep蛋白的切割。
用于AAV的“辅助病毒”指使得AAV(其为缺陷型细小病毒(defectiveparvovirus))得以通过宿主细胞复制并且包装的病毒。已经鉴定了多种这样的辅助病毒，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒，如牛痘。腺病毒涵盖多个不同的亚组，尽管亚组C的腺病毒5型(Ad5)最常使用。多种人、非人哺乳动物和鸟类来源的腺病毒是已知的，并且可从保存机构如ATCC获得。疱疹病毒科(herpes family)的病毒也可从保存机构如ATCC获得，包括例如单纯疱疹病毒(herpes simplex viruses(HSV))、EB病毒(Epstein-Barr viruse(EBV))、巨细胞病毒(cytomegaloviruses(CMV))和伪狂犬病病毒(pseudorabies viruses(PRV))。
相对于参照多肽或核酸序列的“百分比(％)序列同一性”定义为在对齐所述序列并在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性之后，候选序列中与所述参照多肽或核酸序列中的氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分。为了测定百分比氨基酸或核酸序列同一性的比对可以多种方式实现，这些方式属本领域的技术，例如，使用公开可用的电脑软件程序，例如，描述于Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等编,1987),增补30,7.7.18节,表7.7.1中的，并且包括BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。优选的比对程序是ALIGN Plus(Scientific and Educational Software,Pennsylvania)。本领域技术人员能够确定适当的参数用于测量比对，包括在所比较序列的整个长度上实现最大比对所需的任何算法。出于本文的目的，给定氨基酸序列A与或相对于给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可以任选地换而言之叫做与或相对于给定氨基酸序列B具有或包含特定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：100乘以分数X/Y，其中X是由序列比对程序在该程序对A和B的比对中计为相同匹配的氨基酸残基数，并且其中Y是B中的氨基酸残基总数。将会理解的是，在氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不等的情况下，A与B的％氨基酸序列同一性会不等于B与A的％氨基酸序列同一性。就本文而言，给定核酸序列C与、同或相对于给定核酸序列D的％核酸序列同一性(或者可以任选地换而言之叫做与、同或相对于给定核酸序列D具有或包含特定％核酸序列同一性的给定核酸序列C)如下计算：100乘以分数W/Z，其中W是由序列比对程序在该程序对C和D的比对中计为相同匹配的核苷酸数，并且其中Z是D中的核苷酸总数。将会理解的是，在核酸序列C的长度与核酸序列D的长度不等的情况下，C与D的％核酸序列同一性会不等于D与C的％核酸序列同一性。
“分离的”分子(例如，核酸或蛋白质)或细胞意指其已经鉴定并且与其天然环境中的成分分离和/或从中回收。
“有效量”是足以实现有益的或预期的结果的量，所述结果包括临床结果(例如，症状的缓解，实现临床终点，等等)。有效量可以作为一次或多次给药来施用。就疾病状态而言，有效量是足以使疾病缓解、稳定或延迟其发生的量。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括，但不限于，驯养的动物(例如，奶牛、绵羊、猫、狗和马)，灵长类(例如，人和非人灵长类如猴)，兔，以及啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，所述个体或受试者是人。
如用于本文，“治疗/处理”是用于获得有益的或预期的临床结果的手段。就本发明而言，有益的或预期的临床结果包括，但不限于，症状的缓解，疾病程度的削弱，稳定(例如，不恶化)的疾病状态，预防疾病的扩散(例如，转移)，延迟或减缓疾病进程，缓解或减轻疾病状态，和缓和(无论是部分或是全部)，无论这些是可检测的或是不可检测的。“治疗/处理”还可意指与不接受治疗/处理的话所预期的生存期相比得到延长的生存期。
“色素性视网膜炎(RP)”指以进行性失明为特征的一类各种疾病。症状通常起源于视网膜的变性或异常，其可能包括感光细胞功能的丧失。
“视紫红质”指在视网膜的视杆细胞中发挥感光功能的G蛋白偶联受体家族成员。视色素视紫红质含有与其辅因子视黄醛(cofactor retinal)可逆地结合的多肽视蛋白。光引起视黄醛从11-顺式异构化为全-反式形式。这继而引起多肽中的构象变化，导致G蛋白活化。通过将光的存在转化为生化反应，视紫红质使得视觉感知成为可能。其功能是暗视觉(即，弱光中的无色视觉)所需，并且其也被认为是感光细胞生存力所需。
如用于本文，“视紫红质”可指完整的视觉色素，包括视黄醇，或仅仅是分子的氨基酸成分或序列。视紫红质还可称作OPN2、Opsin-2或RP4。视紫红质蛋白的实例可包括但不限于人、小鼠、狗和猫视紫红质，例如，NCBI参考序列NP_000530、NP_663358、NP_001008277和NP_001009242。视紫红质基因的实例可包括但不限于人、小鼠、狗和猫视紫红质基因，例如，GenBank Entrez Gene ID6010(RHO，即RP4、OPN2和CSNBAD1)、GenBank Entrez Gene ID212541(Rho，即Ops、RP4、Opn2和Noerg1)、GenBank Entrez Gene ID 493763和GenBankEntrez Gene ID 493762。术语视紫红质如用于本文还包括视紫红质包括突变、截短、缺失和/或***的功能等同物(例如，视紫红质变体)，只要该功能等同物保持了至少一部分野生型视紫红质缓解色素性视网膜炎症状的活性。
如用于本文“难以(refractory)”指对调节的抗性。例如，难以受到miR-708的抑制的视紫红质基因基本上或完全抵抗miR-708的抑制。
“视蛋白启动子”指源自视蛋白基因(例如，小鼠视蛋白)的多核苷酸序列，其特异性驱动在视杆细胞(例如，视杆细胞)中的表达。如用于本文，“视蛋白启动子”可指完整启动子序列或足以驱动视杆细胞特异性表达(rod-specific expression)的启动子序列片段，例如Quiambao,A.B.等(1997)Vis.Neurosci.14(4):617-25和Le,Y.Z.等(2006)Mol.Vis.12:389-98中描述的序列。在一些实施方案中，视蛋白启动子含有编码400bp CMV增强子的676bp片段，其在视蛋白启动子序列部分的上游(-500bp-+15bp)。此外，包括65bpNRL序列；这一序列编码神经视网膜碱性拉链因子(视杆细胞特异性转录因子)。
“视紫红质激酶(RK)启动子”指源自视紫红质激酶基因(例如，人RK，由GenBankEntrez Gene ID 6011代表)的多核苷酸序列，其特异性驱动在视杆细胞和视锥细胞中以及视网膜细胞系如WERI Rb-1中的表达。如用于本文，“视紫红质激酶启动子”指完整启动子序列或足以驱动光感受器特异性表达(photoreceptor-specific expression)的启动子序列片段，例如Khani,S.C.,等(2007)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.48(9):3954-61和Young,J.E.,等(2003)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.44(9):4076-85中描述的序列。在一些实施方案中，所述RK启动子跨越相对于转录起始位点而言从-112至+180的位置。
“miR-708”指包含如图4所示的茎和环序列的微RNA(miRNA)多核苷酸序列。miR-708多核苷酸的实例可包括但不限于人、小鼠、狗和猫miR-708，例如，如GenBank EntrezGene IDs 100126333、735284和100885899所代表。miRNAs是小的非编码RNA分子，其调节含有由该miRNA识别的靶位点的基因的表达(例如，通过下调基因转录物)(Bartel,D.P.(2004)Cell 116(2):281-97)。miR-708已知受到CHOP诱导并且可能参与调节视紫红质表达(Behrman,S.等(2011)J.Cell Biol.192(6):919-27)。如用于本文，“miR-708”可指经加工的miR-708多核苷酸或加工途径中的任何中间体，例如，pri-miRNA或pre-miRNA。如用于本文，“miR-708”可指转录生成miR-708 RNA的DNA序列，或RNA序列本身。
本文提及“约/大约”某个值或参数包括(和记载)涉及该值或参数本身的实施方案。例如，提及“约X”的记载包括记载“X”。
如用于本文，冠词“一个”、“一种”和“所述/该”的单数形式包括对复数的提及，除非另行说明。
应理解的是本文描述的发明的各个方面和实施方案包括“包含”、“其组成为”和/或“其组成基本上为”各个方面和实施方案。
III.色素性视网膜炎及其实验模型
如上所述，色素性视网膜炎(RP)指一类退行性眼病，其能够引起进行性失明，包括夜间视觉丧失、周边视野损失和完全失明。在美国，RP的发病率被认为在大约每4000人中有一人。RP通常是遗传的，并且体染色体显性RP、体染色体隐性RP和X连锁RP病症已有记载。已将超过50种不同基因中的突变与RP关联，包括光传导级联、视黄醛循环(retinal cycle)和剪接因子中牵涉的组分，以及在视紫红质自身中超过100种不同的突变。在许多情况中，与RP相关的突变导致视锥细胞(感光细胞)功能的丧失和/或细胞死亡。这种丧失导致暗视觉的下降并可能表达为夜盲或周边视觉的下降。视杆细胞死亡也与后续的视锥细胞死亡相关，引起高敏锐度视觉的丧失，与视杆细胞死亡一起引起失明。
已经建立了多种基于细胞和动物的模型用于检查RP的细胞学基础以及用于测试实验性治疗。一种用于RP的基于细胞的模型是培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞(Adamowicz,M.,等(2012)Adv.Exp.Med.Biol.723：573-9)。这种模型可以用于表达RP中牵涉的突变体蛋白并测试这些突变对蛋白质功能的作用或突变体蛋白对细胞功能和/或生存力的作用。例如，可以使用任何合适的启动子(例如，CMV)表达人野生型和突变型视紫红质。不希望受限于理论，认为视蛋白多肽的错误折叠导致ER驻留和压力、对未折叠蛋白质反应(UPR)的诱导和增加的细胞死亡。这种模型可以用于检查任何RP相关突变，例如视紫红质突变如P23H的作用。
基于动物的RP模型可包括小鼠，该小鼠携带已知或疑似引起小鼠中RP的突变，或与在人中发现的那些突变直系同源的突变。在一些实施方案中，小鼠模型可以包括经工程化而在感光细胞中表达视紫红质(例如突变的人或小鼠形式)的小鼠。小鼠模型的实例包括视紫红质P347S小鼠(Li,T.等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93(24):14176-81)、Rho-/-小鼠(Humphries,M.M.等(1997)Nat.Genet.15(2):216-9)和表达P23H突变视紫红质的小鼠(“P23H小鼠”)(Olsson,J.E.等(1992)Neuron 9(5):815-30)。在P23H小鼠中，可以将突变型人视紫红质***小鼠种系。可以使用本领域中已知的任何在感光细胞中表达的启动子(例如，小鼠视蛋白或人RK启动子)。在一些实施方案中，视紫红质可以使用AAV载体表达。
也可以使用其他用于RP的动物模型。除了小鼠模型之外，还可以使用大鼠、狗、猪、蛙(Tam,B.M.和Moritz,O.L.(2006)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.47(8):3234-41)和非人灵长类模型。
IV.治疗色素性视网膜炎的方法
在一些方面，本发明提供用于治疗哺乳动物中的色素性视网膜炎的方法和组合物，包括将有效量的rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物(例如，至视网膜)，所述rAAV病毒颗粒包含编码miR-708的载体。所述方法可用于治疗患有RP的人，以改善与RP有关的病理状态(pathologies)和视觉损伤。在一些实施方案中，本发明包括施用有效量的rAAV病毒颗粒，所述rAAV病毒颗粒包含含有编码视紫红质的核酸(例如，正常的或野生型视紫红质)的载体。在一些实施方案中，所述miR-708作用于抑制与RP相关的突变的视紫红质的活性RP。在一些实施方案中，所述正常的或野生型视紫红质作用于为眼补充有功能的视紫红质。在一些实施方案中，所述病毒颗粒包含AAV血清型5衣壳(AAV5衣壳)，和AAV 2或AAV 5反向末端重复中任一者。在一些实施方案中，所述病毒颗粒包含AAV血清型5酪氨酸突变衣壳，和AAV2或AAV 5反向末端重复中任一者。
在一些方面，本发明提供用于缓解RP症状的方法和组合物，包括将有效量的rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物的眼部，所述rAAV病毒颗粒包含编码miR-708的载体。在其他方面，本发明提供用于缓解RP症状的方法和组合物，包括将有效量的rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物的眼部，所述rAAV病毒颗粒包含编码miR-708和视紫红质的载体。在一些实施方案中，所述RP的症状包括，但不限于，失明、夜盲、周边视觉下降和高敏锐度视觉丧失。在一些实施方案中，治疗色素性视网膜炎包括减少或预防与色素性视网膜炎相关的症状，包括但不限于预防视网膜变性的方法，用于阻滞RP进展的方法，提高感光细胞功能的方法，用于增加感光细胞等。RP的症状和/或病理状态包括但不限于视野损失(loss of sight)、夜间视觉丧失、周边视野损失、ERG功能丧失；视觉敏锐度和对比敏感度(contrastsensitivity)损失；视觉引导的行为丧失，视杆细胞功能丧失，视杆细胞死亡，暗视觉下降，视网膜细胞变化减少(感光细胞结构或功能的丧失；外核层(ONL)变薄或变厚；外网层(OPL)变薄或变厚；杆状和锥状外段的瓦解和之后的丧失；杆状和锥状内段变短；双极细胞树突的回缩；视网膜内层包括内核层、内网层、神经节细胞层和神经纤维层的变薄或变厚；视蛋白错误定位；神经丝的过度表达；等等。在一些实施方案中，本发明提供预防视杆细胞功能退化和视杆细胞死亡和视锥细胞功能退化和视锥细胞死亡的方法。
在一些方面，本发明提供预防或延迟RP进展的方法。体染色体显性的RP是一种能够被基因分型的遗传病。RP的发作和进展可以通过光学相干断层成像术(OpticalCoherence Tomography(OCT))来确定，其允许对外网层(OPL)异常进行检查。
用于测定RP症状缓解的手段是本领域已知的。例如，测量视野(例如，Goldmann视野)，测定视网膜电图(ERG)，眼底照相，光学相干断层成像术和萤光素血管造影(fluorescein angiography)。视觉唤起行为上的改善也可用于确定RP症状的缓解；例如，做出“我能发现下落的物品”，“我能在烛光晚餐中看到面孔”，“我能看到我衬衫上的条纹”，“我能看到夜晚的星星”，“我能阅读普通的书，并且可以坐在教室前排”，“现在我能踢足球，而且不需要有人在旁边帮我找到球”，“我能自己在我家周围骑自行车”，“我实现了我的梦想：我看到我女儿打出了全垒打”，以及“什么时候能给我的另一只眼睛进行注射？”的陈述。
在本发明的一些方面，将所述方法和组合物用于治疗患有RP的人。RP可以按照体染色体显性、体染色体隐性或X连锁的方式遗传。X连锁的RP可以是隐性的，主要影响男性，或者可以是显性的，既影响男性也影响女性。RP可由编码视紫红质蛋白的rho基因中的突变引起。在本发明的一些实施方案中，将所述方法用于治疗在rho基因和/或在视紫红质蛋白中具有突变的人。在本发明的一些实施方案中，视紫红质蛋白中的突变是P23H突变(视紫红质蛋白氨基酸残基23处的脯氨酸被组氨酸取代)。在其他实施方案中，所述视紫红质蛋白中的突变是T58R、P347L、或P347S，或残基I255的缺失。与色素性视网膜炎相关的突变由McWilliam,P等,(1989)Genomics 5:619-622；Dryja,TP等,(1990)Nature 343:364-266；Farrar,GJ等,(1990)Genomics 8:35-40；Farrar,GJ等,(2002)EMBO J.21:857-864提供；将其以参考方式全部并入本文。
miR-708是一种CHOP调节的微RNA，其调节视紫红质表达(Behrman,S.等(2011)J.Cell Biol.192(6):919-27)。miR-708是位于CHOP诱导型基因Odz4(Tenurin-4)内部的内含子型微RNA。CHOP在ER应激期间调节miR-708表达。在视紫红质基因的3’UTR中存在推定的miR-708序列，其是高度保守的(参见Behrman等的图4，同前)。
在一些实施方案中，本发明提供用于治疗患有RP的人的方法。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗患有体染色体显性的RP的人的方法。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗患有与视紫红质基因中的突变相关的RP的人的方法。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗患有RP的人的方法，其通过施用有效量的编码miR-708的AAV载体以抑制突变型视紫红质的活性。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗患有RP的哺乳动物(例如，狗或猫)的方法。在一些实施方案中，所述miR-708核酸可包括但不限于由GenBank EntrezGene IDs 100126333、735284或100885899代表的核酸。
在本发明的一些实施方案中，对突变型视紫红质的抑制通过递送有效量的编码野生型视紫红质或与野生型视紫红质具有实质上相同活性的视紫红质的AAV载体来补充。在一些实施方案中，所述视紫红质是人视紫红质。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗患有RP的人的方法，其通过施用有效量的编码miR-708的载体以抑制突变型视紫红质的活性和有效量的编码具有野生型活性的人视紫红质的载体。在一些实施方案中，所述编码miR-708的AAV载体和编码人视紫红质的AAV载体是相同的AAV载体。在一些实施方案中，所述编码miR-708的AAV载体和编码人视紫红质的AAV载体是不同的AAV载体。在一些实施方案中，编码视紫红质的核酸可以包括但不限于由NCBI参考序列NP_000530、NP_663358、NP_001008277和NP_001009242鉴定并提供的核酸。
在一些方面，本发明提供用于治疗细胞中内质网(ER)应激的方法，其包括向哺乳动物施用包含rAAV载体的rAAV病毒颗粒，所述rAAV载体包含编码miR-708的核酸。在一些实施方案中，所述细胞是眼细胞。在进一步的实施方案中，所述细胞是感光细胞。在更进一步的实施方案中，所述细胞是视杆细胞。在一些实施方案中，所述方法包括减少ER应激的一种或多种细胞标记物。在进一步的实施方案中，所述一种或多种ER应激的细胞标记物是剪接的XBP-1、CHOP或Grp78。在一些实施方案中，所述包含编码miR-708的核酸的rAAV载体进一步包含编码视紫红质的核酸。在其他实施方案中，本发明提供用于治疗细胞中内质网(ER)应激的方法，其包括向哺乳动物施用包含编码miR-708的核酸的第一rAAV载体和包含含有编码视紫红质的核酸之第二rAAV载体的第二rAAV病毒颗粒。
在一些方面，本发明提供向患有RP的哺乳动物递送miR-708或miR-708和视紫红质的方法，所述方法包括向所述哺乳动物的视网膜施用有效量的rAAV病毒颗粒，所述rAAV病毒颗粒包含编码miR-708和/或视紫红质的载体。所述施用将转基因产物递送至感光细胞，其中miR-708和/或视紫红质介导对所述感光细胞和周围的感光细胞的有益作用。在一些实施方案中，AAV病毒颗粒向视网膜的递送是经由将病毒颗粒注射至视网膜的视网膜下间隙来进行。在一些实施方案中，AAV颗粒向视网膜的递送是通过玻璃体内递送来进行，条件是所述AAV颗粒能够渗透至眼后并转导(transduce)感光细胞。在一些实施方案中，所述AAV颗粒在视网膜的视网膜下间隙中的一个或多个位置施用。
在一些实施方案中，向视网膜施用有效量的包含编码miR-708和/或视紫红质的载体的rAAV病毒颗粒转导位于施用位置处或附近的感光细胞。在一些实施方案中，超过约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或100％中任一者的感光细胞被转导。在一些实施方案中，约5％至约100％、约10％至约50％、约10％至约30％、约25％至约75％、约25％至约50％或约30％至约50％的感光细胞被转导。鉴定受到表达miR-708和/或视紫红质的AAV转导的感光细胞的方法是本领域已知的；例如，免疫组织化学或使用标记物物，如增强型绿色萤光蛋白，可用于检测miR-708和/或视紫红质的表达。
在本发明的一些实施方案中，所述方法包括向哺乳动物的视网膜(例如，视网膜下间隙)施用有效量的包含编码miR708和/或视紫红质的载体的AAV病毒颗粒用于治疗患有RP的哺乳动物，例如，人。在一些实施方案中，将组合物注射至一处或多处视网膜下间隙以允许miR-708和/或视紫红质在感光细胞中表达。在一些实施方案中，将组合物注射至视网膜的视网膜下间隙中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或超过十个任一项的位置。
在一些实施方案中，将rAAV病毒颗粒同时或连续施用至超过一个位置。在一些实施方案中，rAAV病毒颗粒的多次注射之间不超过1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、9小时、12小时或24小时。
在一些实施方案中，将编码miR-708的第一rAAV病毒颗粒和编码视紫红质的第二rAAV病毒颗粒同时或连续施用至一个或多个位置。在一些实施方案中，rAAV病毒颗粒的多次注射之间不超过1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、9小时、12小时或24小时。在一些实施方案中，所述编码miR-708的第一rAAV病毒颗粒的施用在所述编码视紫红质的第二rAAV病毒颗粒的施用之前。在一些实施方案中，所述编码miR-708的第一rAAV病毒颗粒的施用在所述编码视紫红质的第二rAAV病毒颗粒的施用之后。
在一些实施方案中，本发明提供用于治疗患有RP的人的方法，其通过施用有效量的包含编码miR-708的AAV载体的药物组合物，以抑制突变型视紫红质的活性。在一些实施方案中，本发明提供用于治疗患有RP的人的方法，其通过施用有效量的包含编码miR-708的AAV载体的药物组合物以抑制突变型视紫红质的活性和有效量的包含编码视紫红质的AAV载体的药物组合物以为感光细胞补充野生型视紫红质活性。在一些实施方案中，所述包含编码miR-708的AAV载体的药物组合物和所述包含编码人视紫红质的AAV载体的药物组合物是相同的药物组合物。在一些实施方案中，所述包含编码miR-708的AAV载体的药物组合物和所述包含编码人视紫红质的AAV载体的药物组合物是不同的药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在本发明的一些实施方案中，注射至视网膜的视网膜下间隙或玻璃体内注射的组合物的体积超过约1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、15μl、20μl、25μl、50μl、75μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl、700μl、800μl、900μl或1mL或其间的任何量中的任一者。
本发明的组合物(例如，包含编码miR-708和/或视紫红质的载体的AAV病毒颗粒)可单独使用或与一种或多种其他治疗剂组合使用用于治疗RP。顺序施用之间的间隔可以以至少(或任选地少于)数分钟、数小时或数天为单位。
V.表达构建体
在一些实施方案中，转基因(例如，miRNA 708和/或视紫红质)与启动子可操作地连接。例示性启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子、RSV LTR、MoMLV LTR、磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子和CK6启动子、运甲状腺素蛋白(transthyretin)启动子(TTR)、TK启动子、四环素反应性启动子(TRE)、HBV启动子、hAAT启动子、LSP启动子、嵌合肝特异性启动子(LSPs)、E2F启动子、端粒酶(hTERT)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β-球蛋白启动子(CAG启动子；Niwa等,Gene,1991,108(2):193-9)和延伸因子1-α启动子(EF1-α)启动子(Kim等,Gene,1990,91(2):217-23和Guo等,Gene Ther.,1996,3(9):802-10)。在一些实施方案中，所述启动子包含人β-葡糖醛酸糖苷酶启动子或巨细胞病毒增强子连接鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。所述启动子可以是组成型、诱导型或抑制型启动子。在一些实施方案中，本发明提供包含与CBA启动子可操作连接的编码miR-708的核酸的AAV载体。在一些实施方案中，本发明提供包含与CBA启动子可操作连接的编码视紫红质的核酸(例如，人视紫红质)的AAV载体。在一些实施方案中，本发明提供包含与CBA启动子可操作连接的编码miR-708的核酸且编码视紫红质(例如，人视紫红质)的核酸的AAV载体。
在一些实施方案中，所述启动子能够在感光细胞中表达转基因。在多个实施方案中，所述启动子是视紫红质激酶(RK)启动子；例如，人RK启动子。在一些实施方案中，所述启动子是视蛋白启动子；例如，人视蛋白启动子或小鼠视蛋白启动子。
在一些实施方案中，本发明提供包含与RK启动子可操作连接的编码miR-708的核酸的AAV载体。在一些实施方案中，本发明提供包含可操作连接至RK启动子的编码视紫红质(例如，人视紫红质)的核酸的AAV载体。在一些实施方案中，本发明提供包含可操作连接至RK启动子的编码miR-708和视紫红质(例如，人视紫红质)的核酸的AAV载体。在一些实施方案中，所述编码miR-708的核酸在编码视紫红质的核酸的5’。在其他实施方案中，所述编码miR-708的核酸在编码视紫红质的核酸的3’。在一些实施方案中，本发明提供包含与第一RK启动子可操作连接的编码miR-708的核酸和与第二RK启动子可操作连接的编码视紫红质的核酸的AAV载体。在一些实施方案中，所述可操作连接至第一RK启动子的编码miR-708的核酸在可操作连接至第二RK启动子的编码视紫红质的核酸的5’。在其他实施方案中，所述可操作连接至第一RK启动子的编码miR-708的核酸在可操作连接至第二RK启动子的编码视紫红质的核酸的3’。在一些实施方案中，所述miR-708包含SEQ ID NO:1的序列。在一些实施方案中，所述miR-708包含与SEQ ID NO:1的序列至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质是野生型视紫红质的功能等同物。在一些实施方案中，视紫红质从AAV载体的表达难以受到miR-708的抑制。在一些实施方案中，编码视紫红质的核酸缺乏视紫红质基因的3’UTR中的miR-708靶位点。在一些实施方案中，编码视紫红质的核酸在视紫红质基因的3’UTR中的miR-708靶位点中包含突变(例如，缺失、取代、***等)，从而使其难以受到miR-708的抑制。
在一些实施方案中，本发明提供包含可操作连接至视蛋白启动子的编码miR-708的核酸的AAV载体。在一些实施方案中，本发明提供包含可操作连接至视蛋白启动子的编码视紫红质(例如，人视紫红质)的核酸的AAV载体。在一些实施方案中，本发明提供包含可操作连接至视蛋白启动子的编码miR-708的核酸和编码视紫红质(例如，人视紫红质)的核酸的AAV载体。在一些实施方案中，所述编码miR-708的核酸在编码视紫红质的核酸的5’。在其他实施方案中，所述编码miR-708的核酸在编码视紫红质的核酸的3’。在一些实施方案中，本发明提供包含可操作连接至第一视蛋白启动子的编码miR-708的核酸和可操作连接至第二视蛋白启动子的编码视紫红质的核酸的AAV载体。在一些实施方案中，所述可操作连接至第一视蛋白启动子的编码miR-708的核酸在可操作连接至第二视蛋白启动子的编码视紫红质的核酸的5’。在其他实施方案中，所述可操作连接至第一视蛋白启动子的编码miR-708的核酸在可操作连接至第二视蛋白启动子的编码视紫红质的核酸的3’。在一些实施方案中，所述miR-708包含SEQ ID NO:1的序列。在一些实施方案中，所述miR-708包含SEQ ID NO:1的序列。在一些实施方案中，所述miR-708包含与SEQ ID NO:1的序列至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质是野生型视紫红质的功能等同物。在一些实施方案中，视紫红质从AAV载体的表达难以受到miR-708的抑制。在一些实施方案中，编码视紫红质的核酸缺乏视紫红质基因的3’UTR中的miR-708靶位点。在一些实施方案中，编码视紫红质的核酸在视紫红质基因的3’UTR中的miR-708靶位点中包含突变(例如，缺失、取代、***等)，从而使其难以受到miR-708的抑制。
在一些实施方案中，本发明提供包含可操作连接至RK启动子的编码miR-708的核酸和可操作连接至视蛋白启动子的编码视紫红质的核酸的AAV载体。在一些实施方案中，所述可操作连接至RK启动子的编码miR-708的核酸在可操作连接至视蛋白启动子的编码视紫红质的核酸的5’。在一些实施方案中，所述可操作连接至RK启动子的编码miR-708的核酸在可操作连接至视蛋白启动子的编码视紫红质的核酸的3’。在一些实施方案中，本发明提供包含可操作连接至视蛋白启动子的编码miR-708的核酸和可操作连接至RK启动子的编码视紫红质的核酸的AAV载体。在一些实施方案中，所述可操作连接至视蛋白启动子的编码miR-708的核酸在可操作连接至RK启动子的编码视紫红质的核酸的5’。在一些实施方案中，所述可操作连接至视蛋白启动子的编码miR-708的核酸在可操作连接至RK启动子的编码视紫红质的核酸的3’。在一些实施方案中，所述miR-708包含SEQ ID NO:1的序列。在一些实施方案中，所述miR-708包含SEQ ID NO:1的序列。在一些实施方案中，所述miR-708包含与SEQ IDNO:1的序列至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质是野生型视紫红质的功能等同物。在一些实施方案中，视紫红质从AAV载体的表达难以受到miR-708的抑制。在一些实施方案中，编码视紫红质的核酸缺乏视紫红质基因的3’UTR中的miR-708靶位点。在一些实施方案中，编码视紫红质的核酸在视紫红质基因的3’UTR中的miR-708靶位点中包含突变(例如，缺失、取代、***等)，从而使其难以受到miR-708的抑制。
在一些实施方案中，本发明提供包含可操作连接至CBA启动子的编码miR-708的核酸和可操作连接至RK启动子的编码视紫红质的核酸的AAV载体。在一些实施方案中，所述可操作连接至CBA启动子的编码miR-708的核酸在可操作连接至RK启动子的编码视紫红质的核酸的5’。在一些实施方案中，所述可操作连接至CBA启动子的编码miR-708的核酸在可操作连接至RK启动子的编码视紫红质的核酸的3’。在一些实施方案中，本发明提供包含可操作连接至RK启动子的编码miR-708的核酸和可操作连接至CBA启动子的编码视紫红质的核酸的AAV载体。在一些实施方案中，所述可操作连接至RK启动子的编码miR-708的核酸在可操作连接至CBA启动子的编码视紫红质的核酸的5’。在一些实施方案中，所述可操作连接至RK启动子的编码miR-708的核酸在可操作连接至CBA启动子的编码视紫红质的核酸的3’。在一些实施方案中，所述miR-708包含SEQ ID NO:1的序列。在一些实施方案中，所述miR-708包含SEQ ID NO:1的序列。在一些实施方案中，所述miR-708包含与SEQ ID NO:1的序列至少约80％、85％、90％或95％相同的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质包含SEQID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述视紫红质是野生型视紫红质的功能等同物。在一些实施方案中，视紫红质从AAV载体的表达难以受到miR-708的抑制。在一些实施方案中，编码视紫红质的核酸缺乏视紫红质基因的3’UTR中的miR-708靶位点。在一些实施方案中，编码视紫红质的核酸在视紫红质基因的3’UTR中的miR-708靶位点中包含突变(例如，缺失、取代、***等)，从而使其难以受到miR-708的抑制。
在一些实施方案中，编码miR-708的核酸包含内源miR-708支架。在一些实施方案中，所述miR-708支架由SEQ ID NO:14提供。在一些实施方案中，编码miR-708的核酸包含异源miRNA支架。在一些实施方案中，异源miRNA支架的使用是用于调节miRNA表达；例如，以增加miRNA表达或减少miRNA表达。在一些实施方案中，编码miR-708的核酸包含内源miR-155支架。在一些实施方案中，所述miR-155支架由SEQ ID NO:14提供。
重组病毒载体
本发明涉及重组病毒基因组的使用，用于将本文描述的编码miR-708miRNA和/或视紫红质蛋白的一种或多种核酸序列引入用于包装至AAV病毒颗粒中。所述重组病毒基因组可包括确立miR-708miRNA和/或视紫红质蛋白表达的任何元素，例如，启动子，miR-708miRNA和/或视紫红质转基因，ITR，核糖体结合元件，终止子，增强子，选择标记物物，内含子，多聚A信号和/或复制起点。
VI.病毒颗粒和用于产生病毒颗粒的方法
rAAV病毒颗粒
本发明提供使用rAAV颗粒治疗色素性视网膜炎的方法并提供包含rAAV颗粒的组合物。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是重组AAV颗粒，其包含的核酸包含本文描述的编码miR-708miRNA和/或视紫红质蛋白的序列，侧翼为一个或两个ITR。所述核酸被衣壳包装在AAV颗粒中。所述AAV颗粒还包含衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述核酸包含感兴趣的编码序列(例如，编码miR-708miRNA和/或视紫红质蛋白的核酸)，其是按照转录的方向可操作连接的组分，调控序列(包括转录起始和终止序列)，由此形成表达盒。在一些实施方案中，编码miR-708的核酸嵌入在内含子中。所述表达盒的5'和3'端侧翼有至少一个功能性AAVITR序列。“功能性AAV ITR序列”的意思是所述ITR序列按照预期发挥拯救、复制和包装AAV病毒体的功能。参见Davidson等,PNAS,2000,97(7)3428-32；Passini等,J.Virol.,2003,77(12):7034-40；和Pechan等,Gene Ther.,2009,16:10-16，将其整体以参考方式并入本文。为了实施本发明的一些方面，所述重组载体至少包含对于衣壳包装和用于由rAAV进行感染的物理结构来说至关重要的全部AAV序列。用于本发明载体中的AAV ITR不需要具有野生型核苷酸序列(例如，如Kotin,Hum.Gene Ther.,1994,5:793-801中所述)，并且可以通过核苷酸的***、缺失或取代来改变，或者所述AAV ITR可以源自数种AAV血清型中的任何一种。目前已知超过40种AAV血清型，并且将不断鉴定新的血清型和现有血清型的变体。参见Gao等,PNAS,2002,99(18):11854-6；Gao等,PNAS,2003,100(10):6081-6；和Bossis等,J.Virol.,2003,77(12):6799-810。任何AAV血清型的使用均被认为在本发明的范围之内。在一些实施方案中，rAAV载体是源自AAV血清型的载体，所述AAV血清型包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV衣壳血清型ITR或类似物。在一些实施方案中，AAV中的核酸包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV衣壳血清型ITR或类似物。在一些实施方案中，AAV中的核酸还编码如本文所述的miR-708、视紫红质，或miR-708和视紫红质。例如，AAV中的核酸可包含本文考虑的任意AAV血清型的至少一个ITR，并且还可编码包含SEQ ID NO:1的核酸的miR-708和/或编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的人视紫红质的核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸从5’至3’包含编码以下各项的核酸：AAV ITR，填充片段(stuffer fragment)(例如，SEQ ID NO:11)，嵌合内含子(例如，SEQ ID NO:10)，miR-708，牛生长激素多聚腺苷酸化序列(bovine growth hormonepolyadenylation sequence)，填充片段，和AAV ITR。在一些实施方案中，AAV中的核酸从5’至3’包含编码以下各项的核酸：AAV ITR，RK启动子，β球蛋白内含子，嵌入β球蛋白内含子中的miR-708，人视紫红质，牛生长激素多聚腺苷酸化序列，和AAV ITR。在一些实施方案中，AAV中的核酸从5’至3’包含编码以下各项的核酸：AAV ITR，填充片段(例如，SEQ ID NO:11)，RK启动子，嵌合内含子(例如，SEQ ID NO:10)，人视紫红质，β-球蛋白内含子，嵌入β-球蛋白内含子的miR-708，牛生长激素多聚腺苷酸化序列，填充片段，和AAV ITR。在一些实施方案中，AAV中的核酸从5’至3’包含编码以下各项的核酸：AAV ITR，填充片段(例如，SEQ IDNO:11)，RK启动子，嵌合内含子(例如，SEQ ID NO:10)，miR-708，小鼠视蛋白启动子，人视紫红质，牛生长激素多聚腺苷酸化序列，和AAVITR。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含SEQID NO:5的核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含与SEQ ID NO:5的核酸至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含SEQ ID NO:6的核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含与SEQID NO:6至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含SEQ ID NO:7的核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含与SEQ ID NO:7至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含SEQ ID NO:8的核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含与SEQ ID NO:8至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含SEQ ID NO:9的核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含与SEQ ID NO:9至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含SEQ ID NO:24的核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含与SEQ ID NO:24至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含SEQ ID NO:25的核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含与SEQ ID NO:2580％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含SEQ ID NO:26的核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含与SEQ ID NO:26至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含SEQ ID NO:27的核酸。在一些实施方案中，AAV中的核酸包含与SEQ ID NO:27至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸。在进一步的实施方案中，所述rAAV颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合型、牛AAV、小鼠AAV衣壳rAAV2/HBoV1血清型衣壳的衣壳蛋白，或这些衣壳蛋白的突变型。在一些实施方案中，突变型衣壳蛋白保有形成AAV衣壳的能力。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含AAV5酪氨酸突变型衣壳(Zhong L.等,(2008)Proc Natl Acad Sci U S A 105(22)：7827-7832。在进一步的实施方案中，所述rAAV颗粒包含进化枝A-F(Clades A-F)的AAV血清型的衣壳蛋白(Gao,等,J.Virol.2004,78(12)：6381)。在一些实施方案中，AAV中的核酸包括选自由SEQID NOs：5-8组成的组的核酸序列，并且侧翼有至少一个AAV2 ITR。在一些实施方案中，AAV中的核酸包括与选自由SEQ ID NOs：5-9组成的组的核酸至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的核酸序列，并且侧翼有至少一个AAV2ITR。
将不同AAV血清型用于优化特定靶细胞的转导或用于靶向特定组织内的具体细胞类型(例如，患病组织)。rAAV颗粒可包含相同血清型或混合血清型的病毒蛋白和病毒核酸。例如，在一些实施方案中，rAAV颗粒可包含AAV5衣壳蛋白和至少一种AAV2 ITR或其可包含AAV2衣壳蛋白和至少一种AAV5 ITR。在其他实施方案中，rAAV颗粒可包含AAV5酪氨酸突变型衣壳蛋白和至少一种AAV2 ITR。在又另一个实例中，rAAV颗粒可包含来自AAV5和AAV2二者的衣壳蛋白，并且进一步包含至少一种AAV2 ITR。本文提供用于产生rAAV颗粒的AAV血清型的任何组合，正如每种组合已经在本文明确说明一样。在一些实施方案中，本发明提供rAAV颗粒，其包含AAV5衣壳蛋白和编码miR-708 RNA和/或视紫红质转基因的核酸，其侧翼有至少一个AAV2 ITR。
自我互补的AAV病毒基因组
在一些方面，本发明提供包含重组自我互补基因组(recombinant self-complementing genome)的病毒颗粒。具有自我互补基因组的AAV病毒颗粒和使用自我互补AAV基因组的方法记载于美国专利Nos.6,596,535；7,125,717；7,765,583；7,785,888；7,790,154；7,846,729；8,093,054；和8,361,457；以及Wang Z.等,(2003)Gene Ther 10:2105-2111，将其每一篇整体以参考方式并入本文。包含自我互补基因组的rAAV会借助于其部分互补序列(例如，补充转基因的编码和非编码链)将快速形成双链DNA分子。在一些实施方案中，本发明提供包含AAV基因组的AAV病毒颗粒，其中所述rAAV基因组包含第一异源多核苷酸序列(例如，miR-708和/或视紫红质编码链)和第二异源多核苷酸序列(例如，miR-708的反义链和/或视紫红质非编码或反义链)，其中所述第一异源多核苷酸序列可以与所述第二多核苷酸序列在其长度的大部分或全部上形成链内碱基配对。在一些实施方案中，所述第一异源多核苷酸序列和第二异源多核苷酸序列通过辅助链内碱基配对的序列连接；例如，发夹DNA结构。发夹结构是本领域已知的，例如在siRNA分子中。在一些实施方案中，所述第一异源多核苷酸序列和第二异源多核苷酸序列系经由突变型ITR(例如，右侧ITR)连接。在一些实施方案中，所述ITR包括多核苷酸序列5’-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG-3’(SEQ ID NO:20)。所述突变型ITR包含D区的缺失，所述D区包含末端解析序列。这样的结果是，在复制AAV病毒基因组时，rep蛋白不会在突变型ITR处切割病毒基因组，并且如此以5'至3'顺序包含以下各项的重组病毒基因组会被包装至病毒衣壳中：AAV ITR，包括调节序列的第一异源多核苷酸序列，突变型AAV ITR，与所述第一异源多核苷酸方向相反的第二异源多核苷酸和第三AAV ITR。在一些实施方案中，本发明提供包含重组病毒基因组的AAV病毒颗粒，所述重组病毒基因组包含功能性AAV2 ITR，编码miR-708 RNA和/或视紫红质转基因的第一多核苷酸序列，包含D区缺失并且缺乏功能性末端解析序列的突变型AAV2 ITR，包含与所述第一多核苷酸序列的编码miR-708 RNA和/或视紫红质的序列互补的序列的第二多核苷酸序列和功能性AAV2 ITR。
AAV颗粒的产生
rAAV颗粒可以使用本领域已知的方法产生。参见，例如，美国专利号6,566,118；6,989,264；和6,995,006。在本发明的实践中，用于产生rAAV颗粒的宿主细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、微生物和酵母。宿主细胞还可以是包装细胞，其中AAV rep和cap基因稳定保持在所述宿主细胞中，或是生产者细胞，其中稳定保有AAV载体基因组。示例性包装和生产细胞源自293、A549或HeLa细胞。使用本领域已知的标准技术纯化和配制AAV载体。
在一些方面，提供用于产生如本文公开的任何rAAV颗粒的方法，包括(a)在产生rAAV颗粒的条件下培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含(i)一种或多种AAV包装基因，其中每种所述AAV包装基因编码AAV复制和/或衣壳包装蛋白(encapsidation protein)；(ii)包含编码如本文所述的miR-708 RNA和/或任何视紫红质转基因的核酸的rAAV原载体(pro-vector)，其侧翼有至少一个AAV ITR，和(iii)AAV辅助功能；和(b)回收由宿主细胞产生的rAAV颗粒。在一些实施方案中，核酸编码SEQ ID NO:1的miR-708 RNA和/或编码视紫红质的转基因；例如，具有SEQ ID NO:2的氨基酸的视紫红质。在一些实施方案中，所述至少一个AAV ITR选自下组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型ITR或类似物。在一些实施方案中，所述衣壳包装蛋白选自下组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6(例如，野生型AAV6衣壳，或变体AAV6衣壳，如ShH10，如美国核准前公开案2012/0164106中所述)、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9(例如，野生型AAV9衣壳，或修饰型AAV9衣壳，如美国核准前公开案2013/0323226)、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、酪氨酸衣壳突变型、肝素结合衣壳突变型(heparin binding capsid mutant)、AAV2R471A衣壳、AAVAAV2/2-7m8衣壳、AAV DJ衣壳(例如，AAV-DJ/8衣壳、AAV-DJ/9衣壳或美国核准前公开案2012/0066783中描述的任何其他衣壳)、AAV2 N587A衣壳、AAV2 E548A衣壳、AAV2 N708A衣壳、AAVV708K衣壳、山羊AAV衣壳、AAV1/AAV2嵌合衣壳、牛AAV衣壳、小鼠AAV衣壳、rAAV2/HBoV1衣壳、美国专利号8,283,151或国际公开案号WO/2003/042397中描述的AAV衣壳，或其突变型。在一些实施方案中，衣壳包装蛋白是AAV5酪氨酸突变型衣壳蛋白。在进一步的实施方案中，所述rAAV颗粒包含来自进化枝A-F的AAV血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含AAV5衣壳和包含AAV2 ITR、突变型AAV2 ITR和编码miR-708和/或视紫红质的核酸的重组基因组。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含AAV5酪氨酸突变型衣壳和包含AAV2ITR、突变型AAV2 ITR和编码miR-708和/或视紫红质的核酸的重组基因组。在进一步的实施方案中，所述rAAV颗粒是经纯化的。术语“纯化的”如用于本文包括不含至少一些其他成分的rAAV颗粒的制备物，所述其他成分可能也存在于所述rAAV颗粒天然存在之处或所述rAAV颗粒最初从中制备之处。因此，例如，分离的rAAV颗粒可使用纯化技术制备以使其从来源混合物(如培养裂解液或生产培养物上清液)富集。富集可以以多种方式测量，例如通过溶液中存在的DNA酶抗性颗粒(DRP)或基因组拷贝(gc)的比例，或者通过感染力，或者其可以相对于来源混合物中的次要的、潜在干扰性物质来测量，如污染物，包括生产培养物污染物或加工污染物(in-process contaminant)，包括辅助病毒，培养基成分，等等。
本文还提供包含本发明的rAAV颗粒和药物上可接受载剂的药物组合物，所述rAAV颗粒包含编码miR-708的转基因和/或视紫红质转基因。在一些实施方案中，所述组合物包含含有编码miR-708的转基因的rAAV颗粒和包含视紫红质转基因的rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述组合物包含含有编码miR-708的转基因和视紫红质转基因的rAAV颗粒。所述药物组合物可适用于本文描述的任何施用模式。本文所述的包含编码miR-708 RNA的核酸和/或视紫红质转基因的rAAV的药物组合物可导入至眼部；例如，通过视网膜下施用或玻璃体内施用。
在一些实施方案中，包含本文所述的rAAV和药物上可接受载剂的药物组合物适合于向人施用。这些载体是本领域中熟知的(参见，例如，Remington's PharmaceuticalSciences,第15版,第1035-1038和1570-1580页)。在一些实施方案中，包含本文所述的rAAV和药物上可接受载剂的药物组合物适用于眼部注射。这些药物上可接受载剂可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油等。盐水溶液和含水葡萄糖(aqueous dextrose)、聚乙二醇(PEG)和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。所述药物组合物可进一步包含额外的成分，例如防腐剂、缓冲液、张度剂(tonicity agents)、抗氧化剂和稳定剂、非离子型润湿剂或澄清剂、增粘剂等。本文所述的药物组合物可以包装成单一单位剂量或包装成多剂量形式。所述组合物通常配制为无菌且基本上等渗的溶液。
VII.制品和试剂盒
还提供在本文所述的方法中使用的试剂盒或制品。在多个方面中，所述试剂盒包含在合适的包装中的本文所述的组合物(例如，包含编码miR-708 RNA的核酸和/或视紫红质转基因的rAAV颗粒)。用于本文所述的组合物(如眼部组合物)的合适包装是本领域已知的，并且包括，例如，小瓶(如密封小瓶)、容器、安瓿(ampule)、瓶、罐、柔性包装(例如，密封的Mylar或塑料袋)，等等。这些制品可以进一步灭菌和/或密封。
本发明还提供包含本文所述的组合物的试剂盒，并且可进一步包含关于使用所述组合物的方法(如本文所述的使用)的说明。本文描述的试剂盒可进一步包括从商业和用户立场来看理想的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有关于实施本文所述任何方法的说明的包装插页。例如，在一些实施方案中，所述试剂盒包含含有编码miR-708 RNA的转基因和/或视紫红质转基因的rAAV用于眼内递送至少1×109基因组拷贝至如本文所述的灵长类，适合于眼内注射的药物上可接受载剂，和如下的一种或多种：缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有关于实施眼部注射的说明的包装插页。在一些实施方案中，所述试剂盒包含关于使用本文所述的rAAV颗粒治疗色素性视网膜炎的说明。在一些实施方案中，所述试剂盒包含关于使用本文所述的rAAV颗粒降低细胞中ER应激的说明。在一些实施方案中，所述试剂盒包含关于根据本文所述的任一方法使用本文所述的rAAV颗粒的说明。
实施例
参考以下实施例会更充分地理解本发明。然而，不应将它们理解为对本发明范围的限制。应理解的是此处记载的实施例和实施方案仅出于示例性目的，并且本领域技术人员会得到提示在其启发下进行多种修改或变化，并且这些修改或变化包括在本申请的宗旨和范围以及所附权利要求范围之内。
实施例1：色素性视网膜炎细胞模型的开发
用于RHO相关体染色体遗传RP的治疗策略会同时敲低突变和野生型视紫红质并缓解ER应激。这可以通过共同递送会抑制视紫红质等位基因的微RNA(miR)并任选地共同递送难以通过外源递送的miR敲低的野生型视紫红质序列来实现。受CHOP调节的miR，miR-708，调节视紫红质表达(Behrman,S.,等(2011)J.Cell Biol.192(6)：919-27)。miR-708是位于CHOP-诱导型基因Odz4(Tenurin-4)之内的内含子miR。在ER应激期间CHOP调节miR-708表达，并且在视紫红质的3’UTR中存在推定的miR-708序列。
本文描述了使用AAV载体递送外源miR-708的方法，所述外源miR-708通过两种等位基因中存在的3’UTR miR-708靶序列靶向野生型和突变视紫红质二者。在多个实施方案中，野生型视紫红质取代序列也被共同递送。这种取代视紫红质序列可经工程化以具有减少的与miR-708的结合(例如，核苷酸取代、缺失或添加至3’UTR)，并因此会难以通过外源miR-708敲低。在多个实施方案中，取代视紫红质序列缺乏3’UTR miR-708靶序列。简而言之，所述AAV载体会敲低引起ER应激的视紫红质的表达(并因此有感光细胞死亡)，并任选地补充难以受到miR-708诱导的敲低的野生型或密码子优化的视紫红质基因的表达，因此重建正常表达和视紫红质功能。
方法
细胞培养
使用来自Invitrogen的T-Rex四环素诱导***将HEK-293细胞经工程化以表达人或小鼠视紫红质P23H。将6孔板中融合的细胞用4μg miR-708(pcDNA)载体或对照miRNA载体使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)按照生产商的说明转染。转染后48小时，将培养基用含有2μM四环素的培养基替代。将细胞温育额外的24小时，并将培养基从每个孔去除。
Western印迹
将细胞在含有1mM PMSF的400μL RIPA缓冲液(Thermo Scientific)中裂解，并多次通过25g注射器。将裂解液在14,000rpm离心10分钟。在整个过程中将细胞保持在4℃。将30μL上清液装载至4-12％Bis/Tris凝胶上并在MOPS缓冲液(Invitrogen)中进行SDS-PAGE。然后将蛋白质使用来自Invitrogen的I-Blot***转移至硝酸纤维素膜。将膜在室温在含有0.05％Tween-20(PBS-T)和0.1％I-Block(Invitrogen)的PBS中封闭1小时。将膜在含有1μg/mL抗视紫红质mAb 1D4(Abcam)的PBS-T中在4℃温育过夜。在PBS-T中清洗几次之后，将膜在含有1：1000稀释的抗小鼠IgG HRP偶联Ab(R&D Systems)的第二抗体溶液中在室温温育1小时。将膜在PBS-T中清洗几次，并使用ECL试剂(Thermo Scientific)显影。m视紫红质蛋白水平使用Image-J软件定量。在含有0.1M甘氨酸pH 2的PBS中将膜的蛋白质剥离，然后在PBS-T中漂洗几次。然后在室温在含有1：20,000稀释的抗GAPDH pAb(Sigma)的PBS-T中探查膜的hGAPDH 2小时。在PBS-T中清洗几次之后，将第二抗体(抗兔IgG-HRP,R&D Systems)在PBS-T以1:1000中稀释，并在室温温育1小时。将膜清洗几次，并使用ECL试剂(ThermoScientific)显影。然后使用Image J软件将m视紫红质蛋白质水平标准化至hGAPDH蛋白质水平。
HEK-293细胞中内源miR-708的敲低
将(上述)表达小鼠或人视紫红质的HEK-293细胞用100pmol pre-miR-708、抗miR-708或对照miRNA(Ambion)使用用于以siRNA分子转染的Lipofectamine 2000方案(Invitrogen)进行转染。在转染后48小时，将培养基用含2uM四环素的培养基替代以诱导视紫红质表达。24小时之后，将每个孔分成2个样品。一个使用上述蛋白质印迹方案探查m视紫红质和hGAPDH，并从另一个提取RNA用于对视紫红质和miR-708 RNA表达的(LifeTechnologies)分析。使用Qiagen的miRNeasy试剂盒，根据生产商的说明，从细胞提取总RNA(包括小RNA)，包括对样品的DNA酶处理。使用Qiagen的Quantitect ReverseTranscription(Quantitect反转录)***从总RNA合成cDNA。将cDNA添加至m视紫红质、hCHOP(Ddit3)、hBiP(Hspa5)或hGAPDH基因表达测定(Life Technologies)。将基因表达相对于hGAPDH使用ΔΔCt方法标准化。将miR-708表达使用miR-708表达测定(Life Technologies)定量。将miR-708表达相对于内源miR-16表达使用ΔΔCt方法呈现。
WERI Rb-1细胞中视紫红质激酶启动子驱动的miR-708表达
将miR-708序列在从pcDNA6.2GW载体(Block-iT***，Invitrogen)切下之后次克隆至载体pRK-MVM中视紫红质激酶(RK)启动子的下游，所述载体pRK-MVM含有天然hRK启动子和MVM内含子序列。将WERI Rb-1细胞(ATCC)用2μg pRK-miR-708或pRK-miR-对照载体使用Fugene-HD(Promega)根据生产商的说明转染。在转染后48小时，收集细胞，并使用miRNeasy试剂盒方案(Qiagen)提取总RNA(包括小RNAs)。使用miR-708基因表达测定如之前所述(Life Technologies)定量每个样品中的miR-708。为了定量表达miR-708的WERI Rb-1细胞中的m视紫红质敲低，将细胞用各2μg pRK-miR-708(或对照)和pSport6m视紫红质P23H使用Fugene-HD根据生产商的说明(Promega)共转染。如所述的提取RNA，并如上所述使用ΔΔCt方法相对于hGAPDH RNA水平定量m视紫红质RNA水平。
从注射AAV载体的小鼠视网膜提取RNA
使用miRNeasy试剂盒根据生产商的说明(Qiagen)从小鼠视网膜提取RNA。将各个小鼠视网膜在Qiazol Lysis Buffer(Qiazol裂解缓冲液)中使用1mm氧化锆/二氧化硅珠(Biospec)均质化10分钟。在均质化之后，根据生产商的说明提取RNA。使用qStar microRNA定量***(Origene)定量每个视网膜中的miR-708水平。使用第一链cDNA合成试剂盒(Origene)合成cDNA，接着使用miR-708特异性引物和miR-708拷贝标准品(Origene)进行miR-708特异性扩增和定量。为了定量经注射的小鼠眼内的视紫红质水平，使用特异性引物(Life Technologies)扩增m视紫红质，并相对于视紫红质cDNA标准品定量。使用ΔΔCt方法相对于GAPDH表达定量分析RdCVF水平。
视紫红质抑制/替代载体
通过从pcDNA载体切下并进行平端连接至pRK-MCS中将h视紫红质cDNA(没有侧翼UTR序列)克隆至pRK载体中。合成(Biobasic)的cDNA含有h视紫红质激酶启动子序列和hβ-球蛋白内含子，带有位于内含子的剪接受体/供***点之间的hmiR-708序列***(取自Genbank/NCBI的序列)。将该序列从pUC57载体次克隆，连接至pcDNA h视紫红质载体中，并重命名为pRK-miR-708 hRho/wt。如上所述测定经转染的WERI Rb-1细胞中的miRNA-708和h视紫红质蛋白质水平。
定量P23H m视紫红质-转染的WERI Rb-1细胞中的XBP-1剪接
将hWERI Rb-1细胞用编码非糖基化的P23H突变的m视紫红质的pcDNA载体和pRK-miR-708载体共转染。使用定点PCR诱变(Agilent Technologies)突变这种P23H视紫红质cDNA以将两个天冬酰胺密码子(在位置2和5)变成丙氨酸。按照描述用每种载体2μg转染细胞并温育72小时。如先前所述从细胞收集总RNA。使用High Capacity cDNA合成试剂盒(Invitrogen)合成cDNA。使用对于XBP-1特异性的引物和High Fidelity PCR MasterMix(高保真PCR主混合物)(Roche)评价XBP-1剪接。在2％琼脂糖凝胶上分析扩增的序列，并使用Image-J软件定量剪接的(～280nt)相对于未剪接的(～300nt)XBP-1转录物的相对量。
其他方法
用于免疫萤光的方法、带有和不带有内切糖苷酶H处理的蛋白质印迹、UPR标记物表达和TUNEL染色表达野生型或P23H突变视紫红质的细胞如Adamowicz,M.等(2012)Adv.Exp.Med.Biol.723:573-9中所述进行。
结果
用编码人野生型(WT)或人P23H突变视紫红质(与RP连锁的突变)的基因瞬时转染人视网膜色素上皮(RPE)细胞。通过共聚焦免疫萤光显微镜使用抗视紫红质抗体研究视紫红质的定位。在野生型蛋白质的情况下，大部分蛋白质经加工至细胞膜(图1A)，说明正常的生物发生。相对而言，突变的P23H显示了内质网(ER)驻留的绕核(perinuclear)/网状(reticular)分布特征，其中几乎没有在细胞表面的表达(图1B)。这些结果证明，P23H突变视紫红质不能正确地运输至细胞膜，反而驻留在ER中。
通过对来自瞬时表达野生型或P23H突变体蛋白的RPE细胞的洗涤剂可溶性提取物的SDS-PAGE免疫印迹分析评估了视紫红质的聚集(图2A)。野生型视紫红质主要作为弥散条带迁移至在～40kDa的分子量处。这种类型对应于单体、成熟的含n-联聚糖的视紫红质。P23H突变视紫红质的迁移力显著区别于野生型视紫红质，其中大部分P23H作为更高分子量的二聚体和寡聚体迁移(图2A)。P23H还对内切糖苷酶H敏感-注意到用内切糖苷酶H的处理影响P23H视紫红质的迁移，但不影响野生型，如图2B中所示。内切糖苷酶H特异性针对尚未成熟至ER之外的蛋白质中典型的核心糖基化、高甘露糖N联寡糖结构。
综合起来，这些数据提示在RPE细胞野生型中，视紫红质能够折叠并成熟至ER之外，而P23H突变型更倾向于形成非天然寡聚体并保留在ER之内，这或许是因为不具有有效折叠的能力。
接下来，通过测量UPR的两种标记物物(BiP和CHOP)的水平来评估P23H视紫红质在经转染的RPE细胞中诱导ER应激的能力。在瞬时表达WT和P23H视紫红质的细胞中检测到了BiP mRNA水平的增加(图3A)，提示增加ER本身的折叠载荷(folding load)诱导UPR。然而，BiP mRNA表达在表达P23H视紫红质的细胞(是未经转染的细胞的43倍)中比在表达WT视紫红质的细胞中显著更高(是未经转染的细胞的14倍)(图3A)。视紫红质mRNA水平在表达WT或所述蛋白的突变形式的细胞中相同(图3A)。因此，P23H视紫红质是比WT视紫红质更有效的BiP诱导剂。不希望受限于理论，这种差异可能是由于突变体蛋白的缺陷。
接下来检查CHOP表达。表达WT视紫红质蛋白的细胞与未经转染的细胞相比显示出了15倍的CHOP诱导，而表达P23H突变型的细胞显示了更胜一筹的23倍的诱导(图3A)。由于CHOP是一种介导凋亡的UPR-诱导型转录因子(Lee,E.S.,等(2007)FEBS Lett.581(22)：4325-32)，测量了表达WT和P23H突变型的细胞之间凋亡的相对水平。与CHOP的mRNA水平一致，TUNEL测定结果进一步表明瞬时表达P23H突变型的RPE细胞比表达野生型视紫红质的那些更倾向于凋亡(图3B)。
实施例2：对miR-708水平的调整调节HEK-293细胞中视紫红质表达和UPR
已在数种哺乳动物视紫红质基因的3’UTR中发现了对应于推定的miR-708靶位点的共有序列(Behrman,S.等(2011)J.Cell Biol.192(6):919-27)。本实施例证明对视紫红质的miR-708调节可用作调整所培养的细胞中视紫红质表达的手段。
用如图4中所描绘的表达miR-708或miR-对照的质粒转染了表达编码3’UTR miR-708靶序列的P23H突变型m视紫红质基因的HEK-293细胞。72小时之后，收集细胞，并使用蛋白质印迹分析了mP23H视紫红质蛋白的表达(图5)。与用CBA-miR-对照载体转染的细胞相比，在用CBA-miR-708转染的细胞中P23H m视紫红质蛋白的表达降低至～30％。
还通过基因表达分析来分析UPR靶基因(CHOP/BIP)的表达。表达miR-708的HEK-293细胞还显示与对照细胞相比降低的CHOP和BiP RNA的表达(图6)。这些结果提示降低错误折叠的P23H m视紫红质的水平导致UPR基因BiP和CHOP表达的同时降低。
在相反的实验中，用抗miR-708 pre-miRNA或阴性对照pre-miRNA转染了表达小鼠P23H视紫红质(包括3’UTR miR-708靶序列)或人P23H视紫红质(缺乏3’UTR miR-708靶序列)的HEK-293细胞(图7)。在这项实验中，使用了外源抗miR-708抑制内源HEK293miR-708。如果内源miR-708通过推定的miR-708靶序列调节视紫红质表达，则只会在视紫红质基因的3’UTR中存在miR-708靶序列的情况下观察到P23H视紫红质水平的变化。将细胞用每种RNA各100pmol转染。生成细胞裂解液，并且在蛋白质上定量视紫红质蛋白，同时通过分析来分析mRNA水平(图7)。对内源miR-708抑制导致小鼠视紫红质mRNA和蛋白质均有所增加(图7A)，而人视紫红质mRNA和蛋白质二者的水平均保持不受影响(图7B)，尽管内源miR-708水平较低。这些结果证明经由miR-708调节视紫红质需要视紫红质3’UTR中的miR-708靶序列。
综合起来，这些结果证明视紫红质是miR-708的功能性靶物，并且对miR-708活性的调整可用作影响视紫红质表达的工具。
实施例3：设计在光感受器特异性视紫红质激酶启动子控制下表达miR-708的AAVITR质粒
认为ER中突变型视紫红质蛋白的累积促成RP中引起感光细胞死亡的ER应激。前述实施例证明了miR-708表达能够调节视紫红质的整体水平。构建了基于腺相关病毒(AAV)的载体，用于miR-708在视网膜的感光细胞中的特异性表达，以测定降低总视紫红质水平(包括野生型和突变形式)是否可不依赖于视紫红质突变来缓解ER应激。
图8描绘设计用于在视网膜感光细胞中特异性表达miR-708的AAV反向末端重复(ITR)质粒。miR-708表达由视紫红质激酶启动子(pRK)驱动，其在视杆细胞中特异性地表达。在这种载体中，miR-708从图4中所示的miR-155支架表达。
接下来，在培养的细胞中验证这种AAV ITR质粒。将WERI或RPE细胞用图8中描述的前病毒质粒(pre-viral plasmid)转染，并且通过分析定量miR-708水平。图9A显示用pRK驱动的miR-708质粒转染的WERI细胞与用表达miR-乱序(对照)的质粒转染的WERI细胞相比在miR-708水平上具有超过2000倍的增加。相对来说，RPE细胞，其中RK启动子不显著表达，没有显示miR-708水平的显著增加(图9A)。
miR-708在调节视紫红质表达中的功能通过将pRK-miR-708质粒(或miR-对照质粒)和具有含3’miR708靶序列的P23H小鼠视紫红质基因的质粒共转染至WERI细胞中而得到了确认。图9B显示与miR-对照相比，在miR-708存在下P23H m视紫红质mRNA减少。这些结果证明使用AAV ITR载体表达miR-708有效降低了感光细胞中视紫红质的表达。
实施例4：使用miR-708AAV5载体敲低小鼠视网膜中的视紫红质
为了检验AAV载体是否能够在体内用于降低视网膜中视紫红质的表达，将图8中描述的pRK-miR-708质粒包装至AAV5衣壳中以生成AAV5-RK miR-708。另外，生成AAV5 miR-对照载体。野生型C57bl小鼠在对侧眼中接受了视网膜下注射的1x108vgs的AAV5-RK miR-708或AAV5 miR-对照。在注射后1个月，对小鼠进行麻醉，提取了神经视网膜并快速冷冻用于对基因表达进行qPCR分析。
图10A显示用表达miR-708的AAV5载体注射过的小鼠眼与注射AAV5miR-对照载体的小鼠眼相比具有降低的视紫红质表达。相对而言，另一视杆细胞特异性基因(视杆细胞来源的视锥细胞活力因子(Rod Derived Cone Viability Factor(RdCVF)))的表达未受影响(图10B)。图10C确认注射了AAV5miR708载体的眼与接受AAV5miR对照的眼相比显示出miR-708拷贝数的显著增加。这些结果提示，在视杆细胞(rod photoreceptor)中表达miR-708的基于AAV的载体有效降低体内内源视紫红质的表达。
为了证明视紫红质敲低的功能相关性，通过视网膜电图(ERG)分析了用AAV5 miR-708或AAV5 miR-对照处理的小鼠眼以评估视网膜功能。接受AAV5 miR-708载体的眼显示降低的暗视反应，正如若视紫红质水平减少时的情况所预期(图11A)。暗视ERG反应是对视杆细胞功能的评估，并且这种测量能够与视紫红质水平相关联。然而，相同动物中视锥细胞功能，如通过明视ERG来评估，在AAV5 miR-708递送之后没有变化(图11B)，确认miR-708对视杆细胞具有生物学效应而不影响视锥细胞(while sparing the cone cells)。这些数据证明AAV5 miR-708递送导致仅限于视杆靶细胞的生物学作用。
实施例5：构建具有嵌入内含子的miR-708表达盒的h视紫红质抑制/替代载体
miR-708在正常情况下由ODZ4基因中的第一内含子在体内表达。因此，基于miR-708的序列及其内源支架/侧翼序列设计新的构建体。将miR-708序列嵌入合成内含子并克隆至光感受器特异性启动子视紫红质激酶(RK)的下游，但在h视紫红质cDNA的上游。将内源miR-708序列包括其侧翼调节和加工序列克隆至h视紫红质cDNA序列上游但在RK启动子下游的β-球蛋白内含子中。由此，miR-708序列相对于视紫红质编码序列系位于5’。
图12提供了这种5’抑制/替代载体的示意图。通过RK启动子控制h视紫红质(缺乏3’UTR mir708靶序列)。将包括内源支架(例如，包括任何Drosha/Dicer识别基序)的内源miR-708序列嵌入β-球蛋白内含子之内。将h视紫红质cDNA(无3’miR-708UTR靶序列)并入在剪接连接位点(splice junction site)的下游。将miR-708嵌入在β-球蛋白之内，其位于RK启动子的下游，因此miR-708在β-球蛋白内含子序列的剪接之后得到加工。另外，生成含有对照miR的具有相似结构的载体。
使用图12描述的载体或具有对照miRNA的载体转染WERI细胞。使用WERI细胞是因为它们(如果有的话)表达很少的内源miR-708，并且它们对于RK启动子是可允许的。将WERI细胞用编码P23H m视紫红质(具有3’UTR miR-708序列)的cDNA共转染。在经转染的细胞中同时检查了视紫红质敲低(RNA水平)以及UPR基因CHOP和BIP的水平。
图13显示用m视紫红质(P23H)和miR-708载体共转染的细胞与用视紫红质和对照miRNA载体共转染的细胞相比具有降低的m视紫红质水平。另外，与对照相比UPR基因CHOP和BiP也在miR-708转染的细胞中被下调。此数据提示使用其中内含子表达miR708的内源miR708支架提供一种可供选择的支持miR708加工和表达的支架。
实施例6：比较不同的miR-708支架
较低的miR-708表达水平可能有益于降低临床使用情况中任何潜在的miRNA脱靶效应(off-target effects)。因此，测试不同miR支架在WERI人成视网膜细胞瘤细胞系中的表达强度。
图14描绘用CBA驱动的miR-708、图4中显示的使用miR-155支架的RK驱动的miR708或图12中显示的RK内含子嵌入的miR-708h视紫红质载体转染的WERI细胞中的定量miR-708水平。RK内含子***中的miR-708表达不如CBA驱动***中那样稳固(robust)。然而，miR-708表达仍足以在背景之上，并且比使用miR-155支架的pRKmiR708低大约5倍。注意到h视紫红质由内含子嵌入载体共表达，在CBA或RKRK miR-155支架载体中则否。
接下来，比较表达miR-708内含子嵌入的、抑制/替代载体或miR-对照载体的WERI细胞中的h视紫红质mRNA水平。图15显示用miR-708内含子嵌入的、抑制/替代载体转染的WERI细胞与用对照载体转染的细胞相比具有相似的h视紫红质水平。这些结果表明缺乏3’UTR miR-708靶序列的h视紫红质由所述抑制/替代载体的表达难以受到miR-708表达的抑制。两种细胞均显示比未经转染的WERI细胞高的h视紫红质之表达。
实施例7：通过miR-708抑制/替代载体敲低突变型视紫红质降低了ER应激的标记物物
检查了miR-708抑制/替代载体降低表达突变型视紫红质的细胞中ER应激的能力。用图12中描述的抑制替代载体转染了表达非糖基化的、P23H突变视紫红质(N2K/N15K/P23H)(带有或不带有3’UTR miR708靶序列)的WERI细胞。收获细胞并提取RNA以测量X-框(box)结合蛋白1(XBP-1)剪接。XBP-1是在对ER应激基因的调节中重要的转录因子，其剪接是细胞ER应激/UPR的已知标记物物；正在经历UPR的细胞显示出剪接的XBP-1水平升高。
如图16中所示，当用miR-708抑制/替代载体转染时，表达带有3’UTR靶序列的突变型视紫红质的细胞具有降低的XBP-1剪接。相对来说，表达缺乏3’UTR miR-708靶序列的突变型P23H视紫红质的细胞与用miR-对照序列转染的细胞相比具有水平相当的XBP-1剪接。这些结果证明使用miR-708抑制/替代载体敲低突变型视紫红质有效降低ER应激。
实施例8：置于视紫红质3’UTR中的β-球蛋白内含子支架中的miR-708的表达增加视紫红质和miR-708的表达
为了检验miR-708支架的位置是否影响其表达，构建了载体，其中将miR-708序列(包括其侧翼调节/加工序列)克隆至视紫红质cDNA下游的β-球蛋白内含子序列中，即在3’UTR之内。图17显示了这种3’抑制/替代载体的示意图，其与图12中所示的载体类似，除了miR-708人β-球蛋白内含子支架位于视紫红质cDNA的3’UTR中，而不是5’UTR。
为了确定miR-708人β-球蛋白内含子支架在载体中的位置是否影响了miR-708或h视紫红质由所述载体的表达，用图12的5’UTR载体和图17的3’UTR载体转染WERI细胞。图18显示这些细胞中h视紫红质和miR-708的表达。发现miR-708支架在3’UTR中的载体比使用5’UTR构型的载体产生更高水平的h视紫红质和miR-708 RNA二者。
实施例9：在视网膜变性的P23H小鼠模型中评估所述抑制/替代载体
在视网膜变性的P23H小鼠模型中评估抑制/替代构建体。在这种模型中，在视杆细胞中表达的突变型P23H蛋白诱导了ER应激/UPR，引起凋亡和最终的视杆细胞死亡(Lee,E.S.等(2007)FEBS Lett.581(22):4325-32)。在视杆细胞死亡之后，出现视锥细胞的非细胞自主性死亡。
用表达miR-708和难以被miR708敲低的人视紫红质基因(因为其缺乏miR-708靶序列)的抑制/替代AAV载体治疗P23H小鼠。抑制/替代载体导致WT和P23H小鼠视紫红质二者的敲低，但是替代视紫红质基因补偿了视紫红质WT水平上的降低。因此，所述载体提供必要的视杆细胞视紫红质以维持视杆细胞功能和完整性。
还测试另一种备选抑制/替代构建体设计。如图19中所示，这种备选载体驱动miR-708从RK启动子的表达并且使用小鼠视蛋白启动子共表达h视紫红质(难以被miR-708敲低)。
这些抑制/替代载体还如上所述在P23H小鼠模型中进行了测试，在所述P23H小鼠模型中内源人视紫红质包含单一拷贝功能丧失的等位基因(例如，该小鼠就人视紫红质敲除等位基因而言是杂合的)。这种杂合小鼠模型可以使用标准小鼠遗传技术由mRho-/-小鼠和上述P23H模型构建。不希望受限于理论，认为这种mRho+/-P23H小鼠模型(含有一个拷贝突变型人视紫红质P23H等位基因和一个拷贝野生型小鼠基因)可模拟人ADRP基因型，在人ADRP基因型中患者具有相等拷贝的突变型和野生型视紫红质等位基因。
实施例10：评估其他抑制/替代载体
克隆了数种载体，其从单一载体表达miR-708(或对照miRNA序列)和h视紫红质二者。这些载体彼此的区别在于miRNA序列的侧翼序列或者源自miR-155(得自Invitrogen“Block-It”***)或者源自内源miR-708 5’和3’侧翼序列。将miRNA序列嵌入在视紫红质激酶启动子下游且在h视紫红质ORF上游的hβ-球蛋白内含子中。目的是检测来自每种构建体的表达和miRNA加工是否相似。另一对载体在h视紫红质ORF下游含有该miRNA序列(对照或miR-708)，也嵌入在β-球蛋白内含子中。在本实验中仅测试含有位于h视紫红质ORF下游的miR-708内源侧翼5’和3’序列的载体，在其中β-球蛋白内含子位于h视紫红质ORF上游的载体中测试了内源miR-708和miR-155两种侧翼序列。用每种构建体转染WERI细胞，并且测定miR-708表达和h视紫红质表达二者。
图20中的结果表明miR-155侧翼序列与内源miR-708侧翼序列相比产生了更好的miR-708表达(或miRNA加工)。在用含有miR-155侧翼序列的载体转染的那些细胞中miR-708表达与miR-708侧翼序列相比高约10倍。无论所述序列相对于h视紫红质ORF位于上游或下游，含有miR-708侧翼序列的载体具有较低的miR-708表达。h视紫红质表达不受miR-708过度表达的影响，因为无论载体中共表达的miRNA为何，其表达水平大致相等。未在含有对照miRNA序列的载体中检测到miR-708表达，如预期的。
实施例11：评估其他具有突变的miR-708靶序列的抑制/替代载体
如上所述，已经在数种哺乳动物视紫红质基因的3’UTR中发现对应于推定的miR-708靶位点的共有序列(Behrman,S.等(2011)J.Cell Biol.192(6):919-27)。本实施例证明具有突变miR-708靶序列的视紫红质能够用于抑制/替代载体中。
构建的rAAV载体包含编码miR-708的核酸和人视紫红质的基因。通过核酸取代、缺失或***来使人视紫红质基因于miR-708靶序列突变(SEQ ID NO:19)，以减少或防止miR-708进行识别。在一些实施例中，整个miR-708靶序列缺失。在一些实施例中，miR-708的减少和防止(reduction or prevention by miR-708)参考miR-708对包含miR-708靶序列的野生型视紫红质3’UTR的识别来测量。
为了测试通过miR-708抑制体染色体显性视紫红质并同时表达野生型视紫红质，用表达miR-708和人视紫红质的质粒(带有(CBA-miR-708-hRho-3’UTR-)或不带有(CBA-miR-708-hRho-3’UTR+)突变的miR-708靶序列)转染表达编码3’UTR miR-708靶序列的P23H突变型m视紫红质基因的HEK-293细胞。还使用实施例2中描述的miR-对照。72小时之后，收集细胞，并使用蛋白质印迹分析mP23H视紫红质和人视紫红质蛋白表达。在用CBA-miR-708-hRho-3’UTR-或CBA-miR-708-hRho-3’UTR+转染的细胞中P23H m视紫红质的蛋白表达与用CBA-miR-对照载体转染的细胞相比降低说明miR-708活性。人视紫红质在用CBA-miR-708-hRho-3’UTR-、而非CBA-miR-708-hRho-3’UTR+转染的细胞中的表达表明由CBA-miR-708-hRho-3’UTR-编码的视紫红质难以受到miR-708的抑制。
实施例12：AAV介导的对内源视紫红质和人视紫红质在小鼠视网膜中的表达的抑制
基于上述实验，实施了进一步的实验在完整眼中检验视紫红质抑制/替代策略。本实施例证明了使用miR-708支架构建的抑制/替代AAV载体在小鼠视网膜中的效力。
构建了具有如下载体的AAV5衣壳，所述载体包含视杆细胞特异性视蛋白启动子、miR-708支架(例如，miR-708内源支架/侧翼序列)和人视紫红质替代基因。在这种载体的一个版本中，***miR-708序列(例如，与miR-708靶序列结合的miR-708序列)以驱动表达miR708支架背景下的miR-708和人视紫红质替代基因(AAV5OPSmiR708708hRHO)。在这种载体的另一个版本中，生成的对照载体包含miR对照序列(AAV5OPSmiR对照708hRHO)。在两种载体中，替代性人视紫红质基因均难以受到miR-708敲低，因为其缺乏miR-708靶序列。两种载体均视网膜下注射至野生型小鼠的视网膜中。对于每只小鼠，未用药的对侧眼是未经注射的，并且将在每个经注射的视网膜中的表达标准化为相较于未经注射的对侧视网膜的表达倍数。注射后三周，收获视网膜并测定miR-708水平(图21A)、小鼠视紫红质mRNA水平(图21B)和人视紫红质(图21C)。
图21A显示与未用药的对侧眼相比，在注射AAV5OPSmiR708708hRHO载体后小鼠视网膜中miR-708水平的增加。在接受AAV5OPSmiR708708hRHO的眼中测量到了小鼠视紫红质的显著降低，而在接受对照载体AAV5OPSmiR对照708hRHO的眼中没有测量到小鼠视紫红质的降低(图21B)。此外，与对侧未经注射的未用药眼相比，两种载体均将人视紫红质水平升高高达100倍(图21C)。这些数据证明AAV5OPSmiR708708hRHO载体在体内是有效的。
总的来说，优化的抑制/替代载体AAV5OPSmiR708708hRHO通过miR-708实现小鼠视紫红质的敲低(内源小鼠视紫红质具有3’UTR靶序列)，同时实现替代人视紫红质的表达，其难以受到miR708敲低(人视紫红质替代基因缺乏3’UTR miR708靶序列)。这些结果证明了抑制/替代策略在完整哺乳动物眼中的效力。
实施例13：在人细胞中验证候选载体
接下来测定基于AAV5的候选载体在人细胞(HeLa)中促进miR-708和人视紫红质表达的能力。
测试了两种不同的启动子：视紫红质激酶(GRK1)和视蛋白启动子。上文描述了视紫红质激酶启动子。视蛋白启动子(示于SEQ ID NO:22)含有编码400bp CMV增强子的676bp片段，其在视蛋白启动子的上游(-500bp-+15bp)。此外，包括65bp NRL序列；这一序列编码神经视网膜碱性拉链因子(视杆细胞特异性转录因子)。启动子构建体下游是杂合内含子序列，其来自CBA外显子1和小鼠细小病毒(MVM)-称作MVM内含子序列(示于SEQ ID NO:23)。这种启动子构建体的示意图示于图22。
使用了两种不同的支架：miR-155支架或miR-708支架。二者均嵌入β-球蛋白内含子中。总共测试4种候选载体：AAV5GRK1miR708_155hRho(AAV5载体，具有视紫红质激酶启动子驱动表达miR-155支架中的miR-708和去掉miR-708靶序列的人视紫红质；SEQ ID NO:24)，AAV5GRK1miR708_708hRho(AAV5载体，具有视紫红质激酶启动子驱动表达miR-708支架中的miR-708和去掉miR-708靶序列的人视紫红质；SEQ ID NO:25)，AAV5OPSmiR708_155hRho(AAV5载体，具有视蛋白启动子驱动表达miR-155支架中的miR-708和去掉miR-708靶序列的人视紫红质；SEQ ID NO:26)，和AAV5OPSmiR708_708hRho(AAV5载体，具有视蛋白启动子驱动表达miR-708支架中的miR-708和去掉miR-708靶序列的人视紫红质；SEQ IDNO:27)。图23A显示嵌入在β-球蛋白内含子中的miR-708序列。miR-708和miR-155支架分别示于图23B和23C。
将4种候选AAV5载体中的每一种用于感染HeLa细胞(使用AdTs149辅助病毒)，并测量miR-708和人视紫红质的水平。如图24中所示，如与驱动从视蛋白或视紫红质激酶启动子表达对照miR的载体相比(分别为Ops miR-对照和RK miR-对照)，所有四种载体导致了miR-708和人视紫红质在人细胞中的体内表达。这些结果证明，成功地验证几种载体可用于在人细胞中的抑制/替代策略(例如上述那些)。
序列
miR-708核苷酸序列
AACTGCCCTCAAGGAGCTTACAATCTAGCTGGGGGTAAATGACTTGCACATGAACACAACTAGACTGTGAGCTTCTAGAGGGCAGGGA(SEQ ID NO:1)
人视紫红质氨基酸序列
MNGTEGPNFYVPFSNATGVVRSPFEYPQYYLAEPWQFSMLAAYMFLLIVLGFPINFLTLYVTVQHKKLRTPLNYILLNLAVADLFMVLGGFTSTLYTSLHGYFVFGPTGCNLEGFFATLGGEIALWSLVVLAIERYVVVCKPMSNFRFGENHAIMGVAFTWVMALACAAPPLAGWSRYIPEGLQCSCGIDYYTLKPEVNNESFVIYMFVVHFTIPMIIIFFCYGQLVFTVKEAAAQQQESATTQKAEKEVTRMVIIMVIAFLICWVPYASVAFYIFTHQGSNFGPIFMTIPAFFAKSAAIYNPVIYIMMNKQFRNCMLTTICCGKNPLGDDEASATVSKTETSQVAPA(SEQ ID NO:2)
人视紫红质cDNA-UTR缺失的
ATGAATGGCACAGAAGGCCCTAACTTCTACGTGCCCTTCTCCAATGCGACGGGTGTGGTACGCAGCCCCTTCGAGTACCCACAGTACTACCTGGCTGAGCCATGGCAGTTCTCCATGCTGGCCGCCTACATGTTTCTGCTGATCGTGCTGGGCTTCCCCATCAACTTCCTCACGCTCTACGTCACCGTCCAGCACAAGAAGCTGCGCACGCCTCTCAACTACATCCTGCTCAACCTAGCCGTGGCTGACCTCTTCATGGTCCTAGGTGGCTTCACCAGCACCCTCTACACCTCTCTGCATGGATACTTCGTCTTCGGGCCCACAGGATGCAATTTGGAGGGCTTCTTTGCCACCCTGGGCGGTGAAATTGCCCTGTGGTCCTTGGTGGTCCTGGCCATCGAGCGGTACGTGGTGGTGTGTAAGCCCATGAGCAACTTCCGCTTCGGGGAGAACCATGCCATCATGGGCGTTGCCTTCACCTGGGTCATGGCGCTGGCCTGCGCCGCACCCCCACTCGCCGGCTGGTCCAGGTACATCCCCGAGGGCCTGCAGTGCTCGTGTGGAATCGACTACTACACGCTCAAGCCGGAGGTCAACAACGAGTCTTTTGTCATCTACATGTTCGTGGTCCACTTCACCATCCCCATGATTATCATCTTTTTCTGCTATGGGCAGCTCGTCTTCACCGTCAAGGAGGCCGCTGCCCAGCAGCAGGAGTCAGCCACCACACAGAAGGCAGAGAAGGAGGTCACCCGCATGGTCATCATCATGGTCATCGCTTTCCTGATCTGCTGGGTGCCCTACGCCAGCGTGGCATTCTACATCTTCACCCACCAGGGCTCCAACTTCGGTCCCATCTTCATGACCATCCCAGCGTTCTTTGCCAAGAGCGCCGCCATCTACAACCCTGTCATCTATATCATGATGAACAAGCAGTTCCGGAACTGCATGCTCACCACCATCTGCTGCGGCAAGAACCCACTGGGTGACGATGAGGCCTCTGCTACCGTGTCCAAGACGGAGACGAGCCAGGTGGCCCCGGCC(SEQ ID NO:3)
人视紫红质cDNA-包括3’UTR
AGAGTCATCCAGCTGGAGCCCTGAGTGGCTGAGCTCAGGCCTTCGCAGCATTCTTGGGTGGGAGCAGCCACGGGTCAGCCACAAGGGCCACAGCCATGAATGGCACAGAAGGCCCTAACTTCTACGTGCCCTTCTCCAATGCGACGGGTGTGGTACGCAGCCCCTTCGAGTACCCACAGTACTACCTGGCTGAGCCATGGCAGTTCTCCATGCTGGCCGCCTACATGTTTCTGCTGATCGTGCTGGGCTTCCCCATCAACTTCCTCACGCTCTACGTCACCGTCCAGCACAAGAAGCTGCGCACGCCTCTCAACTACATCCTGCTCAACCTAGCCGTGGCTGACCTCTTCATGGTCCTAGGTGGCTTCACCAGCACCCTCTACACCTCTCTGCATGGATACTTCGTCTTCGGGCCCACAGGATGCAATTTGGAGGGCTTCTTTGCCACCCTGGGCGGTGAAATTGCCCTGTGGTCCTTGGTGGTCCTGGCCATCGAGCGGTACGTGGTGGTGTGTAAGCCCATGAGCAACTTCCGCTTCGGGGAGAACCATGCCATCATGGGCGTTGCCTTCACCTGGGTCATGGCGCTGGCCTGCGCCGCACCCCCACTCGCCGGCTGGTCCAGGTACATCCCCGAGGGCCTGCAGTGCTCGTGTGGAATCGACTACTACACGCTCAAGCCGGAGGTCAACAACGAGTCTTTTGTCATCTACATGTTCGTGGTCCACTTCACCATCCCCATGATTATCATCTTTTTCTGCTATGGGCAGCTCGTCTTCACCGTCAAGGAGGCCGCTGCCCAGCAGCAGGAGTCAGCCACCACACAGAAGGCAGAGAAGGAGGTCACCCGCATGGTCATCATCATGGTCATCGCTTTCCTGATCTGCTGGGTGCCCTACGCCAGCGTGGCATTCTACATCTTCACCCACCAGGGCTCCAACTTCGGTCCCATCTTCATGACCATCCCAGCGTTCTTTGCCAAGAGCGCCGCCATCTACAACCCTGTCATCTATATCATGATGAACAAGCAGTTCCGGAACTGCATGCTCACCACCATCTGCTGCGGCAAGAACCCACTGGGTGACGATGAGGCCTCTGCTACCGTGTCCAAGACGGAGACGAGCCAGGTGGCCCCGGCCTAAGACCTGCCTAGGACTCTGTGGCCGACTATAGGCGTCTCCCATCCCCTACACCTTCCCCCAGCCACAGCCATCCCACCAGGAGCAGCGCCTGTGCAGAATGAACGAAGTCACATAGGCTCCTTAATTTTTTTTTTTTTTTTAAGAAATAATTAATGAGGCTCCTCACTCACCTGGGACAGCCTGAGAAGGGACATCCACCAAGACCTACTGATCTGGAGTCCCACGTTCCCCAAGGCCAGCGGGATGTGTGCCCCTCCTCCTCCCAACTCATCTTTCAGGAACACGAGGATTCTTGCTTTCTGGAAAAGTGTCCCAGCTTAGGGATAAGTGTCTAGCACAGAATGGGGCACACAGTAGGTGCTTAATAAATGCTGGATGGATGCAGGAAGGAATGGAGGAATGAATGGGAAGGGAGAACATATCTATCCTCTCAGACCCTCGCAGCAGCAGCAACTCATACTTGGCTAATGATATGGAGCAGTTGTTTTTCCCTCCCTGGGCCTCACTTTCTTCTCCTATAAAATGGAAATCCCAGATCCCTGGTCCTGCCGACACGCAGCTACTGAGAAGACCAAAAGAGGTGTGTGTGTGTCTATGTGTGTGTTTCAGCACTTTGTAAATAGCAAGAAGCTGTACAGATTCTAGTTAATGTTGTGAATAACATCAATTAATGTAACTAGTTAATTACTATGATTATCACCTCCTGATAGTGAACATTTTGAGATTGGGCATTCAGATGATGGGGTTTCACCCAACCTTGGGGCAGGTTTTTAAAAATTAGCTAGGCATCAAGGCCAGACCAGGGCTGGGGGTTGGGCTGTAGGCAGGGACAGTCACAGGAATGCAGAATGCAGTCATCAGACCTGAAAAAACAACACTGGGGGAGGGGGACGGTGAAGGCCAAGTTCCCAATGAGGGTGAGATTGGGCCTGGGGTCTCACCCCTAGTGTGGGGCCCCAGGTCCCGTGCCTCCCCTTCCCAATGTGGCCTATGGAGAGACAGGCCTTTCTCTCAGCCTCTGGAAGCCACCTGCTCTTTTGCTCTAGCACCTGGGTCCCAGCATCTAGAGCATGGAGCCTCTAGAAGCCATGCTCACCCGCCCACATTTAATTAACAGCTGAGTCCCTGATGTCATCCTTATCTCGAAGAGCTTAGAAACAAAGAGTGGGAAATTCCACTGGGCCTACCTTCCTTGGGGATGTTCATGGGCCCCAGTTTCCAGTTTCCCTTGCCAGACAAGCCCATCTTCAGCAGTTGCTAGTCCATTCTCCATTCTGGAGAATCTGCTCCAAAAAGCTGGCCACATCTCTGAGGTGTCAGAATTAAGCTGCCTCAGTAACTGCTCCCCCTTCTCCATATAAGCAAAGCCAGAAGCTCTAGCTTTACCCAGCTCTGCCTGGAGACTAAGGCAAATTGGGCCATTAAAAGCTCAGCTCCTATGTTGGTATTAACGGTGGTGGGTTTTGTTGCTTTCACACTCTATCCACAGGATAGATTGAAACTGCCAGCTTCCACCTGATCCCTGACCCTGGGATGGCTGGATTGAGCAATGAGCAGAGCCAAGCAGCACAGAGTCCCCTGGGGCTAGAGGTGGAGGAGGCAGTCCTGGGAATGGGAAAAACCCCA(SEQID NO:4)
仅RK-miR708
GGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGAGGAAGGGGCCGGGCAGAATGATCTAATCGGATTCCAAGCAGCTCAGGGGATTGTCTTTTTCTAGCACCTTCTTGCCACTCCTAAGCGTCCTCCGTGACCCCGGCTGGGATTTAGCCTGGTGCTGTGTCAGCCCCGGTCTCCCAGGGGCTTCCCAGTGGTCCCCAGGAACCCTCGACAGGGCCCGGTCTCTCTCGTCCAGCAAGGGCAGGGACGGGCCACAGGCCAAGGGCGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCTTCGAAAGATCCTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCTGAAGGAGCTTACAATCTAGCTGGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCCAGCTAGTGTAAGCTCCTTCAGGACACAAGGCCTGTTACTAGCACTCACATGGAACAAATGGCCCA(SEQ ID NO:5)
RK-miR-708-op-视紫红质
CAATCTCCCAGATGCTGATTCAGCCAGGAACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCACAAATAGTTATCGAGCCGCTGAGCCGGGGGGCGGGGGGTGTGAGACTGGAGGCGATGGACGGAGCTGACGGCACACACAGCTCAGATCTGTCAAGTGAGCCATTGTCAGGGCTTGGGGACTGGATAAGTCAGGGGGTCTCCTGGGAAGAGATGGGATAGGTGAGTTCAGGAGGAGACATTGTCAACTGGAGCCATGTGGAGAAGTGAATTTAGGGCCCAAAGGTTCCAGTCGCAGCCTGAGGCCACCAGACTGACATGGGGAGGAATTCCCAGAGGACTCTGGGGCAGACAAGATGAGACACCCTTTCCTTTCTTTACCTAAGGGCCTCCACCCGATGTCACCTTGGCCCCTCTGCAAGCCAATTAGGCCCCGGTGGCAGCAGTGGGATTAGCGTTAGTATGATATCTCGCGGATGCTGAATCAGCCTCTGGCTTAGGGAGAGAAGGTCACTTTATAAGGGTCTGGGGGGGGTCAGTGCCTGGAGTTGCGCTGTGGGAGCCGTCAGTGGCTGAGCTCAAGAGGTAAGGGTTTAAGGGATGGTTGGTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTGTTTTACAGGCCTGAAATCACTTGGTTTTAGGTTGGTACATCTGCAGAATTCAGCCACCACCGGCACAATGAATGGCACAGAAGGCCCTAACTTCTACGTGCCCTTCTCCAATGCGACGGGTGTGGTACGCAGCCCCTTCGAGTACCCACAGTACTACCTGGCTGAGCCATGGCAGTTCTCCATGCTGGCCGCCTACATGTTTCTGCTGATCGTGCTGGGCTTCCCCATCAACTTCCTCACGCTCTACGTCACCGTCCAGCACAAGAAGCTGCGCACGCCTCTCAACTACATCCTGCTCAACCTAGCCGTGGCTGACCTCTTCATGGTCCTAGGTGGCTTCACCAGCACCCTCTACACCTCTCTGCATGGATACTTCGTCTTCGGGCCCACAGGATGCAATTTGGAGGGCTTCTTTGCCACCCTGGGCGGTGAAATTGCCCTGTGGTCCTTGGTGGTCCTGGCCATCGAGCGGTACGTGGTGGTGTGTAAGCCCATGAGCAACTTCCGCTTCGGGGAGAACCATGCCATCATGGGCGTTGCCTTCACCTGGGTCATGGCGCTGGCCTGCGCCGCACCCCCACTCGCCGGCTGGTCCAGGTACATCCCCGAGGGCCTGCAGTGCTCGTGTGGAATCGACTACTACACGCTCAAGCCGGAGGTCAACAACGAGTCTTTTGTCATCTACATGTTCGTGGTCCACTTCACCATCCCCATGATTATCATCTTTTTCTGCTATGGGCAGCTCGTCTTCACCGTCAAGGAGGCCGCTGCCCAGCAGCAGGAGTCAGCCACCACACAGAAGGCAGAGAAGGAGGTCACCCGCATGGTCATCATCATGGTCATCGCTTTCCTGATCTGCTGGGTGCCCTACGCCAGCGTGGCATTCTACATCTTCACCCACCAGGGCTCCAACTTCGGTCCCATCTTCATGACCATCCCAGCGTTCTTTGCCAAGAGCGCCGCCATCTACAACCCTGTCATCTATATCATGATGAACAAGCAGTTCCGGAACTGCATGCTCACCACCATCTGCTGCGGCAAGAACCCACTGGGTGACGATGAGGCCTCTGCTACCGTGTCCAAGACGGAGACGAGCCAGGTGGCCCCGGCCTAACCAAGAAAGCTTAAGTTTGTGTCCCGGCTTAGGGCTAAATGTCTAGGACAGAATGGAACACATAGTAGCTGATTAATAAATGCTAGCTGGATGAAGGGAGGAATGAGTGACTGACTGAGTGGATATATGAGTGAAGGGATTAATGGAAGGGAACATGGATGTCCTCAGGTGCCCAACCTGGCAGATCCAGTCATGTCTGGCTGGAATCTATAAGCAGTTTTACATACCTGCCCTGAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGTGACTCTCTTAAGGTAGCCTTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAAAACCTAACCCCCATGGTTGGCGAGGGACTGCTGTGTGTGAAATGGTAACTGCCCTCAAGGAGCTTACAATCTAGCTGGGGGTAAATGACTTGCACATGAACACAACTAGACTGTGAGCTTCTAGAGGGCAGGGACCTTACCCTAGTCATCTCTCTTCTCACCCTGCACACCCTCCCTGAGGGATCTCATGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCACACCGGCACAATGAATGGCACAGAAGGCCCTAACTTCTACGTGCCCTTCTCCAATGCGACGGGTGTGGTACGCAGCCCCTTCGAGTACCCACAGTCAGAGATAAATGACAGTGACAGCAACGTGAGCTGCAGCCCTTAGGACTGAGAAAGCATCGAGACCAGGGGTCTCCGGCAAGGCCTAGGTCCTCCCTTCAGTATGGAAACCTTGCCTCATGTCTCTCAGCCTCCTTGGCCTGTGGAGATCCAGCCCTTCCTCTTGGCTTCTGGATACATTTGCTCTTCTACACCAGCAACCAAGTGGCAACAGTTCCAGGCCAGTATGGAGTTTTAGAAGCCATGCCAATATGCCCACCTTCAGGGAGCAGCTGAGTCCTTGATGCCACCCTTGTTCTGAAGAGTTCAGAAACACAGTGCAAGACATGACCAGGCCTCATCCTTAGGATGCTCATGGATCCAGTTCTTAGCTCCCTTGTTGGATATGCTGTTTTCCTTGGCCTTTGGTCTTTTCTTTATCCCAGAGGGTTTTGGCTTTAAGGCCAACAGGAACTATGGGGTACCAGAATTGAGCAGCCTCAGTCTGCATCCCTCCTCTATAGAACCACAGCTGGGCCCTCAGCAGGCCCAACTCTGCATGGGGACAGAGGCATTAAAAGC(SEQ ID NO:6)
RK-内含子-视紫红质-miR-708.
GGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGAGGAAGGGGCCGGGCAGAATGATCTAATCGGATTCCAAGCAGCTCAGGGGATTGTCTTTTTCTAGCACCTTCTTGCCACTCCTAAGCGTCCTCCGTGACCCCGGCTGGGATTTAGCCTGGTGCTGTGTCAGCCCCGGTCTCCCAGGGGCTTCCCAGTGGTCCCCAGGAACCCTCGACAGGGCCCGGTCTCTCTCGTCCAGCAAGGGCAGGGACGGGCCACAGGCCAAGGGCGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCAAGAGGTAAGGGTTTAAGGGATGGTTGGTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTGTTTTACAGGCCTGAAATCACTTGGTTTTAGGTTGGGGATCCGGTACCCAATTGCCATGGGCTAGCATGCATGAGCTCCCTGCAGGGTTTATCTGCAGAATTCAGCCACCACCGGCACAATGAATGGCACAGAAGGCCCTAACTTCTACGTGCCCTTCTCCAATGCGACGGGTGTGGTACGCAGCCCCTTCGAGTACCCACAGTACTACCTGGCTGAGCCATGGCAGTTCTCCATGCTGGCCGCCTACATGTTTCTGCTGATCGTGCTGGGCTTCCCCATCAACTTCCTCACGCTCTACGTCACCGTCCAGCACAAGAAGCTGCGCACGCCTCTCAACTACATCCTGCTCAACCTAGCCGTGGCTGACCTCTTCATGGTCCTAGGTGGCTTCACCAGCACCCTCTACACCTCTCTGCATGGATACTTCGTCTTCGGGCCCACAGGATGCAATTTGGAGGGCTTCTTTGCCACCCTGGGCGGTGAAATTGCCCTGTGGTCCTTGGTGGTCCTGGCCATCGAGCGGTACGTGGTGGTGTGTAAGCCCATGAGCAACTTCCGCTTCGGGGAGAACCATGCCATCATGGGCGTTGCCTTCACCTGGGTCATGGCGCTGGCCTGCGCCGCACCCCCACTCGCCGGCTGGTCCAGGTACATCCCCGAGGGCCTGCAGTGCTCGTGTGGAATCGACTACTACACGCTCAAGCCGGAGGTCAACAACGAGTCTTTTGTCATCTACATGTTCGTGGTCCACTTCACCATCCCCATGATTATCATCTTTTTCTGCTATGGGCAGCTCGTCTTCACCGTCAAGGAGGCCGCTGCCCAGCAGCAGGAGTCAGCCACCACACAGAAGGCAGAGAAGGAGGTCACCCGCATGGTCATCATCATGGTCATCGCTTTCCTGATCTGCTGGGTGCCCTACGCCAGCGTGGCATTCTACATCTTCACCCACCAGGGCTCCAACTTCGGTCCCATCTTCATGACCATCCCAGCGTTCTTTGCCAAGAGCGCCGCCATCTACAACCCTGTCATCTATATCATGATGAACAAGCAGTTCCGGAACTGCATGCTCACCACCATCTGCTGCGGCAAGAACCCACTGGGTGACGATGAGGCCTCTGCTACCGTGTCCAAGACGGAGACGAGCCAGGTGGCCCCGGCCTAACCAAGAAAGCTTAAGTTTGTGTCCCGGCTTAGGGCTAAATGTCTAGGACAGAATGGAACACATAGTAGCTGATTAATAAATGCTAGCTGGATGAAGGGAGGAATGAGTGACTGACTGAGTGGATATATGAGTGAAGGGATTAATGGAAGGGAACATGGATGTCCTCAGGTGCCCAACCTGGCAGATCCAGTCATGTCTGGCTGGAATCTATAAGCAGTTTTACATACCTGCCCTGAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGTGACTCTCTTAAGGTAGCCTTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAAAACCTAACCCCCATGGTTGGCGAGGGACTGCTGTGTGTGAAATGGTAACTGCCCTCAAGGAGCTTACAATCTAGCTGGGGGTAAATGACTTGCACATGAACACAACTAGACTGTGAGCTTCTAGAGGGCAGGGACCTTACCCTAGTCATCTCTCTTCTCACCCTGCACACCCTCCCTGAGGGATCTCATGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCACACCGGCACAATGAATGGCACAGAAGGCCCTAACTTCTACGTGCCCTTCTCCAATGCGACGGGTGTGGTACGCAGCCCCTTCGAGTACCCACAGTCAGAGATAAATGACAGTGACAGCAACGTGAGCTGCAGCCCTTAGGACTGAGAAAGCATCGAGACCAGGGGTCTCCGGCAAGGCCTAGGTCCTCCCTTCAGTATGGAAACCTTGCCTCATGTCTCTCAGCCTCCTTGGCCTGTGGAGATCCAGCCCTTCCTCTTGGCTTCTGGATACATTTGCTCTTCTACACCAGCAACCAAGTGGCAACAGTTCCAGGCCAGTATGGAGTTTTAGAAGCCATGCCAATATGCCCACCTTCAGGGAGCAGCTGAGTCCTTGATGCCACCCTTGTTCTGAAGAGTTCAGAAACACAGTGCAAGACATGACCAGGCCTCATCCTTAGGATGCTCATGGATCCAGTTCTTAGCTCCCTTGTTGGATATGCTGTTTTCCTTGGCCTTTGGTCTTTTCTTTATCCCAGAGGGTTTTGGCTTTAAGGCCAACAGGAACTATGGGGTACCAGAATTGAGCAGCCTCAGTCTGCATCCCTCCTCTATAGAACCACAGCTGGGCCCTCAGCAGGCCCAACTCTGCATGGGGACAGAGGCATTAAAAGC(SEQ ID NO:7)
RK-miR-708-内含子hRho wt
GGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGAGGAAGGGGCCGGGCAGAATGATCTAATCGGATTCCAAGCAGCTCAGGGGATTGTCTTTTTCTAGCACCTTCTTGCCACTCCTAAGCGTCCTCCGTGACCCCGGCTGGGATTTAGCCTGGTGCTGTGTCAGCCCCGGTCTCCCAGGGGCTTCCCAGTGGTCCCCAGGAACCCTCGACAGGGCCCGGTCTCTCTCGTCCAGCAAGGGCAGGGACGGGCCACAGGCCAAGGGCACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGTGACTCTCTTAAGGTAGCCTTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAAAACCTAACCCCCATGGTTGGCGAGGGACTGCTGTGTGTGAAATGGTAACTGCCCTCAAGGAGCTTACAATCTAGCTGGGGGTAAATGACTTGCACATGAACACAACTAGACTGTGAGCTTCTAGAGGGCAGGGACCTTACCCTAGTCATCTCTCTTCTCACCCTGCACACCCTCCCTGAGGGATCTCATGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCACACCGGCACAATGAATGGCACAGAAGGCCCTAACTTCTACGTGCCCTTCTCCAATGCGACGGGTGTGGTACGCAGCCCCTTCGAGTACCCACAGTACTACCTGGCTGAGCCATGGCAGTTCTCCATGCTGGCCGCCTACATGTTTCTGCTGATCGTGCTGGGCTTCCCCATCAACTTCCTCACGCTCTACGTCACCGTCCAGCACAAGAAGCTGCGCACGCCTCTCAACTACATCCTGCTCAACCTAGCCGTGGCTGACCTCTTCATGGTCCTAGGTGGCTTCACCAGCACCCTCTACACCTCTCTGCATGGATACTTCGTCTTCGGGCCCACAGGATGCAATTTGGAGGGCTTCTTTGCCACCCTGGGCGGTGAAATTGCCCTGTGGTCCTTGGTGGTCCTGGCCATCGAGCGGTACGTGGTGGTGTGTAAGCCCATGAGCAACTTCCGCTTCGGGGAGAACCATGCCATCATGGGCGTTGCCTTCACCTGGGTCATGGCGCTGGCCTGCGCCGCACCCCCACTCGCCGGCTGGTCCAGGTACATCCCCGAGGGCCTGCAGTGCTCGTGTGGAATCGACTACTACACGCTCAAGCCGGAGGTCAACAACGAGTCTTTTGTCATCTACATGTTCGTGGTCCACTTCACCATCCCCATGATTATCATCTTTTTCTGCTATGGGCAGCTCGTCTTCACCGTCAAGGAGGCCGCTGCCCAGCAGCAGGAGTCAGCCACCACACAGAAGGCAGAGAAGGAGGTCACCCGCATGGTCATCATCATGGTCATCGCTTTCCTGATCTGCTGGGTGCCCTACGCCAGCGTGGCATTCTACATCTTCACCCACCAGGGCTCCAACTTCGGTCCCATCTTCATGACCATCCCAGCGTTCTTTGCCAAGAGCGCCGCCATCTACAACCCTGTCATCTATATCATGATGAACAAGCAGTTCCGGAACTGCATGCTCACCACCATCTGCTGCGGCAAGAACCCACTGGGTGACGATGAGGCCTCTGCTACCGTGTCCAAGACGGAGACGAGCCAGGTGGCCCCGGCC(SEQ ID NO:8)
RK-内含子-miR-708-op-hRho wt
CAATCTCCCAGATGCTGATTCAGCCAGGAACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCACAAATAGTTATCGAGCCGCTGAGCCGGGGGGCGGGGGGTGTGAGACTGGAGGCGATGGACGGAGCTGACGGCACACACAGCTCAGATCTGTCAAGTGAGCCATTGTCAGGGCTTGGGGACTGGATAAGTCAGGGGGTCTCCTGGGAAGAGATGGGATAGGTGAGTTCAGGAGGAGACATTGTCAACTGGAGCCATGTGGAGAAGTGAATTTAGGGCCCAAAGGTTCCAGTCGCAGCCTGAGGCCACCAGACTGACATGGGGAGGAATTCCCAGAGGACTCTGGGGCAGACAAGATGAGACACCCTTTCCTTTCTTTACCTAAGGGCCTCCACCCGATGTCACCTTGGCCCCTCTGCAAGCCAATTAGGCCCCGGTGGCAGCAGTGGGATTAGCGTTAGTATGATATCTCGCGGATGCTGAATCAGCCTCTGGCTTAGGGAGAGAAGGTCACTTTATAAGGGTCTGGGGGGGGTCAGTGCCTGGAGTTGCGCTGTGGGAGCCGTCAGTGGCTGAGCTCAAGAGGTAAGGGTTTAAGGGATGGTTGGTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTGTTTTACAGGCCTGAAATCACTTGGTTTTAGGTTGGTACATCTGCAGAATTCAGCCACCACCGGCACAATGAATGGCACAGAAGGCCCTAACTTCTACGTGCCCTTCTCCAATGCGACGGGTGTGGTACGCAGCCCCTTCGAGTACCCACAGTACTACCTGGCTGAGCCATGGCAGTTCTCCATGCTGGCCGCCTACATGTTTCTGCTGATCGTGCTGGGCTTCCCCATCAACTTCCTCACGCTCTACGTCACCGTCCAGCACAAGAAGCTGCGCACGCCTCTCAACTACATCCTGCTCAACCTAGCCGTGGCTGACCTCTTCATGGTCCTAGGTGGCTTCACCAGCACCCTCTACACCTCTCTGCATGGATACTTCGTCTTCGGGCCCACAGGATGCAATTTGGAGGGCTTCTTTGCCACCCTGGGCGGTGAAATTGCCCTGTGGTCCTTGGTGGTCCTGGCCATCGAGCGGTACGTGGTGGTGTGTAAGCCCATGAGCAACTTCCGCTTCGGGGAGAACCATGCCATCATGGGCGTTGCCTTCACCTGGGTCATGGCGCTGGCCTGCGCCGCACCCCCACTCGCCGGCTGGTCCAGGTACATCCCCGAGGGCCTGCAGTGCTCGTGTGGAATCGACTACTACACGCTCAAGCCGGAGGTCAACAACGAGTCTTTTGTCATCTACATGTTCGTGGTCCACTTCACCATCCCCATGATTATCATCTTTTTCTGCTATGGGCAGCTCGTCTTCACCGTCAAGGAGGCCGCTGCCCAGCAGCAGGAGTCAGCCACCACACAGAAGGCAGAGAAGGAGGTCACCCGCATGGTCATCATCATGGTCATCGCTTTCCTGATCTGCTGGGTGCCCTACGCCAGCGTGGCATTCTACATCTTCACCCACCAGGGCTCCAACTTCGGTCCCATCTTCATGACCATCCCAGCGTTCTTTGCCAAGAGCGCCGCCATCTACAACCCTGTCATCTATATCATGATGAACAAGCAGTTCCGGAACTGCATGCTCACCACCATCTGCTGCGGCAAGAACCCACTGGGTGACGATGAGGCCTCTGCTACCGTGTCCAAGACGGAGACGAGCCAGGTGGCCCCGGCCTAACCAAGAAAGCTTAAGTTTGTGTCCCGGCTTAGGGCTAAATGTCTAGGACAGAATGGAACACATAGTAGCTGATTAATAAATGCTAGCTGGATGAAGGGAGGAATGAGTGACTGACTGAGTGGATATATGAGTGAAGGGATTAATGGAAGGGAACATGGATGTCCTCAGGTGCCCAACCTGGCAGATCCAGTCATGTCTGGCTGGAATCTATAAGCAGTTTTACATACCTGCCCTGAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGTGACTCTCTTAAGGTAGCCTTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAAAACCTAACCCCCATGGTTGGCGAGGGACTGCTGTGTGTGAAATGGTAACTGCCCTCAAGGAGCTTACAATCTAGCTGGGGGTAAATGACTTGCACATGAACACAACTAGACTGTGAGCTTCTAGAGGGCAGGGACCTTACCCTAGTCATCTCTCTTCTCACCCTGCACACCCTCCCTGAGGGATCTCATGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCACACCGGCACAATGAATGGCACAGAAGGCCCTAACTTCTACGTGCCCTTCTCCAATGCGACGGGTGTGGTACGCAGCCCCTTCGAGTACCCACAGTCAGAGATAAATGACAGTGACAGCAACGTGAGCTGCAGCCCTTAGGACTGAGAAAGCATCGAGACCAGGGGTCTCCGGCAAGGCCTAGGTCCTCCCTTCAGTATGGAAACCTTGCCTCATGTCTCTCAGCCTCCTTGGCCTGTGGAGATCCAGCCCTTCCTCTTGGCTTCTGGATACATTTGCTCTTCTACACCAGCAACCAAGTGGCAACAGTTCCAGGCCAGTATGGAGTTTTAGAAGCCATGCCAATATGCCCACCTTCAGGGAGCAGCTGAGTCCTTGATGCCACCCTTGTTCTGAAGAGTTCAGAAACACAGTGCAAGACATGACCAGGCCTCATCCTTAGGATGCTCATGGATCCAGTTCTTAGCTCCCTTGTTGGATATGCTGTTTTCCTTGGCCTTTGGTCTTTTCTTTATCCCAGAGGGTTTTGGCTTTAAGGCCAACAGGAACTATGGGGTACCAGAATTGAGCAGCCTCAGTCTGCATCCCTCCTCTATAGAACCACAGCTGGGCCCTCAGCAGGCCCAACTCTGCATGGGGACAGAGGCATTAAAAGC(SEQ ID NO:9)
嵌合内含子
GGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACA(SEQ ID NO:10)
填充序列(Stuffer sequence)
AAGCTTGAAATGCCACCTCCTCTGATATTCTAGGTGTCCTGGAAGCCTGTCTCATCTTGCCCTGTAGTGTTGGGTCACCTGGCCCCCAGCCTGTAACATCCCCAGGGCCCTACACCCAGAGAAACACGGGGCTGGTGGCAGTGCCCAGTGACAACCGTTTAGTGGATAAGAGAAGAGTGACCACACCAGGCTGAGTGCTCCTCTCTGGTTTTCCATGGGGAGACAATGCCACCCTGAGCAGGGTCTGGTGTGAGCGGCAGCTGGCTCTGGGCTCTCTGATCCGTTACCCTCTCAGCCTCTTTGTTCTTTCTCAACCCCTGGAGCAGAGACCTCAGGAGGTGCTGGCATGGAACAGAGAAATTCCAGCCTCGATTCCTATTATGAACCCGACACCTTTTGTATTTTCATCTTGGTTTTACAGTGTACAAAACGAACTAGATCAGCAGGGCATGGGCATAATCACGAATGCACACACATACACTAATGTGTGGCTCATGTTTAAGTATCACTTACTACAGGACACCCAATCTAACAGCACCGATAAAGTGACAGAGAAACGCAAGCCTTCTGCGAACATGGCCTGGCTGTTCCAATTCCGAACCTTGCTTTTCTGGGCCTTGCCACACAGGCTCTTCCCCCGTCCCCCCAGGGACATTCTACCCTTGAACTCCACACTCCACTGCTGCCTTTGCCAGGAAGCCCATCTGTTCCTTTTTGGTTCTGCCAGAACGTGTGGTGGTGCTGCTGTCCCTGCCTTGGGCACTGGATATTGGGAAGGGACAGTGTCCACACTGGAGTGGGAAGTTCCCAGGGACGAGACCTTTACCTCCTCACCCTGGGTACTGTTCTCCTCATGGAGCATGGACGGCGCTGCCTGAACTCAGTGGTGGCCTCATTCTGGAAGCCAAGTTTATACAGAGTAGCAGTGACCCAGGGATGTGGGGTTCACCCTCCTCAGCCCTCTGGCCAGTCCTGATGGGCCTCAGTCCCAACATGGCTAAGAGGTGTGGGCAGCTTCTTGGTCACCCTCAGGTTGGGGAATCACCTTCTGTCTTCATTTTCCAGGAACTTGGTGATGATATCGTGGGTGAGTTCATTTACCAGGTGCTGTAGTTTCCCCTCATCAGGCAGGAAGAAGATGGCGGTGGCATTGCCCAGGTATTTCATCAGCAGCACCCAGCTGGACAGCTTCTTACAGTGCTGGATGTTAAACATGCCTAAACGCTTCATCATAGGCACCTTCACGGTGGTCACCTGGTCCACGTGGAAGTCCTCTTCCTCGGTGTCCTTGACTTCAAAGGGTCTCTCCCATTTGCCTGGAGAGAGGGGAAGGTGGGCATCACCAGGGGTGAGTGAAGGTTTGGAAGAGTGTAGCAGAATAAGAAACCATGAGTCCCCTCCCTGAGAAGCCCTGAGCCCCCTTGACGACACACATCCCTCGAGGCTCAGCTTCATCATCTGTAAAAGGTGCTGAAACTGACCATCCAAGCTGCCGAAAAAGATTGTGTGGGGATAATTCAAAACTAGAGGAAGATGCAGAATTTCTACATCGTGGCGATGTCAGGCTAAGAGATGCCATCGTGGCTGTGCATTTTTATTGGAATCATATGTTTATTTGAGGGTGTCTTGGATATTACAAATAAAATGTTGGAGCATCAGGCATATTTGGTACCTTCTGTCTAAGGCTCCCTGCCCCTTGTTAATTGGCAGCTCAGTTATTCATCCAGGGCAAACATTCTGCTTACTATTCCTGAGAGCTTTCCTCATCCTCTAGATTGGCAGGGGAAATGCAGATGCCTGAGCAGCCTCCCCTCTGCCATACCAACAGAGCTTCACCATCGAGGCATGCAGAGTGGACAGGGGCCTCAGGGACCCCTGATCCCAGCTTTCTCATTGGACAGAAGGAGGAGACTGGGGCTGGAGAGGGACCTGGGCCCCCACTAAGGCCACAGCAGAGCCAGGACTTTAGCTGTGCTGACTGCAGCCTGGCTTGCCTCCACTGCCCTCCTTTGCCTCAAGAGCAAGGGAGCCTCAGAGTGGAGGAAGCAGCCCCTGGCCTTGCCTCCCACCTCCCCTCCCCTATGCTGTTTTCCTGGGACAGTGGGAGCTGGCTTAGAATGCCCTGGGGCCCCCAGGACCCTGGCATTTTAACCCCTCAGGGGCAGGAAGGCAGCCTGAGATACAGAAGAGTCCATCACCTGCTGTATGCCACACACCATCCCCACAGTTACGTACTAGT(SEQ ID NO:11)
pCBA-h视紫红质-miR708(miR-155支架)
GAATTCGGACCGTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCTTCGAAAGATCTGCTAGCTTAATTAACCCAAACGGGCCCTCTAGACTCGAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCAGCCACCACCGGCACAATGAATGGCACAGAAGGCCCTAACTTCTACGTGCCCTTCTCCAATGCGACGGGTGTGGTACGCAGCCCCTTCGAGTACCCACAGTACTACCTGGCTGAGCCATGGCAGTTCTCCATGCTGGCCGCCTACATGTTTCTGCTGATCGTGCTGGGCTTCCCCATCAACTTCCTCACGCTCTACGTCACCGTCCAGCACAAGAAGCTGCGCACGCCTCTCAACTACATCCTGCTCAACCTAGCCGTGGCTGACCTCTTCATGGTCCTAGGTGGCTTCACCAGCACCCTCTACACCTCTCTGCATGGATACTTCGTCTTCGGGCCCACAGGATGCAATTTGGAGGGCTTCTTTGCCACCCTGGGCGGTGAAATTGCCCTGTGGTCCTTGGTGGTCCTGGCCATCGAGCGGTACGTGGTGGTGTGTAAGCCCATGAGCAACTTCCGCTTCGGGGAGAACCATGCCATCATGGGCGTTGCCTTCACCTGGGTCATGGCGCTGGCCTGCGCCGCACCCCCACTCGCCGGCTGGTCCAGGTACATCCCCGAGGGCCTGCAGTGCTCGTGTGGAATCGACTACTACACGCTCAAGCCGGAGGTCAACAACGAGTCTTTTGTCATCTACATGTTCGTGGTCCACTTCACCATCCCCATGATTATCATCTTTTTCTGCTATGGGCAGCTCGTCTTCACCGTCAAGGAGGCCGCTGCCCAGCAGCAGGAGTCAGCCACCACACAGAAGGCAGAGAAGGAGGTCACCCGCATGGTCATCATCATGGTCATCGCTTTCCTGATCTGCTGGGTGCCCTACGCCAGCGTGGCATTCTACATCTTCACCCACCAGGGCTCCAACTTCGGTCCCATCTTCATGACCATCCCAGCGTTCTTTGCCAAGAGCGCCGCCATCTACAACCCTGTCATCTATATCATGATGAACAAGCAGTTCCGGAACTGCATGCTCACCACCATCTGCTGCGGCAAGAACCCACTGGGTGACGATGAGGCCTCTGCTACCGTGTCCAAGACGGAGACGAGCCAGGTGGCCCCGGCCTAACCAAGAAAGCTTAAGTTTGGGACTAGTGGCGGCCGCTCGAGCATGCATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGCTAGAGTCGACCGGACCGCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGTCCCAAGCTGGCTAGTTAAGCTATCAACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGGGAGGTAGTGAGTCGACCAGTGGATCCTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCTGAAGGAGCTTACAATCTAGCTGGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCCAGCTAGTGTAAGCTCCTTCAGGACACAAGGCCTGTTACTAGCACTCACATGGAACAAATGGCCCAGATCTGGCCGCACTCGAGATGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO:12)
MIR155支架
GATCCTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCTGAAGGAGCTTACAATCTAGCTGGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCCAGCTAGTGTAAGCTCCTTCAGGACACAAGGCCTGTTACTAGCACTCACATGGAACAAATGGCCCAGATCTGGCCGCAC(SEQ ID NO:13)
内源MIR708支架
AACCTAACCCCCATGGTTGGCGAGGGACTGCTGTGTGTGAAATGGTAACTGCCCTCAAGGAGCTTACAATCTAGCTGGGGGTAAATGACTTGCACATGAACACAACTAGACTGTGAGCTTCTAGAGGGCAGGGACCTTACCCTAGTCATCTCTCTTCTCACCCTGCACACCCTCCCTGAGGGATCTCAT(SEQ ID NO:14)
pRK-h视紫红质-miR-708(mir708内源支架中的mir708，其位于人视紫红质的3’ UTR中)
TATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGGACCGTCGACATTGATTATTGGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGAGGAAGGGGCCGGGCAGAATGATCTAATCGGATTCCAAGCAGCTCAGGGGATTGTCTTTTTCTAGCACCTTCTTGCCACTCCTAAGCGTCCTCCGTGACCCCGGCTGGGATTTAGCCTGGTGCTGTGTCAGCCCCGGTCTCCCAGGGGCTTCCCAGTGGTCCCCAGGAACCCTCGACAGGGCCCGGTCTCTCTCGTCCAGCAAGGGCAGGGACGGGCCACAGGCCAAGGGCGGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCAAGAGGTAAGGGTTTAAGGGATGGTTGGTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTGTTTTACAGGCCTGAAATCACTTGGTTTTAGGTTGGGGATCCGGTACCCAATTGCCATGGGCTAGCATGCATGAGCTCCCTGCAGGGTTTATCTGCAGAATTCAGCCACCACCGGCACAATGAATGGCACAGAAGGCCCTAACTTCTACGTGCCCTTCTCCAATGCGACGGGTGTGGTACGCAGCCCCTTCGAGTACCCACAGTACTACCTGGCTGAGCCATGGCAGTTCTCCATGCTGGCCGCCTACATGTTTCTGCTGATCGTGCTGGGCTTCCCCATCAACTTCCTCACGCTCTACGTCACCGTCCAGCACAAGAAGCTGCGCACGCCTCTCAACTACATCCTGCTCAACCTAGCCGTGGCTGACCTCTTCATGGTCCTAGGTGGCTTCACCAGCACCCTCTACACCTCTCTGCATGGATACTTCGTCTTCGGGCCCACAGGATGCAATTTGGAGGGCTTCTTTGCCACCCTGGGCGGTGAAATTGCCCTGTGGTCCTTGGTGGTCCTGGCCATCGAGCGGTACGTGGTGGTGTGTAAGCCCATGAGCAACTTCCGCTTCGGGGAGAACCATGCCATCATGGGCGTTGCCTTCACCTGGGTCATGGCGCTGGCCTGCGCCGCACCCCCACTCGCCGGCTGGTCCAGGTACATCCCCGAGGGCCTGCAGTGCTCGTGTGGAATCGACTACTACACGCTCAAGCCGGAGGTCAACAACGAGTCTTTTGTCATCTACATGTTCGTGGTCCACTTCACCATCCCCATGATTATCATCTTTTTCTGCTATGGGCAGCTCGTCTTCACCGTCAAGGAGGCCGCTGCCCAGCAGCAGGAGTCAGCCACCACACAGAAGGCAGAGAAGGAGGTCACCCGCATGGTCATCATCATGGTCATCGCTTTCCTGATCTGCTGGGTGCCCTACGCCAGCGTGGCATTCTACATCTTCACCCACCAGGGCTCCAACTTCGGTCCCATCTTCATGACCATCCCAGCGTTCTTTGCCAAGAGCGCCGCCATCTACAACCCTGTCATCTATATCATGATGAACAAGCAGTTCCGGAACTGCATGCTCACCACCATCTGCTGCGGCAAGAACCCACTGGGTGACGATGAGGCCTCTGCTACCGTGTCCAAGACGGAGACGAGCCAGGTGGCCCCGGCCTAACCAAGAAAGCTTAAGTTTGTGTCCCGGCTTAGGGCTAAATGTCTAGGACAGAATGGAACACATAGTAGCTGATTAATAAATGCTAGCTGGATGAAGGGAGGAATGAGTGACTGACTGAGTGGATATATGAGTGAAGGGATTAATGGAAGGGAACATGGATGTCCTCAGGTGCCCAACCTGGCAGATCCAGTCATGTCTGGCTGGAATCTATAAGCAGTTTTACATACCTGCCCTGAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGTGACTCTCTTAAGGTAGCCTTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAAAACCTAACCCCCATGGTTGGCGAGGGACTGCTGTGTGTGAAATGGTAACTGCCCTCAAGGAGCTTACAATCTAGCTGGGGGTAAATGACTTGCACATGAACACAACTAGACTGTGAGCTTCTAGAGGGCAGGGACCTTACCCTAGTCATCTCTCTTCTCACCCTGCACACCCTCCCTGAGGGATCTCATGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCACACCGGCACAATGAATGGCACAGAAGGCCCTAACTTCTACGTGCCCTTCTCCAATGCGACGGGTGTGGTACGCAGCCCCTTCGAGTACCCACAGTCAGAGATAAATGACAGTGACAGCAACGTGAGCTGCAGCCCTTAGGACTGAGAAAGCATCGAGACCAGGGGTCTCCGGCAAGGCCTAGGTCCTCCCTTCAGTATGGAAACCTTGCCTCATGTCTCTCAGCCTCCTTGGCCTGTGGAGATCCAGCCCTTCCTCTTGGCTTCTGGATACATTTGCTCTTCTACACCAGCAACCAAGTGGCAACAGTTCCAGGCCAGTATGGAGTTTTAGAAGCCATGCCAATATGCCCACCTTCAGGGAGCAGCTGAGTCCTTGATGCCACCCTTGTTCTGAAGAGTTCAGAAACACAGTGCAAGACATGACCAGGCCTCATCCTTAGGATGCTCATGGATCCAGTTCTTAGCTCCCTTGTTGGATATGCTGTTTTCCTTGGCCTTTGGTCTTTTCTTTATCCCAGAGGGTTTTGGCTTTAAGGCCAACAGGAACTATGGGGTACCAGAATTGAGCAGCCTCAGTCTGCATCCCTCCTCTATAGAACCACAGCTGGGCCCTCAGCAGGCCCAACTCTGCATGGGGACAGAGGCATTAAAAGCCTAGAGTATCCCTCGAGGGGCCCAAGCTTACGCGTACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTCCCTATAGTGAGTCGTATTATAAGCTAGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACTGCTAGCTTGGGATCTTTGTGAAGGAACCTTACTTCTGTGGTGTGACATAATTGGACAAACTACCTACAGAGATTTAAAGCTCTAAGGTAAATATAAAATTTTTAAGTGTATAATGTGTTAAACTAGCTGCAAAACCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAACTAGTCGGACCGCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCA(SEQ ID NO:15)
β-球蛋白内含子序列
ACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGTGACTCTCTTAAGGTAGCCTTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAATGGATCCTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCTGAAGGAGCTTACAATCTAGCTGGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCCAGCTAGTGTAAGCTCCTTCAGGACACAAGGCCTGTTACTAGCACTCACATGGAACAAATGGCCCAGATCTGAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCA(SEQ ID NO:16)
MIR155支架中的MIR708序列
TGGATCCTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCTGAAGGAGCTTACAATCTAGCTGGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCCAGCTAGTGTAAGCTCCTTCAGGACACAAGGCCTGTTACTAGCACTCACATGGAACAAATGGCCCAGATCTG(SEQID NO:17)
天然支架中的MIR708序列
AAACCTAACCCCCATGGTTGGCGAGGGACTGCTGTGTGTGAAATGGTAACTGCCCTCAAGGAGCTTACAATCTAGCTGGGGGTAAATGACTTGCACATGAACACAACTAGACTGTGAGCTTCTAGAGGGCAGGGACCTTACCCTAGTCATCTCTCTTCTCACCCTGCACACCCTCCCTGAGGGATCTCAT(SEQ ID NO:18)
来自3’UTR的人视紫红质miR-708靶
CUCUGCCUGGAGACUAAGGCAAAUUGGGCCAUUAAAAGCUCAGCUCCUAUGUUGGUAUUAACGGUGGUGGGUUUUGUUG(SEQ ID NO:19)
突变的AAV ITR
CCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGA(SEQ ID NO:20)
野生型ITR序列
GGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT(SEQ ID NO:21)
视蛋白启动子
TGCTGATTCAGCCAGGAACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCACAAATAGTTATCGAGCCGCTGAGCCGGGGGGCGGGGGGTGTGAGACTGGAGGCGATGGACGGAGCTGACGGCACACACAGCTCAGATCTGTCAAGTGAGCCATTGTCAGGGCTTGGGGACTGGATAAGTCAGGGGGTCTCCTGGGAAGAGATGGGATAGGTGAGTTCAGGAGGAGACATTGTCAACTGGAGCCATGTGGAGAAGTGAATTTAGGGCCCAAAGGTTCCAGTCGCAGCCTGAGGCCACCAGACTGACATGGGGAGGAATTCCCAGAGGACTCTGGGGCAGACAAGATGAGACACCCTTTCCTTTCTTTACCTAAGGGCCTCCACCCGATGTCACCTTGGCCCCTCTGCAAGCCAATTAGGCCCCGGTGGCAGCAGTGGGATTAGCGTTAGTATGATATCTCGCGGA(SEQ ID NO:22)
MVM内含子
GGAGTCGCTGCGACGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCAAGAGGTAAGGGTTTAAGGGATGGTTGGTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTGTTTTACAGGCCTGAAATCACTTGGTTTTAGGTTGGGGATCCGGTACCCAATTGCCATGGGCTAGCATGCATGAGCTCCCTGCAGGGTTTTAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCACC(SEQ ID NO:23)
AAV5GRK1miR708_155hRho(AAV5载体，其具有视紫红质启动子驱动表达miR155支 架中的miR-708和去掉miR-708靶序列的人视紫红质)
TGACTAGTTAGGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGAGGAAGGGGCCGGGCAGAATGATCTAATCGGATTCCAAGCAGCTCAGGGGATTGTCTTTTTCTAGCACCTTCTTGCCACTCCTAAGCGTCCTCCGTGACCCCGGCTGGGATTTAGCCTGGTGCTGTGTCAGCCCCGGTCTCCCAGGGGCTTCCCAGTGGTCCCCAGGAACCCTCGACAGGGCCCGGTCTCTCTCGTCCAGCAAGGGCAGGGACGGGCCACAGGCCAAGGGCACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGTGACTCTCTTAAGGTAGCCTTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAATGGATCCTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCTGAAGGAGCTTACAATCTAGCTGGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCCAGCTAGTGTAAGCTCCTTCAGGACACAAGGCCTGTTACTAGCACTCACATGGAACAAATGGCCCAGATCTGAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCACACCGGCACAATGAATGGCACAGAAGGCCCTAACTTCTACGTGCCCTTCTCCAATGCGACGGGTGTGGTACGCAGCCCCTTCGAGTACCCACAGTACTACCTGGCTGAGCCATGGCAGTTCTCCATGCTGGCCGCCTACATGTTTCTGCTGATCGTGCTGGGCTTCCCCATCAACTTCCTCACGCTCTACGTCACCGTCCAGCACAAGAAGCTGCGCACGCCTCTCAACTACATCCTGCTCAACCTAGCCGTGGCTGACCTCTTCATGGTCCTAGGTGGCTTCACCAGCACCCTCTACACCTCTCTGCATGGATACTTCGTCTTCGGGCCCACAGGATGCAATTTGGAGGGCTTCTTTGCCACCCTGGGCGGTGAAATTGCCCTGTGGTCCTTGGTGGTCCTGGCCATCGAGCGGTACGTGGTGGTGTGTAAGCCCATGAGCAACTTCCGCTTCGGGGAGAACCATGCCATCATGGGCGTTGCCTTCACCTGGGTCATGGCGCTGGCCTGCGCCGCACCCCCACTCGCCGGCTGGTCCAGGTACATCCCCGAGGGCCTGCAGTGCTCGTGTGGAATCGACTACTACACGCTCAAGCCGGAGGTCAACAACGAGTCTTTTGTCATCTACATGTTCGTGGTCCACTTCACCATCCCCATGATTATCATCTTTTTCTGCTATGGGCAGCTCGTCTTCACCGTCAAGGAGGCCGCTGCCCAGCAGCAGGAGTCAGCCACCACACAGAAGGCAGAGAAGGAGGTCACCCGCATGGTCATCATCATGGTCATCGCTTTCCTGATCTGCTGGGTGCCCTACGCCAGCGTGGCATTCTACATCTTCACCCACCAGGGCTCCAACTTCGGTCCCATCTTCATGACCATCCCAGCGTTCTTTGCCAAGAGCGCCGCCATCTACAACCCTGTCATCTATATCATGATGAACAAGCAGTTCCGGAACTGCATGCTCACCACCATCTGCTGCGGCAAGAACCCACTGGGTGACGATGAGGCCTCTGCTACCGTGTCCAAGACGGAGACGAGCCAGGTGGCCCCGGCCTAACCAAGAAAGCTTAAGTTTAAACCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGC(SEQ ID NO:24)
AAV5GRK1miR708_708hRho(AAV5载体，其具有视紫红质启动子驱动表达miR-708支 架中的miR-708和去掉miR-708靶序列的人视紫红质)
GGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGAGGAAGGGGCCGGGCAGAATGATCTAATCGGATTCCAAGCAGCTCAGGGGATTGTCTTTTTCTAGCACCTTCTTGCCACTCCTAAGCGTCCTCCGTGACCCCGGCTGGGATTTAGCCTGGTGCTGTGTCAGCCCCGGTCTCCCAGGGGCTTCCCAGTGGTCCCCAGGAACCCTCGACAGGGCCCGGTCTCTCTCGTCCAGCAAGGGCAGGGACGGGCCACAGGCCAAGGGCACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGTGACTCTCTTAAGGTAGCCTTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAAAACCTAACCCCCATGGTTGGCGAGGGACTGCTGTGTGTGAAATGGTAACTGCCCTCAAGGAGCTTACAATCTAGCTGGGGGTAAATGACTTGCACATGAACACAACTAGACTGTGAGCTTCTAGAGGGCAGGGACCTTACCCTAGTCATCTCTCTTCTCACCCTGCACACCCTCCCTGAGGGATCTCATGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCACACCGGCACAATGAATGGCACAGAAGGCCCTAACTTCTACGTGCCCTTCTCCAATGCGACGGGTGTGGTACGCAGCCCCTTCGAGTACCCACAGTACTACCTGGCTGAGCCATGGCAGTTCTCCATGCTGGCCGCCTACATGTTTCTGCTGATCGTGCTGGGCTTCCCCATCAACTTCCTCACGCTCTACGTCACCGTCCAGCACAAGAAGCTGCGCACGCCTCTCAACTACATCCTGCTCAACCTAGCCGTGGCTGACCTCTTCATGGTCCTAGGTGGCTTCACCAGCACCCTCTACACCTCTCTGCATGGATACTTCGTCTTCGGGCCCACAGGATGCAATTTGGAGGGCTTCTTTGCCACCCTGGGCGGTGAAATTGCCCTGTGGTCCTTGGTGGTCCTGGCCATCGAGCGGTACGTGGTGGTGTGTAAGCCCATGAGCAACTTCCGCTTCGGGGAGAACCATGCCATCATGGGCGTTGCCTTCACCTGGGTCATGGCGCTGGCCTGCGCCGCACCCCCACTCGCCGGCTGGTCCAGGTACATCCCCGAGGGCCTGCAGTGCTCGTGTGGAATCGACTACTACACGCTCAAGCCGGAGGTCAACAACGAGTCTTTTGTCATCTACATGTTCGTGGTCCACTTCACCATCCCCATGATTATCATCTTTTTCTGCTATGGGCAGCTCGTCTTCACCGTCAAGGAGGCCGCTGCCCAGCAGCAGGAGTCAGCCACCACACAGAAGGCAGAGAAGGAGGTCACCCGCATGGTCATCATCATGGTCATCGCTTTCCTGATCTGCTGGGTGCCCTACGCCAGCGTGGCATTCTACATCTTCACCCACCAGGGCTCCAACTTCGGTCCCATCTTCATGACCATCCCAGCGTTCTTTGCCAAGAGCGCCGCCATCTACAACCCTGTCATCTATATCATGATGAACAAGCAGTTCCGGAACTGCATGCTCACCACCATCTGCTGCGGCAAGAACCCACTGGGTGACGATGAGGCCTCTGCTACCGTGTCCAAGACGGAGACGAGCCAGGTGGCCCCGGCCTAACCAAGAAAGCTTAAGTTTAAACCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGC(SEQ ID NO:25)
AAV5OPSmiR708_155hRho(AAV5载体，其具有视蛋白启动子驱动表达miR-155支架 中的miR-708和去掉miR-708靶序列的人视紫红质)
ACGCGTTTTCTGCAGCGGGGATTAATATGATTATGAACACCCCCAATCTCCCAGATGCTGATTCAGCCAGGAACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCACAAATAGTTATCGAGCCGCTGAGCCGGGGGGCGGGGGGTGTGAGACTGGAGGCGATGGACGGAGCTGACGGCACACACAGCTCAGATCTGTCAAGTGAGCCATTGTCAGGGCTTGGGGACTGGATAAGTCAGGGGGTCTCCTGGGAAGAGATGGGATAGGTGAGTTCAGGAGGAGACATTGTCAACTGGAGCCATGTGGAGAAGTGAATTTAGGGCCCAAAGGTTCCAGTCGCAGCCTGAGGCCACCAGACTGACATGGGGAGGAATTCCCAGAGGACTCTGGGGCAGACAAGATGAGACACCCTTTCCTTTCTTTACCTAAGGGCCTCCACCCGATGTCACCTTGGCCCCTCTGCAAGCCAATTAGGCCCCGGTGGCAGCAGTGGGATTAGCGTTAGTATGATATCTCGCGGATGCTGAATCAGCCTCTGGCTTAGGGAGAGAAGGTCACTTTATAAGGGTCTGGGGGGGGTCAGTGCCTGGAGTTGCGCTGTGGGAGCCGTCAGTGGCTGAGCTCAACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGTGACTCTCTTAAGGTAGCCTTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAATGGATCCTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCTGAAGGAGCTTACAATCTAGCTGGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCCAGCTAGTGTAAGCTCCTTCAGGACACAAGGCCTGTTACTAGCACTCACATGGAACAAATGGCCCAGATCTGAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCACACCGGCACAATGAATGGCACAGAAGGCCCTAACTTCTACGTGCCCTTCTCCAATGCGACGGGTGTGGTACGCAGCCCCTTCGAGTACCCACAGTACTACCTGGCTGAGCCATGGCAGTTCTCCATGCTGGCCGCCTACATGTTTCTGCTGATCGTGCTGGGCTTCCCCATCAACTTCCTCACGCTCTACGTCACCGTCCAGCACAAGAAGCTGCGCACGCCTCTCAACTACATCCTGCTCAACCTAGCCGTGGCTGACCTCTTCATGGTCCTAGGTGGCTTCACCAGCACCCTCTACACCTCTCTGCATGGATACTTCGTCTTCGGGCCCACAGGATGCAATTTGGAGGGCTTCTTTGCCACCCTGGGCGGTGAAATTGCCCTGTGGTCCTTGGTGGTCCTGGCCATCGAGCGGTACGTGGTGGTGTGTAAGCCCATGAGCAACTTCCGCTTCGGGGAGAACCATGCCATCATGGGCGTTGCCTTCACCTGGGTCATGGCGCTGGCCTGCGCCGCACCCCCACTCGCCGGCTGGTCCAGGTACATCCCCGAGGGCCTGCAGTGCTCGTGTGGAATCGACTACTACACGCTCAAGCCGGAGGTCAACAACGAGTCTTTTGTCATCTACATGTTCGTGGTCCACTTCACCATCCCCATGATTATCATCTTTTTCTGCTATGGGCAGCTCGTCTTCACCGTCAAGGAGGCCGCTGCCCAGCAGCAGGAGTCAGCCACCACACAGAAGGCAGAGAAGGAGGTCACCCGCATGGTCATCATCATGGTCATCGCTTTCCTGATCTGCTGGGTGCCCTACGCCAGCGTGGCATTCTACATCTTCACCCACCAGGGCTCCAACTTCGGTCCCATCTTCATGACCATCCCAGCGTTCTTTGCCAAGAGCGCCGCCATCTACAACCCTGTCATCTATATCATGATGAACAAGCAGTTCCGGAACTGCATGCTCACCACCATCTGCTGCGGCAAGAACCCACTGGGTGACGATGAGGCCTCTGCTACCGTGTCCAAGACGGAGACGAGCCAGGTGGCCCCGGCCTAACCAAGAAAGCTTAAGTTTAAACCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGC(SEQ ID NO:26)
AAV5OPSmiR708_708hRho(AAV5载体，其具有视蛋白启动子驱动表达miR-708支架 中的miR-708和去掉miR-708靶序列的人视紫红质)
ACGCGTTTTCTGCAGCGGGGATTAATATGATTATGAACACCCCCAATCTCCCAGATGCTGATTCAGCCAGGAACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCACAAATAGTTATCGAGCCGCTGAGCCGGGGGGCGGGGGGTGTGAGACTGGAGGCGATGGACGGAGCTGACGGCACACACAGCTCAGATCTGTCAAGTGAGCCATTGTCAGGGCTTGGGGACTGGATAAGTCAGGGGGTCTCCTGGGAAGAGATGGGATAGGTGAGTTCAGGAGGAGACATTGTCAACTGGAGCCATGTGGAGAAGTGAATTTAGGGCCCAAAGGTTCCAGTCGCAGCCTGAGGCCACCAGACTGACATGGGGAGGAATTCCCAGAGGACTCTGGGGCAGACAAGATGAGACACCCTTTCCTTTCTTTACCTAAGGGCCTCCACCCGATGTCACCTTGGCCCCTCTGCAAGCCAATTAGGCCCCGGTGGCAGCAGTGGGATTAGCGTTAGTATGATATCTCGCGGATGCTGAATCAGCCTCTGGCTTAGGGAGAGAAGGTCACTTTATAAGGGTCTGGGGGGGGTCAGTGCCTGGAGTTGCGCTGTGGGAGCCGTCAGTGGCTGAGCTCAACTAGAAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGTGCTTCTGACACAACAGTCTCGAACTTAAGCTGCAGTGACTCTCTTAAGGTAGCCTTGCAGAAGTTGGTCGTGAGGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAAAACCTAACCCCCATGGTTGGCGAGGGACTGCTGTGTGTGAAATGGTAACTGCCCTCAAGGAGCTTACAATCTAGCTGGGGGTAAATGACTTGCACATGAACACAACTAGACTGTGAGCTTCTAGAGGGCAGGGACCTTACCCTAGTCATCTCTCTTCTCACCCTGCACACCCTCCCTGAGGGATCTCATGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCACACCGGCACAATGAATGGCACAGAAGGCCCTAACTTCTACGTGCCCTTCTCCAATGCGACGGGTGTGGTACGCAGCCCCTTCGAGTACCCACAGTACTACCTGGCTGAGCCATGGCAGTTCTCCATGCTGGCCGCCTACATGTTTCTGCTGATCGTGCTGGGCTTCCCCATCAACTTCCTCACGCTCTACGTCACCGTCCAGCACAAGAAGCTGCGCACGCCTCTCAACTACATCCTGCTCAACCTAGCCGTGGCTGACCTCTTCATGGTCCTAGGTGGCTTCACCAGCACCCTCTACACCTCTCTGCATGGATACTTCGTCTTCGGGCCCACAGGATGCAATTTGGAGGGCTTCTTTGCCACCCTGGGCGGTGAAATTGCCCTGTGGTCCTTGGTGGTCCTGGCCATCGAGCGGTACGTGGTGGTGTGTAAGCCCATGAGCAACTTCCGCTTCGGGGAGAACCATGCCATCATGGGCGTTGCCTTCACCTGGGTCATGGCGCTGGCCTGCGCCGCACCCCCACTCGCCGGCTGGTCCAGGTACATCCCCGAGGGCCTGCAGTGCTCGTGTGGAATCGACTACTACACGCTCAAGCCGGAGGTCAACAACGAGTCTTTTGTCATCTACATGTTCGTGGTCCACTTCACCATCCCCATGATTATCATCTTTTTCTGCTATGGGCAGCTCGTCTTCACCGTCAAGGAGGCCGCTGCCCAGCAGCAGGAGTCAGCCACCACACAGAAGGCAGAGAAGGAGGTCACCCGCATGGTCATCATCATGGTCATCGCTTTCCTGATCTGCTGGGTGCCCTACGCCAGCGTGGCATTCTACATCTTCACCCACCAGGGCTCCAACTTCGGTCCCATCTTCATGACCATCCCAGCGTTCTTTGCCAAGAGCGCCGCCATCTACAACCCTGTCATCTATATCATGATGAACAAGCAGTTCCGGAACTGCATGCTCACCACCATCTGCTGCGGCAAGAACCCACTGGGTGACGATGAGGCCTCTGCTACCGTGTCCAAGACGGAGACGAGCCAGGTGGCCCCGGCCTAACCAAGAAAGCTTAAGTTTAAACCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGC(SEQ ID NO:27)
含视锥视杆同源框的转录因子
AGAGGACTAAGCCACAGGTGAGGAGAAAGGGGGGGGGGGGTCTGCTGACCCAGCAACACTCTTTCCTTCTGAGGCTTAAGAGCTATTAGCGTAGGTGACTCAGTCCCTAATCCTCCATTCAATGCCCTGTGACTGCCCCTGCTTC(SEQ IDNO:28)
CMV增强子
ACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCA(SEQ ID NO:29)
神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子
TTTCTGCAGCGGGGATTAATATGATTATGAACACCCCCAATCTCCCAGATGCTGATTCAGCCAGGA(SEQ ID NO:30)
序列表
<110> C·奥赖尔登(Catherine O'Riordan)
M·亚当莫维兹(Matthew Adamowicz)
<120> 用于色素性视网膜炎的基因疗法
<130> 159792010040
<140> 未分配
<141> 与此同时
<150> US 61/969,027
<151> 2014-03-21
<160> 30
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 88
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
aactgccctc aaggagctta caatctagct gggggtaaat gacttgcaca tgaacacaac 60
tagactgtga gcttctagag ggcaggga 88
<210> 2
<211> 348
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
Met Asn Gly Thr Glu Gly Pro Asn Phe Tyr Val Pro Phe Ser Asn Ala
1 5 10 15
Thr Gly Val Val Arg Ser Pro Phe Glu Tyr Pro Gln Tyr Tyr Leu Ala
20 25 30
Glu Pro Trp Gln Phe Ser Met Leu Ala Ala Tyr Met Phe Leu Leu Ile
35 40 45
Val Leu Gly Phe Pro Ile Asn Phe Leu Thr Leu Tyr Val Thr Val Gln
50 55 60
His Lys Lys Leu Arg Thr Pro Leu Asn Tyr Ile Leu Leu Asn Leu Ala
65 70 75 80
Val Ala Asp Leu Phe Met Val Leu Gly Gly Phe Thr Ser Thr Leu Tyr
85 90 95
Thr Ser Leu His Gly Tyr Phe Val Phe Gly Pro Thr Gly Cys Asn Leu
100 105 110
Glu Gly Phe Phe Ala Thr Leu Gly Gly Glu Ile Ala Leu Trp Ser Leu
115 120 125
Val Val Leu Ala Ile Glu Arg Tyr Val Val Val Cys Lys Pro Met Ser
130 135 140
Asn Phe Arg Phe Gly Glu Asn His Ala Ile Met Gly Val Ala Phe Thr
145 150 155 160
Trp Val Met Ala Leu Ala Cys Ala Ala Pro Pro Leu Ala Gly Trp Ser
165 170 175
Arg Tyr Ile Pro Glu Gly Leu Gln Cys Ser Cys Gly Ile Asp Tyr Tyr
180 185 190
Thr Leu Lys Pro Glu Val Asn Asn Glu Ser Phe Val Ile Tyr Met Phe
195 200 205
Val Val His Phe Thr Ile Pro Met Ile Ile Ile Phe Phe Cys Tyr Gly
210 215 220
Gln Leu Val Phe Thr Val Lys Glu Ala Ala Ala Gln Gln Gln Glu Ser
225 230 235 240
Ala Thr Thr Gln Lys Ala Glu Lys Glu Val Thr Arg Met Val Ile Ile
245 250 255
Met Val Ile Ala Phe Leu Ile Cys Trp Val Pro Tyr Ala Ser Val Ala
260 265 270
Phe Tyr Ile Phe Thr His Gln Gly Ser Asn Phe Gly Pro Ile Phe Met
275 280 285
Thr Ile Pro Ala Phe Phe Ala Lys Ser Ala Ala Ile Tyr Asn Pro Val
290 295 300
Ile Tyr Ile Met Met Asn Lys Gln Phe Arg Asn Cys Met Leu Thr Thr
305 310 315 320
Ile Cys Cys Gly Lys Asn Pro Leu Gly Asp Asp Glu Ala Ser Ala Thr
325 330 335
Val Ser Lys Thr Glu Thr Ser Gln Val Ala Pro Ala
340 345
<210> 3
<211> 1044
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 3
atgaatggca cagaaggccc taacttctac gtgcccttct ccaatgcgac gggtgtggta 60
cgcagcccct tcgagtaccc acagtactac ctggctgagc catggcagtt ctccatgctg 120
gccgcctaca tgtttctgct gatcgtgctg ggcttcccca tcaacttcct cacgctctac 180
gtcaccgtcc agcacaagaa gctgcgcacg cctctcaact acatcctgct caacctagcc 240
gtggctgacc tcttcatggt cctaggtggc ttcaccagca ccctctacac ctctctgcat 300
ggatacttcg tcttcgggcc cacaggatgc aatttggagg gcttctttgc caccctgggc 360
ggtgaaattg ccctgtggtc cttggtggtc ctggccatcg agcggtacgt ggtggtgtgt 420
aagcccatga gcaacttccg cttcggggag aaccatgcca tcatgggcgt tgccttcacc 480
tgggtcatgg cgctggcctg cgccgcaccc ccactcgccg gctggtccag gtacatcccc 540
gagggcctgc agtgctcgtg tggaatcgac tactacacgc tcaagccgga ggtcaacaac 600
gagtcttttg tcatctacat gttcgtggtc cacttcacca tccccatgat tatcatcttt 660
ttctgctatg ggcagctcgt cttcaccgtc aaggaggccg ctgcccagca gcaggagtca 720
gccaccacac agaaggcaga gaaggaggtc acccgcatgg tcatcatcat ggtcatcgct 780
ttcctgatct gctgggtgcc ctacgccagc gtggcattct acatcttcac ccaccagggc 840
tccaacttcg gtcccatctt catgaccatc ccagcgttct ttgccaagag cgccgccatc 900
tacaaccctg tcatctatat catgatgaac aagcagttcc ggaactgcat gctcaccacc 960
atctgctgcg gcaagaaccc actgggtgac gatgaggcct ctgctaccgt gtccaagacg 1020
gagacgagcc aggtggcccc ggcc 1044
<210> 4
<211> 2768
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 4
agagtcatcc agctggagcc ctgagtggct gagctcaggc cttcgcagca ttcttgggtg 60
ggagcagcca cgggtcagcc acaagggcca cagccatgaa tggcacagaa ggccctaact 120
tctacgtgcc cttctccaat gcgacgggtg tggtacgcag ccccttcgag tacccacagt 180
actacctggc tgagccatgg cagttctcca tgctggccgc ctacatgttt ctgctgatcg 240
tgctgggctt ccccatcaac ttcctcacgc tctacgtcac cgtccagcac aagaagctgc 300
gcacgcctct caactacatc ctgctcaacc tagccgtggc tgacctcttc atggtcctag 360
gtggcttcac cagcaccctc tacacctctc tgcatggata cttcgtcttc gggcccacag 420
gatgcaattt ggagggcttc tttgccaccc tgggcggtga aattgccctg tggtccttgg 480
tggtcctggc catcgagcgg tacgtggtgg tgtgtaagcc catgagcaac ttccgcttcg 540
gggagaacca tgccatcatg ggcgttgcct tcacctgggt catggcgctg gcctgcgccg 600
cacccccact cgccggctgg tccaggtaca tccccgaggg cctgcagtgc tcgtgtggaa 660
tcgactacta cacgctcaag ccggaggtca acaacgagtc ttttgtcatc tacatgttcg 720
tggtccactt caccatcccc atgattatca tctttttctg ctatgggcag ctcgtcttca 780
ccgtcaagga ggccgctgcc cagcagcagg agtcagccac cacacagaag gcagagaagg 840
aggtcacccg catggtcatc atcatggtca tcgctttcct gatctgctgg gtgccctacg 900
ccagcgtggc attctacatc ttcacccacc agggctccaa cttcggtccc atcttcatga 960
ccatcccagc gttctttgcc aagagcgccg ccatctacaa ccctgtcatc tatatcatga 1020
tgaacaagca gttccggaac tgcatgctca ccaccatctg ctgcggcaag aacccactgg 1080
gtgacgatga ggcctctgct accgtgtcca agacggagac gagccaggtg gccccggcct 1140
aagacctgcc taggactctg tggccgacta taggcgtctc ccatccccta caccttcccc 1200
cagccacagc catcccacca ggagcagcgc ctgtgcagaa tgaacgaagt cacataggct 1260
ccttaatttt tttttttttt ttaagaaata attaatgagg ctcctcactc acctgggaca 1320
gcctgagaag ggacatccac caagacctac tgatctggag tcccacgttc cccaaggcca 1380
gcgggatgtg tgcccctcct cctcccaact catctttcag gaacacgagg attcttgctt 1440
tctggaaaag tgtcccagct tagggataag tgtctagcac agaatggggc acacagtagg 1500
tgcttaataa atgctggatg gatgcaggaa ggaatggagg aatgaatggg aagggagaac 1560
atatctatcc tctcagaccc tcgcagcagc agcaactcat acttggctaa tgatatggag 1620
cagttgtttt tccctccctg ggcctcactt tcttctccta taaaatggaa atcccagatc 1680
cctggtcctg ccgacacgca gctactgaga agaccaaaag aggtgtgtgt gtgtctatgt 1740
gtgtgtttca gcactttgta aatagcaaga agctgtacag attctagtta atgttgtgaa 1800
taacatcaat taatgtaact agttaattac tatgattatc acctcctgat agtgaacatt 1860
ttgagattgg gcattcagat gatggggttt cacccaacct tggggcaggt ttttaaaaat 1920
tagctaggca tcaaggccag accagggctg ggggttgggc tgtaggcagg gacagtcaca 1980
ggaatgcaga atgcagtcat cagacctgaa aaaacaacac tgggggaggg ggacggtgaa 2040
ggccaagttc ccaatgaggg tgagattggg cctggggtct cacccctagt gtggggcccc 2100
aggtcccgtg cctccccttc ccaatgtggc ctatggagag acaggccttt ctctcagcct 2160
ctggaagcca cctgctcttt tgctctagca cctgggtccc agcatctaga gcatggagcc 2220
tctagaagcc atgctcaccc gcccacattt aattaacagc tgagtccctg atgtcatcct 2280
tatctcgaag agcttagaaa caaagagtgg gaaattccac tgggcctacc ttccttgggg 2340
atgttcatgg gccccagttt ccagtttccc ttgccagaca agcccatctt cagcagttgc 2400
tagtccattc tccattctgg agaatctgct ccaaaaagct ggccacatct ctgaggtgtc 2460
agaattaagc tgcctcagta actgctcccc cttctccata taagcaaagc cagaagctct 2520
agctttaccc agctctgcct ggagactaag gcaaattggg ccattaaaag ctcagctcct 2580
atgttggtat taacggtggt gggttttgtt gctttcacac tctatccaca ggatagattg 2640
aaactgccag cttccacctg atccctgacc ctgggatggc tggattgagc aatgagcaga 2700
gccaagcagc acagagtccc ctggggctag aggtggagga ggcagtcctg ggaatgggaa 2760
aaacccca 2768
<210> 5
<211> 1512
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 5
ggccccagaa gcctggtggt tgtttgtcct tctcagggga aaagtgaggc ggccccttgg 60
aggaaggggc cgggcagaat gatctaatcg gattccaagc agctcagggg attgtctttt 120
tctagcacct tcttgccact cctaagcgtc ctccgtgacc ccggctggga tttagcctgg 180
tgctgtgtca gccccggtct cccaggggct tcccagtggt ccccaggaac cctcgacagg 240
gcccggtctc tctcgtccag caagggcagg gacgggccac aggccaaggg cggagtcgct 300
gcgacgctgc cttcgccccg tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct 360
ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag cgggcgggac ggcccttctc ctccgggctg 420
taattagcgc ttggtttaat gacggcttgt ttcttttctg tggctgcgtg aaagccttga 480
ggggctccgg gagggccctt tgtgcggggg gagcggctcg gggggtgcgt gcgtgtgtgt 540
gtgcgtgggg agcgccgcgt gcggctccgc gctgcccggc ggctgtgagc gctgcgggcg 600
cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcagtgt gcgcgagggg agcgcggccg ggggcggtgc 660
cccgcggtgc ggggggggct gcgaggggaa caaaggctgc gtgcggggtg tgtgcgtggg 720
ggggtgagca gggggtgtgg gcgcgtcggt cgggctgcaa ccccccctgc acccccctcc 780
ccgagttgct gagcacggcc cggcttcggg tgcggggctc cgtacggggc gtggcgcggg 840
gctcgccgtg ccgggcgggg ggtggcggca ggtgggggtg ccgggcgggg cggggccgcc 900
tcgggccggg gagggctcgg gggaggggcg cggcggcccc cggagcgccg gcggctgtcg 960
aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt atggtaatcg tgcgagaggg cgcagggact 1020
tcctttgtcc caaatctgtg cggagccgaa atctgggagg cgccgccgca ccccctctag 1080
cgggcgcggg gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg 1140
tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctccc tctccagcct cggggctgtc cgcgggggga 1200
cggctgcctt cgggggggac ggggcagggc ggggttcggc ttctggcgtg tgaccggcgg 1260
ctctagagcc tctgctaacc atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc tcctgggcaa 1320
cgtgctggtt attgtgctgt ctcatcattt tggcaaagaa ttcttcgaaa gatcctggag 1380
gcttgctgaa ggctgtatgc tgaaggagct tacaatctag ctggggtttt ggccactgac 1440
tgaccccagc tagtgtaagc tccttcagga cacaaggcct gttactagca ctcacatgga 1500
acaaatggcc ca 1512
<210> 6
<211> 3444
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 6
caatctccca gatgctgatt cagccaggaa ctagttatta atagtaatca attacggggt 60
cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc 120
ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag 180
taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc 240
acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg 300
gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc 360
agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccacaaatag ttatcgagcc gctgagccgg 420
ggggcggggg gtgtgagact ggaggcgatg gacggagctg acggcacaca cagctcagat 480
ctgtcaagtg agccattgtc agggcttggg gactggataa gtcagggggt ctcctgggaa 540
gagatgggat aggtgagttc aggaggagac attgtcaact ggagccatgt ggagaagtga 600
atttagggcc caaaggttcc agtcgcagcc tgaggccacc agactgacat ggggaggaat 660
tcccagagga ctctggggca gacaagatga gacacccttt cctttcttta cctaagggcc 720
tccacccgat gtcaccttgg cccctctgca agccaattag gccccggtgg cagcagtggg 780
attagcgtta gtatgatatc tcgcggatgc tgaatcagcc tctggcttag ggagagaagg 840
tcactttata agggtctggg gggggtcagt gcctggagtt gcgctgtggg agccgtcagt 900
ggctgagctc aagaggtaag ggtttaaggg atggttggtt ggtggggtat taatgtttaa 960
ttacctgttt tacaggcctg aaatcacttg gttttaggtt ggtacatctg cagaattcag 1020
ccaccaccgg cacaatgaat ggcacagaag gccctaactt ctacgtgccc ttctccaatg 1080
cgacgggtgt ggtacgcagc cccttcgagt acccacagta ctacctggct gagccatggc 1140
agttctccat gctggccgcc tacatgtttc tgctgatcgt gctgggcttc cccatcaact 1200
tcctcacgct ctacgtcacc gtccagcaca agaagctgcg cacgcctctc aactacatcc 1260
tgctcaacct agccgtggct gacctcttca tggtcctagg tggcttcacc agcaccctct 1320
acacctctct gcatggatac ttcgtcttcg ggcccacagg atgcaatttg gagggcttct 1380
ttgccaccct gggcggtgaa attgccctgt ggtccttggt ggtcctggcc atcgagcggt 1440
acgtggtggt gtgtaagccc atgagcaact tccgcttcgg ggagaaccat gccatcatgg 1500
gcgttgcctt cacctgggtc atggcgctgg cctgcgccgc acccccactc gccggctggt 1560
ccaggtacat ccccgagggc ctgcagtgct cgtgtggaat cgactactac acgctcaagc 1620
cggaggtcaa caacgagtct tttgtcatct acatgttcgt ggtccacttc accatcccca 1680
tgattatcat ctttttctgc tatgggcagc tcgtcttcac cgtcaaggag gccgctgccc 1740
agcagcagga gtcagccacc acacagaagg cagagaagga ggtcacccgc atggtcatca 1800
tcatggtcat cgctttcctg atctgctggg tgccctacgc cagcgtggca ttctacatct 1860
tcacccacca gggctccaac ttcggtccca tcttcatgac catcccagcg ttctttgcca 1920
agagcgccgc catctacaac cctgtcatct atatcatgat gaacaagcag ttccggaact 1980
gcatgctcac caccatctgc tgcggcaaga acccactggg tgacgatgag gcctctgcta 2040
ccgtgtccaa gacggagacg agccaggtgg ccccggccta accaagaaag cttaagtttg 2100
tgtcccggct tagggctaaa tgtctaggac agaatggaac acatagtagc tgattaataa 2160
atgctagctg gatgaaggga ggaatgagtg actgactgag tggatatatg agtgaaggga 2220
ttaatggaag ggaacatgga tgtcctcagg tgcccaacct ggcagatcca gtcatgtctg 2280
gctggaatct ataagcagtt ttacatacct gccctgagct ttattgcggt agtttatcac 2340
agttaaattg ctaacgcagt cagtgcttct gacacaacag tctcgaactt aagctgcagt 2400
gactctctta aggtagcctt gcagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa 2460
ggttacaaga caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaaaaac 2520
ctaaccccca tggttggcga gggactgctg tgtgtgaaat ggtaactgcc ctcaaggagc 2580
ttacaatcta gctgggggta aatgacttgc acatgaacac aactagactg tgagcttcta 2640
gagggcaggg accttaccct agtcatctct cttctcaccc tgcacaccct ccctgaggga 2700
tctcatgact cttgcgtttc tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct 2760
ttctctccac aggtgtccac tcccagttca caccggcaca atgaatggca cagaaggccc 2820
taacttctac gtgcccttct ccaatgcgac gggtgtggta cgcagcccct tcgagtaccc 2880
acagtcagag ataaatgaca gtgacagcaa cgtgagctgc agcccttagg actgagaaag 2940
catcgagacc aggggtctcc ggcaaggcct aggtcctccc ttcagtatgg aaaccttgcc 3000
tcatgtctct cagcctcctt ggcctgtgga gatccagccc ttcctcttgg cttctggata 3060
catttgctct tctacaccag caaccaagtg gcaacagttc caggccagta tggagtttta 3120
gaagccatgc caatatgccc accttcaggg agcagctgag tccttgatgc cacccttgtt 3180
ctgaagagtt cagaaacaca gtgcaagaca tgaccaggcc tcatccttag gatgctcatg 3240
gatccagttc ttagctccct tgttggatat gctgttttcc ttggcctttg gtcttttctt 3300
tatcccagag ggttttggct ttaaggccaa caggaactat ggggtaccag aattgagcag 3360
cctcagtctg catccctcct ctatagaacc acagctgggc cctcagcagg cccaactctg 3420
catggggaca gaggcattaa aagc 3444
<210> 7
<211> 3014
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 7
gggccccaga agcctggtgg ttgtttgtcc ttctcagggg aaaagtgagg cggccccttg 60
gaggaagggg ccgggcagaa tgatctaatc ggattccaag cagctcaggg gattgtcttt 120
ttctagcacc ttcttgccac tcctaagcgt cctccgtgac cccggctggg atttagcctg 180
gtgctgtgtc agccccggtc tcccaggggc ttcccagtgg tccccaggaa ccctcgacag 240
ggcccggtct ctctcgtcca gcaagggcag ggacgggcca caggccaagg gcggagtcgc 300
tgcgacgctg ccttcgcccc gtgccccgct ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc 360
tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga gcgggcggga cggcccttct cctccgggct 420
gtaattagca agaggtaagg gtttaaggga tggttggttg gtggggtatt aatgtttaat 480
tacctgtttt acaggcctga aatcacttgg ttttaggttg gggatccggt acccaattgc 540
catgggctag catgcatgag ctccctgcag ggtttatctg cagaattcag ccaccaccgg 600
cacaatgaat ggcacagaag gccctaactt ctacgtgccc ttctccaatg cgacgggtgt 660
ggtacgcagc cccttcgagt acccacagta ctacctggct gagccatggc agttctccat 720
gctggccgcc tacatgtttc tgctgatcgt gctgggcttc cccatcaact tcctcacgct 780
ctacgtcacc gtccagcaca agaagctgcg cacgcctctc aactacatcc tgctcaacct 840
agccgtggct gacctcttca tggtcctagg tggcttcacc agcaccctct acacctctct 900
gcatggatac ttcgtcttcg ggcccacagg atgcaatttg gagggcttct ttgccaccct 960
gggcggtgaa attgccctgt ggtccttggt ggtcctggcc atcgagcggt acgtggtggt 1020
gtgtaagccc atgagcaact tccgcttcgg ggagaaccat gccatcatgg gcgttgcctt 1080
cacctgggtc atggcgctgg cctgcgccgc acccccactc gccggctggt ccaggtacat 1140
ccccgagggc ctgcagtgct cgtgtggaat cgactactac acgctcaagc cggaggtcaa 1200
caacgagtct tttgtcatct acatgttcgt ggtccacttc accatcccca tgattatcat 1260
ctttttctgc tatgggcagc tcgtcttcac cgtcaaggag gccgctgccc agcagcagga 1320
gtcagccacc acacagaagg cagagaagga ggtcacccgc atggtcatca tcatggtcat 1380
cgctttcctg atctgctggg tgccctacgc cagcgtggca ttctacatct tcacccacca 1440
gggctccaac ttcggtccca tcttcatgac catcccagcg ttctttgcca agagcgccgc 1500
catctacaac cctgtcatct atatcatgat gaacaagcag ttccggaact gcatgctcac 1560
caccatctgc tgcggcaaga acccactggg tgacgatgag gcctctgcta ccgtgtccaa 1620
gacggagacg agccaggtgg ccccggccta accaagaaag cttaagtttg tgtcccggct 1680
tagggctaaa tgtctaggac agaatggaac acatagtagc tgattaataa atgctagctg 1740
gatgaaggga ggaatgagtg actgactgag tggatatatg agtgaaggga ttaatggaag 1800
ggaacatgga tgtcctcagg tgcccaacct ggcagatcca gtcatgtctg gctggaatct 1860
ataagcagtt ttacatacct gccctgagct ttattgcggt agtttatcac agttaaattg 1920
ctaacgcagt cagtgcttct gacacaacag tctcgaactt aagctgcagt gactctctta 1980
aggtagcctt gcagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa ggttacaaga 2040
caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaaaaac ctaaccccca 2100
tggttggcga gggactgctg tgtgtgaaat ggtaactgcc ctcaaggagc ttacaatcta 2160
gctgggggta aatgacttgc acatgaacac aactagactg tgagcttcta gagggcaggg 2220
accttaccct agtcatctct cttctcaccc tgcacaccct ccctgaggga tctcatgact 2280
cttgcgtttc tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac 2340
aggtgtccac tcccagttca caccggcaca atgaatggca cagaaggccc taacttctac 2400
gtgcccttct ccaatgcgac gggtgtggta cgcagcccct tcgagtaccc acagtcagag 2460
ataaatgaca gtgacagcaa cgtgagctgc agcccttagg actgagaaag catcgagacc 2520
aggggtctcc ggcaaggcct aggtcctccc ttcagtatgg aaaccttgcc tcatgtctct 2580
cagcctcctt ggcctgtgga gatccagccc ttcctcttgg cttctggata catttgctct 2640
tctacaccag caaccaagtg gcaacagttc caggccagta tggagtttta gaagccatgc 2700
caatatgccc accttcaggg agcagctgag tccttgatgc cacccttgtt ctgaagagtt 2760
cagaaacaca gtgcaagaca tgaccaggcc tcatccttag gatgctcatg gatccagttc 2820
ttagctccct tgttggatat gctgttttcc ttggcctttg gtcttttctt tatcccagag 2880
ggttttggct ttaaggccaa caggaactat ggggtaccag aattgagcag cctcagtctg 2940
catccctcct ctatagaacc acagctgggc cctcagcagg cccaactctg catggggaca 3000
gaggcattaa aagc 3014
<210> 8
<211> 1826
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 8
gggccccaga agcctggtgg ttgtttgtcc ttctcagggg aaaagtgagg cggccccttg 60
gaggaagggg ccgggcagaa tgatctaatc ggattccaag cagctcaggg gattgtcttt 120
ttctagcacc ttcttgccac tcctaagcgt cctccgtgac cccggctggg atttagcctg 180
gtgctgtgtc agccccggtc tcccaggggc ttcccagtgg tccccaggaa ccctcgacag 240
ggcccggtct ctctcgtcca gcaagggcag ggacgggcca caggccaagg gcactagaag 300
ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat tgctaacgca gtcagtgctt ctgacacaac 360
agtctcgaac ttaagctgca gtgactctct taaggtagcc ttgcagaagt tggtcgtgag 420
gcactgggca ggtaagtatc aaggttacaa gacaggttta aggagaccaa tagaaactgg 480
gcttgtcgag acagagaaaa acctaacccc catggttggc gagggactgc tgtgtgtgaa 540
atggtaactg ccctcaagga gcttacaatc tagctggggg taaatgactt gcacatgaac 600
acaactagac tgtgagcttc tagagggcag ggaccttacc ctagtcatct ctcttctcac 660
cctgcacacc ctccctgagg gatctcatga ctcttgcgtt tctgataggc acctattggt 720
cttactgaca tccactttgc ctttctctcc acaggtgtcc actcccagtt cacaccggca 780
caatgaatgg cacagaaggc cctaacttct acgtgccctt ctccaatgcg acgggtgtgg 840
tacgcagccc cttcgagtac ccacagtact acctggctga gccatggcag ttctccatgc 900
tggccgccta catgtttctg ctgatcgtgc tgggcttccc catcaacttc ctcacgctct 960
acgtcaccgt ccagcacaag aagctgcgca cgcctctcaa ctacatcctg ctcaacctag 1020
ccgtggctga cctcttcatg gtcctaggtg gcttcaccag caccctctac acctctctgc 1080
atggatactt cgtcttcggg cccacaggat gcaatttgga gggcttcttt gccaccctgg 1140
gcggtgaaat tgccctgtgg tccttggtgg tcctggccat cgagcggtac gtggtggtgt 1200
gtaagcccat gagcaacttc cgcttcgggg agaaccatgc catcatgggc gttgccttca 1260
cctgggtcat ggcgctggcc tgcgccgcac ccccactcgc cggctggtcc aggtacatcc 1320
ccgagggcct gcagtgctcg tgtggaatcg actactacac gctcaagccg gaggtcaaca 1380
acgagtcttt tgtcatctac atgttcgtgg tccacttcac catccccatg attatcatct 1440
ttttctgcta tgggcagctc gtcttcaccg tcaaggaggc cgctgcccag cagcaggagt 1500
cagccaccac acagaaggca gagaaggagg tcacccgcat ggtcatcatc atggtcatcg 1560
ctttcctgat ctgctgggtg ccctacgcca gcgtggcatt ctacatcttc acccaccagg 1620
gctccaactt cggtcccatc ttcatgacca tcccagcgtt ctttgccaag agcgccgcca 1680
tctacaaccc tgtcatctat atcatgatga acaagcagtt ccggaactgc atgctcacca 1740
ccatctgctg cggcaagaac ccactgggtg acgatgaggc ctctgctacc gtgtccaaga 1800
cggagacgag ccaggtggcc ccggcc 1826
<210> 9
<211> 3444
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 9
caatctccca gatgctgatt cagccaggaa ctagttatta atagtaatca attacggggt 60
cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc 120
ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag 180
taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc 240
acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg 300
gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc 360
agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccacaaatag ttatcgagcc gctgagccgg 420
ggggcggggg gtgtgagact ggaggcgatg gacggagctg acggcacaca cagctcagat 480
ctgtcaagtg agccattgtc agggcttggg gactggataa gtcagggggt ctcctgggaa 540
gagatgggat aggtgagttc aggaggagac attgtcaact ggagccatgt ggagaagtga 600
atttagggcc caaaggttcc agtcgcagcc tgaggccacc agactgacat ggggaggaat 660
tcccagagga ctctggggca gacaagatga gacacccttt cctttcttta cctaagggcc 720
tccacccgat gtcaccttgg cccctctgca agccaattag gccccggtgg cagcagtggg 780
attagcgtta gtatgatatc tcgcggatgc tgaatcagcc tctggcttag ggagagaagg 840
tcactttata agggtctggg gggggtcagt gcctggagtt gcgctgtggg agccgtcagt 900
ggctgagctc aagaggtaag ggtttaaggg atggttggtt ggtggggtat taatgtttaa 960
ttacctgttt tacaggcctg aaatcacttg gttttaggtt ggtacatctg cagaattcag 1020
ccaccaccgg cacaatgaat ggcacagaag gccctaactt ctacgtgccc ttctccaatg 1080
cgacgggtgt ggtacgcagc cccttcgagt acccacagta ctacctggct gagccatggc 1140
agttctccat gctggccgcc tacatgtttc tgctgatcgt gctgggcttc cccatcaact 1200
tcctcacgct ctacgtcacc gtccagcaca agaagctgcg cacgcctctc aactacatcc 1260
tgctcaacct agccgtggct gacctcttca tggtcctagg tggcttcacc agcaccctct 1320
acacctctct gcatggatac ttcgtcttcg ggcccacagg atgcaatttg gagggcttct 1380
ttgccaccct gggcggtgaa attgccctgt ggtccttggt ggtcctggcc atcgagcggt 1440
acgtggtggt gtgtaagccc atgagcaact tccgcttcgg ggagaaccat gccatcatgg 1500
gcgttgcctt cacctgggtc atggcgctgg cctgcgccgc acccccactc gccggctggt 1560
ccaggtacat ccccgagggc ctgcagtgct cgtgtggaat cgactactac acgctcaagc 1620
cggaggtcaa caacgagtct tttgtcatct acatgttcgt ggtccacttc accatcccca 1680
tgattatcat ctttttctgc tatgggcagc tcgtcttcac cgtcaaggag gccgctgccc 1740
agcagcagga gtcagccacc acacagaagg cagagaagga ggtcacccgc atggtcatca 1800
tcatggtcat cgctttcctg atctgctggg tgccctacgc cagcgtggca ttctacatct 1860
tcacccacca gggctccaac ttcggtccca tcttcatgac catcccagcg ttctttgcca 1920
agagcgccgc catctacaac cctgtcatct atatcatgat gaacaagcag ttccggaact 1980
gcatgctcac caccatctgc tgcggcaaga acccactggg tgacgatgag gcctctgcta 2040
ccgtgtccaa gacggagacg agccaggtgg ccccggccta accaagaaag cttaagtttg 2100
tgtcccggct tagggctaaa tgtctaggac agaatggaac acatagtagc tgattaataa 2160
atgctagctg gatgaaggga ggaatgagtg actgactgag tggatatatg agtgaaggga 2220
ttaatggaag ggaacatgga tgtcctcagg tgcccaacct ggcagatcca gtcatgtctg 2280
gctggaatct ataagcagtt ttacatacct gccctgagct ttattgcggt agtttatcac 2340
agttaaattg ctaacgcagt cagtgcttct gacacaacag tctcgaactt aagctgcagt 2400
gactctctta aggtagcctt gcagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa 2460
ggttacaaga caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaaaaac 2520
ctaaccccca tggttggcga gggactgctg tgtgtgaaat ggtaactgcc ctcaaggagc 2580
ttacaatcta gctgggggta aatgacttgc acatgaacac aactagactg tgagcttcta 2640
gagggcaggg accttaccct agtcatctct cttctcaccc tgcacaccct ccctgaggga 2700
tctcatgact cttgcgtttc tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct 2760
ttctctccac aggtgtccac tcccagttca caccggcaca atgaatggca cagaaggccc 2820
taacttctac gtgcccttct ccaatgcgac gggtgtggta cgcagcccct tcgagtaccc 2880
acagtcagag ataaatgaca gtgacagcaa cgtgagctgc agcccttagg actgagaaag 2940
catcgagacc aggggtctcc ggcaaggcct aggtcctccc ttcagtatgg aaaccttgcc 3000
tcatgtctct cagcctcctt ggcctgtgga gatccagccc ttcctcttgg cttctggata 3060
catttgctct tctacaccag caaccaagtg gcaacagttc caggccagta tggagtttta 3120
gaagccatgc caatatgccc accttcaggg agcagctgag tccttgatgc cacccttgtt 3180
ctgaagagtt cagaaacaca gtgcaagaca tgaccaggcc tcatccttag gatgctcatg 3240
gatccagttc ttagctccct tgttggatat gctgttttcc ttggcctttg gtcttttctt 3300
tatcccagag ggttttggct ttaaggccaa caggaactat ggggtaccag aattgagcag 3360
cctcagtctg catccctcct ctatagaacc acagctgggc cctcagcagg cccaactctg 3420
catggggaca gaggcattaa aagc 3444
<210> 10
<211> 1017
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 10
ggagtcgctg cgacgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct cgcgccgccc 60
gccccggctc tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc 120
tccgggctgt aattagcgct tggtttaatg acggcttgtt tcttttctgt ggctgcgtga 180
aagccttgag gggctccggg agggcccttt gtgcgggggg agcggctcgg ggggtgcgtg 240
cgtgtgtgtg tgcgtgggga gcgccgcgtg cggctccgcg ctgcccggcg gctgtgagcg 300
ctgcgggcgc ggcgcggggc tttgtgcgct ccgcagtgtg cgcgagggga gcgcggccgg 360
gggcggtgcc ccgcggtgcg gggggggctg cgaggggaac aaaggctgcg tgcggggtgt 420
gtgcgtgggg gggtgagcag ggggtgtggg cgcgtcggtc gggctgcaac cccccctgca 480
cccccctccc cgagttgctg agcacggccc ggcttcgggt gcggggctcc gtacggggcg 540
tggcgcgggg ctcgccgtgc cgggcggggg gtggcggcag gtgggggtgc cgggcggggc 600
ggggccgcct cgggccgggg agggctcggg ggaggggcgc ggcggccccc ggagcgccgg 660
cggctgtcga ggcgcggcga gccgcagcca ttgcctttta tggtaatcgt gcgagagggc 720
gcagggactt cctttgtccc aaatctgtgc ggagccgaaa tctgggaggc gccgccgcac 780
cccctctagc gggcgcgggg cgaagcggtg cggcgccggc aggaaggaaa tgggcgggga 840
gggccttcgt gcgtcgccgc gccgccgtcc ccttctccct ctccagcctc ggggctgtcc 900
gcggggggac ggctgccttc gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt 960
gaccggcggc tctagagcct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctaca 1017
<210> 11
<211> 2239
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 11
aagcttgaaa tgccacctcc tctgatattc taggtgtcct ggaagcctgt ctcatcttgc 60
cctgtagtgt tgggtcacct ggcccccagc ctgtaacatc cccagggccc tacacccaga 120
gaaacacggg gctggtggca gtgcccagtg acaaccgttt agtggataag agaagagtga 180
ccacaccagg ctgagtgctc ctctctggtt ttccatgggg agacaatgcc accctgagca 240
gggtctggtg tgagcggcag ctggctctgg gctctctgat ccgttaccct ctcagcctct 300
ttgttctttc tcaacccctg gagcagagac ctcaggaggt gctggcatgg aacagagaaa 360
ttccagcctc gattcctatt atgaacccga caccttttgt attttcatct tggttttaca 420
gtgtacaaaa cgaactagat cagcagggca tgggcataat cacgaatgca cacacataca 480
ctaatgtgtg gctcatgttt aagtatcact tactacagga cacccaatct aacagcaccg 540
ataaagtgac agagaaacgc aagccttctg cgaacatggc ctggctgttc caattccgaa 600
ccttgctttt ctgggccttg ccacacaggc tcttcccccg tccccccagg gacattctac 660
ccttgaactc cacactccac tgctgccttt gccaggaagc ccatctgttc ctttttggtt 720
ctgccagaac gtgtggtggt gctgctgtcc ctgccttggg cactggatat tgggaaggga 780
cagtgtccac actggagtgg gaagttccca gggacgagac ctttacctcc tcaccctggg 840
tactgttctc ctcatggagc atggacggcg ctgcctgaac tcagtggtgg cctcattctg 900
gaagccaagt ttatacagag tagcagtgac ccagggatgt ggggttcacc ctcctcagcc 960
ctctggccag tcctgatggg cctcagtccc aacatggcta agaggtgtgg gcagcttctt 1020
ggtcaccctc aggttgggga atcaccttct gtcttcattt tccaggaact tggtgatgat 1080
atcgtgggtg agttcattta ccaggtgctg tagtttcccc tcatcaggca ggaagaagat 1140
ggcggtggca ttgcccaggt atttcatcag cagcacccag ctggacagct tcttacagtg 1200
ctggatgtta aacatgccta aacgcttcat cataggcacc ttcacggtgg tcacctggtc 1260
cacgtggaag tcctcttcct cggtgtcctt gacttcaaag ggtctctccc atttgcctgg 1320
agagagggga aggtgggcat caccaggggt gagtgaaggt ttggaagagt gtagcagaat 1380
aagaaaccat gagtcccctc cctgagaagc cctgagcccc cttgacgaca cacatccctc 1440
gaggctcagc ttcatcatct gtaaaaggtg ctgaaactga ccatccaagc tgccgaaaaa 1500
gattgtgtgg ggataattca aaactagagg aagatgcaga atttctacat cgtggcgatg 1560
tcaggctaag agatgccatc gtggctgtgc atttttattg gaatcatatg tttatttgag 1620
ggtgtcttgg atattacaaa taaaatgttg gagcatcagg catatttggt accttctgtc 1680
taaggctccc tgccccttgt taattggcag ctcagttatt catccagggc aaacattctg 1740
cttactattc ctgagagctt tcctcatcct ctagattggc aggggaaatg cagatgcctg 1800
agcagcctcc cctctgccat accaacagag cttcaccatc gaggcatgca gagtggacag 1860
gggcctcagg gacccctgat cccagctttc tcattggaca gaaggaggag actggggctg 1920
gagagggacc tgggccccca ctaaggccac agcagagcca ggactttagc tgtgctgact 1980
gcagcctggc ttgcctccac tgccctcctt tgcctcaaga gcaagggagc ctcagagtgg 2040
aggaagcagc ccctggcctt gcctcccacc tcccctcccc tatgctgttt tcctgggaca 2100
gtgggagctg gcttagaatg ccctggggcc cccaggaccc tggcatttta acccctcagg 2160
ggcaggaagg cagcctgaga tacagaagag tccatcacct gctgtatgcc acacaccatc 2220
cccacagtta cgtactagt 2239
<210> 12
<211> 6408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 12
gaattcggac cgtcgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc 60
attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc 120
tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt 180
aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca 240
cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg 300
taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca 360
gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtcgag gtgagcccca cgttctgctt 420
cactctcccc atctcccccc cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt 480
attttgtgca gcgatggggg cggggggggg gggggggcgc gcgccaggcg gggcggggcg 540
gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc agagcggcgc 600
gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata aaaagcgaag 660
cgcgcggcgg gcggggagtc gctgcgacgc tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgccgcc 720
gcctcgcgcc gcccgccccg gctctgactg accgcgttac tcccacaggt gagcgggcgg 780
gacggccctt ctcctccggg ctgtaattag cgcttggttt aatgacggct tgtttctttt 840
ctgtggctgc gtgaaagcct tgaggggctc cgggagggcc ctttgtgcgg ggggagcggc 900
tcggggggtg cgtgcgtgtg tgtgtgcgtg gggagcgccg cgtgcggctc cgcgctgccc 960
ggcggctgtg agcgctgcgg gcgcggcgcg gggctttgtg cgctccgcag tgtgcgcgag 1020
gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg tgcggggggg gctgcgaggg gaacaaaggc 1080
tgcgtgcggg gtgtgtgcgt gggggggtga gcagggggtg tgggcgcgtc ggtcgggctg 1140
caaccccccc tgcacccccc tccccgagtt gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg 1200
ctccgtacgg ggcgtggcgc ggggctcgcc gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg 1260
gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc 1320
ccccggagcg ccggcggctg tcgaggcgcg gcgagccgca gccattgcct tttatggtaa 1380
tcgtgcgaga gggcgcaggg acttcctttg tcccaaatct gtgcggagcc gaaatctggg 1440
aggcgccgcc gcaccccctc tagcgggcgc ggggcgaagc ggtgcggcgc cggcaggaag 1500
gaaatgggcg gggagggcct tcgtgcgtcg ccgcgccgcc gtccccttct ccctctccag 1560
cctcggggct gtccgcgggg ggacggctgc cttcgggggg gacggggcag ggcggggttc 1620
ggcttctggc gtgtgaccgg cggctctaga gcctctgcta accatgttca tgccttcttc 1680
tttttcctac agctcctggg caacgtgctg gttattgtgc tgtctcatca ttttggcaaa 1740
gaattcttcg aaagatctgc tagcttaatt aacccaaacg ggccctctag actcgagcgg 1800
ccgccactgt gctggatatc tgcagaattc agccaccacc ggcacaatga atggcacaga 1860
aggccctaac ttctacgtgc ccttctccaa tgcgacgggt gtggtacgca gccccttcga 1920
gtacccacag tactacctgg ctgagccatg gcagttctcc atgctggccg cctacatgtt 1980
tctgctgatc gtgctgggct tccccatcaa cttcctcacg ctctacgtca ccgtccagca 2040
caagaagctg cgcacgcctc tcaactacat cctgctcaac ctagccgtgg ctgacctctt 2100
catggtccta ggtggcttca ccagcaccct ctacacctct ctgcatggat acttcgtctt 2160
cgggcccaca ggatgcaatt tggagggctt ctttgccacc ctgggcggtg aaattgccct 2220
gtggtccttg gtggtcctgg ccatcgagcg gtacgtggtg gtgtgtaagc ccatgagcaa 2280
cttccgcttc ggggagaacc atgccatcat gggcgttgcc ttcacctggg tcatggcgct 2340
ggcctgcgcc gcacccccac tcgccggctg gtccaggtac atccccgagg gcctgcagtg 2400
ctcgtgtgga atcgactact acacgctcaa gccggaggtc aacaacgagt cttttgtcat 2460
ctacatgttc gtggtccact tcaccatccc catgattatc atctttttct gctatgggca 2520
gctcgtcttc accgtcaagg aggccgctgc ccagcagcag gagtcagcca ccacacagaa 2580
ggcagagaag gaggtcaccc gcatggtcat catcatggtc atcgctttcc tgatctgctg 2640
ggtgccctac gccagcgtgg cattctacat cttcacccac cagggctcca acttcggtcc 2700
catcttcatg accatcccag cgttctttgc caagagcgcc gccatctaca accctgtcat 2760
ctatatcatg atgaacaagc agttccggaa ctgcatgctc accaccatct gctgcggcaa 2820
gaacccactg ggtgacgatg aggcctctgc taccgtgtcc aagacggaga cgagccaggt 2880
ggccccggcc taaccaagaa agcttaagtt tgggactagt ggcggccgct cgagcatgca 2940
tctagagggc cctattctat agtgtcacct aaatgctaga gctcgctgat cagcctcgac 3000
tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct 3060
ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct 3120
gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg 3180
ggaagacaat agcaggcatg ctggggagct agagtcgacc ggaccgctgc aggcatgcaa 3240
gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc 3300
cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct 3360
aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc 3420
agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt 3480
ccgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg 3540
gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt 3600
tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga 3660
cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct ctctggctaa 3720
ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg aaattaatac gactcactat agggagtccc 3780
aagctggcta gttaagctat caacaagttt gtacaaaaaa gcaggcttta aagggaggta 3840
gtgagtcgac cagtggatcc tggaggcttg ctgaaggctg tatgctgaag gagcttacaa 3900
tctagctggg gttttggcca ctgactgacc ccagctagtg taagctcctt caggacacaa 3960
ggcctgttac tagcactcac atggaacaaa tggcccagat ctggccgcac tcgagatgct 4020
tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 4080
tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 4140
gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 4200
aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 4260
ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 4320
gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 4380
ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 4440
ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 4500
cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 4560
attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 4620
ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 4680
aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 4740
gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 4800
tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 4860
ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc 4920
taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 4980
atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata 5040
actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca 5100
cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga 5160
agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga 5220
gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg 5280
gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 5340
gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt 5400
gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct 5460
cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca 5520
ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat 5580
accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 5640
aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 5700
aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg 5760
caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 5820
ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 5880
gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 5940
cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg 6000
aggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc 6060
ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc 6120
gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc tggcttaact atgcggcatc agagcagatt 6180
gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac 6240
cgcatcaggc gccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg 6300
gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg attaagttgg 6360
gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagt 6408
<210> 13
<211> 155
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 13
gatcctggag gcttgctgaa ggctgtatgc tgaaggagct tacaatctag ctggggtttt 60
ggccactgac tgaccccagc tagtgtaagc tccttcagga cacaaggcct gttactagca 120
ctcacatgga acaaatggcc cagatctggc cgcac 155
<210> 14
<211> 189
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 14
aacctaaccc ccatggttgg cgagggactg ctgtgtgtga aatggtaact gccctcaagg 60
agcttacaat ctagctgggg gtaaatgact tgcacatgaa cacaactaga ctgtgagctt 120
ctagagggca gggaccttac cctagtcatc tctcttctca ccctgcacac cctccctgag 180
ggatctcat 189
<210> 15
<211> 6172
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 15
tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggcgccattc 60
gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg 120
ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc 180
ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgaattcgga ccgtcgacat tgattattgg 240
gccccagaag cctggtggtt gtttgtcctt ctcaggggaa aagtgaggcg gccccttgga 300
ggaaggggcc gggcagaatg atctaatcgg attccaagca gctcagggga ttgtcttttt 360
ctagcacctt cttgccactc ctaagcgtcc tccgtgaccc cggctgggat ttagcctggt 420
gctgtgtcag ccccggtctc ccaggggctt cccagtggtc cccaggaacc ctcgacaggg 480
cccggtctct ctcgtccagc aagggcaggg acgggccaca ggccaagggc ggagtcgctg 540
cgacgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct cgcgccgccc gccccggctc 600
tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc tccgggctgt 660
aattagcaag aggtaagggt ttaagggatg gttggttggt ggggtattaa tgtttaatta 720
cctgttttac aggcctgaaa tcacttggtt ttaggttggg gatccggtac ccaattgcca 780
tgggctagca tgcatgagct ccctgcaggg tttatctgca gaattcagcc accaccggca 840
caatgaatgg cacagaaggc cctaacttct acgtgccctt ctccaatgcg acgggtgtgg 900
tacgcagccc cttcgagtac ccacagtact acctggctga gccatggcag ttctccatgc 960
tggccgccta catgtttctg ctgatcgtgc tgggcttccc catcaacttc ctcacgctct 1020
acgtcaccgt ccagcacaag aagctgcgca cgcctctcaa ctacatcctg ctcaacctag 1080
ccgtggctga cctcttcatg gtcctaggtg gcttcaccag caccctctac acctctctgc 1140
atggatactt cgtcttcggg cccacaggat gcaatttgga gggcttcttt gccaccctgg 1200
gcggtgaaat tgccctgtgg tccttggtgg tcctggccat cgagcggtac gtggtggtgt 1260
gtaagcccat gagcaacttc cgcttcgggg agaaccatgc catcatgggc gttgccttca 1320
cctgggtcat ggcgctggcc tgcgccgcac ccccactcgc cggctggtcc aggtacatcc 1380
ccgagggcct gcagtgctcg tgtggaatcg actactacac gctcaagccg gaggtcaaca 1440
acgagtcttt tgtcatctac atgttcgtgg tccacttcac catccccatg attatcatct 1500
ttttctgcta tgggcagctc gtcttcaccg tcaaggaggc cgctgcccag cagcaggagt 1560
cagccaccac acagaaggca gagaaggagg tcacccgcat ggtcatcatc atggtcatcg 1620
ctttcctgat ctgctgggtg ccctacgcca gcgtggcatt ctacatcttc acccaccagg 1680
gctccaactt cggtcccatc ttcatgacca tcccagcgtt ctttgccaag agcgccgcca 1740
tctacaaccc tgtcatctat atcatgatga acaagcagtt ccggaactgc atgctcacca 1800
ccatctgctg cggcaagaac ccactgggtg acgatgaggc ctctgctacc gtgtccaaga 1860
cggagacgag ccaggtggcc ccggcctaac caagaaagct taagtttgtg tcccggctta 1920
gggctaaatg tctaggacag aatggaacac atagtagctg attaataaat gctagctgga 1980
tgaagggagg aatgagtgac tgactgagtg gatatatgag tgaagggatt aatggaaggg 2040
aacatggatg tcctcaggtg cccaacctgg cagatccagt catgtctggc tggaatctat 2100
aagcagtttt acatacctgc cctgagcttt attgcggtag tttatcacag ttaaattgct 2160
aacgcagtca gtgcttctga cacaacagtc tcgaacttaa gctgcagtga ctctcttaag 2220
gtagccttgc agaagttggt cgtgaggcac tgggcaggta agtatcaagg ttacaagaca 2280
ggtttaagga gaccaataga aactgggctt gtcgagacag agaaaaacct aacccccatg 2340
gttggcgagg gactgctgtg tgtgaaatgg taactgccct caaggagctt acaatctagc 2400
tgggggtaaa tgacttgcac atgaacacaa ctagactgtg agcttctaga gggcagggac 2460
cttaccctag tcatctctct tctcaccctg cacaccctcc ctgagggatc tcatgactct 2520
tgcgtttctg ataggcacct attggtctta ctgacatcca ctttgccttt ctctccacag 2580
gtgtccactc ccagttcaca ccggcacaat gaatggcaca gaaggcccta acttctacgt 2640
gcccttctcc aatgcgacgg gtgtggtacg cagccccttc gagtacccac agtcagagat 2700
aaatgacagt gacagcaacg tgagctgcag cccttaggac tgagaaagca tcgagaccag 2760
gggtctccgg caaggcctag gtcctccctt cagtatggaa accttgcctc atgtctctca 2820
gcctccttgg cctgtggaga tccagccctt cctcttggct tctggataca tttgctcttc 2880
tacaccagca accaagtggc aacagttcca ggccagtatg gagttttaga agccatgcca 2940
atatgcccac cttcagggag cagctgagtc cttgatgcca cccttgttct gaagagttca 3000
gaaacacagt gcaagacatg accaggcctc atccttagga tgctcatgga tccagttctt 3060
agctcccttg ttggatatgc tgttttcctt ggcctttggt cttttcttta tcccagaggg 3120
ttttggcttt aaggccaaca ggaactatgg ggtaccagaa ttgagcagcc tcagtctgca 3180
tccctcctct atagaaccac agctgggccc tcagcaggcc caactctgca tggggacaga 3240
ggcattaaaa gcctagagta tccctcgagg ggcccaagct tacgcgtacc cagctttctt 3300
gtacaaagtg gtccctatag tgagtcgtat tataagctag gcactggccg tcgttttaca 3360
acgtcgtgac tgggaaaact gctagcttgg gatctttgtg aaggaacctt acttctgtgg 3420
tgtgacataa ttggacaaac tacctacaga gatttaaagc tctaaggtaa atataaaatt 3480
tttaagtgta taatgtgtta aactagctgc aaaacctgtg ccttctagtt gccagccatc 3540
tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct 3600
ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg 3660
gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg 3720
ggaactagtc ggaccgctgc aggcatgcaa gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 3780
ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 3840
gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 3900
ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 3960
ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 4020
cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 4080
cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 4140
accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 4200
acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 4260
cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 4320
acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 4380
atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 4440
agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 4500
acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 4560
gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg 4620
gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 4680
gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 4740
gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga 4800
acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga 4860
tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt 4920
ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt 4980
catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat 5040
ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag 5100
caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct 5160
ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt 5220
tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg 5280
cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca 5340
aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt 5400
tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat 5460
gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac 5520
cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa 5580
aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt 5640
tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt 5700
tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa 5760
gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt 5820
atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa 5880
taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta 5940
tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctc gcgcgtttcg 6000
gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt 6060
aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc 6120
ggggctggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac ca 6172
<210> 16
<211> 441
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 16
actagaagct ttattgcggt agtttatcac agttaaattg ctaacgcagt cagtgcttct 60
gacacaacag tctcgaactt aagctgcagt gactctctta aggtagcctt gcagaagttg 120
gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa ggttacaaga caggtttaag gagaccaata 180
gaaactgggc ttgtcgagac agagaatgga tcctggaggc ttgctgaagg ctgtatgctg 240
aaggagctta caatctagct ggggttttgg ccactgactg accccagcta gtgtaagctc 300
cttcaggaca caaggcctgt tactagcact cacatggaac aaatggccca gatctgagac 360
tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc tttctctcca 420
caggtgtcca ctcccagttc a 441
<210> 17
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 17
tggatcctgg aggcttgctg aaggctgtat gctgaaggag cttacaatct agctggggtt 60
ttggccactg actgacccca gctagtgtaa gctccttcag gacacaaggc ctgttactag 120
cactcacatg gaacaaatgg cccagatctg 150
<210> 18
<211> 190
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 18
aaacctaacc cccatggttg gcgagggact gctgtgtgtg aaatggtaac tgccctcaag 60
gagcttacaa tctagctggg ggtaaatgac ttgcacatga acacaactag actgtgagct 120
tctagagggc agggacctta ccctagtcat ctctcttctc accctgcaca ccctccctga 180
gggatctcat 190
<210> 19
<211> 79
<212> RNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 19
cucugccugg agacuaaggc aaauugggcc auuaaaagcu cagcuccuau guugguauua 60
acgguggugg guuuuguug 79
<210> 20
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 20
ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac 60
gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag gga 113
<210> 21
<211> 143
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 21
ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg 60
acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc 120
caactccatc actaggggtt cct 143
<210> 22
<211> 795
<212> DNA
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 22
tgctgattca gccaggaact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60
gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120
ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180
ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240
atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300
cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360
tattagtcat cgctattacc acaaatagtt atcgagccgc tgagccgggg ggcggggggt 420
gtgagactgg aggcgatgga cggagctgac ggcacacaca gctcagatct gtcaagtgag 480
ccattgtcag ggcttgggga ctggataagt cagggggtct cctgggaaga gatgggatag 540
gtgagttcag gaggagacat tgtcaactgg agccatgtgg agaagtgaat ttagggccca 600
aaggttccag tcgcagcctg aggccaccag actgacatgg ggaggaattc ccagaggact 660
ctggggcaga caagatgaga caccctttcc tttctttacc taagggcctc cacccgatgt 720
caccttggcc cctctgcaag ccaattaggc cccggtggca gcagtgggat tagcgttagt 780
atgatatctc gcgga 795
<210> 23
<211> 315
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 23
ggagtcgctg cgacgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct cgcgccgccc 60
gccccggctc tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc 120
tccgggctgt aattagcaag aggtaagggt ttaagggatg gttggttggt ggggtattaa 180
tgtttaatta cctgttttac aggcctgaaa tcacttggtt ttaggttggg gatccggtac 240
ccaattgcca tgggctagca tgcatgagct ccctgcaggg ttttaatgcc aactttgtac 300
aaaaaagcag gcacc 315
<210> 24
<211> 2064
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 24
tgactagtta gggccccaga agcctggtgg ttgtttgtcc ttctcagggg aaaagtgagg 60
cggccccttg gaggaagggg ccgggcagaa tgatctaatc ggattccaag cagctcaggg 120
gattgtcttt ttctagcacc ttcttgccac tcctaagcgt cctccgtgac cccggctggg 180
atttagcctg gtgctgtgtc agccccggtc tcccaggggc ttcccagtgg tccccaggaa 240
ccctcgacag ggcccggtct ctctcgtcca gcaagggcag ggacgggcca caggccaagg 300
gcactagaag ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat tgctaacgca gtcagtgctt 360
ctgacacaac agtctcgaac ttaagctgca gtgactctct taaggtagcc ttgcagaagt 420
tggtcgtgag gcactgggca ggtaagtatc aaggttacaa gacaggttta aggagaccaa 480
tagaaactgg gcttgtcgag acagagaatg gatcctggag gcttgctgaa ggctgtatgc 540
tgaaggagct tacaatctag ctggggtttt ggccactgac tgaccccagc tagtgtaagc 600
tccttcagga cacaaggcct gttactagca ctcacatgga acaaatggcc cagatctgag 660
actcttgcgt ttctgatagg cacctattgg tcttactgac atccactttg cctttctctc 720
cacaggtgtc cactcccagt tcacaccggc acaatgaatg gcacagaagg ccctaacttc 780
tacgtgccct tctccaatgc gacgggtgtg gtacgcagcc ccttcgagta cccacagtac 840
tacctggctg agccatggca gttctccatg ctggccgcct acatgtttct gctgatcgtg 900
ctgggcttcc ccatcaactt cctcacgctc tacgtcaccg tccagcacaa gaagctgcgc 960
acgcctctca actacatcct gctcaaccta gccgtggctg acctcttcat ggtcctaggt 1020
ggcttcacca gcaccctcta cacctctctg catggatact tcgtcttcgg gcccacagga 1080
tgcaatttgg agggcttctt tgccaccctg ggcggtgaaa ttgccctgtg gtccttggtg 1140
gtcctggcca tcgagcggta cgtggtggtg tgtaagccca tgagcaactt ccgcttcggg 1200
gagaaccatg ccatcatggg cgttgccttc acctgggtca tggcgctggc ctgcgccgca 1260
cccccactcg ccggctggtc caggtacatc cccgagggcc tgcagtgctc gtgtggaatc 1320
gactactaca cgctcaagcc ggaggtcaac aacgagtctt ttgtcatcta catgttcgtg 1380
gtccacttca ccatccccat gattatcatc tttttctgct atgggcagct cgtcttcacc 1440
gtcaaggagg ccgctgccca gcagcaggag tcagccacca cacagaaggc agagaaggag 1500
gtcacccgca tggtcatcat catggtcatc gctttcctga tctgctgggt gccctacgcc 1560
agcgtggcat tctacatctt cacccaccag ggctccaact tcggtcccat cttcatgacc 1620
atcccagcgt tctttgccaa gagcgccgcc atctacaacc ctgtcatcta tatcatgatg 1680
aacaagcagt tccggaactg catgctcacc accatctgct gcggcaagaa cccactgggt 1740
gacgatgagg cctctgctac cgtgtccaag acggagacga gccaggtggc cccggcctaa 1800
ccaagaaagc ttaagtttaa accgctgatc agcctcgact gtgccttcta gttgccagcc 1860
atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt 1920
cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattct 1980
ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata gcaggcatgc 2040
tggggatgcg gtgggctcta tggc 2064
<210> 25
<211> 2093
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 25
gggccccaga agcctggtgg ttgtttgtcc ttctcagggg aaaagtgagg cggccccttg 60
gaggaagggg ccgggcagaa tgatctaatc ggattccaag cagctcaggg gattgtcttt 120
ttctagcacc ttcttgccac tcctaagcgt cctccgtgac cccggctggg atttagcctg 180
gtgctgtgtc agccccggtc tcccaggggc ttcccagtgg tccccaggaa ccctcgacag 240
ggcccggtct ctctcgtcca gcaagggcag ggacgggcca caggccaagg gcactagaag 300
ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat tgctaacgca gtcagtgctt ctgacacaac 360
agtctcgaac ttaagctgca gtgactctct taaggtagcc ttgcagaagt tggtcgtgag 420
gcactgggca ggtaagtatc aaggttacaa gacaggttta aggagaccaa tagaaactgg 480
gcttgtcgag acagagaaaa acctaacccc catggttggc gagggactgc tgtgtgtgaa 540
atggtaactg ccctcaagga gcttacaatc tagctggggg taaatgactt gcacatgaac 600
acaactagac tgtgagcttc tagagggcag ggaccttacc ctagtcatct ctcttctcac 660
cctgcacacc ctccctgagg gatctcatga ctcttgcgtt tctgataggc acctattggt 720
cttactgaca tccactttgc ctttctctcc acaggtgtcc actcccagtt cacaccggca 780
caatgaatgg cacagaaggc cctaacttct acgtgccctt ctccaatgcg acgggtgtgg 840
tacgcagccc cttcgagtac ccacagtact acctggctga gccatggcag ttctccatgc 900
tggccgccta catgtttctg ctgatcgtgc tgggcttccc catcaacttc ctcacgctct 960
acgtcaccgt ccagcacaag aagctgcgca cgcctctcaa ctacatcctg ctcaacctag 1020
ccgtggctga cctcttcatg gtcctaggtg gcttcaccag caccctctac acctctctgc 1080
atggatactt cgtcttcggg cccacaggat gcaatttgga gggcttcttt gccaccctgg 1140
gcggtgaaat tgccctgtgg tccttggtgg tcctggccat cgagcggtac gtggtggtgt 1200
gtaagcccat gagcaacttc cgcttcgggg agaaccatgc catcatgggc gttgccttca 1260
cctgggtcat ggcgctggcc tgcgccgcac ccccactcgc cggctggtcc aggtacatcc 1320
ccgagggcct gcagtgctcg tgtggaatcg actactacac gctcaagccg gaggtcaaca 1380
acgagtcttt tgtcatctac atgttcgtgg tccacttcac catccccatg attatcatct 1440
ttttctgcta tgggcagctc gtcttcaccg tcaaggaggc cgctgcccag cagcaggagt 1500
cagccaccac acagaaggca gagaaggagg tcacccgcat ggtcatcatc atggtcatcg 1560
ctttcctgat ctgctgggtg ccctacgcca gcgtggcatt ctacatcttc acccaccagg 1620
gctccaactt cggtcccatc ttcatgacca tcccagcgtt ctttgccaag agcgccgcca 1680
tctacaaccc tgtcatctat atcatgatga acaagcagtt ccggaactgc atgctcacca 1740
ccatctgctg cggcaagaac ccactgggtg acgatgaggc ctctgctacc gtgtccaaga 1800
cggagacgag ccaggtggcc ccggcctaac caagaaagct taagtttaaa ccgctgatca 1860
gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc 1920
ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg 1980
cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg 2040
gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggc 2093
<210> 26
<211> 2716
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 26
acgcgttttc tgcagcgggg attaatatga ttatgaacac ccccaatctc ccagatgctg 60
attcagccag gaactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca 120
tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac 180
gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact 240
ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa 300
gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg 360
cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta 420
gtcatcgcta ttaccacaaa tagttatcga gccgctgagc cggggggcgg ggggtgtgag 480
actggaggcg atggacggag ctgacggcac acacagctca gatctgtcaa gtgagccatt 540
gtcagggctt ggggactgga taagtcaggg ggtctcctgg gaagagatgg gataggtgag 600
ttcaggagga gacattgtca actggagcca tgtggagaag tgaatttagg gcccaaaggt 660
tccagtcgca gcctgaggcc accagactga catggggagg aattcccaga ggactctggg 720
gcagacaaga tgagacaccc tttcctttct ttacctaagg gcctccaccc gatgtcacct 780
tggcccctct gcaagccaat taggccccgg tggcagcagt gggattagcg ttagtatgat 840
atctcgcgga tgctgaatca gcctctggct tagggagaga aggtcacttt ataagggtct 900
ggggggggtc agtgcctgga gttgcgctgt gggagccgtc agtggctgag ctcaactaga 960
agctttattg cggtagttta tcacagttaa attgctaacg cagtcagtgc ttctgacaca 1020
acagtctcga acttaagctg cagtgactct cttaaggtag ccttgcagaa gttggtcgtg 1080
aggcactggg caggtaagta tcaaggttac aagacaggtt taaggagacc aatagaaact 1140
gggcttgtcg agacagagaa tggatcctgg aggcttgctg aaggctgtat gctgaaggag 1200
cttacaatct agctggggtt ttggccactg actgacccca gctagtgtaa gctccttcag 1260
gacacaaggc ctgttactag cactcacatg gaacaaatgg cccagatctg agactcttgc 1320
gtttctgata ggcacctatt ggtcttactg acatccactt tgcctttctc tccacaggtg 1380
tccactccca gttcacaccg gcacaatgaa tggcacagaa ggccctaact tctacgtgcc 1440
cttctccaat gcgacgggtg tggtacgcag ccccttcgag tacccacagt actacctggc 1500
tgagccatgg cagttctcca tgctggccgc ctacatgttt ctgctgatcg tgctgggctt 1560
ccccatcaac ttcctcacgc tctacgtcac cgtccagcac aagaagctgc gcacgcctct 1620
caactacatc ctgctcaacc tagccgtggc tgacctcttc atggtcctag gtggcttcac 1680
cagcaccctc tacacctctc tgcatggata cttcgtcttc gggcccacag gatgcaattt 1740
ggagggcttc tttgccaccc tgggcggtga aattgccctg tggtccttgg tggtcctggc 1800
catcgagcgg tacgtggtgg tgtgtaagcc catgagcaac ttccgcttcg gggagaacca 1860
tgccatcatg ggcgttgcct tcacctgggt catggcgctg gcctgcgccg cacccccact 1920
cgccggctgg tccaggtaca tccccgaggg cctgcagtgc tcgtgtggaa tcgactacta 1980
cacgctcaag ccggaggtca acaacgagtc ttttgtcatc tacatgttcg tggtccactt 2040
caccatcccc atgattatca tctttttctg ctatgggcag ctcgtcttca ccgtcaagga 2100
ggccgctgcc cagcagcagg agtcagccac cacacagaag gcagagaagg aggtcacccg 2160
catggtcatc atcatggtca tcgctttcct gatctgctgg gtgccctacg ccagcgtggc 2220
attctacatc ttcacccacc agggctccaa cttcggtccc atcttcatga ccatcccagc 2280
gttctttgcc aagagcgccg ccatctacaa ccctgtcatc tatatcatga tgaacaagca 2340
gttccggaac tgcatgctca ccaccatctg ctgcggcaag aacccactgg gtgacgatga 2400
ggcctctgct accgtgtcca agacggagac gagccaggtg gccccggcct aaccaagaaa 2460
gcttaagttt aaaccgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg 2520
tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct 2580
aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg 2640
gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg 2700
cggtgggctc tatggc 2716
<210> 27
<211> 2755
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 27
acgcgttttc tgcagcgggg attaatatga ttatgaacac ccccaatctc ccagatgctg 60
attcagccag gaactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca 120
tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac 180
gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact 240
ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa 300
gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg 360
cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta 420
gtcatcgcta ttaccacaaa tagttatcga gccgctgagc cggggggcgg ggggtgtgag 480
actggaggcg atggacggag ctgacggcac acacagctca gatctgtcaa gtgagccatt 540
gtcagggctt ggggactgga taagtcaggg ggtctcctgg gaagagatgg gataggtgag 600
ttcaggagga gacattgtca actggagcca tgtggagaag tgaatttagg gcccaaaggt 660
tccagtcgca gcctgaggcc accagactga catggggagg aattcccaga ggactctggg 720
gcagacaaga tgagacaccc tttcctttct ttacctaagg gcctccaccc gatgtcacct 780
tggcccctct gcaagccaat taggccccgg tggcagcagt gggattagcg ttagtatgat 840
atctcgcgga tgctgaatca gcctctggct tagggagaga aggtcacttt ataagggtct 900
ggggggggtc agtgcctgga gttgcgctgt gggagccgtc agtggctgag ctcaactaga 960
agctttattg cggtagttta tcacagttaa attgctaacg cagtcagtgc ttctgacaca 1020
acagtctcga acttaagctg cagtgactct cttaaggtag ccttgcagaa gttggtcgtg 1080
aggcactggg caggtaagta tcaaggttac aagacaggtt taaggagacc aatagaaact 1140
gggcttgtcg agacagagaa aaacctaacc cccatggttg gcgagggact gctgtgtgtg 1200
aaatggtaac tgccctcaag gagcttacaa tctagctggg ggtaaatgac ttgcacatga 1260
acacaactag actgtgagct tctagagggc agggacctta ccctagtcat ctctcttctc 1320
accctgcaca ccctccctga gggatctcat gactcttgcg tttctgatag gcacctattg 1380
gtcttactga catccacttt gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag ttcacaccgg 1440
cacaatgaat ggcacagaag gccctaactt ctacgtgccc ttctccaatg cgacgggtgt 1500
ggtacgcagc cccttcgagt acccacagta ctacctggct gagccatggc agttctccat 1560
gctggccgcc tacatgtttc tgctgatcgt gctgggcttc cccatcaact tcctcacgct 1620
ctacgtcacc gtccagcaca agaagctgcg cacgcctctc aactacatcc tgctcaacct 1680
agccgtggct gacctcttca tggtcctagg tggcttcacc agcaccctct acacctctct 1740
gcatggatac ttcgtcttcg ggcccacagg atgcaatttg gagggcttct ttgccaccct 1800
gggcggtgaa attgccctgt ggtccttggt ggtcctggcc atcgagcggt acgtggtggt 1860
gtgtaagccc atgagcaact tccgcttcgg ggagaaccat gccatcatgg gcgttgcctt 1920
cacctgggtc atggcgctgg cctgcgccgc acccccactc gccggctggt ccaggtacat 1980
ccccgagggc ctgcagtgct cgtgtggaat cgactactac acgctcaagc cggaggtcaa 2040
caacgagtct tttgtcatct acatgttcgt ggtccacttc accatcccca tgattatcat 2100
ctttttctgc tatgggcagc tcgtcttcac cgtcaaggag gccgctgccc agcagcagga 2160
gtcagccacc acacagaagg cagagaagga ggtcacccgc atggtcatca tcatggtcat 2220
cgctttcctg atctgctggg tgccctacgc cagcgtggca ttctacatct tcacccacca 2280
gggctccaac ttcggtccca tcttcatgac catcccagcg ttctttgcca agagcgccgc 2340
catctacaac cctgtcatct atatcatgat gaacaagcag ttccggaact gcatgctcac 2400
caccatctgc tgcggcaaga acccactggg tgacgatgag gcctctgcta ccgtgtccaa 2460
gacggagacg agccaggtgg ccccggccta accaagaaag cttaagttta aaccgctgat 2520
cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt 2580
ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat 2640
cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg 2700
gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggc 2755
<210> 28
<211> 145
<212> DNA
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 28
agaggactaa gccacaggtg aggagaaagg gggggggggg tctgctgacc cagcaacact 60
ctttccttct gaggcttaag agctattagc gtaggtgact cagtccctaa tcctccattc 120
aatgccctgt gactgcccct gcttc 145
<210> 29
<211> 364
<212> DNA
<213> 巨细胞病毒
<400> 29
actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 60
cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 120
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 180
caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 240
ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 300
tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 360
acca 364
<210> 30
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的构建体
<400> 30
tttctgcagc ggggattaat atgattatga acacccccaa tctcccagat gctgattcag 60
ccagga 66

Claims (130)

1.一种用于治疗哺乳动物中的色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa)的方法，包括将包含腺相关病毒(rAAV)载体的重组rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物的眼部，所述rAAV载体包含编码miR-708的核酸。
2.一种用于治疗哺乳动物细胞中的内质网(ER)应激的方法，包括将包含rAAV载体的rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物，所述rAAV载体包含编码miR-708的核酸。
3.权利要求2的方法，其中将所述rAAV颗粒施用至所述哺乳动物的眼部，任选地其中所述哺乳动物患有色素性视网膜炎或处于罹患色素性视网膜炎的风险。
4.权利要求2或3的方法，其中所述细胞是眼细胞(ocular cell)。
5.权利要求4的方法，其中所述细胞是感光细胞(photoreceptor cell)。
6.权利要求5的方法，其中所述细胞是视杆细胞(rod photoreceptor cell)。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述方法包括减少ER应激的一种或多种细胞标记物。
8.权利要求7的方法，其中所述ER应激的一种或多种细胞标记物是剪接的XBP-1、CHOP或Grp78。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述rAAV载体包含编码miR-708和视紫红质(rhodopsin)的核酸。
10.权利要求1-8任一项的方法，进一步包括将包含第二rAAV载体的第二rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物的眼部，所述第二rAAV载体包含编码视紫红质(rhodopsin)的核酸。
11.一种用于治疗哺乳动物中的色素性视网膜炎的方法，包括将包含rAAV载体的rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物的眼部或细胞，所述rAAV载体包含编码miR-708和视紫红质的核酸。
12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述编码miR-708的核酸可操作地连接(operably linked)至启动子。
13.权利要求12的方法，其中所述启动子能够在感光细胞中表达miR-708。
14.权利要求12或13的方法，其中所述启动子包含视紫红质激酶(RK)启动子或视蛋白启动子(opsin promoter)。
15.权利要求9-11任一项的方法，其中所述编码视紫红质的核酸可操作地连接至启动子。
16.权利要求15的方法，其中所述启动子能够在感光细胞中表达视紫红质。
17.权利要求15或16的方法，其中所述启动子包含RK启动子或视蛋白启动子。
18.权利要求9的方法，其中i)所述编码miR-708的核酸和编码视紫红质的核酸可操作地连接至一个RK启动子；或ii)所述编码miR-708的核酸可操作地连接至第一RK启动子或第一视蛋白启动子，且所述编码视紫红质的核酸可操作地连接至第二RK启动子或第二视蛋白启动子。
19.权利要求18的方法，其中所述编码miR-708的核酸在所述编码视紫红质的核酸的5’。
20.权利要求18的方法，其中所述编码miR-708的核酸在所述编码视紫红质的核酸的3’。
21.权利要求12或15的方法，其中所述启动子是鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。
22.权利要求12-21任一项的方法，其中源自小鼠细小病毒(MVM)内含子的序列位于所述启动子的3’，其中任选地所述MVM内含子包含SEQ ID NO:23的序列。
23.权利要求12-22任一项的方法，其中所述启动子进一步包含：
i)CMV增强子；
ii)源自光感受器特异性转录因子的序列；
iii)源自视杆细胞特异性转录因子的序列；
iv)源自神经视网膜碱性拉链因子(zipper factor)的序列；
v)源自含视锥视杆同源框(cone rod homebox)的转录因子序列的序列；
vi)CMV增强子，和源自光感受器特异性转录因子的序列、源自视杆细胞特异性转录因子的序列、源自神经视网膜碱性拉链因子的序列、源自含视锥视杆同源框的转录因子序列的序列中的至少一种或多种；
vii)神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、CMV增强子和视蛋白启动子(-500至+17)；
viii)神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、CMV增强子、视蛋白启动子(-500至+17)和MVM内含子；
ix)包含SEQ ID NO:29的CMV增强子；
x)包含SEQ ID NO:30的神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子序列；
xi)包含SEQ ID NO:28的源自含视锥视杆同源框的转录因子序列的序列；
xii)包含SEQ ID NO:29的CMV增强子，和源自光感受器特异性转录因子的序列、源自视杆细胞特异性转录因子的序列、包含SEQ ID NO:30的源自神经视网膜碱性拉链因子的序列、包含SEQ ID NO:28的源自含视锥视杆同源框的转录因子序列的序列中的至少一种或多种；
xiii)包含SEQ ID NO:30的神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、包含SEQ ID NO:29的CMV增强子和包含SEQ ID NO:22的视蛋白启动子(-500至+17)；或
xiv)包含SEQ ID NO:30的神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、包含SEQ ID NO:29的CMV增强子、包含SEQ ID NO:22的视蛋白启动子(-500至+17)和包含SEQ ID NO:23的MVM内含子。
24.权利要求1-23任一项的方法，其中所述编码miR-708的核酸嵌入在内含子中。
25.权利要求1-24任一项的方法，其中所述编码miR-708的核酸包含内源性miR-708支架或miR-155支架。
26.权利要求9-25任一项的方法，其中所述视紫红质是人视紫红质。
27.权利要求9-26任一项的方法，其中所述编码视紫红质的核酸包含在miR-708靶序列中核酸的取代、***或缺失。
28.权利要求27的方法，其中所述取代、***或缺失降低或防止miR-708进行的识别。
29.权利要求9-28任一项的方法，其中所述视紫红质缺少3’非翻译区(UTR)miR-708靶序列。
30.权利要求9-29任一项的方法，其中所述编码视紫红质的核酸包含在miR-708靶序列中核酸的取代、***或缺失，其中所述miR-708靶序列是SEQ ID NO:19。
31.权利要求9-30任一项的方法，其中所述视紫红质的表达难以受到miR-708的抑制。
32.权利要求1-31任一项的方法，其中所述编码miR-708的核酸包含SEQ ID NO:1的核酸。
33.权利要求1-31任一项的方法，其中所述编码miR-708的核酸包含与SEQ ID NO:1具有约至少85％同一性的核酸。
34.权利要求9-33任一项的方法，其中所述视紫红质包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
35.权利要求9-33任一项的方法，其中所述视紫红质包含与SEQ ID NO:2具有约至少85％同一性的氨基酸序列。
36.权利要求9-34任一项的方法，其中所述编码视紫红质的核酸包含SEQ ID NO:3的核酸。
37.权利要求9-34任一项的方法，其中所述编码视紫红质的核酸包含与SEQ ID NO:3具有约85％同一性的核酸。
38.权利要求1-8或10任一项的方法，其中所述AAV病毒颗粒包含重组病毒基因组，所述重组病毒基因组包含SEQ ID NO:5的多核苷酸。
39.权利要求1-9或11任一项的方法，其中所述AAV病毒颗粒包含重组病毒基因组，所述重组病毒基因组包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26或SEQ ID NO:27的多核苷酸。
40.权利要求1-8或10任一项的方法，其中所述AAV病毒颗粒包含重组病毒基因组，所述重组病毒基因组包含与SEQ ID NO:5具有约至少85％同一性的多核苷酸。
41.权利要求1-9或11任一项的方法，其中所述AAV病毒颗粒包含重组病毒基因组，所述重组病毒基因组包含与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26或SEQ ID NO:27具有约至少85％同一性的多核苷酸。
42.权利要求1-41任一项的方法，其中所述AAV病毒颗粒和/或所述第二AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2 N587A、AAV2 E548A、AAV2 N708A、AAVV708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合型、牛AAV或小鼠AAV衣壳(capsid)rAAV2/HBoV1血清型衣壳。
43.权利要求1-42任一项的方法，其中所述AAV病毒颗粒和/或所述第二AAV病毒颗粒包含AAV血清型5衣壳。
44.权利要求43的方法，其中所述rAAV病毒颗粒和/或所述第二rAAV病毒颗粒包含AAV血清型5酪氨酸突变体衣壳。
45.权利要求1-44任一项的方法，其中所述rAAV载体和/或所述第二rAAV载体包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型反向末端重复序列(ITR)。
46.权利要求45的方法，其中所述rAAV载体和/或所述第二rAAV载体包含AAV血清型2ITR。
47.权利要求1-46任一项的方法，其中所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自相同AAV血清型。
48.权利要求1-46任一项的方法，其中所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自不同AAV血清型。
49.权利要求48的方法，其中所述rAAV病毒颗粒包含AAV-5衣壳，并且其中所述载体包含AAV2 ITR。
50.权利要求48或49的方法，其中所述rAAV病毒颗粒包含AAV-5酪氨酸突变体衣壳，且其中所述载体包含AAV2 ITR。
51.权利要求1-50任一项的方法，其中将所述rAAV颗粒注射入所述哺乳动物视网膜的视网膜下间隙(subretinal space)。
52.权利要求51的方法，其中将所述rAAV施用至所述哺乳动物视网膜的视网膜下间隙中超过一个位置。
53.权利要求1-51任一项的方法，其中将所述rAAV颗粒玻璃体内注射至所述哺乳动物。
54.权利要求1-53任一项的方法，其中至少10-30％的感光细胞由所述AAV转导。
55.权利要求1-54任一项的方法，其中所述哺乳动物在内源视紫红质基因中具有突变。
56.权利要求55的方法，其中所述内源视紫红质基因中的突变是体染色体(autosomal)显性突变。
57.权利要求1或3-56任一项的方法，其中所述色素性视网膜炎是体染色体显性色素性视网膜炎或体染色体隐性色素性视网膜炎。
58.权利要求1-59任一项的方法，其中所述哺乳动物是人。
59.权利要求58的方法，其中所述人具有在内源视紫红质基因中的P23H突变。
60.权利要求10的方法，其中将编码miR-708的rAAV病毒颗粒和编码视紫红质的第二rAAV病毒颗粒同时施用至所述哺乳动物，或将编码miR-708的rAAV病毒颗粒和编码视紫红质的第二rAAV病毒颗粒顺序施用至所述哺乳动物。
61.权利要求60的方法，其中首先将编码miR-708的rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物，其次再将编码视紫红质的rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物，或者首先将编码视紫红质的rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物，其次再将编码miR-708的rAAV病毒颗粒施用至所述哺乳动物。
62.权利要求1-60任一项的方法，其中所述rAAV病毒颗粒在药物组合物中，其中任选地所述药物组合物还包含药物上可接受的载剂。
63.一种权利要求1-62任一项的rAAV颗粒和任选的第二rAAV颗粒。
64.权利要求63的rAAV颗粒和任选的第二rAAV颗粒，其用于权利要求1-62任一项的方法中。
65.一种包含编码miR-708的核酸的rAAV颗粒。
66.权利要求65的rAAV颗粒，其中包含编码miR-708的核酸的rAAV载体还编码视紫红质。
67.权利要求65的rAAV颗粒，进一步包含含有第二rAAV载体的第二rAAV病毒颗粒，所述第二rAAV载体包含编码视紫红质的核酸。
68.权利要求65-67任一项的rAAV颗粒，其中所述编码miR-708的核酸可操作地连接至启动子。
69.权利要求68的rAAV颗粒，其中所述启动子能够在感光细胞中表达miR-708。
70.权利要求68或69的rAAV颗粒，其中所述启动子包含RK启动子或视蛋白启动子。
71.权利要求66或67任一项的rAAV颗粒，其中所述编码视紫红质的核酸可操作地连接至启动子。
72.权利要求71的rAAV颗粒，其中所述启动子能够在感光细胞中表达视紫红质。
73.权利要求71或72的rAAV颗粒，其中所述启动子包含RK启动子或视蛋白启动子。
74.权利要求73任一项的rAAV颗粒，其中i)所述编码miR-708的核酸和编码视紫红质的核酸可操作地连接至一个RK启动子或视蛋白启动子；或ii)所述编码miR-708的核酸可操作地连接至第一RK启动子或第一视蛋白启动子，且所述编码视紫红质的核酸可操作地连接至第二RK启动子或第二视蛋白启动子。
75.权利要求74的rAAV颗粒，其中所述编码miR-708的核酸在所述编码视紫红质的核酸的5’。
76.权利要求74的rAAV颗粒，其中所述编码miR-708的核酸在所述编码视紫红质的核酸的3’。
77.权利要求68或71的rAAV颗粒，其中所述启动子是鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子。
78.权利要求68-77任一项的方法，其中源自小鼠细小病毒(MVM)内含子的序列位于所述启动子的3’，其中任选地所述MVM内含子包含SEQ ID NO:23的序列。
79.权利要求68-78任一项的方法，其中所述启动子进一步包含：
i)CMV增强子；
ii)源自光感受器特异性转录因子的序列；
iii)源自视杆细胞特异性转录因子的序列；
iv)源自神经视网膜碱性拉链因子的序列；
v)源自含视锥视杆同源框的转录因子序列的序列；
vi)CMV增强子，和源自光感受器特异性转录因子的序列、源自视杆细胞特异性转录因子的序列、源自神经视网膜碱性拉链因子的序列、源自含视锥视杆同源框的转录因子序列的序列中的至少一种或多种；
vii)神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、CMV增强子和视蛋白启动子(-500至+17)；
viii)神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、CMV增强子、视蛋白启动子(-500至+17)和MVM内含子；
ix)包含SEQ ID NO:29的CMV增强子；
x)包含SEQ ID NO:30的神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子序列；
xi)包含SEQ ID NO:28的源自含视锥视杆同源框的转录因子序列的序列；
xii)包含SEQ ID NO:29的CMV增强子，和源自光感受器特异性转录因子的序列、源自视杆细胞特异性转录因子的序列、包含SEQ ID NO:30的源自神经视网膜碱性拉链因子的序列、包含SEQ ID NO:28的源自含视锥视杆同源框的转录因子序列的序列中的至少一种或多种；
xiii)包含SEQ ID NO:30的神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、包含SEQ ID NO:29的CMV增强子和包含SEQ ID NO:22的视蛋白启动子(-500至+17)；或
xiv)包含SEQ ID NO:30的神经视网膜碱性亮氨酸拉链因子、包含SEQ ID NO:29的CMV增强子、包含SEQ ID NO:22的视蛋白启动子(-500至+17)和包含SEQ ID NO:23的MVM内含子。
80.权利要求65-79任一项的rAAV颗粒，其中所述编码miR-708的核酸嵌入在内含子中。
81.权利要求65-80任一项的rAAV颗粒，其中所述编码miR-708的核酸包含内源性miR-708支架或miR-155支架。
82.权利要求66-81任一项的rAAV颗粒，其中所述视紫红质是人视紫红质。
83.权利要求66-82任一项的rAAV颗粒，其中所述编码视紫红质的核酸包含在miR-708靶序列中核酸的取代、***或缺失。
84.权利要求83的方法，其中所述取代、***或缺失降低或防止miR-708进行的识别。
85.权利要求66-84任一项的rAAV颗粒，其中所述视紫红质缺少3’UTR miR-708靶序列。
86.权利要求66-85任一项的rAAV颗粒，其中所述编码视紫红质的核酸包含在miR-708靶序列中核酸的取代、***或缺失，其中所述miR-708靶序列是SEQ ID NO:19。
87.权利要求65-86任一项的rAAV颗粒，其中所述视紫红质的表达难以受到miR-708的抑制。
88.权利要求65-87任一项的rAAV颗粒，其中所述编码miR-708的核酸包含SEQ ID NO:1的核酸。
89.权利要求65-88任一项的rAAV颗粒，其中所述编码miR-708的核酸包含与SEQ IDNO:1具有约至少85％同一性的核酸。
90.权利要求66-89任一项的rAAV颗粒，其中所述视紫红质包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
91.权利要求66-90任一项的rAAV颗粒，其中所述视紫红质包含与SEQ ID NO:2具有约至少85％同一性的氨基酸序列。
92.权利要求66-90任一项的rAAV颗粒，其中所述编码视紫红质的核酸包含SEQ ID NO:3的核酸。
93.权利要求66-90任一项的rAAV颗粒，其中所述编码视紫红质的核酸包含与SEQ IDNO:3具有约85％同一性的核酸。
94.权利要求65或66的rAAV颗粒，其中所述AAV病毒颗粒包含重组病毒基因组，所述重组病毒基因组包含SEQ ID NO:5的多核苷酸。
95.权利要求66或68-73任一项的rAAV颗粒，其中所述AAV病毒颗粒包含重组病毒基因组，所述重组病毒基因组包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27的多核苷酸。
96.权利要求65或67的rAAV颗粒，其中所述AAV病毒颗粒包含重组病毒基因组，所述重组病毒基因组包含与SEQ ID NO:5具有约至少85％同一性的多核苷酸。
97.权利要求66或68-73任一项的rAAV颗粒，其中所述AAV病毒颗粒包含重组病毒基因组，所述重组病毒基因组包含与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27具有约至少85％同一性的多核苷酸。
98.权利要求65-97任一项的rAAV颗粒，其中所述AAV病毒颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV2/2-7m8、AAV DJ、AAV2N587A、AAV2E548A、AAV2N708A、AAV V708K、山羊AAV、AAV1/AAV2嵌合型、牛AAV或小鼠AAV衣壳rAAV2/HBoV1血清型衣壳。
99.权利要求65-98任一项的rAAV颗粒，其中所述AAV病毒颗粒包含AAV血清型5衣壳。
100.权利要求98或99的rAAV颗粒，其中所述rAAV病毒颗粒包含AAV血清型5酪氨酸突变体衣壳。
101.权利要求65-100任一项的rAAV颗粒，其中所述rAAV载体包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、山羊AAV、牛AAV或小鼠AAV血清型反向末端重复序列(ITR)。
102.权利要求65-101任一项的rAAV颗粒，其中所述载体包含AAV血清型2 ITR。
103.权利要求65-102任一项的rAAV颗粒，其中所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自相同AAV血清型。
104.权利要求65-102任一项的rAAV颗粒，其中所述rAAV病毒颗粒的ITR和衣壳源自不同AAV血清型。
105.权利要求104的rAAV颗粒，其中所述rAAV病毒颗粒包含AAV-5衣壳，并且其中所述载体包含AAV2 ITR。
106.权利要求105的rAAV颗粒，其中所述rAAV病毒颗粒包含AAV-5酪氨酸突变体衣壳，并且其中所述载体包含AAV2 ITR。
107.一种包含权利要求65-106任一项的rAAV颗粒的组合物。
108.一种包含rAAV颗粒和任选的第二rAAV颗粒的组合物，所述rAAV颗粒包含权利要求1-62任一项的包含编码miR-708的核酸的rAAV载体，所述第二rAAV颗粒包含含有编码视紫红质的核酸的rAAV载体，所述组合物用于权利要求1-62任一项的方法中。
109.权利要求107或108的组合物，其用于权利要求1-62任一项的方法中。
110.权利要求107-108任一项的组合物，其中所述组合物是药物组合物，其中任选地所述药物组合物还包含药物上可接受载剂。
111.一种包含有效量的权利要求1-62任一项的方法的rAAV颗粒的试剂盒。
112.一种包含有效量的权利要求63-106任一项的rAAV颗粒的试剂盒。
113.一种包含有效量的权利要求107-110任一项的组合物的试剂盒。
114.一种包含有效量的包含rAAV载体的rAAV颗粒的试剂盒，所述rAAV载体包含编码miR-708的核酸。
115.一种包含有效量的含有rAAV载体的rAAV颗粒的试剂盒，所述rAAV载体包含编码miR-708和视紫红质的核酸。
116.一种试剂盒，其包含有效量的rAAV颗粒和有效量的第二rAAV颗粒，所述rAAV颗粒包含含有编码miR-708的核酸的rAAV载体，所述第二rAAV颗粒包含含有编码视紫红质的核酸的第二rAAV载体。
117.权利要求118-122任一项的试剂盒，还包含使用所述rAAV颗粒治疗色素性视网膜炎和/或治疗ER应激的说明书。
118.一种包含有效量的权利要求1-62任一项的方法的rAAV颗粒的制品。
119.一种包含有效量的权利要求63-106任一项的rAAV颗粒的制品。
120.一种包含有效量的权利要求107-110任一项的组合物的制品。
121.一种包含有效量的含有rAAV载体的rAAV颗粒的制品，所述rAAV载体包含编码miR-708的核酸。
122.一种包含有效量的含有rAAV载体的rAAV颗粒的制品，所述rAAV载体包含编码miR-708和视紫红质的核酸。
123.一种包含有效量的rAAV颗粒和有效量的第二rAAV颗粒的制品，所述rAAV颗粒包含含有编码miR-708的核酸的rAAV载体，所述第二rAAV颗粒包含含有编码视紫红质的核酸的第二rAAV载体。
124.一种包含源自MVM的内含子的核酸。
125.权利要求124的核酸，其中所述MVM内含子包含SEQ ID NO:23。
126.权利要求124或125的核酸，进一步包含启动子和任选的增强子。
127.权利要求126的核酸，其中所述启动子位于所述MVM内含子的5’。
128.一种包含权利要求124-127任一项的核酸的表达构建体。
129.一种包含权利要求124-127任一项的核酸或权利要求128的表达构建体的载体。
130.一种包含权利要求124-127任一项的核酸、权利要求128的表达构建体或权利要求129的载体的细胞。
CN201580026274.0A 2014-03-21 2015-03-20 用于色素性视网膜炎的基因疗法 Active CN106456660B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210690697.4A CN115252823A (zh) 2014-03-21 2015-03-20 用于色素性视网膜炎的基因疗法

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461969027P 2014-03-21 2014-03-21
US61/969,027 2014-03-21
PCT/US2015/021896 WO2015143418A2 (en) 2014-03-21 2015-03-20 Gene therapy for retinitis pigmentosa

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210690697.4A Division CN115252823A (zh) 2014-03-21 2015-03-20 用于色素性视网膜炎的基因疗法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106456660A true CN106456660A (zh) 2017-02-22
CN106456660B CN106456660B (zh) 2022-05-31

Family

ID=52829343

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580026274.0A Active CN106456660B (zh) 2014-03-21 2015-03-20 用于色素性视网膜炎的基因疗法
CN202210690697.4A Pending CN115252823A (zh) 2014-03-21 2015-03-20 用于色素性视网膜炎的基因疗法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210690697.4A Pending CN115252823A (zh) 2014-03-21 2015-03-20 用于色素性视网膜炎的基因疗法

Country Status (36)

Country Link
US (3) US10383953B2 (zh)
EP (3) EP3119437B1 (zh)
JP (3) JP6669664B2 (zh)
KR (2) KR20160127832A (zh)
CN (2) CN106456660B (zh)
AR (1) AR099837A1 (zh)
AU (1) AU2015230942B2 (zh)
CA (1) CA2943185A1 (zh)
CL (1) CL2016002333A1 (zh)
CR (1) CR20160480A (zh)
DK (2) DK3119437T3 (zh)
DO (1) DOP2016000237A (zh)
EA (1) EA201691891A1 (zh)
EC (1) ECSP16083000A (zh)
ES (2) ES2957840T3 (zh)
FI (1) FI3628334T3 (zh)
HR (2) HRP20231077T1 (zh)
HU (2) HUE046454T2 (zh)
IL (3) IL247543B (zh)
LT (2) LT3119437T (zh)
MA (1) MA39390B2 (zh)
MX (2) MX2016012201A (zh)
MY (1) MY190726A (zh)
NZ (1) NZ724622A (zh)
PE (1) PE20161252A1 (zh)
PH (1) PH12016501684A1 (zh)
PL (2) PL3628334T3 (zh)
PT (2) PT3628334T (zh)
RS (2) RS59634B1 (zh)
SG (3) SG11201607005UA (zh)
SI (2) SI3119437T1 (zh)
TW (2) TWI780401B (zh)
UA (1) UA120050C2 (zh)
UY (1) UY36044A (zh)
WO (1) WO2015143418A2 (zh)
ZA (1) ZA201605924B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019100503A1 (zh) * 2017-11-23 2019-05-31 清华大学 试剂在制备药物中的用途、筛选药物的方法以及药物组合物
CN111050805A (zh) * 2017-03-21 2020-04-21 斯蒂利亚诺斯·米夏拉克基斯 用于治疗cngb1相关视网膜色素变性的基因疗法
CN111518813A (zh) * 2019-02-03 2020-08-11 武汉纽福斯生物科技有限公司 视紫红质的编码序列、其表达载体构建及其应用
CN113795279A (zh) * 2019-03-04 2021-12-14 宾夕法尼亚州大学信托人 靶向akt通路的神经保护性基因疗法
CN114521214A (zh) * 2020-07-24 2022-05-20 尔知渃米斯股份有限公司 视紫红质转录体特异性反式剪接核酶及其用途

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA120050C2 (uk) * 2014-03-21 2019-09-25 Джензайм Корпорейшн Генна терапія для лікування пігментного ретиніту
EP3256588A2 (en) 2015-02-10 2017-12-20 Genzyme Corporation VARIANT RNAi
CN108474001B (zh) * 2015-12-03 2022-04-08 弗里德里克·米谢尔生物医学研究所 SynP160，用于基因在视杆光感受器中特异性表达的启动子
CN108472390B (zh) 2015-12-03 2022-04-15 弗里德里克·米谢尔生物医学研究所 SynP162,用于基因在视杆光感受器中特异性表达的启动子
JP6966442B2 (ja) * 2015-12-04 2021-11-17 ソルボンヌ・ユニヴェルシテSorbonne Universite プロモーター及びその使用
WO2017151823A1 (en) * 2016-03-01 2017-09-08 University Of Florida Research Foundation, Inc. Aav vectors for treatment of dominant retinitis pigmentosa
CN109890424A (zh) * 2016-07-05 2019-06-14 约翰霍普金斯大学 用于治疗视网膜变性的基于crispr/cas9的组合物和方法
CA3076191A1 (en) * 2017-09-22 2019-03-28 Genzyme Corporation Variant rnai
MX2020003351A (es) * 2017-09-27 2020-10-12 Sigilon Therapeutics Inc Metodos, composiciones y elementos implantables que comprenden celulas activas.
EP3768327A4 (en) * 2018-03-23 2022-04-13 The Trustees of Columbia University in the City of New York GENE EDIT FOR AUTOSOMAL DOMINANT DISEASES
WO2019232517A1 (en) * 2018-06-01 2019-12-05 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Compositions and methods for treatment of dominant retinitis pigmentosa
BR112021018354A2 (pt) * 2019-03-21 2021-11-23 Ptc Therapeutics Inc Vetor e método para tratar síndrome de angelman
TWI832531B (zh) * 2022-11-02 2024-02-11 慈濟學校財團法人慈濟大學 Rip1抑制劑或mlkl抑制劑用於治療或預防遺傳性視網膜失養症的用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008125846A2 (en) * 2007-04-12 2008-10-23 The Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth Genetic suppression and replacement
WO2010138263A2 (en) * 2009-05-28 2010-12-02 University Of Massachusetts Novel aav 's and uses thereof

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5262529A (en) * 1990-01-24 1993-11-16 President And Fellows Of Harvard College Diagnosis of hereditary retinal degenerative diseases
US5985583A (en) * 1992-06-23 1999-11-16 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Cloning and expression of gonadotropin-releasing hormone receptor
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
US6995006B2 (en) 1997-09-05 2006-02-07 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
CA2379166C (en) 1999-08-09 2013-03-26 Targeted Genetics Corporation Enhancement of expression of a single-stranded, heterologous nucleotide sequence from recombinant viral vectors by designing the sequence such that it forms instrastrand base pairs
JP4860886B2 (ja) 2000-06-01 2012-01-25 ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル 二本鎖パルボウイルスベクター
NZ600121A (en) 2001-11-13 2013-12-20 Univ Pennsylvania A method of detecting and/or identifying adeno-associated virus (aav) sequences and isolating novel sequences identified thereby
AU2005206410A1 (en) * 2004-01-22 2005-08-04 Dnavec Research Inc. Method of producing minus strand RNA virus vector with the use of hybrid promoter containing cytomegalovirus enhancer and avian beta-actin promoter
US7765583B2 (en) 2005-02-28 2010-07-27 France Telecom System and method for managing virtual user domains
WO2006119432A2 (en) 2005-04-29 2006-11-09 The Government Of The U.S.A., As Rep. By The Sec., Dept. Of Health & Human Services Isolation, cloning and characterization of new adeno-associated virus (aav) serotypes
EP2007795B1 (en) 2006-03-30 2016-11-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Aav capsid proteins
US20090214478A1 (en) * 2008-02-21 2009-08-27 Alberto Auricchio Method of treating ocular diseases by gene therapy
US9217155B2 (en) * 2008-05-28 2015-12-22 University Of Massachusetts Isolation of novel AAV'S and uses thereof
DK2475372T4 (da) * 2009-09-10 2020-11-30 Velin Pharma As Fremgangsmåde til fremstilling af micro-RNA og dets terapeutiske anvendelse
BR112012018899A2 (pt) 2010-01-28 2015-09-15 Philadelphia Children Hospital "método para purificar partículas de vetor de vírus adeno-associado."
US8663624B2 (en) 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
CN103189507A (zh) * 2010-10-27 2013-07-03 学校法人自治医科大学 用于向神经***细胞导入基因的腺相关病毒粒子
CN103502458B (zh) 2011-02-17 2016-11-16 宾夕法尼亚大学托管会 用于改变组织特异性和改善aav9-介导的基因转移的组合物和方法
JP5884152B2 (ja) 2011-07-29 2016-03-15 シャープ株式会社 基地局、端末、通信システムおよび通信方法
ITRM20110685A1 (it) * 2011-12-23 2013-06-24 Internat Ct For Genetic En Gineering And Microrna per la rigenerazione cardiaca attraverso l induzione della proliferazione dei miociti cardiaci
AU2013221212B2 (en) * 2012-02-17 2018-08-09 The Children's Hospital Of Philadelphia AAV vector compositions and methods for gene transfer to cells, organs and tissues
EP3501550A1 (en) * 2012-04-02 2019-06-26 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
US9127274B2 (en) * 2012-04-26 2015-09-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpinc1 iRNA compositions and methods of use thereof
GEP20217251B (en) 2012-05-25 2021-04-26 Charpentier Emmanuelle De Emanuel Methods and compositions for rna-directed target dna modification and for rna-directed modulation of transcription
CN105120901A (zh) * 2012-07-11 2015-12-02 宾夕法尼亚大学托管会 Rpgr x染色体连锁视网膜退化的aav介导的基因治疗
WO2014066498A1 (en) * 2012-10-23 2014-05-01 Vivek Mittal Treatment of metastatic breast cancer
TW201605470A (zh) 2013-10-04 2016-02-16 默沙東藥廠 葡萄糖反應性胰島素結合物
UA120050C2 (uk) 2014-03-21 2019-09-25 Джензайм Корпорейшн Генна терапія для лікування пігментного ретиніту

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008125846A2 (en) * 2007-04-12 2008-10-23 The Provost, Fellows And Scholars Of The College Of The Holy And Undivided Trinity Of Queen Elizabeth Genetic suppression and replacement
WO2010138263A2 (en) * 2009-05-28 2010-12-02 University Of Massachusetts Novel aav 's and uses thereof

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DL GREENWALD等: "Mutation-independent rescue of a novel mouse model of Retinitis Pigmentosa", 《GENE THERAPY》 *
HAOYU MAO等: "Long-Term Rescue of Retinal Structure and Function by Rhodopsin RNA Replacement with a Single Adeno-Associated Viral Vector in P23H RHO Transgenic Mice", 《HUMAN GENE THERAPY》 *
SHANNON BEHRMAN等: "A CHOP-regulated microRNA controls rhodopsin expression", 《J. CELL BIOL.》 *
STEVEN J. GRAY等: "Optimizing Promoters for Recombinant Adeno-Associated Virus-Mediated Gene Expression in the Peripheral and Central Nervous System Using Self-Complementary Vectors", 《HUMAN GENE THERAPY》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111050805A (zh) * 2017-03-21 2020-04-21 斯蒂利亚诺斯·米夏拉克基斯 用于治疗cngb1相关视网膜色素变性的基因疗法
WO2019100503A1 (zh) * 2017-11-23 2019-05-31 清华大学 试剂在制备药物中的用途、筛选药物的方法以及药物组合物
CN111518813A (zh) * 2019-02-03 2020-08-11 武汉纽福斯生物科技有限公司 视紫红质的编码序列、其表达载体构建及其应用
CN111518813B (zh) * 2019-02-03 2023-04-28 武汉纽福斯生物科技有限公司 视紫红质的编码序列、其表达载体构建及其应用
CN113795279A (zh) * 2019-03-04 2021-12-14 宾夕法尼亚州大学信托人 靶向akt通路的神经保护性基因疗法
CN114521214A (zh) * 2020-07-24 2022-05-20 尔知渃米斯股份有限公司 视紫红质转录体特异性反式剪接核酶及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021200988A1 (en) 2021-03-11
US20170173183A1 (en) 2017-06-22
ZA201605924B (en) 2017-09-27
SI3628334T1 (sl) 2023-11-30
JP2017509632A (ja) 2017-04-06
IL284741B2 (en) 2023-02-01
RS59634B1 (sr) 2020-01-31
PE20161252A1 (es) 2016-11-30
MA39390A1 (fr) 2017-12-29
EP3628334A1 (en) 2020-04-01
IL284741A (en) 2021-08-31
LT3628334T (lt) 2023-09-25
JP7048563B2 (ja) 2022-04-05
DK3628334T3 (da) 2023-10-02
PT3119437T (pt) 2019-12-12
NZ762841A (en) 2023-11-24
AR099837A1 (es) 2016-08-24
WO2015143418A2 (en) 2015-09-24
EP3119437A2 (en) 2017-01-25
TW202021627A (zh) 2020-06-16
HUE046454T2 (hu) 2020-03-30
TW201622752A (zh) 2016-07-01
CN106456660B (zh) 2022-05-31
DK3119437T3 (da) 2019-12-09
US20200046851A1 (en) 2020-02-13
US10383953B2 (en) 2019-08-20
US11103598B2 (en) 2021-08-31
LT3119437T (lt) 2019-12-27
HRP20192141T1 (hr) 2020-02-21
ECSP16083000A (es) 2017-02-24
JP2020059737A (ja) 2020-04-16
SG11201607005UA (en) 2016-09-29
MY190726A (en) 2022-05-12
DOP2016000237A (es) 2016-10-16
TWI706789B (zh) 2020-10-11
TWI780401B (zh) 2022-10-11
JP2022084810A (ja) 2022-06-07
EA201691891A1 (ru) 2017-01-30
ES2760263T3 (es) 2020-05-13
BR112016021017A2 (pt) 2017-10-03
MX2016012201A (es) 2017-01-19
JP6669664B2 (ja) 2020-03-18
US20220054657A1 (en) 2022-02-24
CL2016002333A1 (es) 2017-05-26
FI3628334T3 (fi) 2023-09-15
NZ724622A (en) 2022-05-27
HRP20231077T1 (hr) 2023-12-22
KR20160127832A (ko) 2016-11-04
WO2015143418A3 (en) 2015-11-19
MA39390B2 (fr) 2022-04-29
EP3628334B1 (en) 2023-06-28
IL275918B (en) 2021-07-29
PH12016501684A1 (en) 2016-10-03
UA120050C2 (uk) 2019-09-25
PT3628334T (pt) 2023-09-26
RS64611B1 (sr) 2023-10-31
MX2020010694A (es) 2020-11-06
IL247543B (en) 2020-07-30
KR20230006039A (ko) 2023-01-10
IL275918A (en) 2020-08-31
UY36044A (es) 2015-10-30
HUE063460T2 (hu) 2024-01-28
AU2015230942A1 (en) 2016-10-13
CR20160480A (es) 2016-12-14
IL247543A0 (en) 2016-11-30
PL3628334T3 (pl) 2023-12-18
AU2015230942B2 (en) 2020-11-19
CA2943185A1 (en) 2015-09-24
EP4345165A2 (en) 2024-04-03
ES2957840T3 (es) 2024-01-26
SI3119437T1 (sl) 2020-01-31
CN115252823A (zh) 2022-11-01
PL3119437T3 (pl) 2020-04-30
IL284741B (en) 2022-10-01
SG10201912968WA (en) 2020-02-27
SG10201808218YA (en) 2018-10-30
EP3119437B1 (en) 2019-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106456660B (zh) 用于色素性视网膜炎的基因疗法
AU2020260485B2 (en) Gene therapies for lysosomal disorders
AU2023214366B2 (en) Gene therapies for lysosomal disorders
US20040214290A1 (en) Plant artificial chromosomes, uses thereof and methods of preparing plant artificial chromosomes
CN101208425A (zh) 产生复制缺陷型腺病毒的细胞系
KR20210124280A (ko) 표적-이탈 탈아미노화가 감소된 핵염기 편집기 및 이를 이용하여 핵염기 표적 서열을 변형시키는 방법
US20050251872A1 (en) Lentiviral vectors, related reagents, and methods of use thereof
CN1938428A (zh) 多基因表达的质粒***
KR20210125560A (ko) 유전성 질환의 치료를 위한 것을 포함하는, 아데노신 데아미나제 염기 편집기를 사용한 질환-관련 유전자의 스플라이스 수용체 부위 파괴
US6187991B1 (en) Transgenic animal models for type II diabetes mellitus
CN108949825A (zh) 一种靶向her2的car-t细胞的制备方法及应用
CN113322281A (zh) 一种高效组织特异性表达rs1蛋白的重组腺相关病毒及应用
KR20210150486A (ko) 리소좀 장애에 대한 유전자 요법
KR20230066360A (ko) 신경퇴행성 장애를 위한 유전자 요법
KR20220163950A (ko) Aav 생산을 위한 이중 이기능성 벡터
KR20230019063A (ko) C9orf72 연관 질환의 치료를 위한 삼중 기능 아데노-연관 바이러스 (aav) 벡터
KR101616572B1 (ko) 홍역-말라리아 조합 백신
CN100338219C (zh) 成视网膜细胞瘤蛋白的组织特异性表达
AU2021200988B2 (en) Gene therapy for retinitis pigmentosa
CN101679976A (zh) 核酸和文库
KR20220064647A (ko) 내산성 효모 유전자 기반 합성 프로모터
KR20150021839A (ko) 암특이적 유전자를 표적하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임의 조절 유도체를 포함하는 재조합 아데노바이러스 및 이의 용도
CN114990163A (zh) 用于干细胞基因修饰的慢病毒载体及其构建方法和应用
KR20210150487A (ko) 리소좀 장애를 위한 유전자 요법
NZ553497A (en) Plant artificial chromosomes, uses thereof and methods of preparing plant artificial chromosomes

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant