CN106053794A - 一种用于准确检测待测物的试剂卡、试剂盒和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于准确检测待测物的试剂卡、试剂盒和用途。在PVC底板(6)上依次从一端往另一端粘合着样品垫(1)，抗体承载膜(2)和吸水纸(3)，其中样品垫为加样区，所述样品垫上喷有待测物抗体1偶联标记物和生物素偶联标记物；所述抗体承载膜上有三条线，从靠近样品垫的往吸水纸方向，依次是T1线(4)，T2线和C线(5)；或依次是T1线(4)，C线(5)和T2线；所述T1线为检测线，是将待测物抗体2喷涂在T1线位置；所述T2线为将待检物的抗原喷涂在T2线位置；所述C线为链霉亲和素喷涂在C线位置。采用本发明的试剂卡可以大大降低高剂量钩状效应所引起的假阴性率，提高临床检测的准确性，有效解决HOOK产生的影响。

Description

一种用于准确检测待测物的试剂卡、试剂盒和用途
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于解决高剂量钩状效应的试剂卡、试剂盒和用途。
背景技术
临床上的免疫层析实验，当出现高剂量时，很容易出现高剂量钩状效应，即HD-HOOK效应。它指在双位点夹心免疫试验中，其剂量反应曲线的高剂量区段，线性走向不是呈平台状无限后延，而是呈向下弯曲状，似一只钩子或一把镰刀，根据此现象，称之为“HD-HOOK”效应。该效应的存在导致被检测样本不能正确区分是由于其浓度超出检测试剂盒的线性范围还是本身浓度就是该值导致此现象，以至于实验误诊，尤其导致假阴性概率上升。目前还没有有效的避免HOOK效应产生的影响的方法，大多数通过增加包被蛋白量，增加标记蛋白或喷金量来改善这种情况，或者通过工艺配方的调整来起到辅助作用，但是都没能很好的改善此效应带来的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种准确检测待测物的试剂卡。
为实现上述目的，本发明提供一种用于准确检测待测物的试剂卡，其特征在于，在PVC底板(6)上依次从一端往另一端粘合着样品垫(1)，抗体承载膜(2)和吸水纸(3)，其中样品垫为加样区，所述样品垫上喷有待测物抗体1偶联标记物和生物素偶联标记物；
所述抗体承载膜上有三条线，从靠近样品垫的往吸水纸方向，依次是T1线(4)，T2线和C线(5)；或依次是T1线(4)，C线(5)和T2线；所述T1线为检测线，是将待测物抗体2喷涂在T1线位置；所述T2线为将待检物的抗原喷涂在T2线位置；所述C线为链霉亲和素喷涂在C线位置。
进一步，所述样品垫为玻璃纤维膜、聚酯膜或者全血过滤膜。
进一步，所述样品垫上喷有胃蛋白酶抗体1偶联标记物和生物素偶联标记物，其两者体积比为1:1，并用含质量比为1％的BSA的pH7.4，0.01M PBS稀释至工作浓度后喷在样品垫上。
进一步，所述待测物抗体1偶联标记物和生物素偶联标记物通过划膜喷金仪器喷涂。
进一步，所述标记物为稀土元素铕裹在二氧化硅颗粒上或荧光素、乳胶荧光微球或胶体金。6、权利要求1所述用于准确检测待测物的试剂卡，其特征在于，所述抗体承载膜为硝酸纤维膜或尼龙膜。
进一步，所述待测物抗体2通过划膜喷金仪器喷涂在T1线位置；所述待测物抗原通过划膜喷金仪器喷涂在T2线位置；所述C线为链霉亲和素划膜喷金仪器喷涂在C线位置。
进一步，所述待测物是激素或大分子蛋白。
本发明还提供一种试剂盒，其特征在于，含所述用于准确检测待测物的试剂卡。
本发明还提供所述用于准确检测待测物的试剂卡或所述的试剂盒用于准确检测待测物的试剂卡的用途。
本发明的试剂卡是在原来传统的方法上做了技术改进，原传统方法免疫层析承载膜上包被检测线T和C线，现为了提高检测上限并避免钩状效应，在检测线T1后包被上待检物的抗原T2，并在标准曲线定标上实行分段定标。这样即使在高剂量情况下，也能有良好的线性曲线，使检测上限得到提高，从而使高剂量钩状效应所引起的假阴性率大大降低，提高临床检测的准确性，有效解决HOOK产生的影响。
本发明的方法该T2线的位置可以是在C线前或C线后(可根据实际实验确实)。
本发明解决钩状效应免疫层析定量定标并结果换算的方法：定标，以待测物的标准品稀释成所需线性浓度，并以荧光免疫分析仪收集特异性反应后T1、T2和C线的荧光强度。将浓度、T1和T2取对数，并以浓度对数作为横坐标，分别以T1和T2作为纵坐标有线性一段拟合曲线，浓度-T1双对数拟合曲线为曲线1，浓度-T2双对数拟合曲线为曲线2。结果换算，测试样本，收集T1、T2、C线的荧光值，取对数T2并与截点比较，小于截点，将对数T2带入曲线2中的Y，求出X反对数即为浓度；对数T2若大于截点，将对数T1带入曲线1中的Y，求出X反对数即为浓度。所述截点为log浓度-logT1和log浓度-logT2线性相关性R20.95以上，浓度交集的中间值，对应的T2荧光强度的对数。该截点作为判断是带入曲线1或曲线2换算的依据。
本发明解决钩状效应的原理：待测样品通过层析作用与样本垫上包被的待测物抗体1偶联的标记物结合，在毛细作用下，依次通过样本垫、硝酸纤维素膜，并与硝酸纤维素膜T 1线上固定的待测物抗体2特异性反应，形成双抗体免疫夹心复合物，复合物随待测样品浓度升高而升高，当升高到一定程度开始不再升高并慢慢下降。多余未与待测样本反应的测物抗体1偶联的标记物层析至T2线，与T2线上的待测物抗原形成特异性反应，特异性反应随着待测样品浓度的升高逐渐下降。在层析过程中，质控生物素偶联标记物也随着样品的移动而前进，并在硝酸纤维素膜C线位置被固定的亲和素捕获，C线位置捕获的是固定的，不随个体差异或待测样品浓度的影响。未反应的微球继续移动到吸水垫位置。通过荧光免疫分析仪对T1、T2、C线荧光信号收集，分析待测样品中待测抗原浓度。
附图说明
图1是本发明所述试剂卡条的结构构造图。
图2是HCG标准品浓度在10-40000mIU/mL的标准曲线图。
图3是HCG标准品浓度在40000-200000mIU/mL的标准曲线图。
图4是AFP标准品浓度在5-400ng/mL的标准曲线图。
图5是AFP标准品浓度在400-2000ng/mL的标准曲线图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：HCG检测试剂盒(荧光免疫层析法)的制备及检测
HCG抗体1偶联荧光微球和生物素偶联荧光微球的制备：选取10mg荧光微球加入到1mL含5质量％戊二醛的0.01M pH7.4 PBS溶液中反应1h，12000转5min离心去上清后再加入1mgHCG抗体1均匀混合，于4℃反应12h，12000转5min离心后去上清，并用1mL 0.01M pH7.4PBS重悬，形成HCG抗体1偶联荧光微球；以同样方法，选用取10mg荧光微球加入1mL含5质量％戊二醛的0.01M pH7.4PBS溶液中反应1h，12000转5min离心去上清后再加入1mg生物素混合，于4℃反应12h，12000转5min离心后去上清，并用1mL 0.01M pH7.4PBS重悬，形成生物素偶联荧光微球。
样品垫的制备：将HCG抗体1偶联荧光微球和生物素偶联荧光微球按体积比1:1混合，并用含质量比为1％BSA的pH7.4，0.01M PBS稀释至工作浓度(100-5000倍稀释，根据实际实验的荧光强度及线性趋势调整)通过划膜喷金仪器在包被于样品垫上。将包被好的样品垫于45℃2h烘干。所述样品垫为玻璃纤维膜、聚酯膜或者全血过滤膜。
T1线包被液的配制：用pH7.4，0.01M PBS稀释液将HCG抗体2稀释至1.0mg/ml(0.5-5mg/ml据实际实验调整)，2-8℃备用。
T2线包被液的配制：用pH7.4，0.01M PBS稀释液将HCG抗原稀释至1.0mg/ml(0.5-5mg/ml据实际实验调整)，2-8℃备用。
C线包被液的配制：用pH7.4，0.01M PBS稀释液将质控物亲和素稀释至1.0mg/ml(0.5-5mg/ml据实际实验调整)，2-8℃备用。
抗体承载膜包被：通过划膜喷金仪将T1线包被液、T2线包被液和C线包被液同时包被在NC膜上，形成T1线、T2线和C线，将该包被后的NC膜于45℃2h烘干。
贴板、切条组装成检测卡：按照图1所示将玻璃纤维膜和烘干的包被后的NC膜、吸水纸依次粘贴组装，抗体承载膜位于中间，样品垫与吸水纸分别搭接于硝酸纤维素膜左右两端。组装完成后用切条机切成每条宽度4mm的试条，装进试条卡壳，压卡，制备成检测卡。干燥环境下避光备用。
其中①为样品垫；②为抗体承载膜；③为吸水纸；④为T1线所在位置；⑤为T2线所在位置；⑥为C线所在位置；⑦为带粘合剂的PVC底板。
样本缓冲液：含质量比为10％牛血清白蛋白、体积比为10％TWEEN-20和质量比为0.01％叠氮钠的0.05M pH7.4PBS溶液。2-8℃保存。
检测样本：使用人血清或血浆，在24小时内检测，如不能及时检测，全血2-8℃保存7天，血清或血浆-20℃保存1个月，溶血和严重脂血样品不可用。
检测条件：
(1)仪器：免疫荧光分析仪；
(2)工作环境：室温，室内湿度45％-80％；
(3)试剂盒恢复室温，试剂卡现测现拆袋，避免受潮。
检测方法：取出2-8℃保存的样本缓冲液，恢复室温，吸取20ul标准品或临床样本加到180-580μl样本缓冲液中(具体缓冲液体积根据实验灵敏度＜0.05，测试标准品5-200000mIU/mL，线性相关性R2≥0.9801来确定)，充分混匀，吸取80ul混合液，滴加到检测卡的加样口上，将检测卡***荧光免疫检测仪器，按仪器显屏上的标准检测。
定标：以荧光免疫分析仪收集特异性反应后T1、T2和C线的荧光强度。将标准品的浓度、T1和T2的荧光值取对数，并以浓度对数作为横坐标，分别以对数T1和对数T2作为纵坐标，浓度-T1双对数拟合曲线为曲线1HCG浓度在10-40000mIU/mL成良好的线性关系(曲线1见图2)，浓度-T2双对数拟合曲线为曲线2HCG浓度在40000-200000mIU/mL成良好的线性关系(曲线2见图3)。结果见表1。
其中C线是用于判断该试剂卡是否无效的依据。如果C线荧光值低于标准品检测是的C线值的30-100％，则该试剂卡无效；如果C线荧光值在标准品检测时C线值的±30％，则该试剂卡有效，结果可用；
结果换算：测试临床样本，收集T1、T2、C线的荧光值，取对数T2并与截点比较，小于截点，将对数T2带入曲线2中的Y，求出X反对数即为浓度；对数T2若大于截点，将对数T1带入曲线1中的Y，求出X反对数即为浓度。
从图2可以看出，HCG浓度在10-40000ng/mL范围内对数浓度-对数T1荧光呈现良好的线性关系，图3中HCG浓度在40000-200000ng/mL范围内对数浓度-对数T2荧光呈现良好的线性关系，大于10000ng/mL浓度不出现HOOK效应。表2可见截点为4.355。
表1标准品的检测结果表
浓度 T1 T2 C 对数(浓度) 对数(T1) 对数(T2)
200000 20584 4102 22053 5.301 4.314 3.613
150000 28645 6254 21056 5.176 4.457 3.796
100000 34128 9347 22047 5.000 4.533 3.971
80000 35627 11234 20298 4.903 4.552 4.051
50000 34362 19325 21269 4.699 4.536 4.286
40000 30598 22656 22125 4.602 4.486 4.355
20000 22541 32056 21654 4.301 4.353 4.506
5000 14520 33055 20365 3.699 4.162 4.519
500 5202 34106 22546 2.699 3.716 4.533
50 2289 33451 19899 1.699 3.360 4.524
10 1014 30574 20953 1.000 3.006 4.485
精密度：批内精密度，取同一批的检测卡和缓冲液，用同一个已知浓度的血液平行检测20个检测卡，计算出CV＝9.4％。批间精密度，取3个批次的检测卡和缓冲液，用同一个已知浓度的血液平行检测60个检测卡，计算出CV＝10.8％。可以看出，本实施例的试剂卡具有较好的精密度，误差小。
准确性：在样本中分别加入HCG标准品50000mIU/mL、100mIU/mL，回收率分别为105.6％和103.3％。检测回收率落入85％-115％之内，说明本发明的试剂卡具有良好的准确度。
灵敏度：按20个测试0浓度样本所得对数荧光值的均值+2SD计算，最小检出限＜5.0mIU/mL。说明本发明的试剂卡具有高的灵敏度。
临床测试：测试40例临床样本，结果对比如下表2：
表2临床测试结果表
从表2可看出，本实施例的试剂卡均有较好的准确性，高浓度不会出现钩状效应。
实施例2：AFP检测试剂盒(荧光免疫层析法)
与实施例1相比，不同点在于将HCG抗体2替换成AFP抗体2，HCG抗原偷换成AFP抗原，其他方法和步骤均同实施例1。
表2标准品的检测结果表
从图4可以看出，AFP浓度在5-400ng/mL范围内对数浓度-对数T1荧光呈现良好的线性关系，图5中AFP浓度在400-2000ng/mL范围内对数浓度-对数T2荧光呈现良好的线性关系，大于2000ng/mL浓度不出现HOOK效应。表2可见截点为4.186。
精密度试验：批内精密度，取同一批的检测卡和缓冲液，用同一个已知浓度的血液平行检测20个检测卡，计算出CV＝8.7％。批间精密度，取3个批次的检测卡和缓冲液，用同一个已知浓度的血液平行检测60个检测卡，计算出CV＝12.9％。可以看出，本实施例的试剂卡具有较好的精密度，误差小。
准确性试验：在血液样本中分别加入AFP标准品20ng/mL、500ng/mL，回收率分别为106.8％和101.4％。检测回收率落入85％-115％之内，说明本发明的试剂卡具有良好的准确度。
灵敏度试验：按20个测试0浓度样本所得对数荧光值的均值+2SD计算，最小检出限＜3ng/mL。说明本实施例的试剂卡具有高的灵敏度。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种用于准确检测待测物的试剂卡，其特征在于，在PVC底板(6)上依次从一端往另一端粘合着样品垫(1)，抗体承载膜(2)和吸水纸(3)，其中样品垫为加样区，所述样品垫上喷有待测物抗体1偶联标记物和生物素偶联标记物；
所述抗体承载膜上有三条线，从靠近样品垫的往吸水纸方向，依次是T1线(4)，T2线和C线(5)；或依次是T1线(4)，C线(5)和T2线；所述T1线为检测线，是将待测物抗体2喷涂在T1线位置；所述T2线为将待检物的抗原喷涂在T2线位置；所述C线为链霉亲和素喷涂在C线位置。
2.权利要求1所述用于准确检测待测物的试剂卡，其特征在于，所述样品垫为玻璃纤维膜、聚酯膜或者全血过滤膜。
3.权利要求1所述用于准确检测待测物的试剂卡，其特征在于，所述样品垫上喷有胃蛋白酶抗体1偶联标记物和生物素偶联标记物，其两者体积比为1:1，并用含质量比为1％的BSA的pH7.4，0.01M PBS稀释至工作浓度后喷在样品垫上。
4.权利要求1所述用于准确检测待测物的试剂卡，其特征在于，所述待测物抗体1偶联标记物和生物素偶联标记物通过划膜喷金仪器喷涂。
5.权利要求1-4任一项所述用于准确检测待测物的试剂卡，其特征在于，所述标记物为稀土元素铕裹在二氧化硅颗粒上或荧光素、乳胶荧光微球或胶体金。
6.权利要求1所述用于准确检测待测物的试剂卡，其特征在于，所述抗体承载膜为硝酸纤维膜或尼龙膜。
7.权利要求1所述用于准确检测待测物的试剂卡，其特征在于，所述待测物抗体2通过划膜喷金仪器喷涂在T1线位置；所述待测物抗原通过划膜喷金仪器喷涂在T2线位置；所述C线为链霉亲和素划膜喷金仪器喷涂在C线位置。
8.权利要求1-7任一项所述用于准确检测待测物的试剂卡，其特征在于，所述待测物是激素或大分子蛋白。
9.一种试剂盒，其特征在于，含权利要求1所述用于准确检测待测物的试剂卡。
10.权利要求1所述用于准确检测待测物的试剂卡或权利要求9所述的试剂盒用于准确检测待测物的试剂卡的用途。
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