CN105884842B

CN105884842B - 从红枣叶中制备槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷及其应用

Info

Publication number: CN105884842B
Application number: CN201610061341.9A
Authority: CN
Inventors: 白红进; 陈朋; 邹玲; 周忠波; 吴翠云
Original assignee: Tarim University
Current assignee: Tarim University
Priority date: 2016-01-28
Filing date: 2016-01-28
Publication date: 2021-03-12
Anticipated expiration: 2036-01-28
Also published as: CN105884842A

Abstract

本发明公开从红枣叶中制备槲皮素‑3‑O‑α‑L‑***糖‑(1→2)‑α‑L‑鼠李糖苷及其应用，采收红枣叶片用清水洗涤干净，烘燥，粉碎，75%乙醇溶液提取，低温减压浓缩，获得总黄酮浸膏用适量水溶解后上大孔树脂柱，分别用20%、50%、95%乙醇溶液洗脱，收集50%洗脱液，回收溶剂得黄酮苷粗品，用3倍体积50%甲醇溶解，用制备型高效液相精制纯化，洗脱液使用分析型高效液相检测，合并其中相同并且纯度大于98%流份，回收溶剂获得黄酮苷槲皮素‑3‑O‑α‑L‑***糖‑(1→2)‑α‑L‑鼠李糖苷单体，产品纯度高、收率高，可作为分析检测的标准品，对治疗利什曼原虫具有明显的应用效果，具有广泛的实用价值。

Description

从红枣叶中制备槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷及其应用

技术领域

本发明涉及植物有效成分提取制备的技术领域。具体的说，本发明涉及一种具有治疗利什曼原虫的槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷提取的技术领域。

背景技术

枣树为鼠李科(Rhamnaceae)枣属(Ziziphus)植物，其果实称为红枣或大枣，既是一种可口的水果和干果，又是一种疗效显著的中药。现在国内外加工及技术研究局限于枣果，对于枣树的其它资源如根、茎、叶、花、皮的研究很少。截止到2015年，全国枣树的种植面积达到1700万亩，枣叶做为枣树产量最大的副产物，每亩枣田年产鲜枣叶约200公斤，全国每年栆叶的产量约340万吨。同时枣叶中含有大量有生物活性的物质，如黄酮、酚类、生物碱、皂苷、三萜酸类、环磷酸腺苷、鸟苷等。

黄酮苷类化合物多具有较好的抗氧化活性、免疫活性、抗炎活性和抗病毒活性，是一类极具开发价值的天然活性物质。槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷是一种非常少见的黄酮苷，至今为止市面上还没有从红枣叶中提取槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷的标准品出售。

现有技术中，大部分只是粗提取阶段，如公开号CN101926452A，申请号CN200910260210.3 “酸枣叶总黄酮浸膏及其制备方法”，是一种从酸枣叶中制备总黄酮浸膏的方法；公开号 CN103169788A，申请号 CN201310132996.7 “大枣叶提取物及其在制备防治肝损伤药物及保健食品中的应用”，介绍了一种枣叶提取物在防治肝损伤药物及保健食品中的应用。有关于栆叶中黄酮苷类化合物的检测与鉴定的研究，其中涉及提取与纯化过程，但主要是测定所需要的步骤，不是研究黄酮苷的制备工艺，且提取与纯化过程复杂，产率不高。

发明内容

针对目前未见枣叶提取黄酮苷的研究现状，本发明旨在于提供红枣叶中制备槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷及应用,目的在于充分利用枣叶资源，以及充分发挥枣叶的营养价值，制备的黄酮苷杂质种类极少、纯度高、收率高；产品可作为分析检测的标准品，也可作为医药和保健品添加剂使用，制备工艺简单、制备周期短且过程中的填料可以重复利用，能够实现工业化连续生产，且制备的槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷对治疗利什曼原虫具有广泛的实用价值。

本发明通过以下技术方案实现的:

本发明通过采收红枣叶片，用清水洗涤干净，烘燥，粉碎，75%乙醇溶液提取，低温减压浓缩，即得总黄酮浸膏。总黄酮浸膏用适量水溶解后上大孔树脂柱，分别用20%、50%、95%乙醇溶液洗脱，收集50%洗脱液，回收溶剂得黄酮苷粗品。黄酮苷粗品用3倍体积50%甲醇溶解，用制备型高效液相精制纯化，洗脱液使用分析型高效液相检测，合并其中相同并且纯度大于98%流份，回收溶剂，得到一种稀有黄酮苷槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷单体。本发明提供的红枣叶中制备槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷的黄酮苷杂质种类极少、纯度高、收率高，对治疗利什曼原虫具有明显的应用效果；产品可作为分析检测的标准品，制备工艺简单、制备周期短且过程中的填料可以重复利用，能够实现工业化连续生产，具有广泛的实用价值。

本发明具体提供一种通过红枣叶中制备的槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷，具体通过如下提取方法获得：

（1）原材料的预处理：采收无虫蚀、新鲜的红枣叶片，用清水洗涤干净，在45℃的条件下烘干，粉碎，粉碎并过40-60目筛。

（2）提取和浓缩：经步骤（1）制备的粉碎后红枣叶片用75%乙醇溶液提取，其中料液比为1:10（g/ml），于60℃回流提取4次，每次提取2 h，过滤，合并4次滤液，提取液进行低温减压浓缩，即得总黄酮浸膏，产率为13.0%。

（3）洗脱：将步骤（2）制得的总黄酮浸膏用4倍体积的蒸馏水溶解后上大孔树脂柱，上样流速为1 ml/min，待水溶液全部流入柱内，静置吸附2 h后，用4倍柱体积的蒸馏水冲洗，流速为1.0-3.0 ml/min，弃去流出液；用3 L的20%乙醇溶液洗脱，流速为1.0-3.0 ml/min，弃去洗脱液；用5 L的50%乙醇溶液洗脱，流速为1.0-3.0 ml/min，收集洗脱液，回收溶剂得黄酮苷粗品，产率为3.5%。

所述的大孔树脂柱为将 X-5型号大孔树脂装入6 cm×50 cm的玻璃柱内，依次用50%，95%的乙醇水溶液清洗柱子，95%乙醇冲洗到流出液蒸干后无残留，再用5 L蒸馏水清洗柱子。

（4）总黄酮苷的制备：将步骤（3）中制得的黄酮苷粗品用3倍体积的50%甲醇溶解，用制备型高效液相精制纯化，洗脱液按照组分出峰位置进行收集，收集相同组分。

所述的制备型高效液相精制纯化时的制备液相条件为：COSMOSIL 5C18-MS-II色谱柱，19mm×200mm；流动相包含A和B两种溶液，A液为含有0.1%甲酸的乙腈溶液，B液为含有0.1%甲酸的水溶液，A与B的比例为15：85（v/v）；流速为9 ml/min；检测波长为254 nm。

（5）分析型高效液相检测：利用分析型高效液相检测检测步骤（4）收集的成分，分析条件为COSMOSIL 5C18-MS-II色谱柱，4.7mm×200mm；流动相包含A和B两种溶液，A液为含有0.1%甲酸的乙腈溶液，B液为含有0.1%甲酸的水溶液，A与B的比例为20：80（v/v），流速为1.0 ml/min，检测波长为254 nm。

（6）经上述步骤制备获得黄酮苷槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷单体，产率为1.5 mg/g，纯度为98.7%。

同时，本发明提供了一种通过红枣叶中制备的槲皮素-3-O-洋槐糖苷单体，通过上述提供的提取方法制备获得，制备的槲皮素-3-O-洋槐糖苷单体的产率为0.8 mg/g，纯度达到99.9%，达到了槲皮素-3-O-洋槐糖苷标准品要求。

进一步，本发明提供了一种通过红枣叶中制备的槲皮素-3-O-芸香糖苷单体，通过上述提供的提取方法制备获得，制备的槲皮素-3-O-芸香糖苷产率为1.3 mg/g，纯度为99.5%，达到了槲皮素-3-O-芸香糖苷单体标品要求。

关于新发明新创造采用现有公知常识作为现有技术基础的问题。事实上，除了开创性的发明外，任何一项发明创造都是离不开现有技术手段和技术要素为基础，都是在现有技术手段基础上经过进一步创新的结果。对于挑选、粉碎、提取、浓缩、高效液相检测等技术都是现有技术基础，但是如何使得黄酮苷槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷单体的产率高，如何使得黄酮苷槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷单体在经过一系列的工艺后保留其活性以及如何使得黄酮苷槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷单体的纯度高都需要通过系列不可预见的科学试验反复验证得出。正是由于这些原因，本申请虽然利用了常规技术手段为基础，并在此基础上经过科学实验提供了从红枣叶片中制备3种黄酮苷单体。因此本发明黄酮苷槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷单体的产率为1.5 mg/g，纯度达到98.7%，并通过试验证明具有治疗利什曼原虫的价值，可见获得显著的技术效果。

通过实施本发明具体的发明内容可以达到以下有益效果：

（1）本发明提供的通过红枣叶中制备槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷，制备的黄酮苷槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷单体的产率为1.5mg/g，纯度达到98.7%，产品可作为分析检测的标准品，制备工艺简单、制备周期短且过程中的填料可以重复利用，能够实现工业化连续生产，具有广泛的实用价值。

（2）本发明提供的通过红枣叶中制备槲皮素-3-O-洋槐糖苷和槲皮素-3-O-芸香糖苷，其产率分别为 0.8 mg/g和 1.3 mg/g，纯度为99.9% 和 99.5%，产品可作为分析检测的标准品，制备工艺简单、制备周期短且过程中的填料可以重复利用，能够实现工业化连续生产，具有广泛的实用价值。

（3）本发明提供的通过红枣叶中制备槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷，利用枣产业中枣叶固形废弃物作为主料，原料廉价易得，生物资源丰富，制备的黄酮苷杂质种类极少、纯度高、收率高；产品可作为分析检测的标准品，也可作为医药和保健品添加剂使用，制备工艺简单、制备周期短且过程中的填料可以重复利用，所以本发明容易实现自动化，产品标准化，适于规模化生产。

（4）本发明提供的通过红枣叶中制备槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷具有治疗利什曼原虫的价值，具有广泛的应用价值。

附图说明

图1显示为制备型高效液相精制纯化时，洗脱液组分液相色谱图。

图2显示为槲皮素-3-O-洋槐糖苷的液相色谱图。

图3显示为槲皮素-3-O-芸香糖苷的液相色谱图。

图4显示为槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷的液相色谱图。

图5显示为三种黄酮苷对利什曼原虫的杀虫活性图，图中1号样品为槲皮素-3-O-洋槐糖苷；2号样品为槲皮素-3-O-芸香糖苷；3号为槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷。

具体实施方式

本发明中选用的所有试剂、仪器、原辅材料都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。本发明采用的%按照干燥原料总重量百分比核计。

实施例一：红枣叶中提取槲皮素-3-O-α-L-***糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷

红枣叶中制备槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷的具体提取方法步骤如下：

（2）提取和浓缩：经步骤（1）制备的粉碎后红枣叶片用75%乙醇溶液提取，其中料液比为1:10，即g/ml，于60℃回流提取4次，每次提取2 h，过滤，合并4次滤液，提取液进行低温减压浓缩，即得总黄酮浸膏，产率为13.0%。

（3）洗脱：将步骤（2）制得的总黄酮浸膏用4倍体积的蒸馏水溶解后上大孔树脂柱，上样流速为1 ml/min，待水溶液全部流入柱内，静置吸附2 h后，用3L蒸馏水冲洗，弃去流出液，并分别用20%、50%、95%乙醇溶液洗脱，流速为1.0-3.0 ml/min，收集50%洗脱液，回收溶剂得黄酮苷粗品，产率为3.5%。

所述的大孔树脂柱为将 X-5型号大孔树脂装入6cm×50cm的玻璃柱内，依次用50%，95%的乙醇水溶液清洗柱子，95%乙醇冲洗到流出液蒸干后无残留，再用5L蒸馏水清洗柱子。

所述的制备型高效液相精制纯化时的制备液相条件为：COSMOSIL 5C18-MS-II色谱柱，19mm×200mm；流动相为0.1%甲酸或乙酸的乙腈：0.1%甲酸或乙酸的水溶液=15：85，流速为9 ml/min，检测波长为254nm。

（5）分析型高效液相检测：利用分析型高效液相检测检测步骤（4）收集的成分，分析条件为COSMOSIL 5C18-MS-II色谱柱，4.7mm×200mm；流动相包含A和B两种溶液，A液为含有0.1%甲酸的乙腈溶液，B液为含有0.1%甲酸的水溶液，A与B的比例为20：80（v/v）；流速为1ml/min；检测波长为254nm，参见附图4。

关于新发明新创造采用现有公知常识作为现有技术基础的问题。事实上，除了开创性的发明外，任何一项发明创造都是离不开现有技术手段和技术要素为基础，都是在现有技术手段基础上经过进一步创新的结果。对于挑选、粉碎、提取、浓缩、高效液相检测等技术都是现有技术基础，但是如何使得黄酮苷槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷单体的产率高，如何使得黄酮苷槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷单体在经过一系列的工艺后保留其活性以及如何使得黄酮苷槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷单体的纯度高都需要通过系列不可预见的科学试验反复验证得出。正是由于这些原因，本申请虽然利用了常规技术手段为基础，并在此基础上经过科学实验提供了从红枣叶片中制备3种黄酮苷单体。因此本发明黄酮苷槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷单体的纯度均大于98%，产率为 1.5 mg/g，纯度可以达到 98.7%，可见获得显著的技术效果。

本发明利用枣产业中枣叶固形废弃物作为主料，原料廉价易得，生物资源丰富，制备的黄酮苷槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷单体杂质种类极少、纯度高、收率高；产品可作为分析检测的标准品，也可作为医药和保健品添加剂使用，制备工艺简单、制备周期短且过程中的填料可以重复利用，所以本发明容易实现自动化，产品标准化，适于规模化生产。

实施例二：红枣叶中制备槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷

（1）原材料的预处理：采收11月份，无虫蚀、新鲜的红枣叶片，用清水洗涤干净，在45℃的条件下烘干，粉碎，粉碎并过40目筛。

（2）提取和浓缩：称取步骤（1）制备的粉碎后红枣叶片500 g用5 L的75%乙醇溶液提取，于60℃回流提取4次，每次提取2 h，过滤，合并4次滤液，提取液进行低温减压浓缩，即得总黄酮浸膏，产率为13.0%。

（3）洗脱：将步骤（2）制得的总黄酮浸膏用500 ml水溶解后上大孔树脂柱，上样流速为1 ml/min，待水溶液全部流入柱内，静置吸附 2 h 后，用 3 L蒸馏水冲洗，弃去流出液，并分别用 3 L的 20%、50%、95%乙醇溶液洗脱，流速为1.0 ml/min，收集50%洗脱液，回收溶剂得黄酮苷粗品，产率为3.5%。

所述的大孔树脂柱为将1 kg的X-5型号大孔树脂装入6 cm×50 cm的玻璃柱内，依次用50%，95%的乙醇水溶液清洗柱子，95%乙醇冲洗到流出液蒸干后无残留，再用5 L蒸馏水清洗柱子。

（5）分析型高效液相检测：利用分析型高效液相检测检测步骤（4）收集的成分，分析条件为COSMOSIL 5C18-MS-II色谱柱，4.7mm×200mm；流动相包含A和B两种溶液，A液为含有0.1%甲酸的乙腈溶液，B液为含有0.1%甲酸的水溶液，A与B的比例为20：80（v/v）；流速为1ml/min；检测波长为254nm。

（6）经上述步骤制备获得黄酮苷槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷单体，产率为1.5 mg/g，纯度为98.7%，参见附图4。

实施例三：

采收红枣叶片，用清水洗涤干净，45℃烘燥，干燥的红枣叶片经粉碎机粉碎，干燥样品粉末用75%乙醇溶液提取，低温减压浓缩，即得总黄酮浸膏，产率13.0%。总黄酮浸膏用适量水溶解后上大孔树脂柱，分别用20%、50%、95%乙醇溶液洗脱，收集50%洗脱液，回收溶剂得黄酮苷粗品，产率为3.5%。黄酮苷粗品用3倍体积的50%甲醇溶解用制备型高效液相精制纯化，洗脱液使用分析型高效液相检测，合并其中相同并且纯度大于98%流份，回收溶剂，分别得到槲皮素-3-O-洋槐糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷和一种稀有黄酮苷槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷单体。参见附图2、附图3。

通过上述提供的红枣叶中制备槲皮素-3-O-洋槐糖苷单体，通过上述提供的提取方法制备获得，制备的槲皮素-3-O-洋槐糖苷单体的产率为0.8 mg/g，纯度达到99.9%，参见附图2，基本上获得槲皮素-3-O-洋槐糖苷标品。制备的产品纯度高、收率高；产品可作为分析检测的标准品，也可作为医药和保健品添加剂使用，制备工艺简单、制备周期短且过程中的填料可以重复利用，所以本发明容易实现自动化，产品标准化，适于规模化生产。

上述提供的红枣叶中制备槲皮素-3-O-芸香糖苷单体，通过上述提供的提取方法制备获得，制备的槲皮素-3-O-芸香糖苷产率为1.3 mg/g，纯度为99.5%，参见附图3，基本上获得槲皮素-3-O-芸香糖苷单体标品，产品可作为分析检测的标准品，制备工艺简单、制备周期短且过程中的填料可以重复利用，能够实现工业化连续生产，具有广泛的实用价值。

实施例四：核磁分析

将实施例一至实施例三制备的槲皮素-3-O-洋槐糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷和黄酮苷槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷单体流出液经冷冻干燥后，称取干燥样品10 mg进行紫外及核磁分析，具体数据如下，具体参见附图1：

槲皮素-3-O-洋槐糖苷：淡黄色粉末；UV_{γmax nm}：254，365（甲醇）；1H NMR（DMSO-d6，400Hz）：δ7.64-7.66（1 H，dd，J=8.82 Hz，2.19Hz，H-6’），δ7.53（1 H，d，J=2.19 Hz，H-2’），δ6.81-6.83（1 H，d，J=8.82 Hz，H-5’），δ6.39（1 H，d，J=0.20 Hz，H-8），δ6.19（1 H，d，J=0.20Hz，H-6），δ5.32-5.33（1 H，d，H-1’’），δ4.42（1 H，s，H-1’’’），δ1.06-1.07（3 H，d，J=6.43Hz，H-6’’’）；13C NMR（DMSO-d6，400Hz）：δ177.44（C-4），δ164.55（C-7），δ161.27（C-5），δ156.99（C-9），δ156.45（C-2），δ148.62（C-4’），δ144.92（C-3’），δ133.55（C-3），δ121.99（C-6’），δ121.12（C-1’），δ116.04（C-5’），δ115.27（C-2’），δ103.86（C-10），δ102.14（C-1’’），δ100.07（C-1’’’），δ98.86（C-6），δ93.67（C-8），δ73.63（C-5’’），δ73.13（C-3’’），δ71.99（C-4’’’），δ71.18（C-2’’），δ70.69（C-3’’’），δ70.50（C-2’’’），δ68.36（C-4’’），δ68.11（C-5’’’），δ65.18（C-6’’），δ18.00（C-6’’’）。

槲皮素-3-O-芸香糖苷：淡黄色粉末；UV _{γmax nm}：254，365（甲醇）；1H NMR（DMSO-d6，400Hz）：δ7.53-7.55（1 H，dd，J=8.32 Hz，2.30Hz，H-6’），δ7.52（1 H，d，J=2.30 Hz，H-2’），δ6.83-6.84（1 H，d，J=8.32 Hz，H-5’），δ6.37（1 H，d，J=1.96 Hz，H-8），δ6.18（1 H，d，J=1.96Hz，H-6），δ5.33-5.34（1 H，d，H-1’’），δ4.38（1 H，s，H-1’’’），δ0.99-1.00（3 H，d，J=6.43Hz，H-6’’’）；13C NMR（DMSO-d6，400Hz）：δ177.32（C-4），δ164.47（C-7），δ161.21（C-5），δ156.56（C-9），δ156.48（C-2），δ148.54（C-4’），δ144.80（C-3’），δ133.34（C-3），δ121.62（C-6’），δ121.15（C-1’），δ116.25（C-5’），δ115.25（C-2’），δ103.84（C-10），δ101.31（C-1’’），δ100.76（C-1’’’），δ98.78（C-6），δ93.65（C-8），δ76.50（C-5’’），δ75.94（C-3’’），δ74.10（C-4’’’），δ71.89（C-2’’），δ70.59（C-3’’’），δ70.38（C-2’’’），δ70.02（C-4’’），δ68.24（C-5’’’），δ67.01（C-6’’），δ17.73（C-6’’’）。

槲皮素-3-O-α-L-***糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷：淡黄色粉末；UV _{γmax nm}：254，355（甲醇）；1H NMR（DMSO-d6，400Hz）：δ7.35（1 H，d，J=2.15 Hz，H-2’），δ7.26-7.27（1 H，dd，J=8.36Hz，2.15 Hz，H-6’），δ6.88-6.90（1 H，d，J=8.36 Hz，H-5’），δ6.39（1 H，d，J=2.05Hz，H-8），δ6.20（1 H，d，J=2.05 Hz，H-6），δ5.31（1 H，s，H-1’’），δ4.09-4.11（1 H，d，J=6.93Hz，H-1’’’），δ4.03（1 H，d，J=3.35 Hz，H-2’’），δ0.91-0.92（3 H，d，J=6.20 Hz，H-6’’’）；13C NMR（DMSO-d6，400Hz）：δ177.91（C-4），δ164.43（C-7），δ161.40（C-5），δ157.08（C-9），δ156.03（C-2），δ148.78（C-4’），δ145.37（C-3’），δ134.41（C-3），δ120.97（C-6’），δ120.58（C-1’），δ115.72（C-5’），δ115.52（C-2’），δ106.52（C-1’’’），δ103.99（C-10），δ103.03（C-1’’），δ98.83（C-6），δ93.85（C-8），δ80.67（C-2’’），δ72.56（C-3’’’），δ71.88（C-2’’’），δ71.13（C-4’’），δ70.43（C-3’’），δ70.38（C-4’’’），δ67.89（C-5’’’），δ65.93（C-5’’），δ17.57（C-6’’’）。

采用本发明从枣叶中提取槲皮素-3-O-α-L-***糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷，与槲皮素-3-O-芸香糖苷碳谱相比较，样品中缺少一个糖的末端碳，提示存在***糖。并且鼠李糖的2号位碳化学位移向低场移动，提示是***糖-(1→2)-鼠李糖苷。通过与文献数据比对，结合核磁数据确定为槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷。

实施例五：红枣叶中制备槲皮素-3-O-α-L-***糖-（1→2）-α-L-鼠李糖苷的功效实验

本实施例是基于采用实施例一、二通过红枣叶中制备槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷进行如下功效实验。

1、实验过程

从小鼠病灶组织分离得到利什曼原虫前鞭毛体，并使用绿色荧光蛋白对其进行了标记。利什曼原虫在26℃改良的伊戈尔培养基（10%热灭活胎牛血清和150 µg/mL的新霉素）中培养并维持其形态在前鞭毛体时期。然后用24孔板培养小鼠腹腔巨噬细胞，每孔的细胞数目为2×106，加入0.4 ml的完全培养基，37℃并通入0.5% CO₂培养1 h。待细胞依附在培养板上，每孔加入10⁷个前鞭毛体利什曼原虫，在34℃对小鼠巨噬细胞进行4 h的感染。用34℃的生理盐水把游离的利什曼原虫前鞭毛体冲洗掉，感染的巨噬细胞加入0.5%的培养液，并向平样板上加不同浓度的样品，培养72 h。培养之后，弃去上清液，用200 µL蒸馏水将细胞转移至96孔透明底黑色微孔板。最后使用荧光分光光度计，激发波长为435 nm发射波长为538 nm处检测荧光。

2、实验结果

实验结果参见附图5，槲皮素 3-O-α-L-***糖-(1-2) -α-L-鼠李糖苷有着较高的抗利什曼原虫活性，其IC₅₀值为45 µg/ml。当槲皮素 3-O-α-L-***糖-(1-2) -α-L-鼠李糖苷的浓度为100 µg/ml时，其抗利什曼原虫可以达到60.5%，与阳性对照葡萄糖酸锑的抗利什曼原虫活性相接近。抗利什曼原虫活性最高的为槲皮素苷，其IC₅₀值为8 µg/ml，槲皮素苷和槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1-2) -α-L-鼠李糖苷具有共同的槲皮素母核。但是单纯的槲皮素抗利什曼原虫效果并不好，其IC₅₀＞100 µg/ml。

如上所述，即可较好地实现本发明,上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims

1.一种从红枣叶中制备槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷的方法，其特征在于，具体通过如下提取方法获得：

(1)原材料的预处理：采收无虫蚀、新鲜的红枣叶片，用清水洗涤干净，在45℃的条件下烘干，粉碎，粉碎并过40-60目筛；

(2)提取和浓缩：经步骤(1)制备的粉碎后红枣叶片用75％乙醇溶液提取，其中料液比为1∶10(g/ml)，于60℃回流提取4次，每次提取2h，过滤，合并4次滤液，提取液进行低温减压浓缩，即得总黄酮浸膏，产率为13.0％；

(3)洗脱：将步骤(2)制得的总黄酮浸膏用4倍体积的蒸馏水溶解后上大孔树脂柱，上样流速为1ml/min，待水溶液全部流入柱内，静置吸附2h后，用4倍柱体积的蒸馏水冲洗，流速为1.0-3.0ml/min，弃去流出液；用3L的20％乙醇溶液洗脱，流速为1.0-3.0ml/min，弃去洗脱液；用5L的50％乙醇溶液洗脱，流速为1.0-3.0ml/min，收集洗脱液，回收溶剂得黄酮苷粗品，产率为3.5％；所述的大孔树脂柱为将X-5型号大孔树脂装入6cm×50cm的玻璃柱内，依次用50％，95％的乙醇水溶液清洗柱子，95％乙醇冲洗到流出液蒸干后无残留，再用5L蒸馏水清洗柱子；

(4)总黄酮苷的制备：将步骤(3)中制得的黄酮苷粗品用3倍体积的50％甲醇溶解，用制备型高效液相精制纯化，洗脱液按照组分出峰位置进行收集，收集相同组分；所述的制备型高效液相精制纯化时的制备液相条件为：

COSMOSIL5C18-MS-II色谱柱，19mm×200mm；流动相包含A和B两种溶液，A液为含有0.1％甲酸的乙腈溶液，B液为含有0.1％甲酸的水溶液，A与B的比例为15∶85(v/v)；流速为9ml/min；检测波长为254nm；

(5)分析型高效液相检测：利用分析型高效液相检测检测步骤(4)收集的成分，分析条件为COSMOSIL 5C18-MS-II色谱柱，4.7mm×200mm；流动相包含A和B两种溶液，A液为含有0.1％甲酸的乙腈溶液，B液为含有0.1％甲酸的水溶液，A与B的比例为20∶80(v/v)，流速为1.0ml/min，检测波长为254nm；

(6)经上述步骤制备获得黄酮苷槲皮素-3-O-α-L-***糖-(1→2)-α-L-鼠李糖苷单体，产率为1.5mg/g，纯度为98.7％。

2.一种从红枣叶中制备槲皮素-3-O-洋槐糖苷单体的方法，其特征在于，通过权利要求1提供的制备方法获得，制备的槲皮素-3-O-洋槐糖苷单体的产率为0.8mg/g，纯度达到99.9％。

3.一种从红枣叶中制备槲皮素-3-O-芸香糖苷单体的方法，其特征在于，通过权利要求1提供的制备方法获得，制备的槲皮素-3-O-芸香糖苷单体的产率为1.3mg/g，纯度为99.5％。