CN105833356B - 一种新型的脱细胞带瓣血管支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新型的生物工程脱细胞带瓣血管支架及其制备方法。其发明要点包括：过程中全程使用包含一种或多种带瓣血管结构保护剂的混合保护液；采用高静压技术预分离带瓣血管组织内的细胞；采用少量复合核酸酶和去垢剂方法消化带瓣血管组织内残余细胞核；使用混合保护液进行漂洗；能在6小时内得到完全脱净细胞的带瓣血管组织。本发明能够在细胞核脱干净的基础上，最大限度地降低带瓣血管组织中的免疫原性，同时保留了带瓣血管组织的正常胶原纤维的三维结构及排列极性，使制得的脱细胞带瓣血管组织具有良好的生物相容性，而且具有较强生物力学性能。

Description

一种新型的脱细胞带瓣血管支架及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程医用材料的制备领域，具体为脱细胞带瓣血管支架的制备方法。
背景技术
复杂大血管畸形及大血管的外伤的治疗，特别是儿童及婴幼儿先天性心脏和血管畸形的疾病，需要各种直径和大小的血管或带瓣管道来修复。目前临床上应用的血管有人工合成和生物血管或带瓣管道两大类。人工合成材料(或改性材料)，由于有难以克服的非生理性和弹性及拉力的问题，且阻碍了正常血液流动状态，加上手术后的血栓率高，必须终身服用抗凝药物可能，所以临床上没有得到应用。而较理想的是生物带瓣血管具有天然支架结构，最佳血流动力学，不需抗凝的优点，其中以同种异体血管的临床应用技术较为成熟和有较好的治疗效果，但我国没有脑死亡法，同种异体带瓣管道几乎无法取得。所以寻求异种异体的血管成为当前临床治疗复杂心血管外科治疗的热点和难点。而目前异种异体带瓣血管脱细胞和抗原的技术还存在问题，临床应用处于起步阶段。
发明内容
本发明提供了一种快速、全程使用特殊保护液以及高效的物理复合生物酶手段制备脱细胞带瓣血管支架材料的方法。
本发明的发明要点在于：1、带瓣血管脱细胞过程中全程使用包含一种或多种血管结构保护成分的混合保护液；2、采用高静压技术预分离血管组织内的细胞；3、采用复合核酸酶方法消化残余细胞核；4、利用去垢剂脱除松散破碎细胞片；5、使用混合保护液进行漂洗。脱细胞步骤设定合适的温度、时间以及去垢剂、消化酶浓度对血管支架进行处理。
各种保护性成分的用量为硫酸软骨素的浓度为20-50g/L；右旋糖酐的浓度为10-20g/L；甘油浓度为100-200g/L；新霉素5-10mg/L。
高静压压力条件为200-500MPa，高静压频率为3～6次，每次为1～3分钟。
DNA酶的浓度为1000-2000U/ml，核酸酶的浓度为1000-2000U/ml。DNA酶或核酸酶的脱细胞核时间为2-4小时，处理温度为15-30摄氏度。
去垢剂条件为十二烷基磺酸钠的浓度0.1-5％，十二烷基硫酸钠的浓度0.1-5％，海藻酸钠的浓度0.1-5％。去垢剂处理时间为2-4小时。
可选择性的同时或分开进行酶和去垢剂的处理。
制备的带瓣血管支架需贴附在***模上，放入无水氯化钙分子筛内脱水，经装袋密封并标记，用辐照剂量为25kGy的Gamma射线辐照灭菌5-10小时后在4℃下保存备用。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，这些实施例只用于进一步详述说明本发明，不能理解为对本发明保护范围的限定，在本发明保护范围之内做出非本质的调整需本发明方授权。
本发明的实施例1
取新鲜成年猪或牛的升主动脉、主动脉弓及6-8mm长的冠状动脉用PBS溶液清洗后，放入混合保护液保存。
1、全程使用保护液对带瓣血管支架进行保护，保护液配方为：RPMI-1640培养基，添加硫酸软骨素50g/L，右旋糖酐10g/L，新霉素5mg/L，调pH值至7.2，渗透压为300mOsm；
2、将血管支架密封在盛有保护液的塑料袋中；
3、于200MPa高静压条件下，处理6次，每次时间为3分钟；
4、将血管取出后，置于含2％十二烷基硫酸钠+1000U/ml DNA酶的保护液中，温度为30℃，设定摇床速度为100转/分钟，处理2小时；
5、去垢剂与酶处理完毕后，取出带瓣血管置于保护液中漂洗3小时。
本发明的实施例2
取新鲜成年猪或牛的升主动脉、主动脉弓及6-8mm长的冠状动脉用PBS溶液清洗后，放入混合保护液保存。
1、全程使用保护液对带瓣血管支架进行保护，保护液配方为：RPMI-1640培养基，添加硫酸软骨素20g/L，甘油100g/L，新霉素5mg/L，调pH值至7.2，渗透压为350mOsm；
2、将血管支架密封在盛有保护液的塑料袋中；
3、于400MPa高静压条件下，处理4次，每次时间为2分钟；
4、将血管取出后，置于含0.5％海藻酸钠+1500U/ml DNA酶的保护液中，温度为25℃，设定摇床速度为100转/分钟，处理4小时；
5、去垢剂与酶处理完毕后，取出带瓣血管置于保护液中漂洗2小时。
本发明的实施例3
取新鲜成年猪或牛的升主动脉、主动脉弓及6-8mm长的冠状动脉用PBS溶液清洗后，放入混合保护液保存。
1、全程使用保护液对带瓣血管支架进行保护，保护液配方为：RPMI-1640培养基，添加硫酸软骨素40g/L，右旋糖酐15g/L，新霉素5mg/L，调pH值至7.2，渗透压为400mOsm
2、将血管支架密封在盛有保护液的塑料袋中；
3、于500MPa高静压条件下，处理3次，每次时间为1分钟；
4、将血管取出后，置于含3％十二烷基磺酸钠+2000U/ml DNA酶的保护液中，温度为30℃，设定摇床速度为100转/分钟，处理4小时；
5、去垢剂与酶处理完毕后，取出带瓣血管置于保护液中漂洗5小时。

Claims (9)

1.一种新型的生物工程脱细胞带瓣血管支架的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取动物动脉血管；
(2)使用包含一种或多种保护带瓣血管功能和组织完整性的混合保护液；
(3)使用高静压预分离血管内的细胞；
(4)采用复合核酸酶去除破碎细胞核；
(5)利用去垢剂脱除松散破碎细胞；
(6)在带瓣血管混合保护液中漂洗去除多余的核酸酶和细胞碎片；
(7)获得具有正常胶原纤维的三维结构及排列极性的带有生物特性的脱细胞带瓣血管，其中所述混合保护液成分组成为：RPMI-1640培养基；硫酸软骨素的浓度为20-50g/L；右旋糖酐的浓度为10-20g/L；甘油100-200g/L；新霉素5-10mg/L；调节pH值为6.8-7.2，渗透压为300-400mOsm。。
2.如权利要求1所述的制备方法，所取带瓣血管为新鲜成年猪或牛的升主动脉和主动脉弓及6-8mm长的冠状动脉。
3.如权利要求1所述的制备方法，其中所述复合核酸酶包括DNA酶、RNA酶和其他核酸酶及其组合。
4.如权利要求1所述的制备方法，其中所述去垢剂包括十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠、海藻酸钠、CHAPS活性剂中的一种或多种作为组合。
5.如权利要求1所述的制备方法，其中在带瓣血管混合保护液中漂洗去除多余的核酸酶和细胞碎片中漂洗的时间为2～5小时。
6.如权利要求1所述的制备方法，制备的带瓣血管支架需贴附在***模上，放入无水氯化钙分子筛内脱水，经装袋密封并标记，用辐照剂量为25kGy的Gamma射线辐照灭菌5-10小时后在4℃下保存备用。
7.如权利要求1所述的制备方法，其中所述的静压压力条件为200-500MPa，高静压频率为3-6次，每次为1～3分钟。
8.如权利要求3所述的制备方法，其中所述复合核酸酶使用DNA酶时DNA酶的浓度为1000-2000U/ml，使用核酸酶时浓度为1000-2000U/ml，DNA酶或核酸酶的脱细胞核时间为2-4小时，处理温度为15-30摄氏度。
9.如权利要求4所述的制备方法，其中所述去垢剂十二烷基磺酸钠的浓度为0.1-5％，十二烷基硫酸钠的浓度为0.1-5％，海藻酸钠的浓度为0.1-5％，去垢剂使用时间为2-4小时。
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