CN1053042C - Eb病毒有关疾病的体外鉴别诊断方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种EBV相关病毒的体外鉴别诊断方法,其中使用了一组诊断上相关的抗原性EBV多肽,这些抗原多肽通过DNA重组技术产生,并具有EBV相关蛋白的免疫学活性。
Description
本发明涉及到EB病毒有关疾病的体外鉴别诊断方法,其中使用了一组诊断上相关的EB病毒抗原多肽,这些多肽通过DNA重组技术产生,并具有EB病毒有关蛋白的免疫学活性。
疱疹病毒是具套膜的十二面体衣壳,总直径为150毫微米。病毒基因组由一双链DNA组成,其分子量约为108。人类疱疹病毒有单式I型疱疹病毒(“发热性疱疹”)、单式II型疱疹病毒(生殖器疱疹)、水痘带状疱疹病毒(水痘,带形疱疹)、细胞巨化病毒(先天性异常,如头小畸形)、及EB病毒(EBV)。
EBV导致的原发性疾病为传染性单核细胞增多症。它主要感染儿童和青年人。普通成人人口的90%以上受到EBV感染,并且EBV终身都留在外周B淋巴细胞中。该病毒在人的一生中都在腮腺中产生并通过口腔途径传播。在需要对白血病,或在器官移植情况下受体对移植物的排斥危象进行鉴别诊断时,明确而快速地鉴定传染性单核细胞增多症或急性EBV感染是特别重要的。在这些情况中,错误的诊断可能导致不正确的治疗,而这些不正确的治疗可能导致严重的甚至危及生命的后果。
血清学研究提示EBV还极可能与人类继发性肿瘤,即与非洲伯克特氏(Burkitts)淋巴瘤(BL)和鼻咽癌(NPC)形成有关。明确而迅速地鉴定这种继发性疾病也是很重要的,因为NPC的早期检测可使之对其进行早期处理,这将会显著降低NPC的死亡率。
在中国南方的某些地区及新加坡和马来西亚的华人中,NPC是最常见的人类肿瘤,发病率达每年每100,000人中有40人。在世界其它地区,如婆罗洲或突尼西亚发病率也很高。在大部分其它地区,发病率约为每年每100,000人中有0.2人,约占耳、鼻和喉(ENT)肿瘤的4%。在几乎所有的高发病率地区,病人的年龄分布显示在40至50岁左右有一清楚的单峰。对用于EBV有关疾病诊断的EBV有关基因产物的选择
A.EBV感染初期:产生抗病毒衣壳抗原(VCA)、早期抗原(EA)及EB核心抗原(EBNA)的抗体。
在感染(单核细胞增多症)的急性期或初期,EBV感染B淋巴细胞。由于缺乏免疫反应,致使一些细胞进入溶解周期,并产生一系列病毒抗原,这些病毒抗原在细胞溶解时进入血流。为了抗这些抗原,宿主免疫***将合成特异性抗体(表1)。
表 I
疾病 | VCA: IgG IgM IgA | EN EBNA MA1 | |
正常成人急性感染的成人(初期)慢性感染再激活XLP2NPCBL | + - -++ + -+ + -+ + -+ - -++ - +++ - - | - + ++ - -± ± ±?+ + +± (+) ?+(D) + +++(B) + + |
2XLP代表缺乏免疫力宿主的实例
1通过GP240/200的免疫沉淀确定
(MA:膜抗原)
由于细胞因子阻碍EBV的表达,也许并非所有的B淋巴细胞都能受到完全的溶解性感染。在宿主的余生中,这些细胞潜在地携带着EBV基因组。
B.恢复期:抗EA抗体的消失及抗VCA和EBNA抗体的保留
由于肌体的免疫防御机制而从循环中去掉溶解感染的细胞,恢复期的抗体水平将开始下降。一段时间后,抗EA抗体消失。然而,如上所述,EBV仍在腮腺中产生。病毒颗粒及包括EB在内的细胞内病毒相关抗原将进入唾液并到达口咽部。病毒颗粒在这儿与B淋巴细胞结合并作为抗原存在于体内,从而仍维持着抗VCA抗体的效价。由于EA不能与淋巴细胞结合,它将被蛋白酶降解,因此不能被免疫***用作诱导抗体的抗原。
被EBV潜在感染的循环淋巴细胞含有EBNA。在其生命周期之末,这些细胞将被分解,并将EBNA释放到血流中去。因此将保留有针对此抗原的抗体。
这样,由于腮腺产生EBV及潜在感染的B细胞释放EBNA,恢复期的血清中将含有低水平的抗VCA及抗EBNA的IgG抗体(见前面表I)。
此外,极少数可能进入溶解周期的B淋巴细胞释放的EA,可能是抗原性很差的,故不能产生出本测试***所能检测出的抗体水平。
C.患有继发性NPC个体体内的EBV相关抗体
抗原和抗体分类特异性检测方法的引入,尤其是对于抗EA及VCA两个抗原族的外周IgA抗体的确定,及至少对EA族进行再分类的第一次尝试(EA、D或R;G.Henle,W.Henle和G.Klein,”对EB病毒感染之细胞中早期抗原复合物两个不同组分的确定”,Int.J.Cancer,第8卷第272页(1971年)),显著地改善了检测方法的诊断及预防价值。
在NPC的高发病区,1%的成人中具有EBV衣壳抗原(VCA)的IgA抗体。
这些人中有百分之三经临床检查发现患有NPC,除那些极端的病例外,没有发现抗VCA IgA阴性病例。在抗VCA IgA阳性病例之外,三年随访中,患NPC的每年约1%。如果能使用高度特异性的自动读数的ELISA法来检测,则它将为寻找极端危险的群体,提供极好的“第一步”筛选的定量试验。
EB病毒IgA/VCA抗体的检测有助于NPC的诊断,对早期阶段的检测尤其有价值。例如,在梧州市(中国,NPC高危险地区),通过血清学方法作人群普查,检测NPC发病率的结果表明,I期(42%)和II期(48%)病人的百分数比在门诊病人中检测出的数值(1.7%为I期,30%为II期)高得多。存活机会显然与开始治疗的阶段有关,I期病人的存活率(根据上海肿瘤医院)为93%,II期为75%,更以后阶段的存活率是很低的。因此,通过早期检测和早期治疗可以降低NPC的死亡率。基于本方法,能从40%至70%的NPC病人中检测到EBV初期抗原复合物的IgA抗体。非带瘤群体中实质上不存在这些抗体。对带瘤个体的这种测试,对于决定开始治疗来说是极为重要的,如果能提高其灵敏度,使肿瘤病人的疾病检出率达到近100%,则其价值将会更大。
联系到各类抗体出现的已知顺序,尤其是考虑到早期产生IgM抗体,然后产生IgG抗体,便可将EBV产生的各类抗原应用于EBV相关疾病的鉴别诊断中。
然而,目前可用的检测***主要基于细胞抗原或细胞衍生的抗原,因此其实用范围是极为有限的。
这种限制的第一个原因,即由于含有大量非EBV蛋白,造成所述试验中非特异性本底反应过高。其次,由于必须按照复杂费时的多步过程从无菌细胞培养物中制备带有病毒抗原的细胞,则致使所述试验的费用很高。
因此,本发明所涉及的技术问题即是要提供一个廉价、简洁、可靠而快速的体外鉴别诊断EBV有关疾病的方法,其中,检定了表明EBV感染不同阶段(表I)的各类抗体。
根据本发明,该技术问题的解决,是通过利用一组诊断上有关的抗原性EBV多肽完成的,这些多肽是借助DNA重组技术产生的,并具有EBV相关蛋白的免疫学活性。
本文中的术语“免疫学活性”,是指所述EBV多肽至少含有一个抗原决定基,它能与识别相应的天然EBV相关蛋白抗原决定基的抗体产生交叉反应。
在本发明一个较好的实施方案中,那组在诊断上相关的抗原EBV多肽至少包含一种早期抗原(EA)、一种病毒抗原(VCA)、一种膜抗原(MA)、一种EB核心抗原(EBNA),含有或不含有一种被检测淋巴细胞的膜抗原(LYDMA)。
上述EA的特殊实例是p90、p54、p110及p138。
上述VCA的特殊实例是p143及p150。
上述MA的一个特殊实例是gp250/350。
上述EBNA-I的一个特殊实例是p72。
上述LYDMA的一个特殊实例是P42。
那组用于本发明目的在诊断上相关的抗原性EBV多肽,最好是包含有EBV相关蛋白p54和p138(EA)、p150(VCA)、gp250/350(MA)、及p72(EBNA-I)之免疫学活性的EBV多肽。
在本发明一个较好的实施方案中,用于EBV有关疾病的体外鉴别诊断方法,是放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附法(ELISA)。
用于本发明方法的具有EBV相关蛋白之免疫学活性的在诊断上相关的抗原性EBV多肽,能任意地按照下列步骤纯化至99%的纯度:
a)凝胶渗透层析,其中,细菌溶解产物被悬浮于有去污剂存在的8M尿素中,
b)对a)中分离的阳性部分进行疏水性层析分离,
c)阴离子交换层析,进一步纯化b)中分离的阳性部分。
本纯化过程中的一个主要步骤是将细菌溶解产物悬浮于存在有去污剂的8M尿素中。在悬浮中,抗原性EBV多肽以分离的小颗粒形式存留在溶液中,而杂蛋白却完全被溶解。这样,抗原性EBV多肽就出现在层析柱的排空体积中,而其它蛋白则被层析柱充填物所阻滞。
较好的去污剂是十二烷基磺酸钠(SDS),优选的浓度是0.1%。
根据产品不同,可以按不同的顺序采用步骤a、b和c,例如以b、a、c的顺序进行纯化也是非常有效的。
实行本发明的方法,较好是使用含有下列组分的测试箱:
a)一组在诊断上相关的抗原性EBV多肽,这些多肽由DNA重组技术产生,并具有EBV相关蛋白的免疫学活性,这些EBV相关蛋白以合适的稀释度偶联于ELISA微量滴定孔上或聚苯乙烯小球上。
b)酶标记的,具有类别特异性的抗人IgG、抗人IgM和抗人IgA抗体,
c)可被结合于b)中抗体上的酶所转化的检测试剂及
d)洗涤液及缓冲液。
用于标记类别特异性抗人抗体的酶较好是辣根过氧化物酶。类别特异性的抗人免疫球蛋白抗体是按照已知方法制得的,如用人的免疫球蛋白免疫绵羊、山羊或兔。
如果使用辣根过氧化物酶,检测试剂可以是H2O2及二氨基联苯胺的混合物。
通过将病人血清预吸附于预先连接于微球(如琼脂糖)的蛋白A上,或者预吸附于一种过量产生蛋白A的失活的金黄色葡萄球菌菌株(两者均可由市场上购买到,并均为他人的专利)上,而使该试验的敏感性得以提高。
根据本发明,诊断上相关的抗原性EBV多肽是通过用重组质粒转化宿主生物体而产生的,该重组质粒携带有合成诊断上相关的抗原性EBV多肽的遗传信息,之后,在一营养培养基中、在合适条件下培养转化了的宿主生物体,诱导诊断上相关的抗原性EBV多肽的表达,并从培养基中回收所述EBV多肽。
较好是使用质粒pUCARG1140、pUC8KSH1.2、pUC9MBcE3.2、pUR290CXH580、pURLP1.09或pUC19LP1.9。
作为宿主生物体和菌株的大肠杆菌,如大肠杆菌K12JM109、其它细菌如酵母、其它真菌或动物或人类细胞,被用于生产诊断上相关的抗原性EBV多肽。
使用产生于病人的抗血清——这些病人显示了上述EBV感染的不同阶段——通过对放射性标记病毒蛋白的免疫沉淀,来鉴定适合于本发明方法的诊断上相关的病毒抗原(H.Wolf,M.Motz,R.Kuhbeck,R.Seibl,W.Jilg,G.Bayliss,B.Barrell,E.Golub,Y.Zeng,S.Y.Gu:“通过遗传工程经济地制备具诊断及保护价值的EB病毒蛋白之战略:基于编码病毒基因产品片段的新探索”,见于Williams等人编写的《病毒相关肿瘤》(Virus-associatedcancers),525~539页,IARC科学出版物(牛津大学出版社,纽约,1984))。
用免疫沉淀法鉴定的诊断上相关的病毒蛋白主要有早期抗原(EA)p90、p54、p110及p138、病毒衣壳抗原(VCA)p1p143及p150、膜抗原(MA)gp250/350、EB核抗原-I(EBNA-I)p72、及被检测淋巴细胞的膜抗原(LYDMA)p42。
对编码这些病毒抗原的基因的定位,是通过对杂交选择之mRNA的转译完成的,这些mRNA是利用EBV-DNA片段作为杂交探针,从溶解性感染的B细胞中分离的(R.Seibl,H.Wolf:“通过对诱导的P3HR-1细胞及诱导的Raji细胞的杂交选择RNA之转译对EB病毒蛋白在基因组中定位”,Virol.1985年)141卷第1~13页)。本分析之结果详见图1。
精确的开放式解读代表最终寻求之基因的密码,是利用EB病毒株B95-9的已知序列数据而确定的(R.Bear等人:“B95-8EB病毒基因组的DNA序列及表达”,Natvre,310卷(1984年)第207页)。
确定有关开放解读密码,为DNA片段的分离与克隆提供了基本信息,这些DNA片段适用于表达相应于天然EBV相关蛋白的诊断上相关的抗原性EBV多肽,而这些天然EBV相关蛋白最初在上述免疫沉淀中被用作起始材料。
合适的重组质粒、表达载体及宿主生物体的构建,基本上依据T.Maniatis等人所述方法进行(参见1982年冷泉港实验室《分子克隆,实验室手册》)。
具有EBV相关蛋白p54、p138、p150、gp250/350及p72之免疫学活性的诊断上相关的EBV抗原多肽,可利用重组质粒pUC9MBcE3.2、pUCARG1140、pURCXH580、pURLP1.9或pUC19LP1.9及pUC8KSH1.2转化相应的大肠杆菌K12 JM109而产生。对表达产物的详细说明概括于表II中。
表II
EBV蛋白 | 类别 | 表达质粒 | 表达的总EBV蛋白的氨基酸(%) | 并合的外源氨基酸(aa)或β-半乳糖116千道尔顿) | |
羧基末端 | 氨基末端 | ||||
p138 | 早期蛋白主要的DNA结合蛋白 | pUCARG1140 | 375/1128(33.2%) | 6aa | 5aa |
p72 | 在感染细胞中潜在表达的核心抗原(EBNA) | pUC8KSH1.2 | 191/641(29.7%) | 6aa | - |
p54 | 早期蛋白 | pUC9MBcE3.2 | 404/404(100%) | 14aa | - |
p150 | 病毒衣壳抗 原 | pUR290CXH580 | 185/1381(13.4%) | β-gal+14aa | 17aa |
gp250/350 | 主要膜抗 原 | pURLP1.9 | 634/907(69.9%) | β-gal+4aa | 10aa |
gp250/350 | 主要膜抗 原 | pUC19LP1.9 | 634/907(69.9%) | 9aa | 23aa |
从培养的转化了的宿主细菌中分离的蛋白是破碎细胞而得到的,任意地通过凝胶过滤层析、疏水层析和阴离子交换层析而纯化,纯化的蛋白用于ELISA试验以检测人类IgM、IgG和IgA抗体。此试验的结果可见图9。
附图的简要说明
图1:诊断上相关的EBV抗原在病毒基因组中的定位。
下面的线条代表线性EBV基因组及相应的BamHI片段。
粗线指出已鉴定之病毒抗原的定位。
图2:质粒pUC9MBcE3.2的限制性图谱
pUC9载体的大小为2.7千碱基;编码p54的片段插在BamHI及EcoRI之间。编码区以黑带表示,非编码区以空心带表示。缩写:ori,复制原点,PO,半乳糖苷酶基因的启动子及操纵基因;amp,β-内酰胺酶基因;H,Hind III;P,PstI;S,SalI;B,BamHI;E,EcoRI(不是按比例绘制的)。
图3:质粒pUC8KSH1.2的限制性图谱
pUC8载体的大小为2.7千碱基,编码EBNAI蛋白部分的片段用黑带表示;非编码区以空心带表示。
缩写:Sm,SamI;其它的与图2同(不是按比例绘制)。
图4:质粒pUCARG1140的限制性图谱及其构建程序
a)用SstI(上游20碱基对)及HindIII降解除去pUC600中的5′-PstI位点,然后与PUC12-SstI/HindIII连接。用EcoRI及PstI从此质粒中切下***片段,并连接到pUC8-EcoRI中。将编码五个精氨酸的寡聚核苷酸及两个终止密码,以单链DNA形式***得到的pUC601质粒中,位于3′-PstI位点及HindIII之间(pUCARG601)。在最后一步中,通过PstI消化和连接,***编码p138羧基端第二抗原决定子的540碱基对的PstI片段。由此得到的质粒在读码中包含两个抗原位点并跟着五个精氨酸残基。它被称为pUCARG1140。
b)寡聚精氨酸连接子的核苷酸序列。合成下面的单链DNA,并通过在PstI和HindIII粘性末端间的桥接而***之。
图5:质粒pUR290CXH580的限制性图谱
pUR290载体长度为5.2千碱基,由β-内酰胺酶基因(amp)、复制原点(ori)及带有启动子及操纵基因(PO)的β-半乳糖苷酶基因(LacZ)组成。编码p150之抗原部分的片段(空心带)被***在BamHI及HindIII间的LacZ的羧基端(不是按比例绘制;限制性内切酶识别位点的缩写参见图2)。
图6:质粒pURLP1.9的限制性图谱
载体pUR290长度为5.2千碱基,由β-内酰胺酶基因(AMP)及pBR322的复制原点组成。β-半乳糖苷酶基因用粗线标明,各自的启动子-操纵基因区域用PO标示。限制性内切酶缩写如下:BamHI(B),ClaI(C),EcoRI(E),HindIII(H),PstI(P),及SolI(S)。
BamL片段中的1.9千碱基PstI亚片段被***PstI位点中,用空心带标明(不是按比例绘制)。
图7:质粒pUC19LP1.9的限制性图谱
pUC8的大小为2.7千碱基。LacUV5β-半乳糖苷酶启动子和操纵子(PO)的3′端克隆区域含有EcoRI(E)、BamHI(B)、SalI(S)、PstI(P)和HindIII(H)位点。BamL片段中的1.9千碱基PstI亚片段被***PstI位点中,用空心带标明。密码解读与pUC8中的LacZ的编码部分方向相同(用粗线标明)(不是按比例绘制)。
图8:EBV相关疾病的鉴别诊断
用四种不同的储集血清(分别得自EBV阴性、急性EBV感染、既往EBV感染及鼻咽癌病人)进行免疫染色后得到的EBV相关的细菌表达产物的Western印迹,以及对EBV特异性IgM、IgG及IgA抗体的检测。
1、作为阴性对照的pUC8;2、由pUCARG1140编码的p138相关的表达产物;3、由pUC8KSM1.2编码的EBNAI,由pUC9MBcE3.2编码的p54;5、由pURLP1.9编码的P150;7、由pUCLP1.9编码的gp350(MA)。
图9:EBV多肽的纯化
用取自不同纯化步骤的pUCARG1140编码的多肽的探针作银染色品SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。M泳道:分子量标准:
第1泳道:经过分子筛后的阳性部分;
第2泳道:疏水层析之后;
第3泳道:阴离子交换层析之后。
标明为SDS伪迹的三条带也能见于没有探针的泳道,它们是由SDS杂质导致的。
下列实施例进一步说明本发明。
实施例1
相应于EBV蛋白p54的一个EBV多肽的产生
根据B.Bear等人(前述)的序列分析资料,在适于编码EBV蛋白p54的EBV B95-8的BamHI-M片段中,有一开放读码。该开放式解读密码起于79,899位置并止于81,110位置;根据Bear等人的资料,读码BMRF1编码一个43,300道尔顿的蛋白质(计算得来)。
核苷酸序列及相应的氨基酸序列,可从任何核苷酸序列数据库中获得,例如从EMBL核苷酸序列数据库——即西德海登堡6900,邮政信箱102209号,欧洲分子生物学实验室得到。
产生EBV B95-8病毒株的细胞株保藏在玛丽兰州洛克菲尔的美国典型培养物保藏中心,其登记号为ATCC CLR1612。
从大肠杆菌菌株K12 GM169中分离出pBR322-BamM质粒(J.Skare等人:“EB病毒B95-8病毒株转化的DNA的BamHI核酸内切酶片段之克隆与定位”,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77卷(1980年)第3860页)的50微克DNA,用50单位EcoRI(Boohringer)于37℃降解2小时,然后用50单位BclI在50℃降解2小时,总反应体积为150微升,其中含有100mM NaCl,10mMMgCl2,6mM巯基乙醇,6mM Tris-HCl,pH7.9。然后加入30微升终止缓冲液(10mM Tris-HCl,50mMEDTA,60%蔗糖,1%溴酚蓝,pH7.5),将混合物加于在醋酸盐缓冲液中的(0.04M Tris醋酸盐,2mM EDTA,pH7.6)预制备的1%琼脂糖凝胶上,于4℃用40V电压电泳16小时。用HindIII降解的λ噬菌体DNA(Boehringer)作为片段大小的标记物。在室温下用EB(溴化3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓,0.5微克/毫升)将Tris醋酸盐缓冲液中的凝胶染色1小时后,在紫外光下观察DNA,切下相应于3.2千碱基的带。
此带中的DNA,通过将琼脂糖凝胶片放入透析袋中,加入3倍体积的Tris醋酸盐缓冲液并电泳4小时(100V,40℃)而洗脱。进行进一步纯化是通过Elutip D层析柱(Schleicher &Schuell),按照制造者推荐的操作步骤进行层析而完成的,用异戊醇抽提所含的EB,加入2.5倍体积的乙醇并在-20℃下保温过夜而沉淀出DNA。在Sorvall SS 35型转子中离心收集DNA(17,000rpm,20分钟),并用70%乙醇洗涤。将冻干后的DNA溶于15微升TE缓冲液(10mMTris-HCl,1mM EDTA,pH7.5)中。
分离之片段的DNA浓度,是通过将其1微升与100毫微克和1微克其它DNA(如质粒pUC9的DNA)走平行电泳而估计的。
载体pUC9(J.Messing,J.Vieira,Gene,19卷(1982年)第269页)的BamHI/EcoRI双重降解DNA按前述制备。该载体保藏在西德格廷根德国微生物收集中心(DSM),登记号为DSM 3421。
之后将纯化的BclI/EcoRI片段***切断的载体中(BclI和BamHI产生相同的粘性末端:-GATC-)。为此目的,将30毫微克DNA片段和100毫微克pUC9 DNA,在总体积为20微升含有1单位T4-DNA连接酶的连接酶缓冲液(10mMTris,10mM MgCl2,6mM巯基乙醇,0.6mMATP,pH7.5)中完成连接反应。14℃下反应20小时后,加入80微升TE缓冲液和200微升感受态大肠杆菌K12 JM109细胞(大肠杆菌K12 JM109保藏于DSM,登记号为DSM3423)。
转化是按照氯化钙方法完成的(M.Mandel,A.Higa:“依赖钙的细菌噬菌体DNA感染”,J.Mol.Biol.53卷(1970年)第154页)。然后,将细胞与1.5毫升L-培养基(5克酵母提取物,10克胰蛋白胨,5克NaCl)混合并在37℃下保温1.5小时,最后铺在添加有50微克/毫升氨苄青霉素(Sigma公司出品)和40微克/毫升X-半乳糖(Boehringer公司出品)的L-培养基琼脂平板上(1.5%)。在此保温期间,携带重连接之pUC9分子的细菌产生蓝色菌落,携带重组质粒的细菌产生白色菌落。
为鉴别载有所需重组质粒的克隆,检出十二个白色菌落并在L-培养基中于37℃下培养过夜。将根据H.C.Birnboim和J.Doly的方法(“筛选重组质粒DNA的快速碱性提取方法”,Nucl.Acids Res.7卷(1979年)第1513页)获得的DNA制备物的等分试样,用HindIII降解并在琼脂糖凝胶上按前述方法进行电泳分离。
EBV片段的整合及定位,是根据凝胶中出现相当于长约2.2千碱基和3.6千碱基DNA片段的带而确定的。
所获重组质粒之一被定名为pUC9MBcE3.2(见图2)。它在适当的读码区携带有联系着LacUV5启动子的***片段,它被用以表达整个p54蛋白。由pUC9MBcE3.2编码的融合蛋白,包含有β-半乳糖苷酶氨基末端的14个氨基酸以及由pUC9编码的多聚连接物序列。在羧基端则使用得自EBV的终止密码子(见表II)。
通过用IPTG诱导lac UV5-启动子及在SDS-PAGE上分离产生的蛋白,测试pUC9MBcE3.2转化的大肠杆菌K12JM109产生EBV多肽的能力。将蛋白转移至硝化纤维素膜上,用高效价NPC血清及过氧化物酶结合的第二抗IgG抗体进行免疫染色后,能清楚地检测出一个新的EBV多肽的特异谱带。下面更详细地描述实验步骤。在含有所述转化之大肠杆菌K12 JM109细菌的预先培养群落的培养基中,加入光密度为0.9的乳糖类似物异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG;Sigma公司产品)(最终浓度:1mM)。在37℃下进一步保温1.5小时后,取1.5毫升的培养物作离心分离。将细菌再悬浮在200微升沸腾的混合液(2%SDS,5%巯基乙醇,3%蔗糖,50mM Tris-HCl,pH7.0)中,并于100℃下加热10分钟。取20微升所得蛋白提取物在12.5%聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离。将电泳分离的蛋白转移至硝化纤维素滤膜上,即制得一个“Western印迹”(J.Renart,J.Reiser,R.G.Shark:“从凝胶至重氮苄基-甲基滤纸的蛋白转移及抗血清检测”,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76卷(1979年)第3116页,S.Modrow,H.Wolf:“松鼠猴属疱疹病毒及蛛猴属疱疹病毒诱导蛋白的特征确定”,摘于《兽医学中潜伏的疱疹感染》(LatentHerpes Infections in VeterinaryMedicine)Martinus Nijnoff出版,第105页(1984年))。
Western印迹是在Western印迹缓冲液中(72克甘氨酸,15克Tris,1升甲醇,加水至5升)0.8A的电流强度处理3小时而制得。然后,硝化纤维素用Cohen缓冲液(0.1%Ficoll 400,1%聚乙烯吡咯烷酮,1.6%BSA,0.1%NP40,0.05%白明胶,0.17M H3BO3,28mMNaOH,150mM NaCl,6mM NaN3,pH8.2)饱和,并与1∶50稀释的NPC病人的高效价EBV特异生血清保温过夜。血清预先用细菌蛋白提取物(1毫升/109个大肠杆菌细胞)吸收过,以降低细菌蛋白导致的本底反应。在之后,在白明胶缓冲液(50mM Tris-HCl,5mM EDTA,150mMNaCl,0.25%白明胶,0.5%Triton(***),0.2%SDS,pH7.5)中洗涤硝化纤维素滤膜5小时,以去掉未结合的免疫球蛋白。为观察EBV特异蛋白的印迹,加入免抗人的IgG、IgA或IgM抗体,这些抗体连有过氧化物酶并用TN缓冲液(154mM NaCl,10mM Tris,pH7.4)以1∶200稀释过。室温下作用2小时后,用上述白明胶缓冲液洗涤,去掉未结合的免抗体。最后,在100毫升50mM Tris-HCl(pH7.5)中加入50毫克联苯二胺(Sigma公司出品)和40微升水,在室温下保温10分钟,以完成过氧化物酶反应。从此实验结果,可鉴别相应于pUC9MBcF3.2重组质粒编码的EBV多肽的带。
实施例2
一种相当于EBV蛋白p72的EBV多肽的产生
与p72之一部分(EBNAI;解读密码BKRFI)相关的多肽的产生,与实施例1中所述的方法基本相同。编码p72之羧基末端部分的DNA片段,用SamI和HindIII从BamHI-K片段(见前面J.Skare等人)上切下。所获片段起于BamHI-K片段的1844位置并止于该片段的3045位置。然后,将它连接到载体pUC8(保藏于DSM;登记号为DSM3420)用SamI/HindIII切开的DNA中去。
所获重组载体称为pUC8KSH1.2。它的限制性图谱见图3。
对含有重组载体pUC8KSH1.2的转化体性质,依据实施例1中所述的Western印迹方法进行分析。按照这一方法,可以从印迹中见到相应于p72多肽的另一条带。
实施例3
一个相应于EBV蛋白p138的EBV多肽的产生
p138多肽的产生,基本上与实施例1中所述方法相同。
p138的读码包含于B95-8(见前述Bear等人)的BamHI-A片段中。这个读码被称为BALF-2,它从EBV基因组的164,770位置伸展到161,387位置。
如Wolf等人(见前面)所述,用计算机分析来检查读码中的抗原区域。根据这样的分析,找到了p138蛋白的两个抗原区域。它们分别由BamHI-A片段的p540及p600片段编码(见Wolf等人,文献如上)。
用PstI将p600片段从BamHI-A片段上切下,并连接到PstI切开的载体pUC8的DNA中去。得到的重组质粒被称为pUCP600,并用于转化大肠杆菌K12 JM109。pUCP600的限制性图谱见图4。
由pUCP600编码的融合蛋白是一种稳定的表达产物,它因此被用作为融合配体,以稳定含有p138蛋白的第二抗原位点的表达产物。
含有p138蛋白之两个抗原区域遗传信息的质粒,即重组质粒pUCARG1140。它是按照下述方法构建的。
用SstI和HindIII降解质粒,切掉pUCP600的5′-PstI位点(该SstI位点距第一个PstI位点3′端大约20个碱基对)。p138有关的SstI-HindIII片段被***用SstI/HindIII切断的pUC12(保藏于DSM,登记号为DSM3422)(J.Messing,“用于克隆的新的M13载体”,见于《酶学方法》(Methods of Enzymology),101卷C部分,20~78页,R.Wu,L.Groβmann及K.Moldoave编辑,科学出版社,纽约,1983年)中。然后,用EcoRI和PstI降解所获重组质粒。获得的600碱基对的片段被***质粒pUC8中。5′-PstI位点现在被SstI位点所取代,这样,在***片段的3′端和5′端重新构建了读码。
如图4所示,根据已知方法得到的一个合成的寡聚核苷酸,被***到EBV编码序列3′端的PstI及HindIII位点之间,它包括五个精氨酸的读码和2个终止密码子。所得到的质粒pUCARG601编码p138的p600区域,其羧基末端融合到5个精氨酸残基中。
在最后一步中,将按照前面Wolf等人所述方法而得到的编码p138之p540区域的BamHI-A片段中的PstI片段,连接到用PstI切开的重组质粒pUCARG601中,该重组质粒编码p138的p600区域。得到的重组质粒pUCARG1140编码一个约4,300道尔顿的稳定蛋白质,它包括融合在读码中的p138的两个抗原位点。在这个融合蛋白中,p600区域蛋白使p540区域蛋白得以稳定。表达产物之羧基末端的精氨酸残基,可用于按照Sassenfeld和Brewer所述方法(“一种为纯化重组蛋白而设计的融合多肽”,Bio/Technology,第2卷(1984年)第76页)来纯化所获的融合蛋白。
实施例4
一种相应于EBV p150蛋白的EBV多肽的产生
p150多肽的产生方法基本上与实施例1中所述方法相同。编码p150(BcLF1)的开放读码位于B95-8的BamHI-D和BamHI-C片段中。它始于137,466位置并止于133,324位置(Baer等人,文献如前述)。
按照实施例3所述方法,检查相应于p150之开放读码的氨基酸序列的抗原位点。氨基末端区域,即从第50个氨基酸至第150个氨基酸区域,可能编码一个抗原位点。这是用BamHI降解携有所需区域(Ch4A EB69-79)的Charon噬菌体DNA而得到的。
所得到的1.24碱基片段被***pUC12的BamHI位点。从得到的带有合适定向之***片段的质粒中,用XhoI/SalI切下580碱基对的片段。SalI位点是从pUC12连接物中产生的,XhoI位点位于p150起点上游33碱基对处。这个片段被***用SalI降解的pUC8中(SalI和XhoI具有相同的粘性末端序列)。筛选所得到的克隆,直到含有紧靠BamHI位点的p150起始密码子为止。从一个合适的克隆中,用BamHI和HindIII切下p150的编码区域,并克隆到用BamHI和HindIII降解的pUR290里面去。质粒pUR290保藏于DSM,登记号为DSM3417。
所获重组质粒称为pUR290CXH580(见图5)。
β-半乳糖苷酶:p150融合蛋白的表达,由含有新构建质粒的转化的大肠杆菌K12 JM109细菌进行,依实施例1中所述的Western印迹技术得以证实。
实施例5
一个相应于EBV gp250/350蛋白的EBV多肽的产生
相应于gp250/350的开放读码位于B95-8的BamHI-L片段中。它始于92,153位置并止于89,433位置(见前,Baer等人)。用PstI切下一个1.9千碱基的片段(开放读码的697至2594位置),将它连接进用PstI线形化的pUR290和pUC19(保藏于DSM,登记号为DSM3425)中。
所获重组质粒分别称为pURLP1.9和pUC19LP1.9(见图6和7)。
转化的大肠杆菌菌株K12 JM109对编码的融合蛋白的表达,根据实施例1所述的Westen印迹技术确定。
实施例6
将表达的诊断上相关的EBV抗原用于诊断目的
含有质粒pUCARG1140、pUC8KSH1.2、pUC9MBcE3.2、pUR290CXH580及pURLP1.9或pUC19LP1.9的大肠杆菌K12 JM109转化体,分别用于产生具有EBV蛋白p138、p72、p54、p150及gp250/350免疫学活性的多肽。
按实施例1所述的方法,培养相应的大肠杆菌转化体和含有pUC8质粒的转化体,加入IPTG以诱发培养物中的细胞表达EBV多肽,进一步培养后将细胞破碎。所获蛋白质物质都用17.5%SDS-PAGE(见实施例1)进行分离。然后,根据实施例1所述的Western印迹方法,将SDS-PAGE分离的蛋白质材料转移至硝化纤维素滤膜上。这样可制得一组12个同一的硝化纤维素滤膜印迹(见图8)。从pUC8转化体分离得到的蛋白质材料可作为一组免疫印迹的阴性对照。
一组3个滤膜,每组分别与下列血清储备品保温:EBV阴性血清、患急性EBV感染病人的血清、EBV感染恢复期病人的血清以及NPC病人的血清。保温程序如实施例1所述。
洗涤四组不同的滤膜后,利用具有类别特异性的过氧化物酶连接的抗人Ig-抗体,检测出与具有EBV有关抗原免疫学活性之多肽结合的抗体。这样,在四组每组三个的每一个滤膜中,均可分别检测出存在于血清储备品中的IgM、IgG和IgA抗体。
本实验结果示于图8,并可以概括如下:
EBV阴性:
检测不出识别诊断上相关的抗原性EBV多肽的IgM、IgG和IgA抗体。
急性EBV感染:
检测到抗p54(EA)、p150(VCA)及gp250/350(MA)的IgM抗体。
还检测出抗p54(EA)、gp250/350(MA;次要反应)的IgG抗体。
最后还检测出了抗p54(EA;次要反应)的IgA抗体。
EBV感染恢复期:
检测出了抗p150(VCA)及gp250/350(MA;次要反应)的IgM抗体。
进一步还检测出了抗p150(VCA)、gp250/350(MA),特别是抗标志潜伏感染的p72(EBNA-1)的IgG抗体。
没有检测出特异的IgA抗体。
NPC:
没有检测出抗诊断上相关的抗原性EBV多肽的特异性IgM抗体。
然而,检测出了高效价的抗p138(EA)、p72(EBNA-I)、p54(EA)、p150(VCA)和gp250/350(MA)的IgG抗体。
此外,还检测出了抗所有EBV抗原的IgA抗体。尤其是,检测出了高效价的抗早期抗原p138和p54的IgA抗体。
总结一下这个血清学试验的结果,即,本发明的体外鉴别诊断能够显示出EBV感染之重要阶段的特征,其中,使用了本发明的诊断上相关的抗原性EBV多肽,这些抗原多肽通过DNA重组技术产生,并具有EBV相关蛋白的免疫学活性。
从实施例6中可以确定,在纯化分别在实施例1、2和7中给出的蛋白后,必须在哪一个抗体类别特异性测试中,使用哪一个EBV多肽。优先使用的不是Western印迹,而是直接或通过抗体与ELISA小井或聚苯乙烯小球物连接的纯化抗原。必需的纯化程度依赖于期望的测试结合,并能从实施例6的结果中估计出来。
实施例7
pUCARG1140编码的表达产物的纯化
根据实施例1和6所述方法,制备pUCARG1140编码的重组体蛋白的粗提物。此粗提物的进一步纯化按下述3个分开的步骤进行。
首先,进行凝胶过滤层析。为此目的,将细菌溶解产物(粗提物)再悬浮在8M尿素、20mM Tris(pH7.5)、0.1%SDS中。然后,对所获悬浮液进行Sepharose 2B分子筛层析。对洗脱部分作SDS-PAGE分析(见图9第1泳道)。
然后,进行疏水层析。为此目的,将凝胶过滤层析中分离的阳性部分对水透析。所获溶液的体积减少,剩余物再悬浮在5mM磷酸缓冲液(pH7.0,含50mM NaCl)中。然后,进行苯基琼脂糖层析,用水-乙醇梯度作为洗脱液。通过SDS-PAGE确定阳性部分(见图9第2泳道)。EBV多肽在大约20%乙醇浓度时被洗脱。
最后,进行阴离子交换层析。合并疏水层析中得到的阳性部分并减小其体积。剩余物溶入0.1M Tris/HCl(pH8.5)、1M NaCl溶液中。对所得溶液进行DEAE-Tris-丙烯酰基层析,用pH梯度洗脱结合在柱上的物质。pH梯度扩展到0.1MNaOH,pH13。洗脱部分在SDS-PAGE中分析(见图9第3泳道)。EBV多肽在大约pH8.8至9.0时从柱中洗脱。
从图9中可以看出,含在粗提物中的EBV多肽被纯化至大约99%。其余杂质是来自于宿主细菌。
总而言之,本发明的方法中使用了下列质粒、宿主生物体和细胞系:微生物 保藏处 保藏号B95.8 ATCC CRL1612
中国大肠杆菌 DSM 3423U12JM109大肠杆菌GM 169pUC9 DSM 3421pUC8 DSM 3422pUC12 DSM 3422pUR290 DSM 3417pUC19 DSM 3425
Claims (11)
1.一种测试药盒,它包括:
(a)含有以下成分的一组诊断上相关的抗原性EBV多肽:
(aa)由重组质粒pUCARG1140的***片段编码的呈现EBVP138相关抗原决定基的多肽,
(ab)由重组质粒pUC8KSH1.2的***片段编码的呈现EBV P72相关抗原决定基的多肽,
(ac)由重组质粒pUC9MBCE3.2的***片段编码的呈现EBVP54相关抗原决定基的多肽,
(ad)由重组质粒pUR290CXH580的***片段编码的呈现EBVP150相关抗原决定基的多肽,和/或
(ae)一种呈现EBV多肽gp250/350的抗原决定基的融合蛋白,它由重组质粒pURLP1.9或pUC19LP1.9编码。
2.根据权利要求1所述的测试药盒,它另外还含有:
(b)标记的,具有类别特异性的抗人IgG、抗人IgM和抗人IgA抗体:
(c)可被结合于b)中抗体上的酶所转化的检测试剂,和/或
(d)洗涤液及缓冲液。
3.根据权利要求1或2所说的测试药盒,其中所说的EBV多肽被偶联于ELISA微量滴定盘工聚苯乙烯小球。
4.根据权利要求1或2所说的测试药盒,其中所说的EBV多肽对应于一种不同于权利要求(1)的EBV血清型。
5.产生如权利要求1和2中任一项所述的测试药盒所含有的抗原性EBV多肽的方法,其中用一种权利要求1所述的转化
在适宜的条件下于营养培养基中培养该转化的宿主生物,然后从培养物中回收所说的EBV多肽。
6.如权利要求5所述的方法,其中所说的宿主生物为大肠杆菌,另一种细菌,酵母,另一种真菌,动物细胞或人细胞。
7.如权利要求5或6所述的方法,其中宿主生物是大肠杆菌。
8.如权利要求5或6所述的方法,其特征在于:当从培养物中回收出EBV多肽时,通过下列步骤将其纯化至99%纯度:
(a)凝胶过滤层板,其中将细菌溶解产物浮于含有去污剂的8M尿素中,
(b)(a)中分离的阳性部分作疏水层析,和
(c)通过阴离子交换层析对(b)中分离的阳性部分作进一步纯化。
9.使用权利要求1或2的测试药盒对EBV相关疾病进行不同的体外诊断。
10.如权利要求9所述的用途,其特征在于体外诊断是以放射免疫检测法(RIA)或酶联免疫吸附检测法的方式进行。
11.如权利要求9或10所述的用途,其特征在于,在测定IgA和IgM抗体之前,待测的病人血清用金黄色葡萄球菌蛋白A预先吸收,以去掉血清中所含的IgG。
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