CN105198851A - 一种黑莓花青素的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黑莓花青素的纯化方法，包括树脂预处理、黑莓花青素粗提物纯化两个步骤，能够实现黑莓花青素的高效纯化，所得黑莓花青素的纯度高。本发明的纯化方法选用聚酰胺树脂作为吸附剂，其具有大的比表面积和大粒度，吸附和解吸能力高、成本低、容易再生且制备方法简单等特性。本发明通过对黑莓花青素静态和动态的吸附和解吸过程的研究，优化了纯化条件，确立了黑莓花青素的初始浓度、吸附液的pH值、洗脱液的pH值以及乙醇浓度的最佳值，使得黑莓花青素的吸附率和洗脱率均较高。本发明的方法可以实现黑莓花青素省时、高效的纯化，有利于节省纯化时间，节约成本。

Description

一种黑莓花青素的纯化方法

技术领域

本发明涉及一种黑莓花青素的纯化方法，属于植物提取纯化技术领域。

背景技术

从植物中萃取花青素的方法是一种非选择性的提取方法，除了色素外，会产生大量的其他化合物，如糖类、糖醇类、有机酸、氨基酸、蛋白质等，将影响色素的稳定性。因此,对黑莓提取物中的花青素进行纯化是非常必要的，可以有效提升色素稳定性，促进其在食品加工中的应用。现有技术中，纯化花青素的方法主要为CO₂法，柱层析法，吸附剂法以及双水相萃取技术。

吸附是一种简单有效的纯化生物活性成分的方法。最近被用于从天然植物中纯化有效成分(球松树、类黄酮和多酚等)的吸附剂有大孔吸附树脂、阳离子交换树脂和聚酰胺树脂。其中,聚酰胺树脂是一种具有大的比表面积和大粒度的树脂。由于聚酰胺树脂吸附和解吸能力高、成本低、容易再生,制备方法简单，因而引起了广泛的关注。聚酰胺树脂可以从复杂的混合物中去除大部分的杂质，从而提高待纯化化学物质的含量,被广泛用于从天然植物中分离有效成分。聚酰胺树脂对于黄酮有特殊的选择性，因此在植物提取产业中，可作为黄酮类化合物分离提取的优良吸附剂。然而,目前尚未有用聚酰胺树脂分离纯化黑莓花青素的相关报道。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种黑莓花青素的纯化方法，能够对黑莓花青素进行高效纯化。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种黑莓花青素的纯化方法，包括以下步骤：(1)树脂预处理：将聚酰胺树脂先用乙醇煮沸，再用蒸馏水洗净，备用；

(2)黑莓花青素粗提物的纯化：将黑莓花青素粗提物经浓缩挥发乙醇后加水稀释，调节pH值后，上聚酰胺树脂柱，先用水洗，再用乙醇洗脱，浓缩得浸膏。

进一步地，前述纯化方法，包括以下步骤：

(1)树脂预处理：将聚酰胺树脂先用60％～95％乙醇煮沸3～5小时，再用蒸馏水洗净至无醇味，备用；

(2)黑莓花青素粗提物的纯化：将黑莓花青素粗提物经浓缩挥发乙醇后加水稀释至0.6～2.99mg·mL^-1，用盐酸调节pH＝1～5后，以2～10BV/h的速度上柱1～7BV，随后用水洗3BV(洗至几乎没有糖)，再用pH值为1～5的40％～100％乙醇以2～10BV/h的速度洗脱0.5～5BV，浓缩得浸膏。

优选地，前述纯化方法，包括以下步骤：

(1)树脂预处理：将聚酰胺树脂先用95％乙醇煮沸4小时，再用蒸馏水洗净至无醇味，备用；

(2)黑莓花青素粗提物的纯化：将黑莓花青素粗提物经浓缩挥发乙醇后加水稀释至0.75mg·mL^-1，用盐酸调节pH＝1后，以5BV/h的速度上柱5BV，随后用水洗3BV(洗至几乎没有糖)，再用pH值为3的80％乙醇以5BV/h的速度洗脱3.5BV，减压蒸馏浓缩得浸膏。

前述纯化方法中，所述黑莓花青素粗提物的制备方法为：将黑莓进行匀浆，得黑莓浆备用；加入水或任意浓度的乙醇，采用微波辅助萃取，得提取液；提取液离心，收集上清液，即得。

进一步地，前述纯化方法中，所述黑莓花青素粗提物的制备方法为：将黑莓进行匀浆，得黑莓浆备用；按5～25mL/1g黑莓浆的比例加入水或任意浓度的乙醇，采用微波辅助萃取，微波功率100～700w，微波处理时间1～9min，得提取液；提取液离心，收集上清液，即得。

优选地，前述纯化方法中，所述黑莓花青素粗提物的制备方法为：将黑莓进行匀浆，得黑莓浆备用；按25mL/1g黑莓浆的比例加入浓度为52％的乙醇，采用微波辅助萃取，微波功率469w，微波处理时间4min，得提取液；提取液离心，收集上清液，即得。

前述纯化方法中，提取液离心为提取液在3500r/min条件下离心3～8分钟。

优选地，前述纯化方法中，提取液离心为提取液在3500r/min条件下离心5分钟。

前述纯化方法中，聚酰胺树脂为60～100目。

为了确保本发明黑莓花青素纯化方法科学、合理，发明人进行了相应的实验研究和筛选，才得以确定本发明的技术方案。具体实验内容如下：

一、实验材料、药品与仪器

黑莓由北极熊农业生态有限公司羊艾黑莓种植园提供，主要试剂和仪器信息见表1和表2，所用其他试剂均为分析纯。

表1主要实验试剂信息

表2仪器信息

二、实验以及结论

1、纯化实验

1.1纯化实验过程：

(1)树脂预处理：

①离子交换树脂预处理

离子交换树脂用水浸泡12h,接着用水洗至无泡沫无褐色,然后进行湿法装柱。用5％HCl溶液以2BV/h的流速冲洗树脂柱,2h后再以去离子水洗至pH＝5,然后以同样的流速,用5％NaOH溶液冲洗树脂柱,2h后再以去离子水洗至pH＝10,接着以2BV/h的流速,用5％HCl溶液冲洗树脂柱,2h后再以去离子水洗至pH＝4～5,备用。

②聚酰胺树脂预处理

将聚酰胺树脂先用60％～95％乙醇煮沸3～5小时，再用蒸馏水洗净至无醇味，备用；

(2)黑莓花青素粗提物制备：

将黑莓进行匀浆，得黑莓浆备用；按5～25mL/1g黑莓浆的比例加入水或任意浓度的乙醇，采用微波辅助萃取，微波功率100～700w，微波处理时间1～9min，得提取液；提取液离心，收集上清液，即得；

所述黑莓花青素粗提物溶液为黑莓花青素粗提物经浓缩挥发乙醇后加水稀释得到的。

(3)黑莓花青素粗提物的纯化：

将黑莓花青素粗提物经浓缩挥发乙醇后加水稀释至0.6～2.99mg·mL^-1，用盐酸调节pH＝1～5后，以2～10BV/h的速度上柱1～7BV，随后用水洗3BV(洗至几乎没有糖)，再用pH值为1～5的40％～100％乙醇以2～10BV/h的速度洗脱0.5～5BV，浓缩得浸膏。

2、黑莓花青素含量测定

2.1黑莓花青素含量测定方法：是以氯化矢车菊素-3-O-葡萄糖为标准品进行分析，测定黑莓花青素组合物中的花青素含量。

2.2标准曲线的绘制

精密称定3.34mg花青素标准品，用蒸馏水溶解，于10mL容量瓶中定容，作为母液。将母液分别稀释成浓度为33.4、66.8、100.2、133.6、167、200.4、233.8、267.2μg/mL，分别取1.0mL不同浓度的花青素标准品(空白对照以50％乙醇水代替)置于具塞试管中，加入5.00mL的1.00％的盐酸甲醇溶液，充分震荡，50℃水浴10min，冷却至室温，测定其在530nm处的吸光度值(A530)。以花青素标准品浓度为横坐标(X轴)，吸光度为纵坐标(Y轴)，绘制标准曲线。标准曲线方程为：Y＝0.0033X-0.0092，相关系数γ＝0.9989，即有效成分浓度范围在33.4μg·mL^-1～267.2μg·mL^-1内有良好的线性关系。标准曲线如图1所示。

2.3黑莓花青素的含量测定

取适量黑莓花青素溶液(由纯化所得浸膏溶解得到)，稀释到合适浓度，按照2.2“标准曲线的绘制”方法进行显色测定，用标准曲线确定其浓度(c)，进而确定黑莓花青素的含量。具体计算公式如式(1)所示：

注：C：黑莓花青素的质量浓度(μg·mL^-1)；V：溶液体积(mL)；N：稀释倍数；M：样品的质量(g)。

3、静态吸附和解吸

3.1静态吸附：

黑莓花青素在树脂上的静态吸附过程是通过以下方式进行：所有的静态吸附实验用成批处理模式在25℃下进行。将5mL的吸附剂(已经预处理的树脂)和50mL的稀释适当倍数的黑莓花青素粗提物溶液分别加入100mL锥形瓶中，置恒温振荡器上，于25℃、150～200r/min条件下振荡24h。经静态吸附后，剩余溶液过滤后测吸光度。通过式(2)计算树脂在平衡时的吸附能力(qe-mg·mL^-1的树脂)。

$q_e=\frac{(C_0-C_e)V_i}{V_a}---\left(2\right)$

注：q_e是静态吸附能力(mg·mL^-1的树脂)；C₀和C_e分别是花青素的初始浓度和平衡浓度(mg·mL^-1)。V_i和V_a分别是初始样品溶液的量和初始吸附剂的量。

3.2静态解吸：

静态解吸过程是通过以下方式进行:在确保达到吸附平衡后,树脂是由去离子水清洗,然后用50mL乙醇(0.1％盐酸，v/v)洗脱。洗脱下来的溶液测吸光度。通过式(3)和式(4)计算静态解吸平衡时的静态解吸能力和静态解吸率(D,％)

$q_d=\frac{C_d{V}_d}{V_a}---\left(3\right)$

$D=\frac{C_d{V}_d}{(C_0-C_e)V_i}\×100\%---\left(4\right)$

吸附率按照式(9)计算得到

$A=\frac{(Ao-A_e)V_i}{A_o{V}_i}\×100\%---\left(9\right)$

注：q_d是静态解吸能力(mg·mL^-1的树脂)，A_o和A_e分别是黑莓花青素的初始吸光度和平衡吸光度；V_i是初始样品溶液的量，V_d是洗脱液的体积(mL)。

用不同目数聚酰胺树脂进行静态吸附和静态解吸实验。结果如图2所示。从图2中可知,60～100目和100～200目聚酰胺树脂相对于其他目数的聚酰胺树脂表现出更高的静态吸附和静态解吸能力。这是由于其拥有大的表面积。黑莓花青素的回收率用不同目数的聚酰胺树脂进行实验，结果如图3所示。从图3中可以看出,60～100目的聚酰胺树脂对应花青素的回收率要高于其他目数的聚酰胺树脂。60～100目聚酰胺树脂的静态吸附和静态解吸能力分别为4.41和3.29mg·mL^-1的树脂。由于100～200目聚酰胺树脂的分离速度远小于60～100目聚酰胺树脂。因此，此后的实验使用60～100目聚酰胺树脂作为吸附剂。

4、吸附等温线

吸附剂的平衡吸附等温线的实验是通过以下方式进行：用5mL的吸附剂和50mL的不同浓度的黑莓花青素粗提物溶液分别加入100mL锥形瓶中，置于恒温振荡器上，分别在5℃、15℃、25℃条件下振荡60min。用分光光度法分别测定不同温度下初始浓度和平衡浓度。通过朗格缪尔和弗罗因德利克模型来描述平衡吸附。朗格缪尔等温线广泛用于单层吸附,经验方程如式(5)所示：

$q_e=\frac{q_m{C}_e}{K_L+C_e}---\left(5\right)$

注：K_L和q_m分别是吸附平衡常数和经验常数，可以通过绘制C_e/q_e和C_e的线性图和相应的回归系数(γ)值得到。

弗罗因德利克模型广泛用于非理想吸附,经验方程如式(6)所示：

$q_e=K_F{C}_e^{1/n}---\left(6\right)$

注：K_F是弗罗因德利克常数(吸附能力)；1/n(吸附强度)是一个经验常数，可以通过绘制logq_e和logC_e的线性图和相应的回归系数(γ)值获得。

黑莓花青素在液相和固相介质之间的分布规律是由测量吸附过程中达到平衡所需的时间来确定的,通过朗格缪尔和弗罗因德利克等温线进行表述。分别在15℃、25℃、35℃下进行分析。朗格缪尔和弗罗因德利克方程的常数分别用图4和图5中的斜率和截距计算，结果如表3所示。朗格缪尔和弗罗因德利克等温线是研究吸附平衡数据中最常见的模型。弗罗因德利克模型假定树脂的表面在本质上是多相的，其特点是在不同的能量点吸附。它描述了一个单分子层以及多分子层的吸附行为。朗格缪尔模型描述了一个带着尽量相同吸附点的单层吸附以及被吸附的分子相互之间没有交互的吸附行为。表3中的相关系数表明弗罗因德利克模型更适合描述平衡吸附。弗罗因德利克模型的吸附强度值(n)在0<n<10范围内,这表明黑莓花青素的吸附是良好的。可以从表中看到,K_F随温度的降低而增加,表明黑莓花青素的吸附随着温度上升而减少。热敏感花青素在更高的温度下降解可以解释这些结果。此外,弗罗因德利克模型的相关系数远高于朗格缪尔模型。因此可以推断,黑莓花青素的吸附与弗罗因德利克方程有更好地关联性，尤其是在15℃条件下。

表3

注：q_max–最大吸附能力；γ–回归系数；K_L-朗格缪尔常数；K_F-弗罗因德利克常数；n–吸附强度。

5、吸附平衡和动力学

将5mL吸附剂(已经预处理的树脂)和50mL的稀释适当倍数的黑莓花青素粗提物溶液分别加入100mL锥形瓶，置恒温振荡器上振荡60min。每隔5min取1000μL溶液测吸光度,以此判定吸附过程达到平衡的时间。

通过伪一级动力学模型和伪二级动力学模型分析黑莓花青素的吸附。实验数据和吸附能力的预测值之间的一致性用模型的相关系数(γ值)来表达。相对较高的γ值表明该模型成功地描述了花青素的吸附动力学。

伪一级动力学模型，如式(7)所示：

ln(q_e-q_t)＝lnq_e-K₁t(7)

式(7)可转换为 $log(q_e-q_t)={\mathrm{logq}}_e-\frac{K_{1}t}{2.303}$

伪二级动力学模型，如式(8)所示：

$\frac{t}{q_t}=\frac{1}{K_2{q_e}^2}+\frac{1}{q_e}t---\left(8\right)$

注：K₁和K₂分别是伪一级动力学模型和伪二级动力学模型的速率常数；q_t是在时间为t时黑莓花青素吸附量(mg·mL^-1)；q_e是在吸附平衡时的吸附能力。

吸附是一个理化过程,涉及大量溶质(吸附质)从液相到吸附剂表面的传质。吸附动力学的研究可以提供关于吸附机制的信息,可以用于评估吸附过程的效率。吸附动力学的研究描述了在固液交界面的溶质吸收速度。

为了评估伪一级动力学模型对于花青素的吸附的适用性,绘制了log(q_e-q_t)与t的线性图，如图6所示。q_e值(从模型获得)和K₁(从图中的截距和斜率获得)分别如表4所示。t/q_t与t的线性图，如图7所示。平衡吸附容量和伪二级动力学常数K₂(从图中的截距和斜率获得)分别如表4所示。从表4中可以看出,伪一级动力学模型的γ(0.9314)远低于伪二级动力学模型的γ(0.9979)。由此可以推断,伪二级动力学模型更适合描述黑莓花青素的吸附。伪一级动力学模型描述了吸附过程的初始阶段。伪二级动力学模型对预测和描述整个吸附过程更为合适。伪二级动力学模型比伪一级动力学模型更适合描述黑莓花青素在树脂上的吸附动力学。

表4

注：K₁-伪一级动力学速率常数；K₂-伪二级动力学速率常数；q_e–动力学模型的吸附能力；γ–回归系数。

6、吸附和洗脱的条件优化

确定吸附平衡和动力学后,采用单因素试验获得纯化工艺参数的初步范围,包括初始浓度(mg·mL^-1),吸附液的pH值,洗脱液的pH值和乙醇浓度(％)。

确定最优初始浓度采用如下方式：取5mL的树脂吸附剂和20mL不同浓度的花青素粗提物溶液分别加入锥形瓶内，置15℃恒温振荡器上振荡1h。测定未被吸附的黑莓花青素的吸光度。

确定最优吸附液的pH值采用如下方式：取5mL的树脂吸附剂和20mL不同pH值的吸附液分别加入锥形瓶内，置15℃恒温振荡器上振荡1h。测定未被吸附的黑莓花青素的吸光度。

确定最佳洗脱液的pH值采用如下方式：取5mL的已吸附黑莓花青素的树脂吸附剂和50mL不同pH值的洗脱液分别加入锥形瓶内，置15℃恒温振荡器上振荡1h。测定洗脱下来的黑莓花青素的吸光度。

确定最佳乙醇浓度采用如下方式：取5mL的已吸附黑莓花青素的树脂吸附剂和50mL不同浓度的乙醇分别加入锥形瓶内，置15℃恒温振荡器上振荡1h。测定洗脱下来的黑莓花青素的吸光度。

6.1初始浓度对黑莓花青素吸附的影响

为了研究花青素的初始浓度对吸附的影响,采用在0.6～2.99mg·mL^-1范围内不同初始浓度对黑莓花青素吸附率的影响的方式来表述。保持吸附液的pH值＝3,洗脱液的pH值＝4和乙醇浓度为75％。如图8所示,吸附率随初始浓度从2.99到0.75mg·mL^-1的降低而增加，但进一步减少初始浓度，吸附率的增加不明显。因此,黑莓花青素的吸附优选的初始浓度为0.75mg·mL^-1。

6.2吸附液的pH值对黑莓花青素吸附的影响

如图9所示，吸附率随吸附液的pH值从1到5的增加而减少,因此吸附液的pH值＝1时，最有利于黑莓花青素的吸附。

6.3洗脱液的pH值对黑莓花青素洗脱的影响

为了研究洗脱液的pH值对花青素的洗脱的影响,采用在洗脱液的pH值从1到5范围内对解吸率的影响的方式来表述。保持初始浓度为0.75mg·mL^-1、吸附液pH值＝1和乙醇浓度为75％。如图10所示，解吸率(洗脱率)随着洗脱液的pH值从1到3的增加而增加,在洗脱液的pH值为3时达到高峰,进一步提高洗脱液的pH值,导致解吸率减少。因此洗脱液的pH值的最佳值为3。

6.4乙醇浓度对黑莓花青素洗脱的影响

如图11所示，随着乙醇浓度的增加(从20％到100％)，解吸率(洗脱率)也在增加,当乙醇浓度达到80％后，解吸率又呈下降趋势。因此乙醇的最优浓度为80％。

7、动态吸附和解吸

7.1动态吸附和解吸实验：

动态吸附和解吸实验在层析柱(20mm×400mm)上进行。吸附剂的柱床体积(BV)是40mL,填装吸附剂高度为12.7cm。比较了不同的流速(2BV/h、5BV/h、10BV/h)对黑莓花青素吸附的影响。每隔0.5BV收集一次，进行吸光度测定。达到吸附饱和后,柱中的吸附剂用去离子水(2BV)清洗干净，接着用乙醇(pH＝3，80％，v/v)在不同流速(2BV/h、5BV/h、10BV/h)下洗脱。

7.2动态吸附和解吸曲线

为了规范所需的吸附液量和洗脱液量，通过实验去计算样品在不同流速下(2BV/h、5BV/h和10BV/h)的泄露点。因此，由吸附液的体积和溶质的浓度，得到60～100目数的聚酰胺树脂的动态泄露曲线。

如图12所示。当流速为5BV/h时吸附性能达到最佳。当处于低流速时，被吸附物分子与吸附剂间相互作用时间更多，而高流速时虽然所需时间更少，但被吸附物的停留时间短，会对吸附能力造成影响，泄露临界点也将更快达到。通常，流出液浓度达到吸附液浓度的5％被定义为泄露点。综上，吸附液量为5BV、吸附液流速为5BV/h是动态吸附的最佳条件。

由解吸溶液的体积和溶质浓度绘制得到动态解吸曲线，如图13所示。用pH值为3的80％乙醇洗脱花青素，分别保持流速在2BV/h、5BV/h和10BV/h。从图中可以看出,在洗脱液用量为3.5BV，流速为5BV/h时可以完全洗脱花青素。因此,洗脱液用量为3.5BV，流速为5BV/h为最佳解吸条件。

8、不同树脂对于黑莓花青素的纯化的影响

分别选用了离子交换树脂、大孔吸附树脂和聚酰胺树脂，研究不同树脂对于黑莓花青素的纯化的影响,结果见表5。通过聚酰胺树脂吸附得到的黑莓花青素浸膏中含有432mg·g^-1花青素，此含量高于通过阳离子交换树脂吸附得到的花青素纯度(160mg·g^-1)和通过大孔吸附树脂得到的花青素纯度(176mg·g^-1)。因此，聚酰胺树脂为最佳选择。

表5

本发明的有益之处在于：本发明提供了一种黑莓花青素的纯化方法，能够实现黑莓花青素的高效纯化，所得黑莓花青素的纯度高。本发明的纯化方法选用60～100目聚酰胺树脂作为吸附剂，其具有大的比表面积和大粒度，吸附和解吸能力高、成本低、容易再生且制备方法简单等特性。本发明通过对黑莓花青素静态和动态的吸附和解吸过程的研究，优化了纯化条件，确立了黑莓花青素的初始浓度、吸附液的pH值、洗脱液的pH值以及乙醇浓度的最佳值，使得黑莓花青素的吸附率和洗脱率均较高。本发明的方法可以实现黑莓花青素省时、高效的纯化，有利于节省纯化时间，节约成本。

附图说明

图1是黑莓花青素含量测定的标准曲线；

图2是采用不同目数聚酰胺树脂的黑莓花青素吸附和洗脱能力图；

图3是采用不同目数聚酰胺树脂的黑莓花青素回收率图；

图4是不同温度下C_e/q_e和C_e的线性图；

图5是不同温度下logq_e和logC_e的线性图；

图6是log(q_e-q_t)与t的线性图；

图7是t/q_t与t的线性图；

图8是黑莓花青素吸附率随初始浓度变化图；

图9是黑莓花青素吸附率随吸附液pH值变化图；

图10是黑莓花青素洗脱率随洗脱液pH值变化图；

图11是黑莓花青素洗脱率随乙醇浓度变化图；

图12是动态吸附曲线图；

图13是动态解吸曲线图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的介绍。

实施例1黑莓花青素的纯化方法，包括以下步骤：

(1)树脂预处理：将聚酰胺树脂先用60％乙醇煮沸5小时，再用蒸馏水洗净至无醇味，备用；

(2)黑莓花青素粗提物(按现有技术方法制备，该粗提物浸膏中黑莓花青素的含量约为2.8％)的纯化：将黑莓花青素粗提物加水稀释至0.6mg·mL^-1，用盐酸调节pH＝5后，以2BV/h的速度上聚酰胺树脂柱7BV，随后用水洗3BV(洗至几乎没有糖)，再用pH值为1的40％乙醇以2BV/h的速度洗脱5BV，浓缩得浸膏。

采用此纯化工艺，黑莓花青素的吸附率为81％，洗脱率为70％，纯化所得浸膏中黑莓花青素的含量为62％。

实施例2黑莓花青素的纯化方法，包括以下步骤：

(1)树脂预处理：将60～100目聚酰胺树脂先用80％乙醇煮沸3小时，再用蒸馏水洗净至无醇味，备用；

(2)黑莓花青素粗提物的纯化：将黑莓花青素粗提物经浓缩挥发乙醇后加水稀释至2.99mg·mL^-1，用盐酸调节pH＝3后，以10BV/h的速度上聚酰胺树脂柱1BV，随后用水洗3BV(洗至几乎没有糖)，再用pH值为5的100％乙醇以10BV/h的速度洗脱0.5BV，浓缩得浸膏。采用此纯化工艺，黑莓花青素的吸附率为78％，洗脱率为65％，纯化所得浸膏中黑莓花青素的含量为60％。

步骤(2)中黑莓花青素粗提物按此方法制备：将黑莓进行匀浆，得黑莓浆备用；按5mL/1g黑莓浆的比例加入无水乙醇，采用微波辅助萃取，微波功率700w，微波处理时间1min，得提取液；提取液在3500r/min条件下离心8分钟，收集上清液，即得。该粗提物浓缩成浸膏后黑莓花青素的含量为3.2％。

实施例3黑莓花青素的纯化方法，包括以下步骤：

(1)树脂预处理：将80目聚酰胺树脂先用95％乙醇煮沸4小时，再用蒸馏水洗净至无醇味，备用；

(2)黑莓花青素粗提物的纯化：将黑莓花青素粗提物经浓缩挥发乙醇后加水稀释至0.75mg·mL^-1，用盐酸调节pH＝1后，以5BV/h的速度上聚酰胺树脂柱5BV，随后用水洗3BV(洗至几乎没有糖)，再用pH值为3的80％乙醇以5BV/h的速度洗脱3.5BV，减压蒸馏浓缩得浸膏。采用此纯化工艺，黑莓花青素的吸附率为85％，洗脱率为78％，纯化所得浸膏中黑莓花青素的含量为66％。

步骤(2)中黑莓花青素粗提物按此方法制备：将黑莓进行匀浆，得黑莓浆备用；按25mL/1g黑莓浆的比例加入浓度为52％的乙醇，采用微波辅助萃取，微波功率469w，微波处理时间4min，得提取液；提取液在3500r/min条件下离心5分钟，收集上清液，即得。该粗提物浓缩成浸膏后黑莓花青素的含量为5.2％。

实施例4黑莓花青素的纯化方法，包括以下步骤：

(1)树脂预处理：将60～70目聚酰胺树脂先用75％乙醇煮沸4.5小时，再用蒸馏水洗净至无醇味，备用；

(2)黑莓花青素粗提物的纯化：将黑莓花青素粗提物经浓缩挥发乙醇后加水稀释至1.5mg·mL^-1，用盐酸调节pH＝2后，以8BV/h的速度上聚酰胺树脂柱4BV，随后用水洗3BV(洗至几乎没有糖)，再用pH值为4的90％乙醇以4BV/h的速度洗脱3BV，减压蒸馏浓缩得浸膏。采用此纯化工艺，黑莓花青素的吸附率为80％，洗脱率为67％，纯化所得浸膏中黑莓花青素的含量为61％。

步骤(2)中黑莓花青素粗提物按此方法制备：将黑莓进行匀浆，得黑莓浆备用；按15mL/1g黑莓浆的比例加入水，采用微波辅助萃取，微波功率100w，微波处理时间9min，得提取液；提取液在3500r/min条件下离心3分钟，收集上清液，即得。该粗提物浓缩成浸膏后黑莓花青素的含量为4.1％。

Claims (9)

1.一种黑莓花青素的纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)树脂预处理：将聚酰胺树脂先用乙醇煮沸，再用蒸馏水洗净，备用；

(2)黑莓花青素粗提物的纯化：将黑莓花青素粗提物经浓缩挥发乙醇后加水稀释，调节pH值后，上聚酰胺树脂柱，先用水洗，再用乙醇洗脱，浓缩得浸膏。

2.根据权利要求1所述的黑莓花青素的纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)树脂预处理：将聚酰胺树脂先用60％～95％乙醇煮沸3～5小时，再用蒸馏水洗净至无醇味，备用；

(2)黑莓花青素粗提物的纯化：将黑莓花青素粗提物经浓缩挥发乙醇后加水稀释至0.6～2.99mg·mL^-1，用盐酸调节pH＝1～5后，以2～10BV/h的速度上柱1～7BV，随后用水洗3BV，再用pH值为1～5的40％～100％乙醇以2～10BV/h的速度洗脱0.5～5BV，浓缩得浸膏。

3.根据权利要求2所述的黑莓花青素的纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)树脂预处理：将聚酰胺树脂先用95％乙醇煮沸4小时，再用蒸馏水洗净至无醇味，备用；

(2)黑莓花青素粗提物的纯化：将黑莓花青素粗提物经浓缩挥发乙醇后加水稀释至0.75mg·mL^-1，用盐酸调节pH＝1后，以5BV/h的速度上柱5BV，随后用水洗3BV，再用pH值为3的80％乙醇以5BV/h的速度洗脱3.5BV，减压蒸馏浓缩得浸膏。

4.根据权利要求1～3任一项所述的黑莓花青素的纯化方法，其特征在于：所述黑莓花青素粗提物的制备方法为：将黑莓进行匀浆，得黑莓浆备用；加入水或任意浓度的乙醇，采用微波辅助萃取，得提取液；提取液离心，收集上清液，即得。

5.根据权利要求4所述的黑莓花青素的纯化方法，其特征在于：所述黑莓花青素粗提物的制备方法为：将黑莓进行匀浆，得黑莓浆备用；按5～25mL/1g黑莓浆的比例加入水或任意浓度的乙醇，采用微波辅助萃取，微波功率100～700w，微波处理时间1～9min，得提取液；提取液离心，收集上清液，即得。

6.根据权利要求5所述的黑莓花青素的纯化方法，其特征在于：所述黑莓花青素粗提物的制备方法为：将黑莓进行匀浆，得黑莓浆备用；按25mL/1g黑莓浆的比例加入浓度为52％的乙醇，采用微波辅助萃取，微波功率469w，微波处理时间4min，得提取液；提取液离心，收集上清液，即得。

7.根据权利要求4所述的黑莓花青素的纯化方法，其特征在于：所述提取液离心为提取液在3500r/min条件下离心3～8分钟。

8.根据权利要求7所述的黑莓花青素的纯化方法，其特征在于：所述提取液离心为提取液在3500r/min条件下离心5分钟。

9.根据权利要求1～3所述的黑莓花青素的纯化方法，其特征在于：所述聚酰胺树脂为60～100目。