CN105193824A - 一种灵芝三萜酸活性部位及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种灵芝三萜酸活性部位及其制备方法和在制备改善睡眠保健品和镇静安神药物中的应用，方法包括：将灵芝子实体药材粉碎得到干粉，干粉在水中加入复合酶酶解，经灭酶、冷却、抽滤，得到酶解液；将酶解液加入石油醚萃取除脂，再加入乙酸乙酯萃取，得灵芝乙酸乙酯提取物；将灵芝乙酸乙酯提取物先碱化，再水洗至中性，得到碱化水层，然后将碱化水层酸化，再通过乙酸乙酯萃取得粗灵芝酸；将粗灵芝酸，经硅胶柱分离，用氯仿和甲醇***梯度洗脱，经薄层色谱检识、过滤、蒸干，即得灵芝三萜酸活性部位。本发明的灵芝三萜酸活性部位通过复合酶酶解，再经萃取、分离等步骤即可得到，可用于制备改善睡眠保健品和镇静安神药物。

Description

一种灵芝三萜酸活性部位及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及灵芝提取物技术领域，具体涉及一种灵芝三萜酸活性部位及其制备方法和在制备改善睡眠保健品和镇静安神药物中的应用。

背景技术

睡眠是人类和高等动物必须的生理过程，是维持体力和健康的基础。失眠是一种常见的睡眠障碍，指不能入睡或维持睡眠状态。慢性失眠大概影响15％左右的人群，短暂性失眠每年影响约80％的人群。目前对于失眠的治疗以服用人工合成药物为主，然而合成药物存在严重的药物依赖、认知和运动损害、停药反跳等不良反应。因此，亟需寻找发展安全有效的镇静安神药物，以突破镇静安神药物和饮食补充剂的发展瓶颈。

灵芝为多孔菌科赤芝[Ganodermalucidum(Leyss.ex.Fr.)Karst.]或紫芝[Ganodermajaponicum(Fr.)Lloyd]的干燥子实体，其性平；味甘，温。归心、肝、脾经，自古就有“仙草”、“瑞草”之称，药用价值极高，是我国珍贵的菌藻类药材。我国人民把它作为药用已有2000多年的历史，周朝古籍《列子》一书中就有“朽壤之上，有菌者芝”。灵芝的“安神”作用始载于《神农本草经》，2005年版《浙江省中药饮片炮制规范》和2010年版《中华人民共和国药典》均记述了灵芝具有“益气安神”作用。在灵芝的多种化学成分中，灵芝多糖和三萜类化合物是其主要功效成分，我国以灵芝多糖的含量来评价灵芝质量的好坏；在日本等国家则以灵芝三萜酸的含量作为鉴定灵芝制品质量的标准。

现代药理学关于灵芝镇静安神作用的研究报道并不多见，Wang和Tang等研究了灵芝提取物对人体的催眠作用(王祥礼，孟昭阳，王翠萍.灵芝菌液治疗失眠症60例[J].中国医药学报,2001,16(1):47-49；TANGWen-bo,GAOYi-huai,CHENGuo-liang,etal.ARandomized,double-blindandplacebo-controlledstudyofaGanodermaLucidumpolysaccharideextract(ganopoly)inneurasthenia[J].JournalofMedicinalFood,2005,8(1):53-58)，Chu等研究证明灵芝子实体水提物可延长戊巴比妥钠睡眠实验中大鼠的睡眠时间，认为灵芝多糖具有苯二氮卓样作用(ChuQing-ping,WANGLi-en,CuiXiang-yu,etal.ExtractofGanodermalucidumpotentiatespentobarbital-inducedsleepviaaGABAergicmechanism[J].Pharmacology,BiochemistryandBehavior,2007,86(4):693-698)；Cui等研究发现灵芝粗多糖80mg/kg能延长大鼠总睡眠时间和非快速动眼期睡眠时间而不影响慢波睡眠和快速动眼期睡眠时间，大鼠血清、下丘脑和背侧中缝核的TNF-α水平显著升高(CUIXiang-yu,CUISu-ying,ZHANGJuan,etal.ExtractofGanodermalucidumprolongssleeptimeinrats[J].JournalofEthnopharmacology,2012,139(3):796-800)。CHO等应用放射性配体受体结合实验证明灵芝子实体醇提物对GABA_A受体有中等强度亲和力，而水提物对GABA_A受体的亲和力极弱(CHOSueng-mock,SHIMIZUMakoto,LEEC-justin,etal.HypnoticeffectsandbindingstudiesforGABAaand5-HT2creceptorsoftraditionalmedicinalplantsusedinAsiaforinsomnia[J].JournalofPharmacology,2010,132(1):225-232)；贾薇等研究发现灵芝三萜与茯苓提取物有协同改善睡眠的功能，灵芝多糖却没有此药理作用，其作用机制并不明确(贾薇,吴岷,张劲松等.灵芝成分改善睡眠功能试验初探[J].食用菌学报,2005,12(3):43-47)。江海涛等研究发现灵芝提取物具有改善睡眠的作用，但其改善睡眠的效果和受试物剂量没有明显的线性关系，且其作用机制及物质基础也不明确(江海涛,任袁浩,虞蔚岩等.灵芝提取物在睡眠改善中的功能性研究[J].时珍国医国药,2008,19(9):2231-2232)；王雨虹、曹素芳等均对灵芝子实体提取物的镇静安神作用进行了研究，但文中均没有追溯可能的物质基础(王雨虹.灵芝改善睡眠功能的研究[J].山西医药杂志,2011,40(9):878-880；曹素芳,王新瑞,张晨,等.关于灵芝改善睡眠功能的研究[J].浙江食用菌,2009,17(6):52-54)。

因此，尽管灵芝是我国珍贵的菌藻类药材，其“益气安神”作用已有数千年的药用历史，但现代药理学对其相应的活性功能成分尚未十分明确，大多的药理实验仅停留在原药材和粗提物的基础上，尚无灵芝提取物进一步精制至活性部位并用于制备镇静安神保健品和药物的报道。

发明内容

本发明提供了一种灵芝三萜酸活性部位及其制备方法和在制备改善睡眠保健品和镇静安神药物中的应用，灵芝三萜酸活性部位通过复合酶酶解，再经萃取、分离等步骤即可得到，可用于制备改善睡眠保健品和镇静安神药物。

一种灵芝三萜酸活性部位的制备方法，包括以下步骤：

(1)将灵芝子实体药材粉碎得到干粉，干粉在水中加入复合酶酶解，经灭酶、冷却、抽滤，得到酶解液；

(2)将步骤(1)中得到的酶解液加入石油醚萃取除脂，然后将除脂后的酶解液继续加入乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取部位，挥干乙酸乙酯层溶剂，得灵芝乙酸乙酯提取物；

(3)将步骤(2)制备的灵芝乙酸乙酯提取物溶于乙酸乙酯，先碱化至pH9～10，再水洗至中性，得到碱化水层，然后将碱化水层酸化至pH2～3，再通过乙酸乙酯萃取得粗灵芝酸；

(4)将步骤(3)制备的粗灵芝酸，经硅胶柱分离，用氯仿和甲醇***梯度洗脱，收集洗脱液，经薄层色谱检识、过滤、蒸干，即得灵芝三萜酸活性部位。

本发明中，通过复合酶的酶解以及各提取步骤的配合，能更加充分、全面地提取灵芝中三萜酸类的化合物，灵芝三萜酸活性部位具有较好的镇静安神活性。

以下作为本发明的优选技术方案：

步骤(1)中，将灵芝子实体药材粉碎得到干粉，包括：先取灵芝子实体药材，55℃～75℃干燥，粉碎，过80～120目筛得干粉；进一步优选，包括：先取灵芝子实体药材，65℃干燥，粉碎，过100目筛得干粉。

所述的复合酶，由以下重量百分含量的组分组成：

中性蛋白酶5％～95％；

纤维素酶2.5％～48％；

果胶酶2.5％～48％。

进一步优选，所述的复合酶，由以下重量百分含量的组分组成：

中性蛋白酶30％～80％；

纤维素酶10％～35％；

果胶酶10％～35％。

植物细胞壁的主要成分是果胶和纤维素，复合酶中的果胶酶可以酶解其中的果胶，纤维素酶酶解其中的纤维素，使植物细胞中的有效成分释放，中性蛋白酶可对其中的蛋白质等大分子物质进行澄清处理，从而提高有效成分的得率。复合酶的使用可以缩短灵芝三萜酸的提取时间并提高其得率，同时能更加充分、全面地提取灵芝中三萜酸类的化合物，灵芝三萜酸活性部位具有较好的镇静安神活性。

所述的复合酶的加入量为干粉质量的1.0％～5.0％。

所述的水与干粉的料液比为10mL～30mL：1g，进一步优选为20mL：1g。

所述的酶解条件为：温度35～70℃、pH3.5～7、酶解时间4.5～8h。

步骤(3)中，灵芝乙酸乙酯提取物先碱化，将其中的三萜酸成盐，溶解于水中，然后用乙酸乙酯萃取去除碱性、中性杂质；继而将碱化水洗液酸化使成盐的三萜酸释放，用乙酸乙酯继续萃取得到纯化的三萜酸成分。碱化、酸化的作用是纯化三萜酸，主要去除其中的中性三萜。

步骤(4)中，所述的氯仿和甲醇***中氯仿与甲醇的体积比为1～10︰1。进一步优选，所述的氯仿和甲醇***中氯仿与甲醇的体积比为2～8︰1，收集氯仿与甲醇的体积比为2～8︰1的洗脱液，上述洗脱液中含有较多的三萜酸类的化合物。

本发明中，得到的灵芝三萜酸活性部位中，三萜酸的重量百分含量为5％至70％，其三萜酸的含量采用分光光度计测定。

本发明制备方法得到的灵芝三萜酸活性部位，可用于制备改善睡眠作用保健品和镇静安神药物。

为了检测灵芝三萜酸活性部位的镇静安神活性部位的性能，将本发明所得的灵芝三萜酸活性部位配置成25～100mg/ml药液，用于延长戊巴比妥钠睡眠时间实验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验、巴比妥钠睡眠潜伏期实验模型中，分别观察样品在不同剂量下对实验小鼠睡眠行为的影响。结果表明灵芝三萜酸活性部位具有显著的镇静安神活性，可用于制备改善睡眠的保健品或治疗失眠、睡眠障碍等疾病的辅助药物。

本发明的灵芝三萜酸活性部位可以与药学上可接受的辅料组成的药物组合物。

灵芝三萜酸活性部位可单独或几种部位组合，进一步与辅料组合，剂型包括：片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂等。

本发明灵芝三萜酸活性部位的载体和赋形剂包括药剂学常规应用的载体和赋形剂，例如溶剂、崩解剂、矫味剂、防腐剂、着色剂、粘合剂等。

灵芝三萜酸活性部位具有明显的镇静安神作用，可以延长戊巴比妥钠小鼠的睡眠时间，缩短其睡眠潜伏期；在戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验中，可以显著增加睡眠小鼠的数量；并显著缩短巴比妥钠睡眠潜伏期实验中小鼠的睡眠潜伏期，表明灵芝三萜酸活性部位具有良好的镇静安神作用，具有开发的潜力。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明灵芝三萜酸活性部位的制备方法，其中灵芝三萜酸的含量和纯度大幅提升。现有的方法多用氯仿、乙酸乙酯等试剂对灵芝子实体干粉或醇提物直接萃取，其中混杂了大量的脂肪酸、中性三萜等杂质。

本发明灵芝三萜酸活性部位的制备方法，对灵芝三萜酸的提取工艺进行了优化，在提取前和提取后分别采用酶法和层析法对灵芝三萜酸和其活性部位进行了预处理和精制，一方面能够更加充分、全面地提取灵芝中三萜酸类的化合物，另一方面能够提高灵芝三萜酸的得率，其工艺简单、得率高；设备简单，适合工业生产。

本发明的灵芝三萜酸活性部位，具有明显的镇静安神作用，可用于制备改善睡眠作用保健品和镇静安神药物，有利于市场化推广利用，具备广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例1制备的灵芝三萜酸活性部位对延长戊巴比妥钠睡眠潜伏时间实验的影响比较图；

图2为实施例1制备的灵芝三萜酸活性部位对延长戊巴比妥钠睡眠时间实验的影响比较图；

图3为实施例1制备的灵芝三萜酸活性部位对巴比妥钠睡眠潜伏期实验的影响比较图。

具体实施方式

实施例1(灵芝三萜酸活性部位的制备)

(1)取灵芝子实体药材(浙江五养堂药业有限公司)，65℃干燥，粉碎，过100目筛得干粉；干粉按料液比1g︰20mL加入蒸馏水，在温度50℃、pH5.5条件下，加入相对于干粉的质量3.0％的复合酶，复合酶，由重量百分含量50％中性蛋白酶、25％纤维素酶以及25％果胶酶组成，酶解时间为6h，灭酶，冷却，抽滤，得到酶解液，备用；

(2)取上述步骤(1)制备得到的酶解液，加入石油醚萃取除脂，然后将除脂后的酶解液继续加入乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取部位，挥干乙酸乙酯层溶剂，得乙酸乙酯提取物；

(3)取上述步骤(2)制备得到的灵芝乙酸乙酯提取物溶于乙酸乙酯，碱化至pH9.5，水洗至中性，碱化水层酸化至pH2.5，再通过乙酸乙酯萃取得粗灵芝酸，备用；

(4)取上述步骤(3)制备得到的粗灵芝酸，经硅胶柱分离，用体积比为1～10︰1的氯仿和甲醇***梯度洗脱，收集氯仿与甲醇的体积比为2～8︰1的洗脱液，薄层色谱检识、过滤、蒸干即为灵芝三萜酸活性部位。

实施例1制备的灵芝三萜酸活性部位中，采用分光光度计测定，灵芝三萜酸活性部位中，三萜酸的重量百分含量为65％。

实施例2(灵芝三萜酸活性部位的制备)

(1)取灵芝子实体药材(浙江五养堂药业有限公司)，65℃干燥，粉碎，过100目筛得干粉；干粉按料液比1g︰15mL加入蒸馏水，在温度40℃、pH4.0条件下，加入相对于干粉的质量2.0％的复合酶，复合酶，由重量百分含量30％中性蛋白酶、35％纤维素酶以及35％果胶酶组成，酶解时间为5h，灭酶，冷却，抽滤，得到酶解液，备用；

(2)取上述步骤(1)制备得到的酶解液，加入石油醚萃取除脂，然后将除脂后的酶解液继续加入乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取部位，挥干乙酸乙酯层溶剂，得乙酸乙酯提取物；

(3)取上述步骤(2)制备得到的灵芝乙酸乙酯提取物溶于乙酸乙酯，碱化至pH9，水洗至中性，碱化水层酸化至pH2，再通过乙酸乙酯萃取得粗灵芝酸，备用；

(4)取上述步骤(3)制备得到的粗灵芝酸，经硅胶柱分离，用体积比为1～10︰1的氯仿和甲醇***梯度洗脱，收集氯仿与甲醇的体积比为2～8︰1的洗脱液，薄层色谱检识、过滤、蒸干即为灵芝三萜酸活性部位。

实施例2制备的灵芝三萜酸活性部位中，采用分光光度计测定，灵芝三萜酸活性部位中，三萜酸的重量百分含量为45％。

实施例3(灵芝三萜酸活性部位的制备)

(1)取灵芝子实体药材(浙江五养堂药业有限公司)，65℃干燥，粉碎，过100目筛得干粉；干粉按料液比1g︰25mL加入蒸馏水，在温度60℃、pH6.0条件下，加入相对于干粉的质量4.0％的复合酶，复合酶，由重量百分含量80％中性蛋白酶、10％纤维素酶以及10％果胶酶组成，酶解时间为7h，灭酶，冷却，抽滤，得到酶解液，备用；

(2)取上述步骤(1)制备得到的酶解液，加入石油醚萃取除脂，然后将除脂后的酶解液继续加入乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取部位，挥干乙酸乙酯层溶剂，得乙酸乙酯提取物；

(3)取上述步骤(2)制备得到的灵芝乙酸乙酯提取物溶于乙酸乙酯，碱化至pH10，水洗至中性，碱化水层酸化至pH3，再通过乙酸乙酯萃取得粗灵芝酸，备用；

(4)取上述步骤(3)制备得到的粗灵芝酸，经硅胶柱分离，用体积比为1～10︰1的氯仿和甲醇***梯度洗脱，收集氯仿与甲醇的体积比为2～8︰1的洗脱液，薄层色谱检识、过滤、蒸干即为灵芝三萜酸活性部位。

实施例3制备的灵芝三萜酸活性部位中，采用分光光度计测定，灵芝三萜酸活性部位中，三萜酸的重量百分含量为55％。

实施例4(灵芝三萜酸活性部位对实验小鼠睡眠的影响)

1、实验材料

1.1实验药物

灵芝购于浙江五养堂药业有限公司；本发明实施例1制备得到的灵芝三萜酸活性部位。

***，aladdin公司；戊巴比妥钠、巴比妥钠，merck公司

1.2实验动物：实验选用清洁级健康ICR小鼠，体重18-22g，单一雄性，浙江省医学科学院实验动物中心提供，实验动物生产证许可证号SCXK(浙)2014-0001；饲养于浙江省医学科学院实验动物中心SPF级动物房，实验条件保持温度为25℃，相对湿度为40％-70％，光照-黑暗循环为12h：12h，自由饮水摄食。

2、实验方法

实验动物根据体重随机分为5组，每组10只：空白对照组(5％tween80，10ml/kg·bw)、阳性对照组(***，2.5mg/kg·bw)、灵芝三萜酸低剂量组(25mg/kg·bw)、中剂量组(50mg/kg·bw)、高剂量组(100mg/kg·bw)，其中，bw代表的是体重(bodyweight)。各组动物每天灌胃1次，观察其直接睡眠作用，30d后进行实验处理。动物实验于每天10:00-14:00安静环境中进行。

2.1本发明中灵芝三萜酸活性部位对延长戊巴比妥钠睡眠时间实验的影响：

在戊巴比妥钠催眠的基础上，观察各受试物是否延长睡眠时间，若睡眠时间延长，则说明受试物与戊巴比妥钠有协同作用。各组小鼠每天给药1次，连续30d，于末次给药前12h禁食不禁水。末次灌胃给药60min后，各组小鼠给予48mg/kg·bw戊巴比妥钠(i.p.)，注射量为0.1mL/10g·bw。以小鼠的翻正反射消失60s以上作为入睡判断标准，翻正反射恢复即为动物觉醒，翻正反射消失至恢复这段时间为动物睡眠时间，比较各受试物能否延长戊巴比妥钠注射小鼠的睡眠时间。

2.2灵芝三萜酸活性部位对戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验中小鼠的影响：

各组小鼠每天给药1次，连续30d，于末次给药前12h禁食不禁水。在末次灌胃给药60min后，各组动物i.p.给予32mg/kg·bw戊巴比妥钠，注射量为0.1mL/10g·bw，以小鼠的翻正反射消失达60s以上作为入睡判断标准，记录30min内各组入睡动物数并计算睡眠发生率，睡眠发生率＝每组睡眠动物数/每组动物总数×100％。

2.3灵芝三萜酸活性部位对巴比妥钠睡眠潜伏期实验中小鼠的影响

在巴比妥钠催眠的基础上，观察受试物是否能够缩短动物的入睡潜伏期，若潜伏期缩短，则说明受试物与巴比妥钠有协同作用。各组小鼠每天给药1次，连续30d，于末次给药前12h禁食不禁水。各剂量组在末次灌胃给药60min后，各组动物按280mg/kg·bw给予巴比妥钠(i.p.)，注射量为0.1mL/10g·bw，以小鼠翻正反射消失60s以上作为入睡指标，从注射巴比妥钠到动物入睡即为睡眠潜伏期，观察各组受试物能否缩短巴比妥钠睡眠潜伏期。

综合上述各项指标评述本发明中灵芝三萜酸活性部位的镇静安神效果。

3、实验结果

3.1本发明中灵芝三萜酸活性部位对延长戊巴比妥钠睡眠时间实验的影响

图1为实施例1制备的灵芝三萜酸活性部位对延长戊巴比妥钠睡眠潜伏时间实验的影响比较图。图2为实施例1制备的灵芝三萜酸活性部位对延长戊巴比妥钠睡眠时间实验的影响比较图。结果见图1和图2，数据表明，灵芝三萜酸活性部位各剂量组均能显著增长小鼠的睡眠时间，且缩短睡眠潜伏期。灵芝三萜酸活性部位高剂量组的睡眠时间强于阳性对照组。

3.2本发明中灵芝三萜酸活性部位对戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验的影响

结果见表1，由实验结果可见，灵芝三萜酸活性部位100mg/kg·bw对戊巴比妥钠阈下催眠剂量具有一定的协同作用，且作用效果强于***2.5mg/kg。

表1灵芝三萜酸对戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验的影响

3.3本发明中灵芝三萜酸活性部位对巴比妥钠睡眠潜伏期实验的影响

图3为灵芝三萜酸活性部位对巴比妥钠睡眠潜伏期实验的影响比较图，结果见图3，数据表明，灵芝三萜酸活性部位低、中、高剂量组均能显著缩短小鼠巴比妥钠睡眠潜伏期，其促进睡眠的效果显著。

以上实验结果表明，本发明制备得到的灵芝三萜酸活性部位，能够显著延长戊巴比妥钠睡眠实验中小鼠的睡眠时间，缩短其睡眠潜伏期；并提高戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验中小鼠的入睡率；同时，还显著缩短巴比妥钠睡眠潜伏期实验中小鼠的睡眠潜伏期，说明灵芝三萜酸活性部位具有明显的镇静安神作用。

实施例5(滴丸的制备)

分别称取400g聚乙二醇4000，在水浴上融化，再加入灵芝三萜酸活性部位500g干燥粉末，搅拌均匀，倾入保温管中，调节恒温装置，使药液在80-90℃下滴入冷却过的液体石蜡中(温度±4℃)，滴完后，将药丸倾入滤纸上吸干石蜡油，再加入少量滑石粉，混匀，得灵芝三萜酸滴丸1000粒。

实施例6(胶囊剂的制备)

灵芝三萜酸活性部位干燥粉末1000g，与药用淀粉500g混合均匀，烘干，按每粒0.45g制成胶囊。

实施例7(片剂的制备)

灵芝三萜酸活性部位干燥粉末1000g，淀粉500g，混合均匀，用适量乙醇制粒，经整粒机整粒，压片，每片0.35g。

实施例8(颗粒剂的制备)

灵芝三萜酸活性部位干燥粉末1500g，淀粉1000g，糖粉400g，混合均匀，用适量乙醇制粒，干燥、整粒、分装即得。

Claims (10)

1.一种灵芝三萜酸活性部位的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将灵芝子实体药材粉碎得到干粉，干粉在水中加入复合酶酶解，经灭酶、冷却、抽滤，得到酶解液；

(2)将步骤(1)中得到的酶解液加入石油醚萃取除脂，然后将除脂后的酶解液继续加入乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取部位，挥干乙酸乙酯层溶剂，得灵芝乙酸乙酯提取物；

(3)将步骤(2)制备的灵芝乙酸乙酯提取物溶于乙酸乙酯，先碱化至pH9～10，再水洗至中性，得到碱化水层，然后将碱化水层酸化至pH2～3，再通过乙酸乙酯萃取得粗灵芝酸；

(4)将步骤(3)制备的粗灵芝酸，经硅胶柱分离，用氯仿和甲醇***梯度洗脱，收集洗脱液，经薄层色谱检识、过滤、蒸干，即得灵芝三萜酸活性部位。

2.根据权利要求1所述的灵芝三萜酸活性部位的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将灵芝子实体药材粉碎得到干粉，包括：先取灵芝子实体药材，55℃～75℃干燥，粉碎，过80～120目筛得干粉。

3.根据权利要求1所述的灵芝三萜酸活性部位的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的复合酶，由以下重量百分含量的组分组成：

中性蛋白酶5％～95％；

纤维素酶2.5％～48％；

果胶酶2.5％～48％。

4.根据权利要求3所述的灵芝三萜酸活性部位的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的复合酶，由以下重量百分含量的组分组成：

中性蛋白酶30％～80％；

纤维素酶10％～35％；

果胶酶10％～35％。

5.根据权利要求1所述的灵芝三萜酸活性部位的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的复合酶的加入量为干粉质量的1.0％～5.0％。

6.根据权利要求1所述的灵芝三萜酸活性部位的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的水与干粉的料液比为10mL～30mL：1g。

7.根据权利要求1所述的灵芝三萜酸活性部位的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的酶解的条件为：温度35～70℃、pH3.5～7、酶解时间4.5～8h。

8.根据权利要求1所述的灵芝三萜酸活性部位的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的氯仿和甲醇***中氯仿与甲醇的体积比为1～10︰1。

9.根据权利要求1～8任一项所述的制备方法制备的灵芝三萜酸活性部位。

10.根据权利要求9所述的灵芝三萜酸活性部位在制备改善睡眠作用保健品和镇静安神药物中的应用。