CN105030810A - 一种甜叶悬钩子多糖用于抑制血液的凝固 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取的水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖的混合物甜叶悬钩子多糖用于抑制血液的凝固。
Description
技术领域
本发明属于一种从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取甜叶悬钩子多糖提取物，甜叶悬钩子提取的水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖的混合物甜叶悬钩子多糖用于抑制血液的凝固，属于医药用途。
背景技术
血液凝固，是指血液由液体状态转变为不流动的凝胶状态的过程，是生理性止血的重要环节。血液凝固是一个复杂的过程，凝血机制内部采用级联机制逐级放大凝血信号，并通过多个正反馈环节加强凝血过程。与此同时，为了防止正常情况下意外形成血栓，或者出血部位形成的血栓不受控制，机体还有抗凝机制和纤溶机制对抗凝血机制。
抗凝药物是一类通过影响凝血过程的不同环节而抑制血液凝固的药物，抗凝药物被广泛用于血栓栓塞性疾病的预防和治疗，预防中风或其它血栓性疾病。传统抗凝药物中最常用的口服抗凝药华法林，已经在临床使用很多年，但其存在诸多局限性，如起效延缓、抗凝治疗窗窄、易受饮食影响、用药期间需要频繁的监测及调节剂量、与多种药物之间存在相互作用以及大出血等副作用等。因此长期以来，人们一直在寻找一种安全、有效和方便的抗凝药物。理想的抗凝药应该具有高的有效/安全系数、可预测的剂量响应(无需监测)、起效快、药物间相互作用少等特点。从天然植物中寻找安全有效的抗凝活性物质一直是关注的热点。
甜叶悬钩子是蔷薇科悬钩子属的一个变种，属于多年生有刺灌木，主要生长于我国广西省的山区，由于其叶味道甘甜，口感独特，故又称广西甜茶，是广西特有的无毒、低热量、高甜度的野外珍稀天然植物。在民间有悠久的应用历史，长期以来当地百姓一直以其叶当茶饮用，也用来代糖加工食品。根据广西中药药物标准记载，甜叶悬钩子具有清热降火、润肺生津、止咳祛痰的功效。其食用性以及药用性早已为当地民间医药所证实。但是直至上世纪80年代的全国药物调查中发现，虽然悬钩子植物在我国各地均有分布，但都不具备广西甜叶悬钩子这种甜味，因此该植物被植物学家李树刚确定为悬钩子的变种，与其它悬钩子区分来。甜叶悬钩子、甜叶菊以及罗汉果被并称为广西三大甜味植物，以它们为原料大量制备天然甜味剂，而其中以甜叶悬钩子制备成的甜味剂口感最为独特。日本专家保健学部高级专员田中三郎等曾在广西考察时指出，较之甜叶菊和罗汉果，甜叶悬钩子的甜味是人们最容易接受的，是目前世界上所发现的甜味植物中最理想的植物。自上世纪80年代发现该物种以来，我国逐步展开了对甜叶悬钩子的研究，在其食用和药用等方面获得了一定的进展。研究表明，甜叶悬钩子叶片中含有丰富的必需氨基酸、黄酮苷、甜叶悬钩子苷、多酚、维生素以及人体所必需的多种微量元素；甜叶悬钩子粗提物具有降糖、降脂、抗炎、抗过敏、改善皮肤瘙痒等多种药理活性。
多糖是一类具有广泛生物活性的天然大分子化合物，广泛分布于自然界高等植物、藻类、微生物(细菌和真菌)及动物体内。多糖类物质是除蛋白质和核酸之外的又一类重要的生物大分子，是很多植物药发挥药效的物质基础，植物多糖具有复杂的、多方面的生物活性和功能，如免疫调节功能、抗感染、抗辐射、抗凝血、降血糖、降血脂、促进核酸与蛋白质的生物合成以及抗衰老等作用。如甘草多糖具有明显的抗病毒和抗肿瘤作用；黑木耳多糖、银杏外种皮多糖和芦荟多糖可抗肿瘤和增强人体免疫功能；柴胡多糖具有抗辐射、增强免疫功能等生物学作用；麦冬多糖具有降血糖及免疫增强作用；爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用；茶叶多糖、灵芝多糖、大蒜多糖及黑木耳多糖等植物多糖具有抗凝血作用等。目前已有部分天然多糖类化合物用于临床，显示出良好疗效，已成为天然药物及保健品研发中的重要部分。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取的水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖的混合物甜叶悬钩子多糖用于抑制血液的凝固。
本发明所采用的技术方案是：
1.从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖
(1)将甜叶悬钩子干叶粉碎后，用体积百分数为80％-85％的乙醇水溶液在60-80℃浸泡80-100min，抽滤，弃滤液，滤渣用去离子水在50-70℃保温浸取两次，每次90-150min，冷却后抽滤，滤渣留下一步(2)提取用，合并两次滤液，加入相当于浓缩物三倍体积的无水乙醇，4℃静置过夜沉淀，离心分离，得到沉淀物a，称重，用丙酮、***、乙醇交替洗涤3次，加去离子水溶解，加入相当于沉淀a质量的2％-3％的三氯乙酸，于4℃静置90-150min，离心分离，滤渣留下一步(2)提取用，取上清滤液置于蒸馏水中透析20-30h，每隔8h换一次透析液，透析后的溶液冷冻干燥，即得到水溶性甜叶悬钩子多糖；
(2)合并以上(1)中去离子水提取抽滤后的滤渣和后续离心分离的滤渣，加入质量百分数为0.5％草酸铵水溶液，在85-95℃搅拌，提取2-3次，每次40-80min，冷却，抽滤，滤渣留下一步(3)提取用，滤液用冰醋酸调pH值为5-6，于50-60℃减压蒸馏浓缩，加入相当于浓缩物三倍体积的无水乙醇，沉淀，离心分离，得到沉淀b，称重，沉淀b用丙酮、***、乙醇交替洗涤3次，加去离子水溶解，加入相当于沉淀b质量2％-3％的三氯乙酸，4℃静置90-150min，离心分离，滤渣留下一步(3)提取用，取上清滤液置于蒸馏水中透析20-30h，每隔8h换一次透析液，透析后的溶液冷冻干燥，即得到草酸盐溶果胶类甜叶悬钩子多糖；
(3)合并以上(2)中草酸铵水溶液提取抽滤后的滤渣和后续离心分离的滤渣，加入0.5mol/LNaOH水溶液，室温N2流下提取2-3次，每次40-80min，过滤，离心分离，上清滤液以冰醋酸调pH值为5-6，于50-60℃减压蒸馏浓缩，加入相当于浓缩物三倍体积的无水乙醇，沉淀，离心分离，得到沉淀c，沉淀物c用丙酮、***、乙醇交替洗涤3次，加去离子水溶解，加入相当于沉淀c质量2％-3％的三氯乙酸，于4℃静置90-150min，离心分离，取上清滤液置于蒸馏水中透析20-30h，每隔8h换一次透析液，透析后的溶液冷冻干燥，即得到碱溶性甜叶悬钩子多糖。
2.将以上1中(1)、(2)、(3)分别提取的蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖混合，即为甜叶悬钩子多糖，其优选的混合质量比为1∶1∶1。
3.从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖结构特征的检测
(1)总糖含量、糖醛酸含量、蛋白质含量
采用苯酚-硫酸法测定蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖的总糖含量，采用间羟基联苯比色法测定其糖醛酸含量，采用考马斯亮蓝法测定其蛋白质含量，结果见实施例表1。
(2)单糖组成
采用气相色谱测定蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖单糖组成，结果显示，甜叶悬钩子提取水溶性多糖主要由核糖、***糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖5种单糖组成，其摩尔比为0.146∶0.403∶17.745∶1.436∶0.382；草酸盐溶果胶类多糖主要由鼠李糖、核糖、***糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖7种单糖组成，其摩尔比为0.1081∶0.2478∶0.1056∶0.0851∶40.558∶1.52∶0.2797；碱溶性多糖主要由***糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖5种单糖组成，其摩尔比为0.5386∶0.2686∶29.441∶1.354∶0.2556。
(3)红外光谱
甜叶悬钩子提取水溶性多糖中较大的吸收峰有3409.92cm-1、1648.13cm-1、1410.84cm-1、1237.84cm-1、1098.03cm-1、875.06cm-1，如实施例图1所示。3409.92cm-1附近出现强吸收峰是由于糖类的O-H和蛋白质N-H伸缩振动引起的，存在分子内氢键；在3000-2800cm-1之间存在小的吸收峰，是糖类C-H伸缩振动(-CH2-)引起的吸收峰；1648.13cm-1附近的吸收峰属于酰胺I带吸收峰；1410.84cm-1附近的吸收峰是由C-C-H或H-C-O产生的，而在1237.84cm-1处的吸收峰也是由该基团中的C-O产生的，1098.03cm-1附近为糖醛酸的特征吸收峰；在875.06cm-1处的特征吸收峰，是β-D-吡喃糖C-H的变角振动所引起的，表明该组分含有β-D-吡喃葡萄糖环，分子以β-糖苷键连接，650-450cm-1处出现吸收峰表明甜叶悬钩子提取水溶性多糖中含有酰氨基，由红外光谱图可以推断甜叶悬钩子提取水溶性多糖是β-D-吡喃环蛋白多糖。
甜叶悬钩子提取草酸盐溶果胶类多糖中较大吸收峰有3422.90cm-1、2933.82cm-1、1743.95cm-1、1630.19cm-1、1441.18cm-1、1328.22cm-1、1235.27cm-1、1143.57cm-1、1101.65cm-1、1019.05cm-1、919.11cm-1、829.50cm-1、637.11cm-1、536.19cm-1，如实施例图2所示。3422.90cm-1出现强吸收峰是由于糖类的O-H和蛋白质N-H伸缩振动引起的，存在分子内氢键；2933.82cm-1处出现小的吸收峰，是糖类C-H伸缩振动(-CH2-)引起的吸收峰；1743.95cm-1、1630.19cm-1是氨基酸的C＝O和N-H的变角振动引起的强吸收峰，证明有蛋白质的存在；1441.18cm-1、1328.22cm-1、1235.27cm-1这几组峰是糖类的O-H内面弯曲振动、-CH2-的摇摆和扭曲振动；1143.57cm-1、1101.65cm-1、1019.05cm-1附近的三个强吸收峰说明甜叶悬钩子提取草酸盐溶果胶类多糖为吡喃糖；916.71cm-1、829.50cm-1附近的吸收峰表明该多糖具有α-糖苷键；637.11cm-1、536.19cm-1处出现吸收峰，表明该多糖结构中存在酰氨基，由红外光谱分析可推测甜叶悬钩子提取草酸盐溶果胶类多糖是含有α构型吡喃环的糖蛋白缀合物。
甜叶悬钩子提取碱溶性多糖中较大的吸收峰有3415.47cm-1、2930.30cm-1、1648.60cm-1、1405.68cm-1、1042.51cm-1、896.23cm-1、645.26cm-1，如实施例图3所示。在3415.47cm-1出现的吸收峰，是糖类分子内或分子间O-H键的伸缩振动，2930.30cm-1处出现一个弱吸收峰，是糖类不对称C-H的伸缩振动，1648.60cm-1处的吸收峰，是-CHO的C＝O造成的，1405.68cm-1处的吸收峰属于C-H的变角振动吸收峰；1042.51cm-1处的吸收峰是C-O-C基团振动所致或六元环C-H面内弯曲振动，896.23cm-1处的特征吸收峰，是β-D-吡喃糖C-H的变角振动所引起的，表明该组分含有β-D-吡喃葡萄糖环，分子以β-糖苷键连接，1548.74cm-1和645.26cm-1处出现吸收峰，表明结构中存在酰氨基，由此可推断甜叶悬钩子提取碱溶性多糖可能是一种含有β构型的吡喃环蛋白多糖。
(4)平均分子量及分子量分布
通过高效凝胶渗透色谱法测定从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取的水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖的分子量，结果如实施例图4-6以及表2所示。从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取的水溶性多糖重均分子量Mw为8.29E+04，数均分子量Mn为3.29E+03，质均分子量Mz为1.80E+06，Mw/Mn为25.23；从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取的草酸盐溶果胶类多糖重均分子量Mw为7.90E+05，数均分子量Mn为7.63E+03，质均分子量Mz为4.96E+06，Mw/Mn为103.54；从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取的水溶性多糖重均分子量Mw为1.35E+06，数均分子量Mn为5.28E+03，质均分子量Mz为4.04E+06，Mw/Mn为25.68。
4.从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖的混合物甜叶悬钩子多糖用于抑制血液的凝固
(1)制备贫血小板血浆
20周龄雄性家兔，麻醉，静脉取血，置于枸橼酸钠凝血试管中，抗凝剂与血液的比例为1∶9，充分混匀，2800-3200rpm离心8-12min，分离血浆，分装至离心管内，制得贫血小板血浆(PPP)，-20℃保存，备用。
(2)血液凝固抑制的应用
1)样品制备：取甜叶悬钩子提取的水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖及以上三者以质量比1∶1∶1混合的混合物甜叶悬钩子多糖，分别溶于生理盐水，配制成0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L甜叶悬钩子提取水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖及以上三者的混合物甜叶悬钩子多糖各溶液为待测样品，进行体外血液凝固抑制活性测定，待测样品与贫血小板血浆(PPP)以1∶4的体积比混匀，此为待测血浆，3.06μg/mL浓度的肝素作为阳性对照，等量生理盐水作为溶剂对照。
2)凝血酶时间(Thrombintime，TT)的测定：取37℃预温3min的待测血浆0.2mL，加入37℃预温的TT试剂0.2mL，混匀，开动秒表计时，不断地倾斜试管至液体流动缓慢趋于停止时，终止计时，记录所需时间，重复测定3次以上。
3)凝血酶原时间(Prothrombintime，PT)的测定：取37℃预温3min的待测血浆0.1mL，加入37℃预温的PT试剂0.2mL，混匀，开动秒表计时。不断地倾斜试管至液体流动缓慢趋于停止时，终止计时，记录所需时间，重复测定3次以上。
4)活化部分凝血酶原时间(Aetivedpartialthromboplastintime，APTT)的测定方法：取37℃预温3min的待测血浆0.1mL，加入37℃预温的APTT试剂0.1mL，37℃孵育5min，再加入37℃预温的0.025mol/LCaCl2溶液0.1mL，混匀，开动秒表计时，不断地倾斜试管至液体流动缓慢趋于停止时，终止计时，记录所需时间，重复测定3次以上。
5)统计学处理：数据以均数±标准差表示，用SPSS13.0统计学软件进行方差分析，组间比较采用Dunett’s检验，P≤0.05具有统计学意义。
本发明的应用效果：从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取的水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖及其混合物甜叶悬钩子多糖均能延长TT、PT以及APTT，其中以甜叶悬钩子多糖混合物作用最强，表现出较强的体外抑制血液凝固的作用。蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子在民间有悠久的应用历史，其食用性以及药用性早已为当地民间医药所证实。较之于传统抗凝药物如最常用的口服抗凝药华法林，从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取的甜叶悬钩子多糖则更加安全和方便，具有较高的有效/安全系数等特点；较之于临床最常用的抗凝药肝素，由于肝素口服不吸收，需要注射用药，而甜叶悬钩子多糖不仅口服吸收良好，且口感良好，适于长期应用；而较之于只能延长APTT的茶多糖，甜叶悬钩子多糖既能延长APTT，也能延长TT以及PT，表明甜叶悬钩子多糖既能通过影响内源性以及外源性凝血***而发挥抗凝血作用，也能通过增强纤维蛋白溶解活性而发挥抗凝血作用。从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取的甜叶悬钩子多糖作为抗凝剂具有安全、有效、廉价且使用方便等特点，极具开发价值，应用前景看好。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
实施例
1.从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖和碱溶性多糖
(1)将甜叶悬钩子干叶粉碎后，用体积分数为80％的乙醇70℃提取90min，抽滤，弃滤液，滤渣用去离子水60℃保温提取两次，每次120min，冷却后抽滤，滤渣留下一步(2)提取用，合并两次滤液，55℃减压蒸馏浓缩，加入三倍体积的无水乙醇沉淀，4℃静置过夜；抽滤收集沉淀a，称重，沉淀a用丙酮、***、乙醇交替洗涤3次，用去离子水溶解，加入相当于沉淀a质量2.5％的三氯乙酸，4℃静置120min；离心，取上清滤液透析24h，每隔8h换一次透析液(蒸馏水)，透析后的溶液冷冻干燥，得到水溶性甜叶悬钩子多糖；
(2)合并以上(1)中去离子水提取抽滤后的滤渣和后续离心分离的滤渣，加入质量百分数为0.5％草酸铵水溶液90℃搅拌提取2次，每次60min，冷却后抽滤，滤渣留下一步(3)提取用，滤液用冰醋酸调pH值为5.5，55℃减压蒸馏浓缩，加入三倍体积的无水乙醇沉淀，离心收集沉淀b，称重，沉淀b用丙酮、***、乙醇交替洗涤3次，去离子水溶解，加入相当于沉淀b质量2.5％的三氯乙酸，4℃静置120min，离心分离，滤渣留下一步(3)提取用，取上清滤液置于蒸馏水中透析24h，每隔8h换一次透析液，透析后的溶液冷冻干燥，得到草酸盐溶果胶类甜叶悬钩子多糖；
(3)合并以上(2)中草酸铵水溶液提取抽滤后的滤渣和后续离心分离的滤渣，加入0.5mol/LNaOH水溶液，室温N2流下提取2次，每次60min，过滤，离心分离，上清滤液以冰醋酸调pH值为5.5，55℃减压蒸馏浓缩，加入三倍体积的无水乙醇沉淀，离心收集沉淀c，沉淀物c用丙酮、***、乙醇交替洗涤3次，去离子水溶解，加入相当于沉淀c质量2.5％的三氯乙酸，4℃静置120min，离心分离，取上清滤液置于蒸馏水中透析24h，每隔8h换一次透析液，透析后的溶液冷冻干燥，得到碱溶性甜叶悬钩子多糖。
2.将以上1中(1)、(2)、(3)方法分别提取的蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖按照1∶1∶1的质量比例混合，即得甜叶悬钩子多糖。
3.从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖结构特征的检测
(1)总糖含量、糖醛酸含量、蛋白质含量
采用苯酚-硫酸法测定蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖的总糖含量；采用间羟基联苯比色法测定其糖醛酸含量；采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，其结果见表1。
表1甜叶悬钩子提取多糖总糖含量、糖醛酸含量、蛋白质含量
(2)单糖组成
采用气相色谱测定蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖单糖组成，结果显示，甜叶悬钩子提取水溶性多糖主要由核糖、***糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖5种单糖组成，其摩尔比为0.146∶0.403∶17.745∶1.436∶0.382；草酸盐溶果胶类多糖主要由鼠李糖、核糖、***糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖7种单糖组成，其摩尔比为0.1081∶0.2478∶0.1056∶0.0851∶40.558∶1.52∶0.2797；碱溶性多糖主要由***糖、岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖5种单糖组成，其摩尔比为0.5386∶0.2686∶29.441∶1.354∶0.2556。
(3)红外光谱
甜叶悬钩子提取水溶性多糖中较大的吸收峰有3409.92cm-1、1648.13cm-1、1410.84cm-1、1237.84cm-1、1098.03cm-1、875.06cm-1，如图1所示。图1中，3409.92cm-1附近出现强吸收峰是由于糖类的O-H和蛋白质N-H伸缩振动引起的，存在分子内氢键；在3000-2800cm-1之间存在小的吸收峰，是糖类C-H伸缩振动(-CH2-)引起的吸收峰；1648.13cm-1附近的吸收峰属于酰胺I带吸收峰；1410.84cm-1附近的吸收峰是由C-C-H或H-C-O产生的；而在1237.84cm-1处的吸收峰也是由该基团中的C-O产生的；1098.03cm-1附近为糖醛酸的特征吸收峰；在875.06cm-1处的特征吸收峰，是β-D-吡喃糖C-H的变角振动所引起的，表明该组分含有β-D-吡喃葡萄糖环，分子以β-糖苷键连接；650-450cm-1处出现吸收峰是表明茶多糖中含有酰氨基；由红外光谱可以推断甜叶悬钩子提取水溶性多糖是β-D-吡喃环蛋白多糖。
甜叶悬钩子提取草酸盐溶果胶类多糖中较大吸收峰有3422.90cm-1、2933.82cm-1、1743.95cm-1、1630.19cm-1、1441.18cm-1、1328.22cm-1、1235.27cm-1、1143.57cm-1、1101.65cm-1、1019.05cm-1、919.11cm-1、829.50cm-1、637.11cm-1、536.19cm-1，如图2所示。图2中，3422.90cm-1出现强吸收峰是由于糖类的O-H和蛋白质N-H伸缩振动引起的，存在分子内氢键；2933.82cm-1处出现小的吸收峰，是糖类C-H伸缩振动(-CH2-)引起的吸收峰；1743.95cm-1、1630.19cm-1是氨基酸的C＝O和N-H的变角振动引起的强吸收峰，证明有蛋白质的存在；1441.18cm-1、1328.22cm-1、1235.27cm-1这几组峰是糖类的O-H内面弯曲振动、-CH2-的摇摆和扭曲振动；1143.57cm-1、1101.65cm-1、1019.05cm-1附近的三个强吸收峰说明甜叶悬钩子提取草酸盐溶果胶类多糖为吡喃糖；916.71cm-1、829.50cm-1附近的吸收峰表明该多糖具有α-糖苷键；637.11cm-1、536.19cm-1处出现吸收峰，表明该多糖结构中存在酰氨基，由红外光谱分析可推测甜叶悬钩子提取草酸盐溶果胶类多糖是含有α构型吡喃环的糖蛋白缀合物。
甜叶悬钩子提取碱溶性多糖中较大的吸收峰有3415.47cm-1、2930.30cm-1、1648.60cm-1、1405.68cm-1、1042.51cm-1、896.23cm-1、645.26cm-1，如图3所示。图3中，在3415.47cm-1出现的吸收峰，是糖类分子内或分子间O-H键的伸缩振动；2930.30cm-1处出现一个弱吸收峰，是糖类不对称C-H的伸缩振动；1648.60cm-1处的吸收峰，是-CHO的C＝O造成的；1405.68cm-1处的吸收峰属于C-H的变角振动吸收峰；1042.51cm-1处的吸收峰是C-O-C基团振动所致或六元环C-H面内弯曲振动；896.23cm-1处的特征吸收峰，是β-D-吡喃糖C-H的变角振动所引起的，表明该组分含有β-D-吡喃葡萄糖环，分子以β-糖苷键连接；1548.74cm-1和645.26cm-1处出现吸收峰，表明结构中存在酰氨基，由此推断甜叶悬钩子提取碱溶性多糖可能是一种含有β构型的吡喃环蛋白多糖。
(4)平均分子量及分子量分布
通过高效凝胶渗透色谱法测定从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取的水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖的分子量，结果如图4-6以及表2所示。
表2甜叶悬钩子提取多糖分子量及分布
注：Mw为重量平均分子量，Mn为数均分子量，Mz为质均分子量
4.从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖以质量比1∶1∶1混合的混合物甜叶悬钩子多糖用于抑制血液的凝固
(1)制备贫血小板血浆
20周龄雄性家兔，麻醉，静脉取血，置于枸橼酸钠凝血试管中，抗凝剂与血液的比例为1∶9，充分混匀，2800-3200rpm离心8-12min，分离血浆，分装至离心管内，制得贫血小板血浆(PPP)，-20℃保存，备用。
(2)血液凝固抑制的应用
1)样品制备：取甜叶悬钩子提取的水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖及以上三者以质量比1∶1∶1混合的混合物甜叶悬钩子多糖，分别溶于生理盐水，配制成0.5g/L、1.0g/L、2.0g/L甜叶悬钩子提取水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖及甜叶悬钩子多糖各溶液为待测样品，进行体外血液凝固抑制活性测定，待测样品与贫血小板血浆(PPP)以1∶4的体积比混匀，此为待测血浆，3.06μg/mL浓度的肝素作为阳性对照，等量生理盐水作为溶剂对照。
2)凝血酶时间(Thrombintime，TT)的测定：取37℃预温3min的待测血浆0.2mL，加入37℃预温的TT试剂0.2mL，混匀，开动秒表计时，不断地倾斜试管至液体流动缓慢趋于停止时，终止计时，记录所需时间，重复测定3次以上。
3)凝血酶原时间(Prothrombintime，PT)的测定：取37℃预温3min的待测血浆0.1mL，加入37℃预温的PT试剂0.2mL，混匀，开动秒表计时。不断地倾斜试管至液体流动缓慢趋于停止时，终止计时，记录所需时间，重复测定3次以上。
4)活化部分凝血酶原时间(Aetivedpartialthromboplastintime，APTT)的测定：取37℃预温3min的待测血浆0.1mL，加入37℃预温的APTT试剂0.1mL，37℃孵育5min，再加入37℃预温的0.025mol/LCaCl2溶液0.1mL，混匀，开动秒表计时，不断地倾斜试管至液体流动缓慢趋于停止时，终止计时，记录所需时间，重复测定3次以上。
5)统计学处理：数据以均数±标准差表示，用SPSS13.0统计学软件进行方差分析，组间比较采用Dunett’s检验，P＜0.05具有统计学意义。
6)通过凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血酶原时间(APTT)的测定结果表明，甜叶悬钩子提取的水溶性多糖具有体外抑制血液凝固的作用，其均能延长TT、PT以及APTT，量效关系明显，结果如表3所示；甜叶悬钩子提取的草酸盐溶果胶类多糖具有体外抑制血液凝固的作用，其在较高剂量时能延长TT、PT以及APTT，结果如表4所示；甜叶悬钩子提取的碱溶性多糖具有体外抑制血液凝固的作用，其能延长PT及APTT，量效关系明显，在较高剂量时能延长TT，结果如表5所示；甜叶悬钩子提取的水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖以质量比1∶1∶1混合的混合物甜叶悬钩子多糖均能延长TT、PT以及APTT，量效关系明显，且表现出较之以上三者更强的效价强度，结果如表6所示。
表3不同浓度甜叶悬钩子提取的水溶性多糖
体外抑制凝血活性((*与生理盐水比较P≤0.05)
表4不同浓度甜叶悬钩子提取的草酸盐溶果胶类多糖
体外抑制凝血活性(*与生理盐水比较P≤0.05)
表5不同浓度甜叶悬钩子提取的碱溶性多糖
体外抑制凝血活性(*与生理盐水比较P≤0.05)
表6不同浓度甜叶悬钩子多糖体外抑制凝血活性(*与生理盐水比较P≤0.05)
附图说明
图1是甜叶悬钩子提取水溶性多糖红外光谱图；
图2是甜叶悬钩子提取草酸盐溶果胶类多糖红外光谱图；
图3是甜叶悬钩子提取碱溶性多糖红外光谱图；
图4是甜叶悬钩子提取水溶性多糖高效凝胶渗透色谱图；
图5是甜叶悬钩子提取草酸盐溶果胶类多糖高效凝胶渗透色谱图；
图6是甜叶悬钩子提取碱溶性多糖高效凝胶渗透色谱图。
Claims (4)
1.一种甜叶悬钩子多糖用于抑制血液的凝固。
2.根据权利要求1所述的一种甜叶悬钩子多糖，其特征是从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取的水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖的混合物。
3.根据权利要求1所述的甜叶悬钩子多糖，其特征是从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取的水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖按照质量比1∶1∶1混合的混合物。
4.根据权利要求2所述，从蔷薇科悬钩子属植物甜叶悬钩子提取水溶性多糖、草酸盐溶果胶类多糖、碱溶性多糖的方法为：
(1)将甜叶悬钩子干叶粉碎后，用体积百分数为80％-85％的乙醇水溶液在60-80℃浸泡80-100min，抽滤，弃滤液，滤渣用去离子水在50-70℃保温浸取两次，每次90-150min，冷却后抽滤，滤渣留下一步(2)提取用，合并两次滤液，加入相当于浓缩物三倍体积的无水乙醇，4℃静置过夜沉淀，离心分离，得到沉淀物a，称重，用丙酮、***、乙醇交替洗涤3次，加去离子水溶解，加入相当于沉淀a质量的2％-3％的三氯乙酸，于4℃静置90-150min，离心分离，滤渣留下一步(2)提取用，取上清滤液置于蒸馏水中透析20-30h，每隔8h换一次透析液，透析后的溶液冷冻干燥，即得到水溶性甜叶悬钩子多糖；
(2)合并以上(1)中去离子水提取抽滤后的滤渣和后续离心分离的滤渣，加入质量百分数为0.5％草酸铵水溶液，在85-95℃搅拌，提取2-3次，每次40-80min，冷却，抽滤，滤渣留下一步(3)提取用，滤液用冰醋酸调pH值为5-6，于50-60℃减压蒸馏浓缩，加入相当于浓缩物三倍体积的无水乙醇，沉淀，离心分离，得到沉淀b，称重，沉淀b用丙酮、***、乙醇交替洗涤3次，加去离子水溶解，加入相当于沉淀b质量2％-3％的三氯乙酸，4℃静置90-150min，离心分离，滤渣留下一步(3)提取用，取上清滤液置于蒸馏水中透析20-30h，每隔8h换一次透析液，透析后的溶液冷冻干燥，即得到草酸盐溶果胶类甜叶悬钩子多糖；
(3)合并以上(2)中草酸铵水溶液提取抽滤后的滤渣和后续离心分离的滤渣，加入0.5mol/LNaOH水溶液，室温N2流下提取2-3次，每次40-80min，过滤，离心分离，上清滤液以冰醋酸调pH值为5-6，于50-60℃减压蒸馏浓缩，加入相当于浓缩物三倍体积的无水乙醇，沉淀，离心分离，得到沉淀c，沉淀物c用丙酮、***、乙醇交替洗涤3次，加去离子水溶解，加入相当于沉淀c质量2％-3％的三氯乙酸，于4℃静置90-150min，离心分离，取上清滤液置于蒸馏水中透析20-30h，每隔8h换一次透析液，透析后的溶液冷冻干燥，即得到碱溶性甜叶悬钩子多糖。
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