CN104871357B - 电化学生物反应器模块和使用所述模块的方法 - Google Patents

电化学生物反应器模块和使用所述模块的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种装置和使用所述装置的方法，用于通过生物学方法制备通用化学品，其需要添加还原性等效物。所述装置允许方便地改变操作条件以实现给定生物介导的氧化还原反应、一系列反应或发酵过程的最大电化学效率。

Description

电化学生物反应器模块和使用所述模块的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年9月9日提交的美国临时申请号61/698,702的优先权和权益，该申请的公开内容在此以全文引用的方式并入本文中。
发明技术领域
本发明总体上涉及使用生物介导的反应，其改变化合物的氧化状态，并且具体地说改变给定化合物中的碳原子的氧化状态。
背景
在化学反应的情形下，还原是特定化学物质获得电子，而氧化是特定化学物质失去电子。一般术语氧化还原反应(redox reaction)是氧化-还原反应(oxidation-reduction reaction)的缩写。氧化还原反应是涉及电子从一种化学物质传递至另一种化学物质的反应。电化学电池被定义为如下的***，其利用氧化还原反应的组合以产生有用的电能，或使用电能来驱动有用的氧化还原反应的组合(Silberberg,Martin(2009)Chemistry:The Molecular Nature of Matter and Change(第5版)New York,NY:McGraw-Hill)。
电化学电池含有被称为阳极和阴极的两个电极。在阴极处发生电子从电极到化学物质的传递，即还原反应，而在阳极处发生电子从化学物质到电极的传递，即氧化反应。为了平衡阴极处电子的损耗与阳极处电子的累积，在电化学电池的外部的电子必须以某种方式从阳极流向阴极，即通过导线或允许电子移动的一些其它材料。电子的这种流动是电流，并且可以被利用来执行工作，例如驱动电子装置。相反地，电子从阳极流向阴极可由诸如电池的外部电源驱动，从而使得在阳极或阴极或两者处发生有用的化学反应。
电化学电池可以被构建成产生电流，即由发生在阳极和阴极处的自发氧化还原反应引起的电子通过诸如导线的导电元件的单向流动，或者它可以被构建成消耗由诸如电池的外部来源提供的电流，以驱动在阳极和阴极处的非自发反应。在后一种情况下，电驱动、非自发反应可称为电合成。
电化学电池需要发生两个反应，一个在阳极处，且一个在阴极处，每个电极处发生的反应称为半电池反应，或半反应。不管电化学电池是被消耗还是产生电流，阳极与阴极处均必需同时发生半电池反应。
半电池反应被认为具有正的或负的还原/氧化电位，称为氧化还原电位；其为半电池反应的氧化型和还原型物质之间的平衡常数，其以伏特表示并且是相对于氢离解为质子和电子来说的，氢离解为质子和电子被认为具有零伏的氧化还原电位。
使得环境的氧化还原电位比给定半电池反应的氧化还原电位更正的条件将迫使半电池反应朝向反应的氧化型物质进行。使得环境的氧化还原电位比给定半电池反应的氧化还原电位更负的条件将迫使半电池反应朝向半电池反应的还原型物质进行。
通过供应来自外部来源的电子，即在电化学电池的阴极室施加来自外部电源的负电压时，可使得阴极室中环境的氧化还原电位更负。这种效应可用于迫使半电池反应朝向还原型物质。为了平衡这种情况，半电池反应必需在阳极室中在相应的正电压下发生，从而迫使阳极处的半电池反应朝向氧化型物质进行。
因此，向电化学电池的阴极室中的环境中提供电子将迫使半电池反应产生其还原型物质。
导致特定化学物质的还原或氧化的任何反应均可提供有用的半电池反应。这包括生命***，其中所要的半反应存在于执行有机化合物的转化并且由酶催化的代谢途径中。如前面所指出，半电池反应一般称为氧化还原反应，因此催化此类半反应的酶通常称为氧化还原酶。典型地，但不排他地，氧化还原酶需要称为辅酶或辅因子的其它生物组分，并且正是这些辅酶或辅因子在催化给定生物***中的半电池反应(氧化还原反应)的各种氧化还原酶之间以物理方式传输电子。
为了使微生物产生对微生物本身有用(诸如对于细胞膜来说的脂肪酸)或适用作市售产品(诸如乙醇)的有机分子，必要的是使微生物消耗向微生物提供的一些形式的碳。典型地，这是糖或碳水化合物，但也可以是可以由微生物代谢的基本上任何有机分子。另外，微生物必须改变存在于向微生物提供的含碳分子中的碳原子的氧化状态，并且这个行为是基本细胞代谢的主要部分。为了氧化给定的碳原子，微生物的代谢过程必须从相关碳原子中去除电子，而为了还原给定的碳原子，代谢过程必须向相关碳原子提供电子。
在氧化的情况下，这容易通过使用来自环境(例如来自空气)的分子氧作为电子“池”来实现，并且在所述过程中，氧分子被电化学还原，典型地产生两个水分子。
在还原的情况下，微生物的代谢过程必须氧化一些其它化学物质，以提供电子来执行所要的还原。在依靠诸如碳水化合物的碳源生长的微生物的情况下最通常的是，通过将碳水化合物的一部分完全氧化为CO2来产生还原性等效物，即向微生物提供的碳水化合物中的一些被牺牲氧化，以便为微生物提供用于代谢过程中的电子，所述代谢过程产生还原程度更高的有机分子。虽然所得电子是所希望的并且对微生物有用，但因氧化为CO2而牺牲的碳原子损失了。
存在于起初输入的糖或碳水化合物中的碳原子的这种损失使微生物可以从给定质量的所输入的例如糖或碳水化合物的碳质材料制备的产物的量减少。举例来说，为了使微生物从葡萄糖产生乙醇，必要的是使微生物产生电子，用于使葡萄糖转化为乙醇的代谢步骤。这是通过将葡萄糖中的一些牺牲氧化为CO2以使剩余的葡萄糖可以转化为乙醇来实现。在这个过程中，对于向微生物提供的用于转化为乙醇的每180g葡萄糖来说，88g以CO2形式损失，并且生产仅92g乙醇。因此，对于向商业发酵过程中提供的每公吨葡萄糖来说，可以产生最多仅511kg乙醇，同时产生489kg CO2。
仅考虑存在于葡萄糖分子中的碳原子，即6个碳原子，仅4个碳原子存在于所要的乙醇产物，同时所述碳原子中有两个以CO2形式被损失。因此，葡萄糖到乙醇的发酵的“碳效率”仅为三分之二。
在理论上是可能在不形成CO2的情况下将葡萄糖转化为乙醇的(参见美国专利申请公布号20120052542(2012年3月1日))，但这需要以电化学方式供应必需的还原性等效物。
类似的计算将适用于牺牲一些所输入的碳质材料以提供用于所要的代谢过程中的电子的所有代谢过程。
如果可以由外部来源(即电流)提供电子，那么对牺牲所输入的碳质材料以提供电子的需要会降低或消除，并且诸如刚才关于产生乙醇所给出的实例的过程的碳效率可以达到100％。对于由葡萄糖产生乙醇的实例来说，如果可以提供足够的电子来促使碳效率为100％，那么从一公吨葡萄糖可以产生700kg乙醇，而不是仅511kg。此外，未产生CO2。
在用于产生琥珀酸、正丁醇、异丁醇、甲烷、己二酸以及需要从向发酵过程中提供的碳水化合物起始物质产生还原性等效物的任何其它产物的发酵过程中可以实现显著提高的碳效率。
因此，非常理想的是由外部来源向生物***提供电子，否则将牺牲一些所输入的碳质材料用于产生有用的化合物。在所述理想过程中，来自所输入材料的向代谢过程提供的碳原子全部可以转化为所要的产物。这肯定使一般情况(即未提供外部电子并且所输入的碳质材料中的一些必须被牺牲氧化)下的化学反应的化学计量变为碳效率为100％的化学计量。结果是在给定化学反应中氢化学计量与碳化学计量“解耦”。
一些生物***可以直接利用氢气作为还原剂，即作为电子源。然而，氢气的物理储存、运输以及处理是没有吸引力的。现场产生氢气可以避免那些没有吸引力的问题中的一些，但氢气在发酵***中的必要的混合受氢气在水中的极低溶解度以及氢气气泡与周围的水性流体之间的气/液界面的表面积的限制。为实现有用的氢转移速率，必须考虑发酵器设计和用于搅拌的能量输入，并且这些也没有吸引力。因此，需要引入还原性等效物作为固有地与异构水性生物***相容的电化学物质。
自然界已具有至少一种由外部来源提供电子的方法，用于产生对活细胞有用的化合物，而这是经由光合作用实现。显然，此类电子提供仅对具有光合代谢并且曝露于光源的生物体有效。通过由外部驱动的电流向生物***供应电子，可以为需要还原性等效物的基本上任何化学反应带来由光合作用驱动的化学反应的产率优势。然而，光合作用的生物效率被限制在小于10％，并且在整个生物圈，光合作用通常被认为仅具有介于4％与5％之间的效率(参见Zhu等,Annu.Rev.Plant Biol.61:235-61,2010)。因此，通过用以电化学方式供应的还原性等效物来驱动化学反应，不仅从根本上改变了所述反应的化学计量，而且新的电化学过程可以比天然光合作用过程更大的总能量效率运行。
其他人已认识到这一希望，并且已公布了许多为向生物***递送电子而进行的尝试。
Zeikus等,Journal of Bacteriology,181(8),第2403-2410页,(1999年4月)提供了以下证据：来自还原性等效物的碳源的分离可以有利地改变通过微生物的碳通量，从而增加碳效率并且因此增加产物产率，并且使浪费掉碳的不需要的CO2形成减少。
据记载，丁醇可以通过发酵产生，但产率低仍然是一个难关(参见Machado,C.,“Technical Characteristics and Current Status of Butanol Production and Useas Biofuel,”BIO V Seminario Latinoamericano y del Caribe de Biocombustibles2010,Santiago,Chile(2010年8月17日至18日))。在UCLA，James Liao和同事正试图通过向罗尔斯顿菌(Rolstonia)馈送以电化学方式产生的甲酸酯以制造生物燃料来解决这个问题。然而，对于商业上可行的工艺来说，目前的产率、生产率以及效价需要显著增加(参见AIChE,“Update:Plug-In Bacteria Produce Fuel from CO2,”Chemical EngineeringProgress,第12-13页,2012年5月)。
使用甲酸酯作为碳源以及还原性等效物就碳效率与能量利用来说是有效性最低的方法。基于已设计到有机体中的途径，异丁醇与3-甲基-1-丁醇(3MB)除了分别需要4个和5个甲酸酯碳以外均还分别需要两个或三个额外的甲酸酯分子(HCOO-)，从而形成产物骨架。这些额外的甲酸酯碳原子被细胞以CO2形式由所设计的代谢途径释放。因此，生物体将需要每个异丁醇或3MB分子最少6或7个甲酸酯碳。供应超过这个数目未必降低碳效率或降低能量效率，因为它是更昂贵的并且以电化学方式将二氧化碳还原为甲酸酯然后将水还原为氢气和氧气的效率低。然而，***必须为细胞供应这种过量的碳，以获得适量的电子。
上述努力中的中心问题之一是，微生物细胞与电极之间的直接电子传递以非常低的效率进行(参见Allen,"Cellular Electrophysiology",第247-283页,于J.R.Norris和D.W.Ribbons(编著).Methods in Microbiology.Academic Press,New York,1992)并且电子从生物***载体传递至电极通常需要电子传输介体(参见Fultz等,Anal.Chim.Acta.140:1-18,1982)。
所公布的实例表明，许多方法已用于介导电子从生物***到电极的传递以产生外部电流，即在生物燃料电池的构建和操作中。生物燃料电池是一种使用电化学技术将微生物代谢能力直接转化为电力的装置。(参见例如Allen,"Cellular Electrophysiology",第247-283页,于J.R.Norris和D.W.Ribbons(编著).Methods in Microbiology.AcademicPress,New York,1992；Bennetto等,Biotechnol.Lett.7:699-105,1985；Roller等,J.Chem.Tech.Biotechnol.34B:3-12,1984；以及Thurston等,J.Gen.Microbial.131:1393-1401,1985)。
化学能量可以通过将有机或无机底物的生物降解性氧化与在阳极与阴极之间的界面处的氧化剂的化学还原耦合来转化为电能(参见Willner等,Bioelectrochem.Bioenerg,44:209-214,1998)。在生物燃料电池中，需要两种电子传递，一种用于将电子传递介体的还原与生物氧化代谢耦合，而另一种用于将电子介体的氧化与阴极表面上电子受体的还原耦合，其中电子受体用大气氧再生(参见Ardeleanu等,Bioelectrochem.Bioenerg,11:273-277,1983；以及Delaney等,Chem.Tech.Biotechnol.34b:13-27,1985)。
由大肠杆菌(Escherichia coli)或普通变形杆菌(Proteus vulgaris)所产生的代谢还原能力已被传递至阳极，并且通过使用诸如2-羟基-l,4-萘醌(HNQ)或硫素的介体转化为外部电流(参见Tanaka等,Chem.T ech.Biotechnol.42:235-240,1988；以及Tanaka等,Chem.Tech.Biot echnol.35B:191-197,1985)。
Park等在Biotech.Techniq.11:145-148,1997中证实紫精染料(参见Kim等,Biochem.Biophys.Res.Com.,180:11276-1130,1982；以及Morimyo,J.Bacteriol.170:2136-2142,1988)与碳聚合物交联并且被吸收到脱硫弧菌(Desulfovivriodesulfuricans)细胞膜中可介导电子传递至电极。
Kim等.J.Microbial.Biotechnol.,9:127-13,1999显示含有能够还原Fe(III)的外膜细胞色素的希万氏菌(Shawella putrefacians)具电活性并且它可依靠作为电子受体的乳酸酯生长，其中在复合生物燃料电池中石墨毡电极作为电子受体。
上述实例说明了电子从生物***传递至电极。相反的情况，即电子从电极(阴极)传递至生物***，也是通过使用电子传输介体来改善，并且在这一方面一般使用化合物中性红(NR)。
Zeikus等的美国专利号6,270,649显示中性红是一种改进的电子介体，用于将电力转化为微生物还原能力以获得增强的细胞生长并且产生还原型末端产物(参见Park等,Appl.Environ.Microbioi.65:2912-2917,1999；以及Park等,J.Bacteriol.1812:2403-2410,1999)，或者将微生物还原能力转化为生物燃料电池中的电力(参见Park和Zeik us,Appl.Environ.Microbiol.66:1292-1297,2000)。
Park等.J.Bacteriol.1812:2403-2410,1999通过显示以下结果提供了NR如何在生理上发挥作用的第一生化证据：(i)NR的电还原在化学上与NAD+的还原有关，并且其在生物化学上与质子动力的产生和琥珀酸酯制备有关；以及(ii)NR似乎通过代替膜结合复合物中的甲基萘醌发挥作用。
Park等在Biotech.Lett.22:1301-1304,2000中显示使中性红结合于石墨电极进一步提高了微生物燃料电池的电子传递效率。
发酵和生物转化的电增强还涉及利用生物反应器***中的电极和电子介体以增强还原型末端产物的产生(参见Hongo等,Agri.Biolio.Chem.,43:2075-208111979；Hongo等,Agri.Biolio.Chem.,43:2083-2086,1979；Kim等,1988；Park和Zeikus,J.Bacteriol.181:403-2410,1999；以及Shin等,Appl Microbiol Biotechnol.,DOl1O.1007/s002530100809.网上公布：2001年9月22日。)举例来说，石墨毡电极和可溶性中性红可以使通过发酵产生的琥珀酸酯(参见Park和Zeikus,J.Bacteriol.181：403-24101999)以及通过酵母转化产生的四氢萘醇(Shin等,Appl Microbiol Biotechnol.,DOl1O.1007/s002530100809.网上公布：2001年9月22日)的产率大大提高。
除了使用全细胞(即完整的微生物)来从含碳输入材料产生有用的分子以外，还有可能使用与任何必要的辅因子结合的分离的氧化还原酶来催化氧化还原反应，并且还已提出在电化学电池中使用氧化还原酶，此类氧化还原酶需要使用氧化还原辅因子，诸如NAD+。
限制氧化还原酶在化学合成中(参见例如S.M.Roberts等,Chimicaoggi,1993年7月/8月,第93-104页；以及D.Miyawaki等,Enzg.Microbiol.Technol.15:525-29,1993)或在化学检测中(即生物传感器)(参见例如P.N.Bartlett,Med.And BioI.Eng.and Comput.28:BlO-B7,1990；以及D.Miyawaki等，同上)的利用的一个主要因素是缺少用于再生或再循环电子传递辅因子(例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、醌、黄素腺嘌呤二核苷酸等)的简易***。
虽然电子可以由生物***中的辅因子以单个电子的形式传输，但电子的传输经常以电子对形式进行。在电子对的情况下，还在形式上传输质子，并且因此形式化学物质是氢化物，即携带额外的电子并且因此携带负电荷的氢原子，并且通常写为“H-”。
在生物***内，所述物质在历史上被称为“还原性等效物”，因为向化学物质中形式添加氢化物引起这种化学物质的还原。形式上，需要额外的、第二质子以中和通过添加氢化物物质反应的还原产物将携带的形式负电荷。在生物***中最通常地，必要的质子是简单地经由水合氢离子(即质子化水分子，H3O+)提供。在电化学电池内，可在阳极处产生质子化水分子并且使其迁移到阴极。
Park和Zeikus在J.Bacteriol.181:2403-2410,1999中已报道中性红将经历在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸情况下的可逆的化学氧化还原，即，呈还原形式(NRred)的中性红具有足够低的氧化还原值，所述氧化还原值将使电子传递至氧化还原辅因子NAD+，并且因此使其从其氧化形式还原为其还原形式NADH。在这个过程中，中性红被氧化为物质NRox，其然后可用于接受来自阴极的电子，并且因此返回到还原形式NRred，所述还原形式又可用于还原NAD+。
还已报道，通过在含有微生物的电化学反应器中使用可溶性中性红：微生物可单独依靠电力生长；多样化的微生物可在生物转化的发酵期间过度产生多种还原型生物化学品；并且微生物可在有机质代谢期间产生电力。(参见例如Park等,Appl.Environ.Microbioi.第2912-2917页,1990；Park和Zeikus,Appl.Environ.Microbiol.,66:1292-1297,2000；以及美国专利号6,270,649)。
Zeikus等的美国专利号7,250,288B2讨论了对改进电化学生物反应器***的电极效率的需要，并且提出改进，诸如将烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、中性红以及富马酸酯还原酶键联至电极，以改善电子传递特性。虽然上述方法可改善电子传递特性，但对电极设计和电化学生物反应器***设计以其它方式加以改进也可以是有利的。
关于用于产生氯、臭氧以及过氧化氢的商业规模电化学工艺设备的文献记录：用于实验室电化学研究的电极的大小经常不良地限制了流体流速和团块传输特性，并且提供放大的挑战(Walsh,F.和G.Reade,Analyst,119(1),第797-803页(1994年5月))。
琥珀酸发酵是一种熟知的方法(参见美国专利号5,143,833；5,573,931；5,504,004；以及5,723,322；美国专利申请公布号US2008/0305533和2005/0032195；以及Song,H.和S.Y.Lee,Enzyme and Microbial Technology,39(1),第352-361页(2006))，所述方法可使用所提出的***在工业规模上加以改进。
向微生物提供还原性等效物可通过使NADH再生来完成。标准电位在文献中经常报道为-0.32V，然而根据Karyakin等，在pH 6下-0.59V的电位可能更精确(参见Karyakin等,Electrochemistry Communications 5:677-680,2003)。
用于监测细胞内NADH的各种检测器已描述于美国专利号4,577,110；Armiger等,Chemical Engineering Communications,45(1),第197-206页(1986)；Humphrey等,第20章,Squires,R.G.；G.V.Rekl aitis编,”第124卷,American Chemical Society,Washington,DC,第355-366页(1980)；Ristroph等,Journal of Fermentation Technology,55(6),第599页(1977)；美国专利号5,466,604；以及美国专利号5,401,412。
还原型电子梭可将电子传递至若干不同的吸电子化合物，诸如偶氮染料、多卤代化合物、硝基芳香烃以及氧化型准金属。Van der Zee和Cervantes综述了由电子梭催化的还原性生物转化过程的结果(参见Frank P.Van der Zee和FranciscoJ.Cervantes.Biotechnology Advances27:265-277,2009)。
为了使电化学生物反应器成为商业上可行的，必须对常规***的硬件设计和过程设计作出改变，以使产率和效率提高到实用水平。
此外，虽然Zeikus、Liao以及其他人先前已认识到向生物***提供外部电子的可取性，但其中所提供的实施例中所揭示的用于实现此目的的方法需要以将防止阳极经历与主体生物***的不需要的反应的方式含有阳极。因此，必须进行一些物理布置以提供电子向阳极的传递，同时保持阳极与发酵液(在全细胞的情况下)或缓冲***(在含分离的酶的水性介质的情况下)物理上分离，并且这是用多种膜、盐桥或其它物理构件来实现。需要相对于先前揭示的设计简化电化学电池的设计，并且此外，设计一种用于连续、流过式***(诸如穿过大发酵容器或化学反应器行进的回路)的电池。甚至更需要的是，按以下方式布置电化学电池，该方式利用在阳极处的简单半反应并且以避免使用用于连通阳极室与阴极室的盐桥的方式进行操作，并且当膜用于分隔阳极室与阴极室时减轻了膜污染。
附图简述
图1示出了在一个实施方案中总电化学和电化学电池的一般布置。
图2示出了示例性装置，其使得EBM***的两“侧”为：发酵器侧和去离子水(DI)侧。
图3示出了示例性EBM***设计图。
图4示出了示例性阴极室设计。
图5示出了示例性阳极室设计。
图6示出了EBM***的示例性电解槽部分。
图7图形化地示出了由对照发酵器和连接至EBM单元的发酵器产生的琥珀酸产量的差异。
图8图形化地示出了电流对发酵培养基穿过EBM单元的阴极室的流速的依赖性。
图9示出了电流对流速的线性依赖性以及在流速变得过高时使这种线性依赖性打破的点。
发明概述
在一个方面中，本发明涉及一种装置，其用于调节微生物的各种代谢过程中产生的碳通量，目的是最大化碳效率和产物形成。举例来说，本发明的实施方案使用生物介导的反应，其改变化合物的氧化状态，并且具体地说改变给定化合物中的碳原子的氧化状态。这些反应需要电子传递至由诸如酶、酶的群组或整个微生物细胞的生物介体所作用的化合物或从其传递出来。在一些实施方案中，电子的传递可使用例如电化学电池等物理装置，并且更具体地说，使用具有整体仪器和各种物理属性的电化学电池来进行，所述各种物理属性有利于用于将电子传递至生物***或从生物***传递出来，所述生物***调节还原和氧化反应，并且更具体地说，调节碳原子的还原和氧化，以形成有用的化合物。
本发明的装置可用作用于使用为执行所要氧化还原反应所需的还原性等效物将质子和电子传递至诸如全细胞、单一酶或酶的群组的生物***的构件。
在向氧化还原酶提供还原性等效物的情况下，例如属于酶类别EC 1.1.1.n或EC1.1.1.-的细胞色素P450和乙醇脱氢酶。
在向依靠所提供的碳源进行发酵的全细胞提供还原性等效物的情况下，供应外部还原性等效物将消除或减少为产生驱动所需反应所需的还原性等效物而消耗的所提供的碳源的量。这种方法可允许微生物利用所有给定的碳源以高达100％碳效率产生产物。
在一个方面中，提供一种装置，其包括：容纳于阳极室中的阳极和容纳于阴极室中的阴极，两个腔室由至少一个膜隔开，所述至少一个膜允许中性或带正电荷的水分子穿过膜从一个腔室到达另一个腔室，其中阳极室内部含有与阳极接触的去离子水；在阴极室中与阴极接触的含生物***的水性介质，所述生物***能够执行还原性生物过程；在阳极与阴极之间提供电压的外部电源；以及具有用于控制还原性生物过程的控制构件的检测仪器。
在一些实施方案中，水性介质进一步包含电子传输介体。所述装置进一步可以包括一个部件，用于将水性介质从外部容器再循环穿过阴极室并且返回到外部容器中。外部容器可以是发酵罐。
在某些实施方案中，所述装置可具有一个或多个位于阴极与生物***之间的分隔膜，使得阴极不与生物***直接接触。分隔膜可以形成额外的隔室，并且可保留任选地含于流体介质中的电子传输介体，使得电子传输介体可提供从阴极穿过中间室到达生物学***的电子传输。
在各种实施方案中，电子传输介体可以是腐殖酸和/或中性红。
在另一个方面中，提供一种执行生物***中的还原过程的方法。所述方法包括：提供本文所描述的装置，其中执行还原过程的生物***的至少一部分存在于阴极室中；将适量的电子传输介体放置于阴极隔室中，其中电子传输介体的至少一部分被还原，并且生物***能够进行化学还原；以及由外部电源在阳极与阴极之间施加适当的电压。
在另一个方面中，提供一种用于产生通用化学品的方法。所述方法包括如下使用本文所描述的用于向发酵过程提供还原性等效物的装置：使发酵液流经阴极室；由外部电源在阳极与阴极之间施加电压；并且任选如下利用电子传输介体：(1)将介体直接添加至发酵液中；或(2)将介体提供于分隔膜上。
在各种实施方案中，发酵液可包括用于产生琥珀酸、1,4-丁二醇、乙醇、正丁醇以及/或者异丁醇的发酵产物。发酵液还可包含微生物，其已被改变以增加其利用由本文所描述的装置提供的电子的能力。在一些实施方案中，微生物已在基因上改变以在其细胞膜或表面表达分子，这促进电子传输。
在另一个方面中，提供一种执行生物***中的还原过程的方法。所述方法包括使用本文所描述的装置来向由氧化还原酶催化的反应提供还原性等效物，其中所述反应需要来自生物介体的还原性等效物，并且其中氧化还原酶任选经由电子传输介体接收来自阴极的还原性等效物。生物介体是NADH、NADPH以及/或者FMNH2。酶可包括P450酶和P450还原酶。酶还可包括已被工程化为包括P450还原酶活性的改性P450酶。
在其它实施方案中，本发明的装置和/或方法的其它商业应用包括饮用水或废水处理中的反硝化过程，其中诸如甘油或甲醇的碳源被添加至生物反应器中，以产生还原性等效物用于反硝化细菌。
本发明的详细描述
本发明包括一种***，该***可实现将氢的化学计量与碳的化学计量解耦的新型处理技术。Flynn(参见Flynn等,mBio,1(5),第1-8页,2010)证实了将氢的化学计量与碳的化学计量解耦的技术。本发明涉及用于通过代谢途径来调节碳通量的新方法。适当地控制电流和电压对于递送还原性等效物是必要的，使得作为一系列紧密相关的氧化和还原反应的细胞代谢可得以平衡，以使产物产率和处理效率最大化。本文所描述的***和装置有利地允许所述控制。
本发明的另一优势是用于监测细胞内的NADH或NADPH(“NAD(P)H”)的在线、连续荧光检测器，其将允许实时地对细胞代谢进行新型的监测。
本发明还有利地相对于先前揭示的设计简化了电化学电池的设计，并且此外，提供了一种用于连续、流过式***(诸如穿过大发酵容器或化学反应器行进的回路)的电池。本发明另外按以下方式布置了电化学电池，该方式利用在阳极处的简单半反应并且以避免使用用于连通阳极室与阴极室的盐桥的方式进行操作，并且当膜用于分隔阳极室与阴极室时减轻了膜污染。另外，本发明能够直接物理并入离开发酵器或反应器运行的连续流动回路中，并且因此可与现有基础设施一起使用。
在一些实施方案中，本发明中被称为“电化学生物反应器模块”或EBM。EBM包括具有容纳于阳极室中的阳极、容纳于阴极室中的阴极以及分隔两个腔室的膜的电化学电池。
如图1所示，其示出了在一个实施方案中电化学电池的总电化学和一般布置，从阳极室(“去离子水侧”)到阴极室(“发酵器侧”)的净水通量，以及外部驱动电流和电化学物质。中性红显示为在阴极与氧化还原辅因子NAD+或NADP+(“NAD(P)+”)之间的示例性电子传输介体。为清楚起见，化学计量显示4电子传递(2×2电子)，以避免O2的摩尔数为分数。对于由电化学电池提供的每对电子来说，1个NAD(P)+还原为一个NAD(P)H并且消耗一个水分子。在这个过程中，每形成一个NAD(P)H产生0.5个O2分子。
如图2中所示，EBM***可具有两“侧”，发酵器侧和去离子水(DI)侧。如图所示，发酵器侧含有发酵液、发酵器罐、荧光NADH传感器、用于细胞和无细胞培养液的再循环的任选的超滤***(其过滤发酵液，以收集细胞和其它固体并且将其再循环回到发酵罐中，同时允许无细胞培养液继续到达阴极侧，从而避免细胞或其它固体在阴极侧阻塞流体通道)、发酵器泵以及电解槽的阴极和阴极室、氢气收集和测量***、压力测量***。DI侧含有DI水储集器、DI水泵、水纯化***(用于duel树脂去离子化、过滤、紫外线灭菌以及真空脱气膜的模块)、氧气收集和测量***以及电解槽的阳极和阳极室。
图3示出了示例性EBM***设计图。它显示了EBM***的主要组件，以及所测得并且在整个***中受控制的参数。
在某些实施方案中，用于分隔阳极室和阴极室的膜是改性(DuPont)膜，所述膜只允许质子(呈水合氢离子H30+形式)穿过它行进。所述膜在阳极侧可含有氧催化剂，用于产生氧气。
EBM还可以包括具有整合仪器的电化学电池，所述仪器包括以下中的一种或多种：阳极侧氧气收集***、阴极侧气体收集***、流速控制***、温度测量和控制***、电压和电流测量和调节***、pH值测量***、溶解氧(DO)测量***、电导率测量***、代谢活性(荧光)测量***。所述整合***允许以下具有重大效用的作用：电子和质子传递调节和优化、微生物侧副产品最少化、H2气体消除或最少化、所要产物优化、去离子(DI)水纯度分析、完整质量平衡分析、流速控制、温度控制或其任何组合。
在一些实施方案中，阳极可以是允许适用电流密度的任何方便的设计。举例来说，阳极可以是涂有铂的钛基底。所述阳极设计现可商购获得，并且用于电解槽中。
阳极室可以是允许去离子水的输入、再循环以及温度控制同时允许输出和任选地收集在阳极表面产生的气体(即氧气)的任何方便的设计。图5示出了示例性阳极室设计。
在一个实施方案或使用方法中，阳极室可用去离子水填充，并且施加足够的电压以引起水的电解裂解。这使得阳极室中形成氧气，其可释放到大气中或被捕获用于其它用途。相伴产生的水合氢离子(H3O+)沿电位梯度迁移并且穿过分隔阳极室和阴极室的隔膜。这引起水从阳极室进入阴极室的物理通量。
阴极可以是允许良好电流密度和到达电子传输介体或如果不存在电子传输介体那么直接到达生物***的电子传递的任何方便的设计。在本发明的一个实施方案中，电解槽的阴极具有平行通道，其被设计成用于增加表面积并且最大化流体流量(在存在任何悬浮固体颗粒的情况下)，同时最大化阴极的总电子传递特性。
EBM的阴极室、其物理结构、流动特性和流体流场的设计被设计成用于处理生物培养液，例如发酵液、全细胞的悬浮液以及其它异构生物混合物。阴极室可以是允许发酵液或其它异构混合物流经腔室的任何方便的设计。图4示出了示例性阴极室设计。在一个实施方案中，阴极室由九个蛇形通道组成，所述九个蛇形通道是根据培养液流速、粘度以及培养液中颗粒的大小进行尺寸调节。阴极室中的蛇形通道还被设计成在不降低培养液流速的情况下增强阴极本身的总电子传递。
在另一个实施方案中，阴极室包括主要由碳组成的阴极。这可以是一片实心的碳，其已被加工成具有流通道或增加表面积和异质生物物质与阴极之间的接触时间的其它物理成形物。
在本发明的另一个实施方案中，阴极室包括碳电极，所述碳电极是碳的薄片、碳毡或多孔碳。这在商业上称为“碳纸”，并且可以下商标名获得：Toray Carbon Paper TGP-H-060、Carbon Paper AvCarb。其它类似产品也可获得并且将是本领域技术人员已知的。
图6示出了EBM***的示例性电解槽部分。示出了发酵液穿过阴极室(B)以及水穿过阳极腔(H)的流动。电解槽可在任一端具有端板(A，I)。可将改性PEM(蛋白质交换膜，F)放置在阴极室与阳极室之间。可使用硅垫片(E，G)来放在PEM的侧翼。可将一个或多个任选的膜(D)放置在电解槽中。
在各种实施方案中，可将任选的电子传输介体添加至EBM***中。电子传输介体可与发酵液(其可含有诸如细胞和/或酶的生物***)混合，并且馈入阴极室。电子传输介体还可以保留在定位于阴极室内并且将阴极与生物***分隔开的膜中或由所述膜截留(例如在膜的下方或在附接于膜的外部隔室内)。
在一个实施方案中，所提出的***可以使用腐殖质作为电子传输介体。已显示腐殖质使电子在腐植质还原性微生物与Fe(III)氧化物之间以及从微生物到腐植酸穿梭(参见Lovley等“Humic substances as electron acceptors for microbial respiration”Nature 382,1996年8月)。
还已显示腐植酸将[1,2-14C]氯乙烯和[1,2-14C]二氯乙烯氧化为14CO2(参见Bradley等.,Applied And Environmental Microbiology第64卷,第8期:3102-3105,1998)。已计算了各种腐植酸标准电极电位(参见Z.Struyk和Garrison Sposito,Geoderma102:329-246,2001)。
在一些实施方案中，也可以使用中性红作为电子传输介体。中性红主要是经由诸如烟碱腺嘌呤二核苷酸、NAD+的氧化还原辅因子的直接化学还原来工作(Park和Zeikus,J.Bacteriol.181:403-2410,1999)。
其它电子传输介体(诸如甲基紫精(例如Sonomoto等.,Journal of Bioscienceand Bioengineering,104:3,238-240(2007)和本领域已知的其它电子传输介体)的使用是与本发明相容的。
在第一使用方法中，EBM提供了一种方法，用于减少或消除在全细胞代谢(以活性发酵形式或以保持在允许细胞继续代谢但限制或阻止细胞生长的生理上可接受的介质中的静息细胞形式)期间发生的用于产生还原性等效物的碳的牺牲性损失。不需要的代谢途径的减少或消除将增加所需的碳通量，并且减少不需要的CO2产生。因此，使用EBM体系来产生诸如乙醇、正丁醇、异丁醇、3MB或琥珀酸的示例性化合物将显著提高碳效率。在涉及异丁醇制备和3MB制备的有关代谢途径的实例的情况下，对碳化学计量和氢化学计量的独立控制将允许对异丁醇与3MB的比率进行调节。
在第二使用方法中，EBM***可用于在不存在全细胞的情况下向分离的氧化还原酶提供还原性等效物。酶可包括P450酶和P450还原酶。酶还可包括已被工程化为包括P450还原酶活性的改性P450酶。
在任一使用方法中，EBM***可容易地与诸如大型发酵器的现有基本设备接口。因此，EBM***可容易地用于推进工艺工程技术，从而使得生物基化学品和生物燃料制备的效率提高。
在一个操作实施方案中，生物工艺物流简单地穿过阴极室循环，并且允许直接接触阴极。在所述实施方案中，电子传递直接从阴极到生物物质进行，但电子传递的速率可能是慢的。
在另一个操作实施方案中，可将电子传输介体添加至再循环生物***中，以使到达所需生物物质的质子和电子传递增加。介体可穿过在阴极侧使其与阴极接触的装置进行循环。质子和电子传递至介体，所述介体然后将这些质子和电子传递给生物物质。介体在这一过程中再循环，并且与阴极再次接触以重复所述过程。电子介体的浓度将根据所需电子和质子传输特性进行调节。
在一个任选的实施方案中，电子传输介体容纳于额外的膜的后面或下方，或被束缚或结合于阴极，以得到非常高的局部浓度，而不必存在于大量的生物工艺物流中。
在另一个任选的实施方案中，膜可插在阴极与生物***之间，使得任选的膜允许电子传输介体穿过，从生物***到达阴极并且再返回，同时防止生物***中物理上较大的组分(例如细胞、细胞碎片、夹带的固体颗粒或甚至酶)接触阴极或进入阴极室。
EBM的使用不限于全细胞。其它物理和操作实施方案包括使用分离的酶和P450。
如本领域中通常已知，细胞色素P450超家族(缩写为CYP)是催化有机物质的氧化作用的酶的群组。由细胞色素P450催化的最常见的反应是单加氧酶反应，例如将一个氧原子***有机底物(RH)，同时另一个氧原子被还原成水：
RH+O2+NADPH+H+→ROH+H2O+NADP+
基于电子传递蛋白的性质，CYP可归类到若干组中：
(1)微粒体P450***，其中电子从NADPH经由细胞色素P450还原酶(个别地为CPR、POR或CYPOR)传递。细胞色素b5(cyb5)在通过细胞色素b5还原酶(CYB5R)还原后也可为这个***贡献还原能力。
(2)线粒体P450***，其采用皮质铁氧还蛋白还原酶和皮质铁氧还蛋白将电子从NADPH传递至P450。
(3)细菌P450***，其采用铁氧还蛋白还原酶和铁氧还蛋白将电子传递至P450。
(4)CYB5R/cyb5/P450***，其中CYP需要的电子两者均来自细胞色素b5。
(5)起初发现于红球菌(Rhodococcus)属中的FMN/Fd/P450***，其中含FMN域的还原酶融合至CYP。
(6)仅P450***，其不需要外部还原能力。值得注意的那些包括CYP5(血栓素合成酶)、CYP8(环***素合成酶)以及CYP74A(丙二烯氧化物合成酶)。
在向诸如NADH/NADPH的氧化还原辅因子提供还原性等效物的实施方案的情况下，有可能可形成这些辅因子的非生产性还原状态。为了防止氧化还原辅因子的损失，有必要在已执行需要NADH/NADPH的所需氧化还原反应之后使辅因子流穿过氧化步骤。在这一氧化步骤中，整个辅因子混合物将被彻底氧化以移除辅因子的非生产性还原形式。所述氧化可通过任何方便的手段来进行，但优选通过以氧化方式操作的第二EBM装置来进行。
在另一个实施方案中，EBM内的两个或多个电解槽组件可串联或以使阳极板和阴极板交替与每一侧的流动室堆叠的模式进行使用。这可提供降低的硬件成本以及更有效的电条件。
本领域的普通技术人员将了解，在任何实施方案中，通过EBM向生物学***引入还原性等效物可包括以下行为中的一种或多种：
a)将阳极室用去离子水填充，并且将阴极室用所要传递电子的主体生物***填充，
b)在阳极与阴极之间施加具有足够的电压(电位)的外部电流，使得水在阳极处电解裂解，从而使得电子流到阳极中并且在阳极室中形成中性氧(O2)和带正电荷的水合氢离子(H3O+)，
c)带正电荷的水合氢离子穿过PEM膜从阴极室迁移至阳极室，造成从阳极室进入阴极室的水的净通量，从而在阴极室中提供质子源，
d)来自阳极的电子由外部电源驱动通过外部电路到达阴极，
e)电子从阴极传递至在PEM膜的阴极侧的所需微生物、氧化还原酶、氧化还原辅因子或电子介体，
f)生物***使用由阴极提供的电子通过从阴极直接传递电子或经由电子从阴极到电子传输介体并且然后到生物学***的传递来进行所需化学还原，并且/或者
g)来自迁移自阳极室的水合氢离子的质子被布置到主体生物***中，以平衡已从阴极传递至生物***的电子。
应指出，这一EBM***的电力输入可来自可再生资源(风、太阳、水电等)。因此，这一技术提供增加的优势的另一个实例，即能够储存可再生能源供以后用作液体燃料。
本发明的各个方面可单独、组合或以在前述内容中所描述的实施方案中未具体讨论的布置进行使用，并且因此其应用不限于前述描述中所阐述或图式中示出的组件的细节和布置。举例来说，一个实施方案中所描述的方面可与其它实施方案中所描述的方面以任何方式组合。
在权利要求书中使用诸如“第一”、“第二”、“第三”等顺序术语来修饰权利要求元素本身并不意味着一个权利要求元素的任何优先性、优先级或顺序优于另一者或用于执行一个方法的动作的暂时顺序，而是仅仅用作标记，用于将一个具有某个名称的权利要求元素与另一个具有相同名称(除使用顺序术语以外)的元素区分开来区分权利要求元素。
另外，本文中使用的措辞和术语是出于描述目的，并且不应认为是限制性的。本文中使用“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化形式意指涵盖其后列出的项目和其等效物以及额外的项目。
实施例
可根据以下说明性但非限制性的实施例来执行反应和发酵。
实施例A：琥珀酸的概念证明
按以下方式准备含有获自美国农业部的生长活跃的大肠杆菌(E.coli)株AFP184的两个7升发酵容器(美国专利6,743,610；以及Nghiem等.,Appl Biochem Biotechnol(2010)162:1915-1928)。制备5升生长培养基，其含有以下组分(每升双蒸馏水)：100g葡萄糖、1.46g K2HPO4、0.62g KH2PO4、3.4g(NH4)2SO4、0.42g MgSO4·7H2O、15g玉米浆、1ml消泡剂A-204(Sigma Aldrich)以及500μM中性红(Sigma Aldrich)。使用一个发酵器作为对照，同时使用第二个发酵器来证实通过电化学生物反应器模块(EBM)(BioChemInsights,Inc.,Malvern,PA)连续再循环发酵器内容物的优势。
将盐、玉米浆以及中性红混合，并且在两个7升发酵器中与葡萄糖分开灭菌。灭菌后，将葡萄糖与其它组分混合，并且将两个发酵器中的完全培养基的pH值调节至6.5。另外，将1升1.5M Na2CO3过滤灭菌，并且提供用于pH值控制。准备另两个各含50ml培养基的烧瓶用于接种目的；此培养基含有与生长培养基相同的盐和玉米浆量，但不含中性红并且含有仅5g/L的葡萄糖浓度。将具有接种物培养基的各烧瓶本身用0.2ml解冻的储备培养物接种，并且使其在250rpm和37℃下在摇床上生长16小时，此时使用其接种在两个7升发酵器中的5升生长培养液。使每个发酵器在将pH值主动控制于pH 6.5下的情况下有氧(1vvm)生长9小时。
9小时后，切断曝气，并且使发酵器继续厌氧生长。此时，经由外部再循环回路将第二发酵器连接至高度仪表化的EBM，以证实向生物***(即发酵液)提供外源性还原性等效物的影响。第二发酵器中的全部内容物在7升发酵容器与电化学生物反应器模块(EBM)之间连续地再循环。使用计算机控制的蠕动泵将来自发酵器通过EBM单元的流速调节在所要的流速。向EBM施加-2.5伏的电压并且以1秒的时间间隔测量电流。在24小时范围内向EBM提供的电流在1.5安培至3.1安培范围内，并且平均值是约1.9至2.0安培。在这些条件下，EBM单元具有78％的法拉第效率(Faradaic Efficiency)。
从对照发酵器并且从连接至EBM单元的发酵器获取培养液样品，以通过高效液相色谱法测定葡萄糖和琥珀酸的水平以及预期副产物乳酸和乙酸的水平。结果显示于图7和下表1中。
表1
图形化地显示于图7中的结果显示，连接至EBM单元的发酵器24小时产生比对照发酵器更多的琥珀酸。表1列出了由对照发酵器和经由再循环回路连接至EBM单元的发酵器消耗的葡萄糖的摩尔量以及产生的琥珀酸、乳酸以及乙酸的摩尔量。这些值是在两个发酵器已达到相同的葡萄糖消耗速率之后在6.5小时与24小时之间的时间以内的。所述值还被针对由添加Na2CO3溶液用于随时间推移进行pH值控制所造成的体积变化进行校正。
在6.5小时与24小时的经过的时间之间，对照发酵器消耗0.58摩尔葡萄糖并且产生0.71摩尔琥珀酸，加上0.02摩尔乳酸和0.07摩尔乙酸。考虑这后面的两种酸是重要的，因为它们有助于发酵对还原性等效物的总体要求。乳酸的产生需要每摩尔乳酸1摩尔还原性等效物，而乙酸的产生使得细胞每产生1摩尔乙酸内源性地产生2摩尔还原性等效物。
连接至EBM的发酵器在相同时间周期(6.5小时至24小时)内消耗0.60摩尔葡萄糖，同时产生0.77摩尔琥珀酸，加上0.05摩尔乳酸，但仅产生0.04摩尔乙酸。
在相同时间内，测量电解槽中的电流，所述电解槽对于上述操作条件来说以78％的法拉第效率运行，使得向所连接的发酵容器递送0.260摩尔电子(加上相应数目的水合氢离子，即还原性等效物)，即0.260摩尔还原性等效物。
对照发酵器根据以下化学计量产生琥珀酸：
7C6H12O6+6CO2→→12C4H6O4+6H2O
相对于由对照发酵器产生的琥珀酸的量，由连接至EBM单元的发酵器产生的琥珀酸的增加的量是(0.58/0.60)×(0.77-0.71)＝0.058摩尔。这种增加是由相同量的葡萄糖产生多6％的琥珀酸。为从相同量的葡萄糖产生更多琥珀酸，连接至EBM单元的发酵器必须遵循以下反应式中的化学计量。(请注意，在此反应式情况下，理论上最多增加16％。)
7C6H12O6+14CO2+28H·→→14C4H6O4+14H2O
这种化学计量显示每产生1摩尔琥珀酸需要2摩尔还原性等效物。因此，在通过EBM单元向发酵器提供的0.260摩尔外源性还原性等效物中，0.116摩尔(2×0.058)用于产生额外的琥珀酸。连接至EBM单元的发酵器还产生比对照发酵器过量0.030摩尔的乳酸，从而利用了额外的0.030摩尔还原性等效物。这个EBM发酵器还产生比对照发酵器少0.030摩尔的乙酸，从而解释了另外0.060摩尔的还原性等效物。
因此，在通过EBM单元递送的0.260摩尔还原性等效物中，(0.116+0.030+0.060)＝0.206由EBM发酵器产生增加量的琥珀酸和乳酸并且产生减少量的乙酸直接解释。并非发酵的所有代谢特性均可测量，诸如总细胞质量或其它代谢产物。然而，递送至EBM发酵器的剩余0.054摩尔的还原性等效物可归因于还原性等效物的这些额外的代谢需要。
实施例B：流速对电解槽电流的影响
给定的单位体积的发酵液接收来自EBM单元的阴极室的还原性等效物的能力受单位体积将这些还原性等效物传递至发酵容器中的代谢过程中的能力的限制。因此，一旦还原性等效物的代谢池被充满，就无法将更多的外源提供的还原性等效物(即电子和水合氢离子)传递给发酵容器中的微生物，这导致EBM单元的阴极室中的电流减小。相反，如果进入阴极室的发酵液在还原性等效物中相对耗竭，那么当EBM向需要更多还原性等效物的代谢过程递送还原性等效物时阴极室中的电流将增加。在这种操作条件下，增加流速引起每单位时间还原性等效物中越来越多的相对耗竭的培养液进入阴极室，使得阴极电流将随流速而直线增加。随着培养液穿过阴极室的流速继续增加，停留时间继续减少。当停留时间足够短时，发酵液所需的并非所有的还原性等效物均可在阴极室中得到传递。超过这个过渡流速，流速与电流之间的关系将是非线性的。
为了证实电流对发酵液穿过EBM单元的流速的依赖性，以与实施例A相同的方式准备混合培养发酵。混合培养物可含有大肠杆菌、乳酸杆菌(Lactobacillus)属或作为需要消耗还原性等效物的诸如乳酸或琥珀酸的代谢产物的良好生产者的其它方便的微生物。试验0至3LPM的穿过EBM单元的各种流速以确定流速对电流的影响。在各种泵速下测量的电流值图形化地显示于图8中。
图9显示在发酵培养基穿过阴极室的流速达到临界值之后，穿过EBM单元的电流变为非线性依赖于所述流速。在这个流速下，还原性等效物中相对耗竭的发酵液在阴极室中的停留时间如此短，以致EBM单元不能在培养液离开阴极室之前使整个氧化还原池完全再生。在高于这个临界值的流速下，电流将逐渐接近恒定值，并且实际上将不再依赖于流速。
实施例C
为了进一步测试EBM***的控制和调节方面，以与实施例A相同的方式产生一系列样品，除了在EBM的阳极和阴极上施加电压以外。使用介于0.0V与-4.0V之间的各种电压。改变电压以确定用于产生琥珀酸的最佳电位，直到如通过氢气产量所测量的法拉第效率达到100％之前的最大可能电压。琥珀酸产量连同实施例A中的所有其它参数一起测量。
实施例D
为了测试EBM***中的电子传输介体的性能，以与实施例A相同的方式产生一系列样品，除了以下各项以外：在发酵液中介体类型和浓度改变。以在0M至给定介体在发酵液中的溶解限度范围内的不同浓度使用介体腐殖酸、中性红、甲基紫精以及蒽醌-2,6-二磺酸酯。琥珀酸产量连同实施例A中的所有其它参数一起测量。
实施例E
为了显示EBM***向由单一的、分离的氧化还原酶催化的氧化还原反应提供还原性等效物的效用，由乙醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)在NAD+辅因子的存在下进行苯乙酮到苯乙醇的还原。将乙醇脱氢酶、NAD+以及苯乙酮在pH值为7的磷酸盐缓冲液中混合，并且使溶液经由再循环回路穿过EBM的阳极室。施加足够的电压以使得NAD+还原为NADH。NADH结合于乙醇脱氢酶，并且将苯乙酮还原为苯乙醇，并且NADH伴随氧化回到NAD+。将NAD+物质通过阴极室再循环返回，并且再次还原为NADH。通过HPLC监测苯乙酮还原为苯乙醇的进展。
NAD+电化学还原为NADH已知得到烟酰胺环的非生物活性2-二氢和5-二氢物质以及生物活性4-二氢物质，并且由酶反应产生的NAD+将还原为这三种物质。随着时间的推移，基本上所有NAD+均将被还原并且以非生物活性2-二氢和5-二氢物质形式累积。因此，有必要在返回阴极室的再循环反应混合物再进入之前将2-二氢和5-二氢物质氧化回NAD+。
实施例F
由梭状芽胞杆菌属(Clostridia sp.)产生正丁醇经历产酸阶段，接着是产溶剂阶段，在此期间，产酸阶段中所产生的丁酸被还原为正丁醇。用以提供还原性等效物的电子传输在溶剂产生阶段中具有极大重要性，并且可以通过提供诸如甲基紫精的电子传输介体来增强正丁醇的产生(Sonomoto等,Journal of Bioscience And Bioengineering,104:3,238-240(2007))。然而，丁酸酯还原为正丁醇仍需要消耗葡萄糖以提供还原性等效物。
使糖丁基丙酮梭菌(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)N1-4(ATCC13564)的培养物生长并且使其经历产酸阶段。在葡萄糖耗尽后，将甲基紫精添加至发酵液中，并且将发酵液通过EBM再循环。监测正丁醇的产生和丁酸酯的减少以显示在不存在葡萄糖的情况下正丁醇的产生。
等效方案
本发明除其它事项外提供了用于向生物***提供还原性等效物的新型方法和装置。虽然已论述了本发明的特定实施方案，但以上说明书是说明性的而不是限制性的。在阅读本说明书之后，本发明的许多变化对本领域技术人员来说将变得显而易见。本发明的全部范围应参考权利要求书连同其等效物的全部范围以及本说明书连同所述变化来确定。
以引用的方式并入
以上所引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的以全文引用的方式并入本文中，就如每个单个出版物或专利申请被具体地指出以引用的方式并入本文中的程度一样。

Claims (15)

1.一种装置，所述装置包括：
a.容纳于阳极室中的阳极和容纳于阴极室中的阴极，所述两个腔室由至少一个膜隔开，所述至少一个膜允许中性或带正电荷的水分子穿过所述膜从一个腔室到达另一个腔室，其中所述阳极室由与所述阳极接触的去离子水和任选的氧气和水合氢离子组成；
b.在所述阴极室中含有生物***的水性介质，所述水性介质与所述阴极接触，所述生物***能够执行还原性生物过程；
c.用于将所述水性介质从外部容器连续再循环穿过所述阴极室并且返回到所述外部容器中的部件；
d.在所述阳极与所述阴极之间提供电压的外部电源；以及
e.具有用于控制所述还原性生物过程的控制构件的检测仪器，其中所述控制构件是用于监测细胞内的NADH或NADPH的连续荧光检测器，从而控制所述还原性生物过程中的还原程度。
2.如权利要求1所述的装置，其中所述水性介质进一步包含电子传输介体。
3.如权利要求1或权利要求2所述的装置，其进一步包括计算机控制的蠕动泵，用于将水性介质的流速调节在高于过渡流速的水平，此时水性介质的流速与电流之间的关系是非线性的。
4.如权利要求1所述的装置，其中所述外部容器是发酵罐。
5.如权利要求1所述的装置，其进一步包括一个或多个位于所述阴极与所述生物***之间的分隔膜，使得所述阴极不与所述生物***直接接触。
6.如权利要求5所述的装置，其进一步包括由所述分隔膜保留并且任选地含于流体介质中的电子传输介体，使得所述电子传输介体提供从所述阴极到所述生物***的电子传输。
7.如权利要求2或6所述的装置，其中所述电子传输介体是腐殖酸或中性红。
8.一种执行生物***中的还原过程的方法，其包括：
a.提供如权利要求2、5以及7中任一项所述的装置，其中所述生物***的至少一部分存在于所述阴极室的发酵液中；
b.将适量的电子传输介体放置于所述阴极室中，其中所述电子传输介体的至少一部分被还原，并且所述生物***能够进行化学还原；以及
c.由所述外部电源在所述阳极与所述阴极之间施加合适的电压。
9.一种用于产生通用化学品的方法，其包括使用如权利要求1-7中任一项所述的装置通过下述步骤向发酵过程中提供还原性等效物：
a.使发酵液流经所述阴极室；
b.由所述外部电源在所述阳极与所述阴极之间施加电压；并且
c.任选如下利用电子传输介体：
i.将所述介体直接添加至所述发酵液中；或者
ii.将所述介体提供于所述分隔膜上。
10.如权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述发酵液包含用于产生琥珀酸的发酵产物。
11.如权利要求8或权利要求9所述的方法，其中所述发酵液包含用于产生乙醇、正丁醇或异丁醇的发酵产物。
12.一种执行生物***中的还原过程的方法，其包括使用如权利要求1-7中任一项所述的装置来向由氧化还原酶催化的反应提供还原性等效物，其中所述反应需要来自生物介体的所述还原性等效物，并且其中所述氧化还原酶任选经由电子传输介体接收来自所述阴极的所述还原性等效物。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述生物介体是NADH、NADPH或FMNH2。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述酶包括P450酶和P450还原酶。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述酶包括已被工程化为包括P450还原酶活性的改性P450酶。
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