CN104672317B - 调节Oct4基因表达的转录因子ZNF312b及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种调节Oct4基因表达的转录因子ZNF312b及其应用。该转录因子ZNF312b的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。编码该转录因子ZNF312b的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明首次发现转录因子ZNF312b在MSCs内能活化关键转录因子Oct4基因，促进MSCs的增殖。因此，该转录因子能用于制备调节Oct4基因表达制剂和/或制备促进MSCs增殖制剂。

Description

调节Oct4基因表达的转录因子ZNF312b及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体涉及一种调节Oct4基因表达的转录因子ZNF312b及其应用。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类能够自我更新和具有多向分化潜能的干细胞，可以向脂肪、骨、软骨、神经、肌肉和肝细胞等组织细胞分化，所以在组织工程、细胞移植和基因治疗等领域具有巨大的应用潜能。MSCs不仅是机体微环境的重要组成部分，而且在体内外均具有分泌多种细胞因子、生长因子和基质分子的作用。MSCs可表达胚胎干细胞标记物Oct4、Nanog、碱性磷酸酶和SSEA-4。但是，MSCs维持自我更新与未分化状态的分子机制还尚不清楚。
Oct4属于POU转录因子家族的成员，由pou5f1基因编码产生。Oct4是参与调控胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)的自我更新，维持其全能性重要的转录因子，被公认为干细胞多向分化潜能性的重要标志物。ZNF312b基因也称为前脑胚胎锌指样蛋白I(Fezfl)基因，是非洲爪蟾(Xenopus)前脑的嗅感觉神经元(OSN)中第一个被鉴定的基因，并且已知编码具有锌离子的蛋白。该基因对嗅神经的适当终止(proper termination oftheolfactory nerve)、嗅球的形成和中间神经兀祖细胞的经头端迁移流来说是必不可少的，并且对轴突导向(axonal projection)细胞自我控制和嗅球膜形成控制来说也是重要因素。已知有少量的关于ZNF312b基因功能的报道，但是它们均与胃癌的发展有关。有研究表明，在人的胃癌组织及胃癌细胞株内检测到ZNF312b的过表达，在裸鼠体内ZNF312b的过表达能够诱导癌症形成，ZNF312b能够作为转录因子诱导肿瘤基因K-ras的表达，从而活化与细胞增殖有关的ERK信号转导通路，导致胃癌的形成；在胃癌细胞内，DNA去甲基化和组蛋白乙酰化促进Sp1转录因子与ZNF312b启动子结果，从而活化ZNF312b的表达。至今未见文献报道有关ZNF312b对Oct4表达的调节作用。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种调节Oct4基因表达的转录因子ZNF312b。
本发明的另一目的在于提供所述调节Oct4基因表达的转录因子ZNF312b的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种调节Oct4基因表达的转录因子ZNF312b，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
所述的调节Oct4基因表达的转录因子ZNF312b，其编码核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
一种重组表达转录因子ZNF312b的载体，是将表达载体和上述调节Oct4基因表达的转录因子ZNF312b的编码核苷酸序列重组得到。
所述的表达载体为原核表达载体或真核表达载体，优选为真核表达载体。
一种能表达转录因子ZNF312b的重组菌，是将上述重组表达转录因子ZNF312b的载体转入工程菌得到。
一种能表达转录因子ZNF312b的重组细胞，是将上述重组表达转录因子ZNF312b的载体转入工程细胞得到。
所述的调节Oct4基因表达的转录因子ZNF312b在制备调节Oct4基因表达制剂和/或制备促进MSCs增殖制剂中的应用。
所述的制剂优选为药物。
所述的调节Oct4基因表达的转录因子ZNF312b在制备调节Oct4基因表达制剂和/或制备促进MSCs增殖制剂中的应用，优选包括如下步骤：
(1)将所述的调节Oct4基因表达的转录因子ZNF312b的编码核苷酸序列与表达载体重组，得到重组表达ZNF312b的载体；
(2)将重组表达ZNF312b的载体转入宿主细胞中进行表达，纯化，得到调节Oct4基因表达的转录因子ZNF312b；
步骤(1)得到的重组表达ZNF312b的载体与步骤(2)纯化后得到的调节Oct4基因表达的转录因子ZNF312b均为调节Oct4基因表达制剂和/或促进MSCs增殖制剂。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
Oct4基因的上游非编码区含有增强子，包括Site 2A和Site 2B。本发明首次发现转录因子ZNF312b在MSCs内对Oct4基因表达的调节机理。本发明采用酵母单杂交技术成功地克隆了与Site 2A特异性结合的转录因子ZNF312b，证明了在MSCs内转录因子ZNF312b能够与Oct4基因的Site 2A特异性结合，并能够活化Oct4基因的转录。转录因子ZNF312b不能与Site 2B结合，Site 2B对活化Oct4基因表达不起作用。本发明还将ZNF312b表达质粒瞬时转染至MSCs中进行表达，发现ZNF312b能促进MSCs的增殖。本发明揭示了转录因子ZNF312b对调节关键转录因子Oct4基因的分子调控机制，为ZNF312b转录因子对MSCs的自我更新和多向分化潜能起着关键调节作用提供了理论依据。
附图说明
图1是本发明实施例1中涉及进行酵母单杂交技术所使用到的载体图谱图，其中图A是用于构建诱饵质粒的pAbAi载体，图B是用于构建表达质粒的pAD-GAL4载体。
图2是本发明实施例2中BM-MSCs分化为不同种类细胞后Oct4和ZNF312b的表达检测结果图。
图3是本发明实施例3中将报告基因荧光素酶质粒和不同的启动子构建质粒同时转染到未分化的BM-MSCs和HeLa细胞内，以及将报告基因荧光素酶质粒、不同的启动子构建质粒和ZNF312b表达质粒同时转染HeLa细胞后检测到的结果图。
图4是本发明实施例4中将Oct4、ZNF312b、Oct4siRNA和ZNF312b siRNA表达质粒分别瞬时转染至BM-MSCs中进行表达后BM-MSCs增殖情况结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步的详细描述，但不用来限制本发明的范围。若未特别指出，实施例均参照常规实验条件，或者参照试剂盒制造厂商的说明书进行。实施例中所用到的工程菌、细胞株均为商业化的菌株或细胞株。大肠杆菌感受态细胞的制备均按照《分子克隆》进行制备。
实施例1酵母单杂交技术筛选与Site 2A特异性结合的转录因子
根据Clonetech公司酵母单杂交试剂盒Matchmaker Gold Yeast One-HybridLibrary Screening System说明书的操作要求，构建诱饵质粒及诱饵酵母菌株。为了提高转录因子和顺式作用元件的识别率和结合率，以OCT4基因的Site2A核苷酸序列为基本单位，并在两端引入与酵母基因组整合载体pAbAi(图1A)相匹配的Xho I(ctcgag)和Hind III(aagctt)酶切位点，最终合成含有Xho I和Hind III酶切位点的3次重复Site 2A序列的正义链和反义链(如SEQ ID No.3和4所示)，正义链和反义链同摩尔数混合后，加热到95℃后自然退火，得到具有双链结构的三重Site 2A寡聚核苷酸链。再用Xho I和Hind III分别双酶切三重Site 2A寡聚核苷酸链和pAbAi载体，将连接产物转化大肠杆菌Top 10感受态细胞，用含100mg/L氨苄霉素的LB固体培养基筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒，经Xho I和Hind III双酶切后用12％的PAGE和银染显色鉴定，验证目的片段的***，取酶切片段长度正确的重组质粒进行测序，鉴定***序列与三重Site 2A寡聚核苷酸链序列完全一致且方向正确，说明诱饵载体pSite2A-AbAi构建成功。取pSite2A-AbAi诱饵载体1μg，经BstB I酶切线性化后转化酵母Y1HGold感受态细胞，转化液涂布SD/-Ura固体培养基上，3天后挑单克隆用Matchmaker Insert Check PCR Mix 1进行菌落PCR鉴定，证明线性化的pSite2A-AbAi诱饵载体已经整合到酵母Y1HGold基因组中，从而成功获得诱饵酵母。
接着，构建酵母单杂交文库。用TRIzol法提取BM-MSCs(HUXMA-01001，购自赛业(广州)生物科技有限公司)总RNA，凝胶电泳分析证明RNA无降解且质量良好。取1μg总RNA为模板，用SMART技术合成单链cDNA，以单链cDNA为模板进行LD-PCR扩增合成双链cDNA，并用CHROMA SPINTE-400树脂层析柱纯化。将纯化的双链cDNA和线性化的pAD-GAL4表达载体(图1B)进行连接，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，得到cDNA文库。
最后，进行筛选与Site 2A特异性结合的转录因子。将cDNA文库转化含有pSite2A-AbAi的诱饵酵母感受态细胞，涂布在SD/-leu/AbA平板上进行cDNA文库的筛选。转化液稀释至1/100后在SD/-leu/AbA平板上长出211个克隆。依据下面公式计算筛选的总克隆数：总克隆数＝cfu/涂板体积×稀释率×细胞悬液总体积。结果是总克隆数为3.17×106，cDNA文库的重组率及转化效率符合要求。挑取以上单克隆，经过测序后进行NCBI Blast比对分析，结果发现筛选到了ZNF312b转录因子(SEQ ID No.1-2)。这说明了本实验室采用酵母单杂交技术成功地克隆了与Site 2A特异性结合的转录因子ZNF312b。
实施例2检测Oct4和ZNF312b基因在BM-MSCs中的表达情况
分别从未分化的BM-MSCs内(0天)，或由BM-MSCs的成骨分化、成软骨分化和成脂肪分化(间质干细胞成骨、成软骨、成脂肪诱导分化培养基均购自广州赛业生物科技有限公司)后7天，14天和21天的细胞内提取总mRNA，逆转录为cDNA，然后利用目的基因的正、反向引物进行扩增以检测其表达情况，目的基因分别有：GAPDH(引物序列：SEQ ID No.5-6)，Oct4(引物序列：SEQ ID No.7-8)和ZNF312b(引物序列：SEQ ID No.9-10)。PCR的反应体系为：10-20ng/μl模板1μl，10pmol/μl正、反向引物各1μl，10mmol/L dNTP mix 0.4μl，0.5U/μl高保真Taq DNA聚合酶1μl，10×PCR反应缓冲液2μl，其余为水，共20μl。PCR的反应条件：94℃5分钟；94℃20秒，55℃20秒，72℃1分钟，共35个循环；72℃10分钟。
结果显示，未分化的BM-MSCs(0天)，成骨分化后7天，或软骨分化后7天，脂肪分化后7天的细胞能够表达Oct4和ZNF312b mRNA，而三种分化后14天和21天的细胞都不能表达Oct4和ZNF312b mRNA(图2)。
实施例3荧光素酶报告基因分析
分别合成含有BstBI(ttcgaa)和BbsI(tctcta)酶切位点的Oct4Site 2A(SEQ IDNo.11)、Site 2B基因序列(SEQ ID No.12)、Site 2A+2B基因序列(SEQ ID No.13)和Site2A+2A基因序列(SEQ ID No.14)，为了方便描述，将这些序列统称为Oct4启动子DNA。将Oct4启动子DNA和pGL-3basic质粒(Promega)分别进行BstBI和BbsI双酶切，酶切条件分别如下：pGL3-basic质粒10μl或Oct4启动子DNA 30μl，BstBI(10U/μL)2μl，BbsI(10U/μl)2μl，10×buffer 5μl，ddH2O补足至50μl。37℃酶切过夜后，于2％琼脂糖凝胶电泳，并分别回收酶切后的Oct4启动子DNA和pGL3-basic质粒。将回收的Oct4启动子DNA双酶切产物连接到pGL3-basic质粒中，并将此重组的pGL3-basi-Oct4启动子质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得含有Oct4启动子的DNA pGL3-basic DH5α重组克隆。具体方法如下：分别取Oct4启动子DNA双酶切回收产物(68ng/μl)6μl，pGL3-basic质粒双酶切回收产物(160ng/μl)2μl，10×buffer 2μl，T4DNA ligase(5U/μl，Fermentas)1μl，ddH2O9μl，共20μl，16℃连接2h，将20μl连接产物与100μl大肠杆菌DHα5感受态细胞混匀，冰上放置30min，42℃90s，冰上5min，然后加入700μl LB无抗性培养基，于37℃250r/min培养1h后，涂于含100mg/L Amp抗性的固体培养基平板，37℃培养过夜，平板上有克隆长出，挑取一些克隆进行阳性鉴定，挑选阳性克隆于上海生工公司进行测序。测序结果显示其核苷酸序列全部正确，得到pGL3-basic Site2A、pGL3-basic Site 2B、pGL3-basic Site2A+2B、pGL3-basic Site 2A+2A启动子质粒。
使用HD转染试剂(Promega公司)进行转染，转染对象为一组未分化的BM-MSCs和两组人***细胞系HeLa细胞。对于未分化的BM-MSCs和一组人***细胞系HeLa细胞，分别转染入pGL3-basic质粒、构建的pGL3-basic Site 2A、pGL3-basic Site2B、pGL3-basic Site 2A+2B、pGL3-basic Site 2A+2A启动子质粒，同时转入pRLSV40荧光素酶表达质粒(E2231，Promega公司)作为转染效率内参对照。对于另一组人***细胞系HeLa细胞，分别转染入pGL3-basic质粒、构建的pGL3-basic Site 2A、pGL3-basic Site2B、pGL3-basic Site 2A+2B、pGL3-basic Site 2A+2A启动子质粒，同时转入pRLSV40荧光素酶表达质粒和pGL3-basic ZNF312b表达质粒(将实施例1得到的含ZNF312b转录因子基因序列的克隆和pGL3-basic交付由广州辉骏生物科技有限公司完成构建过程，测序结果表明为如SEQ ID No.2所示的序列通过BstBI(ttcgaa)和BbsI(tctcta)酶切位点***到pGL-3basic质粒中)。24h后收集转染细胞，用被动裂解液(Passive Lysis Buffer，Promega公司)制成细胞裂解液，使用Promega公司的双荧光素酶报告基因分析试剂盒和GloMax 2/20发光检测仪测定荧光值。结果显示，在未分化的BM-MSCs内，Site 2A能够促进荧光素酶表达，在HeLa细胞内，ZNF312b能够活化Site2A，从而促进荧光素酶表达，两个Site 2A能促进更多荧光素酶的表达；在未分化的BM-MSCs和HeLa细胞内，Site 2B和ZNF312b不能促进荧光素酶表达(图3)。结果证明了ZNF312b转录因子能与Site 2A区域结合，不与Site 2B区域结合。
实施例4检测ZNF312b转录因子对BM-MSCs增殖的影响
用Primer 5.0分别设计扩增ZNF312b和Oct4基因开放阅读框的引物：扩增Oct4的引物序列如SEQ ID No.15-16所示，扩增ZNF312b的引物序列如SEQ ID No.17-18所示，引物两端酶切位点分别为XhoⅠ，NcoⅠ。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。扩增ZNF312b基因和Oct4基因是分别以胃癌细胞系MKN28和人胚胎干细胞系H9(均购自江苏斯坦福生物技术有限公司)的cDNA为模板，PCR扩增的反应条件：94℃5分钟；94℃20秒、55℃20秒、72℃1分钟，共35个循环；72℃10分钟。PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，并对PCR产物回收纯化。将回收的PCR产物克隆至pGL3-Basic真核表达载体，分别命名为pGL3-ZNF312b和pGL3-Oct4，DNA测序表明序列正确。Oct4siRNA(SEQ ID No.19)、ZNF312b siRNA(SEQ IDNo.20)与无关的siRNA(SEQ ID No.21)都购买于北京信诺金达生物科技有限公司。将BM-MSCs细胞接种于六孔板中，置于5％CO2的37℃培养箱中，用含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养。当单层细胞生长密度达到80％～90％时，按HD转染试剂盒(Promega公司)操作步骤转染质粒。按照以下分组进行转染：对照为未转染的BM-MSCs，Oct4为瞬时转染pGL3-Oct4质粒的BM-MSCs，siOct4为瞬时转染Oct4siRNA的BM-MSCs；siOct4对照为瞬时转染无关的siRNA作为阴性对照；ZNF312b为瞬时转染pGL3-ZNF312b质粒的BM-MSCs，siZNF312b为瞬时转染ZNF312b siRNA的BM-MSCs，siZNF312b对照为瞬时转染无关的siRNA作为阴性对照。
结果显示，Oct4和ZNF312b能够促进BM-MSCs的增殖，Oct4siRNA和ZNF312b siRNA能够抑制BM-MSCs增殖，无关的siRNA作为阴性对照对BM-MSCs增殖没有影响(图4)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.调节Oct4基因表达的转录因子ZNF312b的应用，其特征在于：所述的调节Oct4基因表达的转录因子ZNF312b在制备调节Oct4基因表达制剂和/或制备促进MSCs增殖制剂中的应用；
所述的调节Oct4基因表达的转录因子ZNF312b的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。
2.根据权利要求1所述的调节Oct4基因表达的转录因子ZNF312b的应用，其特征在于：所述的制剂为药物。
3.根据权利要求1所述的调节Oct4基因表达的转录因子ZNF312b的应用，其特征在于包括如下步骤：
(1)将所述的调节Oct4基因表达的转录因子ZNF312b的编码核苷酸序列与表达载体重组，得到重组表达ZNF312b的载体；
(2)将重组表达ZNF312b的载体转入宿主细胞中进行表达，纯化，得到调节Oct4基因表达的转录因子ZNF312b；
步骤(1)得到的重组表达ZNF312b的载体与步骤(2)纯化后得到的调节Oct4基因表达的转录因子ZNF312b均为调节Oct4基因表达制剂和/或促进MSCs增殖制剂。
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