CN104650242A - 一种融合多肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种融合多肽及其制备方法和应用，属于医药技术领域。本发明融合多肽，在利尿多肽HKI的序列的C端连接蛋白转导域TAT多肽序列，将HKI同蛋白转导域进行融合表达，构建TAT-HKI融合肽，借助TAT的高效跨膜转运作用，使HKI快速地穿过食道***内膜进入体内位点，确保利尿多肽序列在体内运送过程中稳定发挥作用，使棉铃虫过度***，导致死亡。本发明融合多肽可通过棉铃虫自然取食的行为进入棉铃虫体内，并在体内高效稳定的表达，表现出非常强的毒杀活力，克服了HKI经昆虫消化道毒力差得缺陷，可用于制备防治棉铃虫的药物。

Description

一种融合多肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种融合多肽，同时还涉及该融合多肽的制备方法和应用。

背景技术

棉铃虫，夜蛾科铃夜蛾属昆虫的一种，是棉花蕾铃期的大害虫，广泛分布在世界各地，中国棉区和蔬菜种植区均有发生，主要蛀食蕾、花、铃和嫩叶。棉铃虫天敌很多，有寄生性天敌—寄生蜂、寄生蝇等，捕食性天敌乌雀类及一些细菌、真菌、病毒等可对棉铃虫的卵和幼虫起到抑制作用。

利尿激肽helicokinin I(HKI)对棉铃虫的水分代谢活动刺激最为强烈(Seinsche et al.，2000)，在极微量的HKI注射进入棉铃虫幼体后，即可使其过度***，进而导致死亡，HKI作为杀虫物质进行应用的潜力巨大。由于其来源于生物体，对高等生物和环境安全，因此作为杀虫物质进行应用具有先天的环境优势。如何将HKI作为一种杀虫活性物质进行使用，是否可以利用害虫的取食行为将其摄入体内发挥作用；如何使有活性的短肽分子穿透消化道进入体内位点，同时保证短肽在运送过程中的稳定，这是亟待解决的问题。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种对棉铃虫具有强的毒杀活性的融合多肽。

本发明的目的之二在于提供一种融合多肽的制备方法。

同时，本发明还在于提供一种融合多肽的应用。

为了克服现有技术的缺陷，本发明采用的技术方案如下：

一种融合多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。具体为：甲硫氨酸-酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-精氨酸-谷氨酰胺-精氨酸-精氨酸-精氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸-脯氨酸-色氨酸-甘氨酸。

所述融合多肽的N端乙酰化。

上述融合多肽的制备方法，包括以下操作步骤：

1)以2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯为缩合剂，以聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂为起始树脂，采用FMOC固相合成法逐一耦合每一个保护氨基酸，合成得到全保护的肽链树脂；

2)制备的融合多肽N端进行乙酰化。

3)用切割试剂对乙酰化处理后的测链全保护的肽链树脂进行切割，将肽链从树脂上裂解下来并取出侧链保护基团，得到多肽粗品；

4)将步骤3)制备的多肽粗品经冰***沉淀，离心收集沉淀，分离纯化，冷冻干燥即得所述的融合多肽。

步骤2)所述乙酰化试剂为乙酸酐和N-甲基咪唑的混合液。

步骤3)中切割试剂为氟化氢、对甲苯酚、对疏基苯酚按照体积比90：5：5的比例配制而成的混合物。

步骤3)中切割试剂的用量为10～15mL/g。

上述融合多肽在制备防治棉铃虫药物方面的应用。

TAT(transactivator of transcription，TAT)为病毒有效转录和复制所必须的多肽序列。TAT能够将与之共价连接的生物大分子非特异地转导细胞内部，这种过程既不依赖于受体和转运蛋白，也与温度和能量无关，而且对宿主细胞几乎没有毒性。这种具有携带外源蛋白穿透细胞膜能力的特异多肽序列称为蛋白转导域(Protein transduction Domains，PTDs)，也称细胞穿膜肽(cell penetratingpeptides，CPP)。

利尿多肽Helicokinin是属于昆虫激肽家族的一类小分子昆虫神经肽，整个家族成员都具有类似的碳末端五肽序列Phe-Tyr-Pro-Trp-Gly-NH₂(FYPWGa)，这个核心5肽对于其刺激肌肉活动和利尿活动是必需的，研究表明微量昆虫激肽及其类似物可以对昆虫生理代谢造成较大的影响(Smagghe et al.Antifeedant activity and high mortality in the peaaphid Acyrthosiphon pisum(Hemiptera:Aphidae)induced by biostable insect kininanalogs，，2010；Nachman et al.Nachman et al.Biostable and PEG polymer-conjugatedinsect pyrokinin analogs demonstrate antifeedant activity and induce high mortality in the peaaphid Acyrthosiphon pisum(Hemiptera:Aphidae，2012)

本发明融合多肽，在利尿多肽HKI的序列的C端连接蛋白转导域TAT多肽序列，将HKI同蛋白转导域进行融合表达，构建TAT-HKI融合肽，借助TAT的高效跨膜转运作用，使HKI快速地穿过食道***内膜进入体内位点，确保利尿多肽序列在体内运送过程中稳定发挥作用，使融合多肽进入棉铃虫体内后，使棉铃虫过度***，导致死亡。本发明融合多肽可通过棉铃虫自然取食的行为进入棉铃虫体内，并在体内高效稳定的表达，表现出非常强的毒杀活力，克服了HKI经昆虫消化道毒力差得缺陷。

本发明融合多肽的制备方法采用FMOC法制备融合多肽，氨基酸接枝成功率高，操作简便，易于实现，适于工业化推广应用。

本发明融合多肽在棉铃虫体内高效表达，表现出毒杀活性的特性，使其可用于制备防治棉铃虫的药物。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1

本实施例融合多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为甲硫氨酸-酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-精氨酸-精氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸-脯氨酸-色氨酸-甘氨酸。

本实施例融合多肽N端乙酰化。

本实施例融合多肽的制备方法，具体操作步骤为：

1)以2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯为缩合剂，以聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂为起始树脂，采用FMOC固相合成法逐一耦合每一个保护氨基酸，合成得到全保护的肽链树脂；

2)用乙酸酐和N-甲基咪唑的混合液对步骤1)制备的全保护的肽链树脂进行乙酰化处理；

3)用13㎎/L切割试剂对乙酰化处理后的测链全保护的肽链树脂进行切割，将肽链从树脂上裂解下来并取出侧链保护基团，得到多肽粗品；所述切割试剂为氟化氢、对甲苯酚、对疏基苯酚按照体积比90：5：5的比例配制而成的混合物；

4)将步骤3)制备的多肽粗品经冰***沉淀，离心收集沉淀，分离纯化，加入乙酸酐和N-甲基咪唑的混合液进行乙酰化处理，冷冻干燥即得所述的融合多肽。

性能检测：实施例制备的融合多肽的毒力测定

测定方法，具体操作步骤为：

1)首先配制新鲜的棉铃虫人工饲料：将琼脂8g煮沸融化，温度低于90℃后依次加入无菌麦麸70g，干酵母10g，玉米油3ml，山梨醇1g，抗坏血酸15g，溶剂为水，边加边搅拌均匀；

2)试验分为3组：融合多肽TAT-HKI试验组：将实施例制备的融合多肽TAT-HKI溶于无菌水中，待人工饲料温度加热至45℃时，加入TAT-HKI融合多肽搅拌均匀，作为融合多肽TAT-HKI试验组；利尿激肽HKI试验组：将HKI溶于无菌水中，待人工饲料温度加热至45℃时，加入HKI多肽搅拌均匀，作为HKI试验组；空白对照组：人工饲料中不添加任何添加剂；

3)将步骤2)制备的3组饲料分别切成1cm³方块，放入2.5×10cm平底试管中(棉塞封口)，并接入正常的棉铃虫初孵化2龄初的幼虫，每处理组接虫200头，每管1头，置于培养箱中；处理后试虫的饲养条件：温度27±1℃，相对湿度65～70％，光照比(L：D)16：8h，每隔4天更换一次饲料，每隔4天观察棉铃虫的存活状态，统计死亡率，判断融合多肽的毒力；其中统计数据采用DSP软件进行方差分析。

棉铃虫存活状态判断标准：以小毛笔轻触虫体，不能协调运动认为死亡。

检测结果如下表1所示：

表1不同多肽的毒力检测比较

上述检测比较结果表明，仅取食HKI对棉铃虫幼虫致死能力非常低，与空白对照组差异不显著，而TAT-HKI融合多肽，借助TAT的高效跨膜转运作用，TAT-HKI对取食幼虫产生了非常强的毒杀能力，棉铃虫幼虫生长明显受到抑制，体重增加比其他组偏小，且随着取食时间的延长，死亡的个体逐渐增多，死亡率最终达到73.6±5.7％，而取食HKI的试验组校正死亡率仅为6.9％(见表1)，取食TAT-HKI融合肽的试验组幼虫死亡率同其他组之间差异极显著(p﹤0.01)。该检测结果表明本发明构建的融合多肽可通过自然取食进入棉铃虫体内，并在体内高效稳定表达，表现出非常强的毒杀活力，可用于棉铃虫防治，用于制备防治棉铃虫的药物。

Claims (4)

1.一种融合多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的融合多肽，其特征在于，所述融合多肽的N端乙酰化。

3.一种如权利要求1所述的融合多肽的制备方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

1)以2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯为缩合剂，以聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂为起始树脂，采用FMOC固相合成法逐一耦合每一个保护氨基酸，合成得到全保护的肽链树脂；

2)将步骤1)制备的融合多肽N端进行乙酰化；

3)用切割试剂对乙酰化处理后的测链全保护的肽链树脂进行切割，将肽链从树脂上裂解下来并取出侧链保护基团，得到多肽粗品；

4)将步骤3)制备的多肽粗品经冰***沉淀，离心收集沉淀，分离纯化，冷冻干燥即得所述的融合多肽。

4.一种如权利要求1所述的融合多肽在制备防治棉铃虫药物方面的应用。