CN104540811B - 新的羟基红花黄色素药用盐 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种新的式(I)的羟基红花黄色素A药用盐，特别是羟基红花黄色素A的钾、铵、钙、镁盐的新单体化合物及其生产方法和医药用途。与羟基红花黄色素A相比，本发明的羟基红花黄色素A药用盐纯度达到98％以上，是更安全有效、更稳定可控的单体化合物，具有抗PAF或ADP诱导的血小板聚集作用，可应用于抗血小板聚集、冠心病、心绞痛、急性脑缺血等诸多血液循环障碍疾病的治疗上相较于羟基红花黄色素A。

Description

新的羟基红花黄色素药用盐
技术领域
本发明提供一种新的羟基红花黄色素药用盐，具体地说，提供一种羟基红花黄色素A药用盐及其制备方法、冻干粉针剂以及医药用途。属于药物化学领域。
背景技术
中药红花为菊科植物Carthamus tinctouiusL.的干燥花，是一种常见的活血化淤中药，可用于冠心病、心绞痛等诸多血液循环障碍疾病的治疗。羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A)是具有单查尔酮苷类结构的化合物，是红花药理功效的最有效水溶性部位，可抑制血小板激活因子诱发的血小板聚集与释放，可竞争性地抑制血小板激活因子与血小板受体的结合，是红花黄色素的活血化瘀有效成分。研究表明，它具有多方面的心血管药理作用，可抗凝、促进纤溶、抗血栓形成、改善微循环等。
羟基红花黄色素A作为红花黄色素中含量最高的组分，其药用价值在心血管的应用已得到证明，该机理也十分明确。现有技术中已经公开了大量的羟基红花黄色素A生产工艺，包括以红花为原料，经过水提取、大孔吸附树脂分离、葡聚糖凝胶层析以及超滤等步骤，得到注射用的羟基红花黄色素A。然而，现有的生产工艺所制得的羟基红花黄色素A，产品纯度不高，基本都存在10％以上的杂质，且这类杂质的结构性质均都未能定性，存在一定的质量不可控性，并且影响了产品，特别是注射用药的稳定性和安全性。CN102675379A中公开了一种从红花中提取精制羟基红花黄色素A的方法，并具体公开了从中药红花中经过提取、弱碱性离子交换树脂纯化、中极性大孔吸附树脂纯化和非极性大孔吸附树脂纯化、冷冻干燥五个步骤，也仅仅得到含量为80％以上的羟基红花黄色素A。
发明内容
为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种羟基红花黄色素A药用盐新化合物，其纯度能保证达到98％以上，杂质个数控制在5个以下，将成为应用于冠心病、心绞痛、脑中风等诸多血液循环障碍疾病的治疗上相较于羟基红花黄色素A更安全有效、更稳定可控的新的单体化合物。
本发明技术方案如下：
本发明目的之一是提供一种如式(I)所示的羟基红花黄色素A药用盐：
其中，n为1或2，M选自Ca、Mg、K、NH4或其中，R1、R2、R3、R4分别相同或者不同，各自独立选自氢、烷基。
优选地，上述所述的羟基红花黄色素A药用盐，其选自式(II)的钾盐、式(III)的铵盐，式(IV)的钙盐或者式(V)的镁盐：
作为本发明另一发明目的，还提供上述所述的羟基红花黄色素A药用盐的制备方法，其包括红花药材的提取、强酸性H型阳离子交换树脂的转换、大孔吸附树脂分离、葡聚糖凝胶层析分离和超滤的步骤，其特征在于：
(1)红花药材的提取：红花药材为原料，水提取得到含有羟基红花黄色素A的提取液；
(2)强酸性H型阳离子交换树脂转换：将步骤(1)制得的提取液过强酸性H型阳离子交换树脂柱，收集洗脱液，加入氢氧化钾、氢氧化铵、烷基胺或烷基铵、氢氧化镁、氢氧化钙、碳酸镁或者碳酸钙，使羟基红花黄色素A生成羟基红花黄色素A药用盐，收集含羟基红花黄色素A药用盐的洗脱液；
(3)大孔吸附树脂分离：将步骤(2)制得的含羟基红花黄色素A药用盐的洗脱液用大孔吸附树脂柱分离，以水为洗脱剂，收集洗脱液，减压浓缩，得到羟基红花黄色素A药用盐的粗品；
(4)葡聚糖凝胶分离：将步骤(3)制得的羟基红花黄色素A药用盐粗品用葡聚糖凝胶层析分离，以水为洗脱剂，收集含羟基红花黄色素A药用盐洗脱液；
(5)超滤：将步骤(4)所得含羟基红花黄色素A药用盐洗脱液浓缩后经过滤或离心后采用截留分子量8000-10000道尔顿的超滤膜进行超滤得到超滤液，干燥后即得羟基红花黄色素A药用盐。
其中，优选地，上述所述的制备方法，步骤(2)中所述的阳离子交换树脂为强酸性H型阳离子交换树脂，其选自001*7离子交换树脂或者大孔HB-8交换树脂。
本发明所用的强酸性H型阳离子交换树脂，可以采用市售的强酸性H型阳离子交换树脂，例如001*7离子交换树脂或者大孔HB-8交换树脂均可购自上海华震科技有限公司，并且可以用HCl再生，重复使用。
作为本发明另一目的，还提供了一种制备上述所述的羟基红花黄色素A药用盐的方法，其包括红花药材的提取、大孔吸附树脂分离、葡聚糖凝胶分离、超滤、酸化和转盐的步骤，其特征在于：
(1)红花药材的提取：红花药材为原料，水提取得到含有红花黄色素的提取液；
(2)大孔吸附树脂分离：将步骤(1)制得的含红花黄色素提取液用大孔吸附树脂柱分离，以水为洗脱剂，收集洗脱液，减压浓缩，得到红花黄色素的粗品；
(3)葡聚糖凝胶分离：将步骤(2)制得的红花黄色素粗品用葡聚糖凝胶层析分离，以水为洗脱剂，收集含红花黄色素洗脱液；
(4)超滤：将步骤(3)所得含红花黄色素洗脱液浓缩后经过滤或离心后采用截留分子量8000-10000道尔顿的超滤膜进行超滤得到超滤液，干燥后即得红花黄色素粉末。
(5)酸化：将步骤(4)得到的红花黄色素粉末加水，加酸后放置冷处2～24小时，析出淡黄色固体羟基红花黄色素A，滤去上层液体。
(6)转盐：将步骤(5)得到的羟基红花黄色素A，加水后加入氢氧化钾、氢氧化铵、烷基胺或烷基铵、氢氧化镁、氢氧化钙、碳酸镁或者碳酸钙，使羟基红花黄色素A生成羟基红花黄色素A药用盐，再用超滤膜进行超滤，冻干制得所述的羟基红花黄色素A药用盐。
作为本发明另一目的，还提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的上述所述的羟基红花黄色素A药用盐为活性成分和药学上可接受的载体为辅料。
羟基红花黄色素A药用盐，可制备成合适的制剂使用，例如冻干粉针剂或输液剂。可以制成：(1)注射用羟基红花黄色素A药用盐冻干粉针剂，每瓶含50mg-200mg，不加辅料或加入1∶0.5～1.5甘露醇；(2)羟基红花黄色素A药用盐氯化钠注射液，每100ml氯化钠注射液含羟基红花黄色素A药用盐50mg-200mg；(3)羟基红花黄色素A药用盐葡萄糖注射液，每100ml葡萄糖注射液含羟基红花黄色素A药用盐50mg-200mg。
其中，优选上述所述的药物组合物为冻干粉针剂，并用包括如下步骤的方法制备得到：
(1)以红花药材为原料，加入温度为50～100℃的水抽提，抽提是以水抽提2～3次，每次0.5～24小时，抽提用水量为红花生药重量的10～30倍，抽提后滤除药渣，将提取液冷却至5～30℃，静置2～24小时；
(2)将步骤(1)制得的提取液过强酸性H型阳离子交换树脂，流速1～30ml/min，收集洗脱液，加入氢氧化钾、氢氧化铵、烷基胺或烷基铵、氢氧化镁、氢氧化钙、碳酸镁或者碳酸钙，使羟基红花黄色素A生成羟基红花黄色素A药用盐，收集含羟基红花黄色素A药用盐的洗脱液；
(3)将步骤(2)制得的洗脱液用大孔吸附树脂柱分离，以纯化水为洗脱剂，洗脱流速10～30ml/min，收集洗脱液，减压浓缩，得羟基红花黄色素A药用盐浓缩液粗品；
(4)将步骤(3)得到的羟基红花黄色素A药用盐浓缩液粗品过滤或离心后用葡聚糖凝胶层析分离，以纯化水为洗脱剂，洗脱流速控制线性流速为1～10cm/h，收集含羟基红花黄色素A药用盐洗脱液，减压浓缩得浓缩液；
(5)将步骤(4)所得浓缩液经过滤或离心后采用截留分子量8000-10000道尔顿的超滤膜进行超滤得到超滤液；
(6)将步骤(5)所得超滤液经冷冻干燥，即得羟基红花黄色素A药用盐精品；
(7)将步骤(6)得到的羟基红花黄色素A药用盐精品溶解于注射用水，经采用0.22μm的微孔滤膜或者截留分子量8000-10000道尔顿的超滤膜过滤后分装于瓶中，冷冻干燥后，即得到羟基红花黄色素A药用盐冻干粉针。
优选地，其中，上述所述的阳离子交换树脂是用001*7离子交换树脂或者大孔HB-8交换树脂；所述的大孔吸附树脂是用大孔吸附树脂HZ801；所述的葡聚糖凝胶层析是用葡聚糖凝胶LH-20。
本发明上述所述的方法，其中加入所述的药用碱使羟基红花黄色素A生成羟基红花黄色素A药用盐，碱的加入量，优选为羟基红花黄色素A的摩尔量的0.5～1倍。
作为本发明一个具体实施方式，提供一种式(II)所述的羟基红花黄色素A钾及其冻干粉针剂的制备方法，其包括红花药材的提取、强酸性H型阳离子交换树脂的转换、大孔树脂分离、葡聚糖凝胶层析分离和超滤的步骤，其特征在于：(1)以红花药材为原料，加入适量的温度为50～100℃的水抽提，抽提是以水抽提2～3次，每次0.5～24小时，抽提用水量为红花生药重量的10～30倍。抽提后滤除药渣，将提取液冷却至5～30℃：，静置2～24小时；(2)将提取液过强酸性H型阳离子交换树脂，流速1～30ml/min，收集洗脱液，按羟基红花黄色素A计，加入等摩尔的氢氧化钾，得到含羟基红花黄色素A钾洗脱液；(3)大孔吸附树脂分离：步骤(2)得到的洗脱液用大孔吸附树脂HZ801柱分离，大孔吸附树脂柱的柱内径与柱高的比值为1∶8～15，以纯化水为洗脱剂，洗脱流速10～30ml/min，收集洗脱液，减压浓缩，得羟基红花黄色素A钾浓缩液粗品；(4)葡聚糖凝胶层析分离：步骤(3)得到的羟基红花黄色素A钾浓缩液粗品过滤或离心后用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶层析分离，层析柱的径高比为1∶5～20，以纯化水为洗脱剂，洗脱流速控制线性流速为1～10cm/h，收集含羟基红花黄色素A钾洗脱液，减压浓缩得浓缩液；(5)超滤：步骤(4)所得浓缩液经过滤或离心后采用截留分子量8000-10000道尔顿的超滤膜进行超滤得到超滤液；(6)冻干：步骤(5)所得超滤液经冷冻干燥，即得羟基红花黄色素A钾；如果需要，将步骤(6)得到的羟基红花黄色素A钾精品，溶解于注射用水，经采用0.22μm的微孔滤膜或者截留分子量8000-10000道尔顿的超滤膜过滤后分装于瓶中，冷冻干燥后，得到羟基红花黄色素A钾冻干粉针。
作为本发明另一个具体实施方式，提供一种式(III)所述的羟基红花黄色素A铵及其冻干粉针剂的制备方法，其包括红花药材的提取、强酸性阳离子交换树脂的转换、大孔树脂分离、葡聚糖凝胶层析分离和超滤的步骤，其特征在于：(1)以红花药材为原料，加入适量的温度为50～100℃的水抽提，抽提是以水抽提2～3次，每次0.5～24小时，抽提用水量为红花生药重量的10～30倍。抽提后滤除药渣，将提取液冷却至5～30℃：，静置2～24小时；(2)将提取液过强酸性阳离子交换树脂，流速1～30ml/min，收集的提取液，按羟基红花黄色素A计，加入等摩尔的氢氧化铵(即氨水)，得到含羟基红花黄色素A铵的洗脱液；(3)大孔吸附树脂分离：步骤(2)得到的洗脱液用大孔吸附树脂HZ801柱分离，大孔吸附树脂柱的柱内径与柱高的比值为1∶8～15，以纯化水为洗脱剂，洗脱流速10～30ml/min，收集洗脱液，减压浓缩，得羟基红花黄色素A铵盐浓缩液粗品；(4)葡聚糖凝胶层析分离：步骤(3)得到的羟基红花黄色素A铵盐浓缩液粗品过滤或离心后用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶层析分离，层析柱的径高比为1∶5～20，以纯化水为洗脱剂，洗脱流速控制线性流速为1～10cm/h，收集含羟基红花黄色素A铵盐洗脱液，减压浓缩得浓缩液；(5)超滤：步骤(4)所得浓缩液经过滤或离心后采用截留分子量8000-10000道尔顿的超滤膜进行超滤得到超滤液；(6)冻干：步骤(5)所得超滤液经冷冻干燥，即得羟基红花黄色素A铵盐。如果需要，将步骤(6)得到的羟基红花黄色素A铵盐精品，溶解于注射用水，经采用0.22μm的微孔滤膜或者截留分子量8000-10000道尔顿的超滤膜过滤后分装于瓶中，冷冻干燥后，得到羟基红花黄色素A铵盐冻干粉针。
作为本发明另一个具体实施方式，提供一种式(IV)所述的羟基红花黄色素A钙及其冻干粉针剂的制备方法，其包括红花药材的提取、强酸性H型阳离子交换树脂的转换、大孔树脂分离、葡聚糖凝胶层析分离和超滤的步骤，其特征在于：(1)以红花药材为原料，加入适量的温度为50～100℃的水抽提，抽提是以水抽提2～3次，每次0.5～24小时，抽提用水量为红花生药重量的10～30倍。抽提后滤除药渣，将提取液冷却至5～30℃：，静置2～24小时；(2)将提取液过强酸性H型阳离子交换树脂，流速1～30ml/min，收集洗脱液，按羟基红花黄色素A计，加入一半摩尔的Ca(OH)2，得到含羟基红花黄色素A钙洗脱液；(3)大孔吸附树脂分离：步骤(2)得到的洗脱液用大孔吸附树脂HZ801柱分离，大孔吸附树脂柱的柱内径与柱高的比值为1∶8～15，以纯化水为洗脱剂，洗脱流速10～30ml/min，收集洗脱液，减压浓缩，得羟基红花黄色素A钙浓缩液粗品；(4)葡聚糖凝胶层析分离：步骤(3)得到的羟基红花黄色素A钙浓缩液粗品过滤或离心后用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶层析分离，层析柱的径高比为1∶5～20，以纯化水为洗脱剂，洗脱流速控制线性流速为1～10cm/h，收集含羟基红花黄色素A钙洗脱液，减压浓缩得浓缩液；(5)超滤：步骤(4)所得浓缩液经过滤或离心后采用截留分子量8000-10000道尔顿的超滤膜进行超滤得到超滤液；(6)冻干：步骤(5)所得超滤液经冷冻干燥，即得羟基红花黄色素A钙。如果需要，可以将步骤(6)得到的羟基红花黄色素A钙精品，溶解于注射用水，经采用0.22μm的微孔滤膜或者截留分子量8000-10000道尔顿的超滤膜过滤后分装于瓶中，冷冻干燥后，得到羟基红花黄色素A钙冻干粉针。
作为本发明另一个具体实施方式，提供一种式(V)所述的羟基红花黄色素A镁及其冻干粉针剂的制备方法，其包括红花药材的提取、强酸性阳离子交换树脂的转换、大孔树脂分离、葡聚糖凝胶层析分离和超滤的步骤，其特征在于：(1)以红花药材为原料，加入适量的温度为50～100℃的水抽提，抽提是以水抽提2～3次，每次0.5～24小时，抽提用水量为红花生药重量的10～30倍。抽提后滤除药渣，将提取液冷却至5～30℃：，静置2～24小时；(2)将提取液过强酸性阳离子交换树脂，流速1～30ml/min，收集的提取液，按羟基红花黄色素A计，加入一半摩尔的氢氧化镁，得到含羟基红花黄色素A镁的洗脱液；(3)大孔吸附树脂分离：步骤(2)得到的洗脱液用大孔吸附树脂HZ801柱分离，大孔吸附树脂柱的柱内径与柱高的比值为1∶8～15，以纯化水为洗脱剂，洗脱流速10～30ml/min，收集洗脱液，减压浓缩，得羟基红花黄色素A镁盐浓缩液粗品；(4)葡聚糖凝胶层析分离：步骤(3)得到的羟基红花黄色素A镁盐浓缩液粗品过滤或离心后用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶层析分离，层析柱的径高比为1∶5～20，以纯化水为洗脱剂，洗脱流速控制线性流速为1～10cm/h，收集含羟基红花黄色素A镁盐洗脱液，减压浓缩得浓缩液；(5)超滤：步骤(4)所得浓缩液经过滤或离心后采用截留分子量8000-10000道尔顿的超滤膜进行超滤得到超滤液；(6)冻干：步骤(5)所得超滤液经冷冻干燥，即得羟基红花黄色素A镁盐。如果需要，可以将步骤(6)得到的羟基红花黄色素A镁盐精品，溶解于注射用水，经采用0.22μm的微孔滤膜或者截留分子量8000-10000道尔顿的超滤膜过滤后分装于瓶中，冷冻干燥后，得到羟基红花黄色素A镁盐冻干粉针。
其中，上述所述的离子交换树脂是用001*7离子交换树脂或者大孔HB-8交换树脂；所述的大孔树脂分离是用大孔吸附树脂HZ801；所述的葡聚糖凝胶层析分离是用葡聚糖凝胶LH-20；所述的超滤是用截留分子量8000-10000道尔顿的超滤膜。
作为本发明另一发明目的，还提供了上述所述的羟基红花黄色素A药用盐在制备药物中的应用，其中所述的药物具有抗PAF或ADP诱导的血小板聚集作用，用于治疗或者预防涉及心肌缺血、脑缺血、血栓形成所致损伤疾病。本发明的羟基红花黄色素A药用盐的临床应用剂量为50-200mg/每天。
本发明以红花药材为原料，制备获得了新型单体药物羟基红花黄色素A药用盐，纯度能保证达到98％以上，杂质个数控制在5个以下，将成为应用于冠心病、心绞痛等诸多血液循环障碍疾病的治疗上相较于羟基红花黄色素A更安全有效、更稳定可控的单体化合物。
本发明在研究中，通过反复试验研究发现，红花药材提取液中的羟基红花黄色素A是不以酸形式存在的，现有技术(例如CN101168539A、CN1895317A、CN101195647A)中通过红花黄色素提取液直接加入氢氧化钠等pH调节剂来调节pH值，羟基红花黄色素A并不能转化生成羟基红花黄色素A药用盐，因此得不到羟基红花黄色素A药用盐单体化合物。本发明令人意外发现，红花黄色素提取液先通过用强酸性H型阳离子交换树脂转化后得到真正意义上的羟基红花黄色素A，即以酸形式，然后通过不同的碱调节pH，转化得到羟基红花黄色素A相应的盐，可以得到单一的羟基红花黄色素A药用盐单体化合物。同样地，本发明还发现，还可以通过将红花黄色素精制品通过酸化先制得羟基红花黄色素A，羟基红花黄色素A再用氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化镁、氢氧化钙、碳酸镁或者碳酸钙等成盐，也可以高收率、高纯度获得本发明所述的羟基红花黄色素A药用盐单体化合物。与羟基红花黄色素A相比，本发明的羟基红花黄色素A药用盐不仅纯度更高，达到98％以上，杂质个数控制在5个以下，而且稳定性也更好。
一、药效学研究试验
药效学研究试验一：
羟基红花黄色素A盐对大鼠急性心肌梗死的保护作用
受试药物
注射用红花黄色素(50mg/瓶)，来源：浙江永宁药业股份有限公司，含量：50mg/瓶含羟基红花黄色素A 42.5mg；
羟基红花黄色素A钾(按照实施例1所制得)；
羟基红花黄色素A钙(按照实施例5所制得)。
动物：雄性SD大鼠32只，体重250～350g.
试验分组及剂量设置：
试验方法
1.大鼠急性心肌梗死模型的制备：以3％戊巴比妥钠45mg/kg腹腔麻醉。右侧股动、静脉插管分别作血压监测和静脉给药用；气管插管行人工机械通气，频率60次/min、通气量约10ml/kg。四肢皮下置入针电极以记录心电图。于胸骨左缘外侧约0.5cm处纵行切开皮肤，钝性分离皮下组织，依次分离、结扎并剪断胸大肌、胸小肌、肋间肌，在胸骨左缘第四肋间心尖博动最强外开胸，剪开心包，以止血钳夹持心包于胸壁两侧，形成心包床，暴露左心室表面血管。6-0丝线穿过左心耳下约2mm处的浅层心肌(即冠状动脉前降支)。穿线后稳定15min。如此期间出现心律失常或动脉收缩压低于70mmHg(9.31KPa)持续超过5min则废除该动物，穿线15min后静脉给药，给药10min后结扎冠脉，结扎时间持续4小时。
2.心律失常评分：对冠脉结扎后30min内出现心律失常严重程度进行评分。
3.心肌酶学检查：试验结束取静脉血约2ml，4℃下4000/min离心5min，取上清液作心肌酶学检查。测定项目：LDH、AKP、CK。
4.心肌梗死区面积测定：冠脉结扎后4h后于左心室前壁穿刺，注射碳素墨水后自处死动物，取出心脏，用生理盐水洗净，除去血污剔除血管、脂肪等非心肌组织，用吸水纸吸去水分，称重。从心尖到心底部平行将心室切成约2mm左右薄片，将灌注区(墨水灌注部分)和缺血危险区(无墨水灌注部分)分离，将缺血危险区称重并置入0.05％的NBT溶液中，37℃恒温水浴箱中染色15min。NBT可使活组织内的基质、辅酶及脱氧酶等染成紫蓝色，而坏死组织中这些代谢基质、酶等丧失，故不着色。可见到非梗死区域被NBT染成深蓝色，梗死区不被染色。剪去各心肌中被染色的非梗死心肌，把末被染色的梗心心肌称重，计算梗死心肌占危险区心肌的重量百分比(梗死区重量/危险区重量*100％)。
统计学处理：
试验数据以均数±标准差表示，采用方差分析进行统计学检验，P＜0.05表示差异显著。
一、对大鼠急性心肌缺血后心律失常的影响
大鼠冠脉结扎后5min开始有心律失常出现，持续至30min，10min左右达到高峰。本试验结果显示红花黄色素，羟基红花黄色素A钾与羟基红花黄色素A钙静脉给药都可降低心律失常的严重程度，但羟基红花黄色素A钾、羟基红花黄色素A钙的效果更佳。
各实验组心律失常评分
*P＜0.05vs组1
二、比较红花黄色素、羟基红花黄色素A钾与羟基红花黄色素A钙对大鼠心肌梗死范围的影响
各实验组对心肌梗死范围的影响
*P＜0.05vs组1
三、注射用红花黄色素对大鼠心肌梗死后血清LDH、AKP、CK的影响
本试验结果显示注射用红花黄色素、羟基红花黄色素A钾与羟基红花黄色素A钙静脉给药都可抑制大鼠血清LDH、CK的升高，但羟基红花黄色素A钾、羟基红花黄色素A钙效果更显著。
各实验组血清LDH、AKP、CK值
*p＜0.05vs组1
试验结论
1.注射用红花黄色素、羟基红花黄色素A钾与羟基红花黄色素A钙均可明显降低大鼠冠脉结扎后心律失常的严重程度，但羟基红花黄色素A钾、羟基红花黄色素A钙的效果更好；
2.与注射用红花黄色素比较，羟基红花黄色素A钾、羟基红花黄色素A钙降低大鼠心肌梗死范围效果更好；
3.与注射用红花黄色素比较，羟基红花黄色素A钾、羟基红花黄色素A钙抑制大鼠血清LDH、CK的疗效更明显；
4.羟基红花黄色素A钾与羟基红花黄色素A钙两者药效无显著差别。
药效学研究试验二：
羟基红花黄色素A钾与羟基红花黄色素A钙静脉注射给药对急性脑缺血有防治作用。
受试药物
注射用红花黄色素(50mg/瓶)，来源：浙江永宁药业股份有限公司，含量：50mg/瓶含羟基红花黄色素A 42.5mg；
羟基红花黄色素A钾(按照实施例1所制得)；
羟基红花黄色素A钙(按照实施例5所制得)。
实验内容如下：
1.对犬离体心、脑血管的选择性：该实验将Beagle犬大脑基底动脉环和冠状动脉环固定在离体血管测量装置上，调整张力传感器并向浴杯液中加入10-6mol/L的苯肾上腺素使血管维持适度张力，然后每间隔5min向浴杯液中按每毫升10mg的剂量加入注射用羟基红花黄色素A钾或羟基红花黄色素A钙，直到血管环反应很弱或不再出现反应为止(一般加药次数为4-5次)。计算血管收缩或舒张变化值。实验结果显示：注射用羟基红花黄色素A钾对心脏血管环的舒张作用为31.6％，而对脑血管环的舒张作用为73.1％；注射用羟基红花黄色素A钙对心脏血管环的舒张作用为37.1％，而对脑血管环的舒张作用为69.7％。提示注射用羟基红花黄色素A钾与羟基红花黄色素A钙对脑血管均具有非常好的选择性和舒张作用，两者之间无显著差别。
2.对急性脑缺血的影响：实验用SD大鼠，静脉注射羟基红花黄色素A钾或羟基红花黄色素A钙后用常规的大脑中动脉栓塞(MCAO)线栓法制备急性脑缺血模型。饲养24h后先对其进行神经行为学评分，然后断头处死大鼠，取出大脑，放入模具中切成7片，予以TTC染色，存活脑组织被染成红色，坏死脑组织不着色，用图形分析软件计算坏死脑组织占大脑半球的比例。试验结果，脑梗死面积溶剂对照组为38％，尼莫地平阳性对照组为15.7％，注射用羟基红花黄色素A钾低中高三个剂量组分别为38.2％、27.6％和21.9％，注射用羟基红花黄色素A钙低中高三个剂量组分别为41.3％、25.7％和21.6％，与溶剂对照组比较，注射用羟基红花黄色素A钾与羟基红花黄色素A钙在中高剂量能够显著减轻急性脑缺血引起脑组织坏死，两者之间无显著差别。
3.对大鼠脑血管通透性的影响：大鼠静脉注射给药，每天一次，连续7天，最后一次给药后将大鼠麻醉，静脉注射伊文思蓝50mg/kg，5分钟后结扎双侧颈总动脉，3小时后断头处死动物，取出大脑，称重后浸泡于甲酰胺溶液中，置45℃恒温箱中72h，此时脑血管中的伊文思蓝能够浸出到甲酰胺溶液中，用分光光度计检测甲酰胺溶液中伊文思蓝析出量的多少表示脑血管通透性的高低。实验结果显示：注射用羟基红花黄色素A钾及羟基红花黄色素A钙在中高剂量组有非常显著的减少伊文思蓝从脑血管中的溢出的作用，说明该药对降低血管通透性有较好作用，两者之间无显著差别。
4.对犬脑血流量的影响：实验动物用Beagle犬，犬用戊巴比妥钠麻醉后手术分离出一侧颈外静脉、颈内静脉和椎动脉，结扎颈外静脉，放置流量探头在颈内静脉和椎动脉，两处探头记录的血流量相加乘2代表全脑供血量，实验结束取出大脑称重计算每100g大脑组织血流量。试验结果，注射用羟基红花黄色素A钾及羟基红花黄色素A钙在静脉给药后中高剂量均有明显增加血流量的作用，但两者血流量增加维持时间较短(约15min)，该实验提示今后在临床用于治疗急性脑缺血时应选用静脉滴注的方法给药，两者之间无显著差别。
5.对急性脑缺氧的影响：实验用昆明种小鼠和SD大鼠进行，将动物放入缺氧环境中，记录存活时间，了解动物用药后是否能增加对急性缺氧的耐受性。实验发现：小鼠在密闭的容器中，溶剂对照组存活时间为32min，而注射用羟基红花黄色素A钾低中高三个剂量组的小鼠存活时间分别为36、37、36min；注射用羟基红花黄色素A钙低中高三个剂量组的小鼠存活时间分别为35、38、37min，经统计学处理与溶剂对照组比较有显著差异(P＜0.05～0.01)。大鼠实验在含97％的氮气和3％氧气的环境中进行，动物放入容器后到呼吸停止，各组的生存时间为，溶剂对照组平均3分43秒；阳性对照组(尼莫地平)为5分38秒，两者间比较差别非常显著；注射用羟基红花黄色素A钾低中高三个剂量组分别为3分20秒、4分30秒和4分9秒；注射用羟基红花黄色素A钙低中高三个剂量组分别为3分31秒、4分35秒和4分21秒，和溶剂对照组比较中注射用羟基红花黄色素A钾及注射用羟基红花黄色素A钙的高剂量组存活时间显著增加，两者之间无显著差别。
6.抗血小板聚积：实验分为用仪器检测和活体实验两部分，1)仪器检测方法：家兔静脉注射羟基红花黄色素A钾，每天一次连续5天，最后一次给药结束2小时内从心脏取血4ml，血液经低速离心得到富含血小板的血清；经高速离心得到贫血小板血清，血小板聚积诱导剂选用二磷酸腺苷(adenosine diphosphate；ADP)和血小板聚集活化因子(Platelet-Activating Factor PAF)两种，用血小板聚集仪进行测试。在羟基红花黄色素A钾注射液抗ADP和PAF诱导的血小板聚集实验中，均显示有非常好的抗血小板聚集作用，在三个剂量之间显示出有良好的量-效关系存在。2)活体方法：用乳胶管在大鼠动静脉之间形成短路，乳胶管内固定有手术用丝线，利用血小板粘附的特点，开放短路使血液经乳胶管跨动静脉流动15分钟，取出丝线称重，减去丝线干重即是粘附在丝线上的血小板重量。实验结果，在丝线上粘附的血小板重量溶剂对照组为14.8±1.57mg；阳性对照组为8.62±2.79mg；注射用羟基红花黄色素A钾低中高三个剂量组的粘附血小板重量分别为13.6±1.89mg，9.90±1.53mg和8.91±1.34mg；注射用羟基红花黄色素A钙低中高三个剂量组的粘附血小板重量分别为13.9±1.54mg，10.26±1.15mg和8.73±1.79mg；注射用羟基红花黄色素A钾及羟基红花黄色素A钙的中高剂量组和溶剂对照组比较相差非常明显，说明注射用羟基红花黄色素A钾或羟基红花黄色素A钙均有非常好的抗大鼠血小板聚集的作用，两者之间无显著差别。
7.对血液粘滞度的影响：家兔静脉给药，每天一次，连续5天，最后一次给药2小时心脏取血抗凝后直接用血液流变仪检测。试验结果，与溶剂对照组比较，羟基红花黄色素A钾及羟基红花黄色素A钙治疗组随着用药剂量的增加，血液粘滞度低切、中切和高切三个指标均随之降低，降低幅度随剂量增加而增加，两者高剂量组效果均优于阳性对照药尼莫地平注射用液组，说明注射用羟基红花黄色素A钾及羟基红花黄色素A钙对降低血液粘滞度均有显著作用，两者之间无显著差别。
二、稳定性试验和理化数据
(一)观察羟基红花黄色素A盐与羟基红花黄色素A稳定性
受试药物
注：含量是以羟基红花黄色素A计。
试验结果表明，本发明的羟基红花黄色素A药用盐单体化合物与羟基红花黄色素A的稳定性比较试验，说明羟基红花黄色素A药用盐的稳定性更好。
(二)观察羟基红花黄色素A盐与羟基红花黄色素A理化数据。
羟基红花黄色素A药用盐理化数据结果
试验结果表明，本发明的羟基红花黄色素A药用盐单体化合物与羟基红花黄色素A的理化数据比较，说明羟基红花黄色素A药用盐的耐受性更好。
附图说明
图1：式(IV)的羟基红花黄色素A钙核磁共振1H-NMR
图2：式(IV)的羟基红花黄色素A钙核磁共振13C-NMR
图3：式(V)的羟基红花黄色素A镁核磁共振1H-NMR
图4：式(V)的羟基红花黄色素A镁核磁共振13C-NMR
具体实施方式
实施例1：羟基红花黄色素A钾(本发明式II化合物)
称取红花，加12.5倍药材重量的去离子水，于100℃提取20-25分钟，过滤，滤渣加10倍药材重量的去离子水再按上述条件重复提取一次，过滤。合并二次提取液，冷却至室温，用离心机离心后，取离心液备用。将上述离心液缓缓加到已处理平衡好的001*7强酸性H型阳离子交换树脂，柱径高比为1∶10，柱体积为500ml，流速为3ml/min，收集流出液，按羟基红花黄色素A计，加入等摩尔的氢氧化钾，然后缓缓加到大孔吸附树脂分离柱中，柱径高比为1∶12，上样流速为每分钟10ml。上样结束后，用常温的去离子水以每分钟20ml的流速洗脱。洗脱液于60℃减压浓缩，得羟基红花黄色素A钾粗品浓缩液。以红花计，每公斤红花得浓缩液100ml。羟基红花黄色素A钾粗品浓缩液上凝胶LH-20柱，柱的径高比为1∶5，上样量为柱床体积的10％，洗脱流速为每分钟5ml，收集含羟基红花黄色素A钾部分。收集液经60℃减压浓缩后，得羟基红花黄色素A钾精品浓缩液，以红花计，每公斤红花得浓缩液35～50ml，经冷冻干燥，即得淡黄色的羟基红花黄色素A钾精品粉末，纯度为98.5％，收率按红花计为0.55％左右。
羟基红花黄色素A钾的红外光谱(IR)、质谱MS、核磁共振1H-NMR、13C-NMR数据如下：
1.红外吸收光谱
仪器型号：Bruker VECTOR-22型红外吸收光谱仪
IR(溴化钾压片)
2.质谱
仪器型号：美国FINNIGAN公司液质联用多级离子阱质谱系(LCQ-DECAXP)
测试条件：ESI
质谱MS
+c ESI 651.06(M)+
-c ESI 611.24(M-K)-
3.核磁共振氢谱和碳谱
仪器型号：BRUCKER AVANCE III 500型超导核磁共振仪
测试条件：溶剂：DMSO，内标：TMS
羟基红花黄色素A钾的1H一NMR数据
羟基红花黄色素A钾盐的13C一NMR数据
将所制得的羟基红花黄色素A钾精品，溶解于注射用水，经采用0.22μm的微孔滤膜或者截留分子量8000-10000道尔顿的超滤膜过滤后分装于瓶中，冷冻干燥后，得到羟基红花黄色素A钾冻干粉针。
实施例2：羟基红花黄色素A钾(本发明式II化合物)
称取红花，加12.5倍药材重量的去离子水，于100℃提取20-25分钟，过滤，滤渣加10倍药材重量的去离子水再按上述条件重复提取一次，过滤。合并二次提取液，冷却至室温，用离心机离心后，取离心液备用。将上述离心液缓缓加到已处理平衡好的HB-8大孔强酸性H型阳离子交换树脂，柱径高比为1∶10，柱体积为500ml，流速为3ml/min，收集流出液，按羟基红花黄色素A计，加入等摩尔的氢氧化钾，然后缓缓加到大孔吸附树脂分离柱中，柱径高比为1∶12，上样流速为每分钟10ml。上样结束后，用常温的去离子水以每分钟20ml的流速洗脱。洗脱液于60℃减压浓缩，得羟基红花黄色素A钾粗品浓缩液。以红花计，每公斤红花得浓缩液100ml。羟基红花黄色素A钾粗品浓缩液上凝胶LH-20柱，柱的径高比为1∶5，上样量为柱床体积的10％，洗脱流速为每分钟5ml，收集含羟基红花黄色素A钾部分。收集液经60℃减压浓缩后，得羟基红花黄色素A钾精品浓缩液，以红花计，每公斤红花得浓缩液35～50ml，经冷冻干燥，即得淡黄色的羟基红花黄色素A钾精品粉末，纯度为98.6％，收率按红花计为0.50％左右。
实施例3：式III的羟基红花黄色素A铵(本发明式III化合物)
称取红花，加12.5倍药材重量的去离子水，于100℃提取20-25分钟，过滤，滤渣加10倍药材重量的去离子水再按上述条件重复提取一次，过滤。合并二次提取液，冷却至室温，用离心机离心后，取离心液备用。将上述离心液缓缓加到已处理平衡好的001*7强酸性H型阳离子交换树脂，柱径高比为1∶10，柱体积为500ml，流速为3ml/min，收集流出液，按羟基红花黄色素A计，加入等摩尔的氨水，然后缓缓加到大孔吸附树脂分离柱中，柱径高比为1∶12，上样流速为每分钟10ml。上样结束后，用常温的去离子水以每分钟20ml的流速洗脱。洗脱液于60℃减压浓缩，得羟基红花黄色素A铵粗品浓缩液。以红花计，每公斤红花得浓缩液100ml。羟基红花黄色素A铵粗品浓缩液上凝胶LH-20柱，柱的径高比为1∶5，上样量为柱床体积的10％，洗脱流速为每分钟5ml，收集含羟基红花黄色素A铵部分。收集液经60℃减压浓缩后，得羟基红花黄色素A铵精品浓缩液，以红花计，每公斤红花得浓缩液35～50ml，经冷冻干燥，即得淡黄色的羟基红花黄色素A铵精品粉末，纯度为99.3％，收率按红花计为0.45％左右。
羟基红花黄色素A铵的红外光谱(IR)、质谱MS、核磁共振1H-NMR、13C-NMR数据如下：
1.红外吸收光谱
仪器型号：Bruker VECTOR-22型红外吸收光谱仪
IR(溴化钾压片)
2.质谱
仪器型号：美国FINNIGAN公司液质联用多级离子阱质谱系(LCQ-DECAXP)
测试条件：ESI
质谱MS
+c ESI 613.17(M)+
-c ESI 611.22(M-H)-
3.核磁共振氢谱和碳谱
仪器型号：BRUCKER AVANCE III 500型超导核磁共振仪
测试条件：溶剂：DMSO，内标：TMS
核磁共振
羟基红花黄色素A铵的1H一NMR数据
羟基红花黄色素A铵的13C一NMR数据
实施例4：羟基红花黄色素A铵(即本发明式III化合物)
称取红花，加12.5倍药材重量的去离子水，于100℃提取20-25分钟，过滤，滤渣加10倍药材重量的去离子水再按上述条件重复提取一次，过滤。合并二次提取液，冷却至室温，用离心机离心后，取离心液备用。将上述离心液缓缓加到已处理平衡好的HB-8大孔强酸性H型阳离子交换树脂，柱径高比为1∶10，柱体积为500ml，流速为3ml/min，收集流出液，按羟基红花黄色素A计，加入等摩尔的氨水，然后缓缓加到大孔吸附树脂分离柱中，柱径高比为1∶12，上样流速为每分钟10ml。上样结束后，用常温的去离子水以每分钟20ml的流速洗脱。洗脱液于60℃减压浓缩，得羟基红花黄色素A铵粗品浓缩液。以红花计，每公斤红花得浓缩液100ml。羟基红花黄色素A铵粗品浓缩液上凝胶LH-20柱，柱的径高比为1∶5，上样量为柱床体积的10％，洗脱流速为每分钟5ml，收集含羟基红花黄色素A铵部分。收集液经60℃减压浓缩后，得羟基红花黄色素A铵精品浓缩液，以红花计，每公斤红花得浓缩液35～50ml，经冷冻干燥，即得淡黄色的羟基红花黄色素A铵精品粉末，纯度为99.4％，收率按红花计为0.50％左右。
实施例5：羟基红花黄色素A钙(式IV化合物)
称取红花，加12.5倍药材重量的去离子水，于100℃提取20-25分钟，过滤，滤渣加10倍药材重量的去离子水再按上述条件重复提取一次，过滤。合并二次提取液，冷却至室温，用离心机离心后，取离心液备用。将上述离心液缓缓加到已处理平衡好的001*7强酸性H型阳离子交换树脂，柱径高比为1∶10，柱体积为500ml，流速为3ml/min，收集流出液，按羟基红花黄色素A计，加入一半摩尔的Ca(OH)2，然后缓缓加到大孔吸附树脂分离柱中，柱径高比为1∶12，上样流速为每分钟10ml。上样结束后，用常温的去离子水以每分钟20ml的流速洗脱。洗脱液于60℃减压浓缩，得羟基红花黄色素A钙粗品浓缩液。以红花计，每公斤红花得浓缩液100ml。羟基红花黄色素A钙粗品浓缩液上凝胶LH-20柱，柱的径高比为1∶5，上样量为柱床体积的10％，洗脱流速为每分钟5ml，收集含羟基红花黄色素A钙部分。收集液经60℃减压浓缩后，得羟基红花黄色素A钙精品浓缩液，以红花计，每公斤红花得浓缩液35～50ml，经冷冻干燥，即得淡黄色的羟基红花黄色素A钙精品粉末，纯度为98.8％，收率按红花计为0.50％左右。
羟基红花黄色素A钙的质谱MS、核磁共振1H-NMR、13C-NMR数据如下：
1.质谱
仪器型号：美国FINNIGAN公司液质联用多级离子阱质谱系(LCQ-DECAXP)
测试条件：ESI
质谱MS
+c ESI 1263.08(M)+
-c ESI 611.29(M)-
2.磁共振氢谱和碳谱
仪器型号：BRUCKER AVANCE III 500型超导核磁共振仪
测试条件：溶剂：DMSO，内标：TMS
结果见图1和2。
羟基红花黄色素A钙的1H一NMR数据归属(由于结构对称，编号一致)
化学位移δ(ppm)3.01～4.15归属于糖部分氢G1～G6和G’1～G’6；4.29～4.88归属于糖上羟基氢；7.33(1H)7.38(1H)归属于8和9；6.77～7.47(4H)归属于11～15；18.74(1H)归属于3-OH；4.72(1H)归属于4-OH；9.82(1H)归属于13-OH。
羟基红花黄色素A钙的13C一NMR数据归属
化学位移δ(ppm)60.32(1C)、61.83(1C)(仲碳)归属于糖部分碳G6、G’6；68.92、69.28、69.38、71.04、73.71、78.33、79.36、79.81、80.95、85.67(10C)(叔碳)归属于糖部分碳G1～G5和G’1～G'5；115.71(2C)(叔碳)归属于12和14；129.58(2C)(叔碳)归属于11和15；122.81(1C)136.56(1C)(叔碳)归属于8和9；化学位移δ(ppm)189.21、105.74、85.59、183.92、99.72(5C)归属于1～2、4～6；179.88(1C)、127.17(1C)、158.66(1C)分别归属于7、10、13。
将所制得的羟基红花黄色素A钙精品，溶解于注射用水，经采用0.22μm的微孔滤膜或者截留分子量8000-10000道尔顿的超滤膜过滤后分装于瓶中，冷冻干燥后，得到羟基红花黄色素A钙冻干粉针。
实施例6：羟基红花黄色素A钙(式IV化合物)
称取红花，加12.5倍药材重量的去离子水，于100℃提取20-25分钟，过滤，滤渣加10倍药材重量的去离子水再按上述条件重复提取一次，过滤。合并二次提取液，冷却至室温，用离心机离心后，取离心液备用。将上述离心液缓缓加到已处理平衡好的HB-8大孔强酸性H型阳离子交换树脂，柱径高比为1∶10，柱体积为500ml，流速为3ml/min，收集流出液，按羟基红花黄色素A计，加入一半摩尔的Ca(OH)2，然后缓缓加到大孔吸附树脂分离柱中，柱径高比为1∶12，上样流速为每分钟10ml。上样结束后，用常温的去离子水以每分钟20ml的流速洗脱。洗脱液于60℃减压浓缩，得羟基红花黄色素A钙粗品浓缩液。以红花计，每公斤红花得浓缩液100ml。羟基红花黄色素A钙粗品浓缩液上凝胶LH-20柱，柱的径高比为1∶5，上样量为柱床体积的10％，洗脱流速为每分钟5ml，收集含羟基红花黄色素A钙部分。收集液经60℃减压浓缩后，得羟基红花黄色素A钙精品浓缩液，以红花计，每公斤红花得浓缩液35～50ml，经冷冻干燥，即得淡黄色的羟基红花黄色素A钙精品粉末，纯度为98.6％，收率按红花计为0.50％左右。
实施例7：羟基红花黄色素A钙(本发明式IV化合物)
称取红花，加12.5倍药材重量的去离子水，于100℃提取20-25分钟，过滤，滤渣加10倍药材重量的去离子水再按上述条件重复提取一次，过滤。合并二次提取液，冷却至室温，用离心机离心后，取离心液备用。将上述离心液缓缓加到大孔吸附树脂分离柱中，柱径高比为1∶12，上样流速为每分钟10ml。上样结束后，用常温的去离子水以每分钟20ml的流速洗脱。洗脱液于60℃减压浓缩，得红花黄色素粗品浓缩液。以红花计每公斤红花得浓缩液100ml。红花黄色素粗品浓缩液上凝胶LH-20柱，柱的径高比为1∶5，上样量为柱床体积的10％，以纯化水为洗脱剂，洗脱流速为每分钟5ml，收集含红花黄色素部分。收集液经60℃减压浓缩后，得红花黄色素浓缩液，以红花计，每公斤红花得浓缩液35～50ml，经冷冻干燥，即得淡黄色的红花黄色素粉末，纯度约为90％。红花黄色素粉末加水溶解后用HCl酸化，放置冷处2～24小时析出羟基红花黄色素A固体。固体过滤后加水溶解，按羟基红花黄色素A计，再加入一半摩尔的氢氧化钙，经冷冻干燥即得淡黄色的羟基红花黄色素A钙精品，纯度为99.2％，收率按红花计为0.7％左右。
实施例8：式III的羟基红花黄色素A镁(本发明式V化合物)
称取红花，加12.5倍药材重量的去离子水，于100℃提取20-25分钟，过滤，滤渣加10倍药材重量的去离子水再按上述条件重复提取一次，过滤。合并二次提取液，冷却至室温，用离心机离心后，取离心液备用。将上述离心液缓缓加到已处理平衡好的001*7强酸性H型阳离子交换树脂，柱径高比为1∶10，柱体积为500ml，流速为3ml/min，收集流出液，按羟基红花黄色素A计，加入一半摩尔的氢氧化镁，然后缓缓加到大孔吸附树脂分离柱中，柱径高比为1∶12，上样流速为每分钟10ml。上样结束后，用常温的去离子水以每分钟20ml的流速洗脱。洗脱液于60℃减压浓缩，得羟基红花黄色素A镁粗品浓缩液。以红花计，每公斤红花得浓缩液100ml。羟基红花黄色素A镁粗品浓缩液上凝胶LH-20柱，柱的径高比为1∶5，上样量为柱床体积的10％，洗脱流速为每分钟5ml，收集含羟基红花黄色素A镁部分。收集液经60℃减压浓缩后，得羟基红花黄色素A镁精品浓缩液，以红花计，每公斤红花得浓缩液35～50ml，经冷冻干燥，即得淡黄色的羟基红花黄色素A镁精品粉末，纯度为99.0％，收率按红花计为0.5％左右。
羟基红花黄色素A镁的质谱MS、核磁共振1H-NMR、13C-NMR数据如下：
1.质谱
仪器型号：美国FINNIGAN公司液质联用多级离子阱质谱系(LCQ-DECAXP)
测试条件：ESI
质谱MS
+cESI 1247.01(M)+
-c ESI 611.35(M-H)-
2.核磁共振氢谱和碳谱
仪器型号：BRUCKER AVANCE III 500型超导核磁共振仪
测试条件：溶剂：DMSO，内标：TMS
结果见图3和4。
羟基红花黄色素A镁的1H一NM和13C一NMR，跟案例(埃索美拉唑钠与埃索美拉唑镁)类似，由于镁的存在，会干扰样品的测试。只能得到部分的氢谱和碳谱。由于工艺和骨架结构都与羟基红花黄色A钙一致，故可作为参考。
羟基红花黄色素A镁的1H一NMR数据归属(由于结构对称，编号一致)化学位移δ(ppm)2.85～4.11归属于糖部分氢G1～G6和G’1～G’6；4.38～4.81归属于糖上羟基氢；7.30(1H)7.38(1H)归属于8和9；6.74～7.41(4H)归属于11～15；18.68(1H)归属于3-OH；4.72(1H)归属于4-OH；9.80(1H)归属于13-OH。
羟基红花黄色素A镁的13C一NMR数据归属
化学位移δ(ppm)61.26(1C)、62.26(1C)(仲碳)归属于糖部分碳G6、G’6；69.24、70.03、71.51、74.13、79.70、80.54、81.33、85.91(8C)(叔碳)归属于糖部分碳G1～G5和G’1～G'5部分；116.09(2C)(叔碳)归属于12和14；129.90(2C)(叔碳)归属于11和15；122.81(1C)136.56(1C)(叔碳)归属于8和9；
化学位移δ(ppm)195.38(1C)归属于3；179.83(1C)、127.62(1C)、159.01(1C)分别归属于7、10、13。
实施例9：羟基红花黄色素A镁(即本发明式V化合物)
称取红花，加12.5倍药材重量的去离子水，于100℃提取20-25分钟，过滤，滤渣加10倍药材重量的去离子水再按上述条件重复提取一次，过滤。合并二次提取液，冷却至室温，用离心机离心后，取离心液备用。将上述离心液缓缓加到大孔吸附树脂分离柱中，柱径高比为1∶12，上样流速为每分钟10ml。上样结束后，用常温的去离子水以每分钟20ml的流速洗脱。洗脱液于60℃减压浓缩，得红花黄色素粗品浓缩液。以红花计每公斤红花得浓缩液100ml。红花黄色素粗品浓缩液上凝胶LH-20柱，柱的径高比为1∶5，上样量为柱床体积的10％，以纯化水为洗脱剂，洗脱流速为每分钟5ml，收集含红花黄色素部分。收集液经60℃减压浓缩后，得红花黄色素浓缩液，以红花计，每公斤红花得浓缩液35～50ml，经冷冻干燥，即得淡黄色的红花黄色素粉末，纯度约为90％。红花黄色素粉末加水溶解后用HCl酸化，放置冷处2～24小时析出羟基红花黄色素A固体。固体过滤后加水溶解，按羟基红花黄色素A计，再加入一半摩尔的氢氧化镁，经冷冻干燥即得淡黄色的羟基红花黄色素A镁精品，纯度为99.2％，收率按红花计为0.7％左右。
实施例10：羟基红花黄色素A三乙胺(即式I中，n为1，R1为氢，R2、R3、R4为乙基)
称取红花，加12.5倍药材重量的去离子水，于100℃提取20-25分钟，过滤，滤渣加10倍药材重量的去离子水再按上述条件重复提取一次，过滤。合并二次提取液，冷却至室温，用离心机离心后，取离心液备用。将上述离心液缓缓加到已处理平衡好的001*7强酸性H型阳离子交换树脂，柱径高比为1∶10，柱体积为500ml，流速为3ml/min，收集流出液，按羟基红花黄色素A计，加入等摩尔的三乙胺，然后缓缓加到大孔吸附树脂分离柱中，柱径高比为1∶12，上样流速为每分钟10ml。上样结束后，用常温的去离子水以每分钟20ml的流速洗脱。洗脱液于60℃减压浓缩，得羟基红花黄色素A三乙胺粗品浓缩液。以红花计，每公斤红花得浓缩液100ml。羟基红花黄色素A三乙胺粗品浓缩液上凝胶LH-20柱，柱的径高比为1∶5，上样量为柱床体积的10％，洗脱流速为每分钟5ml，收集含羟基红花黄色素A三乙胺部分。收集液经60℃减压浓缩后，得羟基红花黄色素A三乙胺精品浓缩液，以红花计，每公斤红花得浓缩液35～50ml，经冷冻干燥，即得淡黄色的羟基红花黄色素A三乙胺精品粉末，纯度为99.0％，收率按红花计为0.45％左右。
实施例11：羟基红花黄色素A三乙胺(即式I中，n为1，R1为氢，R2、R3、R4为乙基)
称取红花，加12.5倍药材重量的去离子水，于100℃提取20-25分钟，过滤，滤渣加10倍药材重量的去离子水再按上述条件重复提取一次，过滤。合并二次提取液，冷却至室温，用离心机离心后，取离心液备用。将上述离心液缓缓加到已处理平衡好的HB-8大孔强酸性H型阳离子交换树脂，柱径高比为1∶10，柱体积为500ml，流速为3ml/min，收集流出液，按羟基红花黄色素A计，加入等摩尔的三乙胺，然后缓缓加到大孔吸附树脂分离柱中，柱径高比为1∶12，上样流速为每分钟10ml。上样结束后，用常温的去离子水以每分钟20ml的流速洗脱。洗脱液于60℃减压浓缩，得羟基红花黄色素A三乙胺粗品浓缩液。以红花计，每公斤红花得浓缩液100ml。羟基红花黄色素A三乙胺粗品浓缩液上凝胶LH-20柱，柱的径高比为1∶5，上样量为柱床体积的10％，洗脱流速为每分钟5ml，收集含羟基红花黄色素A三乙胺部分。收集液经60℃减压浓缩后，得羟基红花黄色素A三乙胺精品浓缩液，以红花计，每公斤红花得浓缩液35～50ml，经冷冻干燥，即得淡黄色的羟基红花黄色素A三乙胺精品粉末，纯度为99.0％，收率按红花计为0.47％左右。
实施例12：羟基红花黄色素A四甲基铵(即式I中，n为1，R1、R2、R3、R4为甲基)
称取红花，加12.5倍药材重量的去离子水，于100℃提取20-25分钟，过滤，滤渣加10倍药材重量的去离子水再按上述条件重复提取一次，过滤。合并二次提取液，冷却至室温，用离心机离心后，取离心液备用。将上述离心液缓缓加到已处理平衡好的001*7强酸性H型阳离子交换树脂，柱径高比为1∶10，柱体积为500ml，流速为3ml/min，收集流出液，按羟基红花黄色素A计，加入等摩尔的四甲基氢氧化铵，然后缓缓加到大孔吸附树脂分离柱中，柱径高比为1∶12，上样流速为每分钟10ml。上样结束后，用常温的去离子水以每分钟20ml的流速洗脱。洗脱液于60℃减压浓缩，得羟基红花黄色素A四甲基铵粗品浓缩液。以红花计，每公斤红花得浓缩液100ml。羟基红花黄色素A四甲基铵粗品浓缩液上凝胶LH-20柱，柱的径高比为1∶5，上样量为柱床体积的10％，洗脱流速为每分钟5ml，收集含羟基红花黄色素A四甲基铵部分。收集液经60℃减压浓缩后，得羟基红花黄色素A四甲基铵精品浓缩液，以红花计，每公斤红花得浓缩液35～50ml，经冷冻干燥，即得淡黄色的羟基红花黄色素A四甲基铵精品粉末，纯度为99.0％，收率按红花计为0.45％左右。
羟基红花黄色素A四甲基铵的质谱MS、核磁共振1H-NMR数据如下：
1.质谱
仪器型号：美国FINNIGAN公司液质联用多级离子阱质谱系(LCQ-DECAXP)
测试条件：ESI
质谱MS
-c ESI 611.22(M-H)-
2.核磁共振氢谱
仪器型号：BRUCKER AVANCE III 500型超导核磁共振仪
测试条件：溶剂：DMSO，内标：TMS
核磁共振
羟基红花黄色素A四甲基铵的1H一NMR数据

Claims (10)

1.一种羟基红花黄色素A药用盐，其特征在于其选自式(IV)的钙盐或者式(V)的镁盐：
2.一种制备如权利要求1所述的羟基红花黄色素A药用盐的方法，其包括红花药材的提取、强酸性H型阳离子交换树脂的转换、大孔吸附树脂分离、葡聚糖凝胶层析分离和超滤的步骤，其特征在于：
(1)红花药材的提取：红花药材为原料，水提取得到含有羟基红花黄色素A的提取液；
(2)强酸性H型阳离子交换树脂转换：将步骤(1)制得的提取液过强酸性H型阳离子交换树脂柱，收集洗脱液，加入氢氧化镁、氢氧化钙、碳酸镁或者碳酸钙，使羟基红花黄色素A生成羟基红花黄色素A药用盐，收集含羟基红花黄色素A药用盐的洗脱液；
(3)大孔吸附树脂分离：将步骤(2)制得的含羟基红花黄色素A药用盐的洗脱液用大孔吸附树脂柱分离，以水为洗脱剂，收集洗脱液，减压浓缩，得到羟基红花黄色素A药用盐的粗品；
(4)葡聚糖凝胶分离：将步骤(3)制得的羟基红花黄色素A药用盐粗品用葡聚糖凝胶层析分离，以水为洗脱剂，收集含羟基红花黄色素A药用盐洗脱液；
(5)超滤：将步骤(4)所得含羟基红花黄色素A药用盐洗脱液浓缩后经过滤或离心后采用截留分子量8000-10000道尔顿的超滤膜进行超滤得到超滤液，干燥后即得羟基红花黄色素A药用盐。
3.根据权利要求2所述的方法，其中步骤(2)中所述的阳离子交换树脂为强酸性H型阳离子交换树脂，其选自001*7离子交换树脂或者大孔HB-8交换树脂。
4.一种制备如下式(I)的羟基红花黄色素A药用盐的方法，
其中，n为1或2，M选自Ca、Mg、K或其中，R1、R2、R3、R4分别相同或者不同，各自独立选自氢、甲基、乙基，
其包括红花药材的提取、大孔吸附树脂分离、葡聚糖凝胶分离、超滤、酸化和转盐的步骤，其特征在于：
(1)红花药材的提取：红花药材为原料，水提取得到含有红花黄色素的提取液；
(2)大孔吸附树脂分离：将步骤(1)制得的含红花黄色素提取液用大孔吸附树脂柱分离，以水为洗脱剂，收集洗脱液，减压浓缩，得到红花黄色素的粗品；
(3)葡聚糖凝胶分离：将步骤(2)制得的红花黄色素粗品用葡聚糖凝胶层析分离，以水为洗脱剂，收集含红花黄色素洗脱液；
(4)超滤：将步骤(3)所得含红花黄色素洗脱液浓缩后经过滤或离心后采用截留分子量8000-10000道尔顿的超滤膜进行超滤得到超滤液，干燥后即得红花黄色素粉末；
(5)酸化：将步骤(4)得到的红花黄色素粉末加水，加酸后放置冷处小时，析出淡黄色固体羟基红花黄色素A，滤去上层液体；
(6)转盐：将步骤(5)得到的羟基红花黄色素A，加水后加入氢氧化钾、氢氧化铵、烷基胺或烷基铵、氢氧化镁、氢氧化钙、碳酸镁或者碳酸钙，使羟基红花黄色素A生成羟基红花黄色素A药用盐，再用超滤膜进行超滤，冻干制得所述的羟基红花黄色素A药用盐。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的羟基红花黄色素A药用盐选自式(II)的钾盐、式(III)的铵盐，式(IV)的钙盐或者式(V)的镁盐：
6.一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求1所述的羟基红花黄色素A药用盐为活性成分和药学上可接受的载体为辅料。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其为冻干粉针剂或输液剂。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其为冻干粉针剂，并用包括如下步骤的方法制备得到：
(1)以红花药材为原料，加入温度为的水抽提，抽提是以水抽提次，每次小时，抽提用水量为红花生药重量的倍，抽提后滤除药渣，将提取液冷却至静置小时；
(2)将步骤(1)制得的提取液过强酸性H型阳离子交换树脂，流速1～30ml/min，加入氢氧化镁、氢氧化钙、碳酸镁或者碳酸钙，使羟基红花黄色素A生成羟基红花黄色素A药用盐，收集包含权利要求1所述的羟基红花黄色素A药用盐的洗脱液；
(3)将步骤(2)制得的洗脱液用大孔吸附树脂柱分离，以纯化水为洗脱剂，洗脱流速10～30ml/min，收集洗脱液，减压浓缩，得羟基红花黄色素A药用盐浓缩液粗品；
(4)将步骤(3)得到的羟基红花黄色素A药用盐浓缩液粗品过滤或离心后用葡聚糖凝胶层析分离，以纯化水为洗脱剂，洗脱流速控制线性流速为1～10cm/h，收集含羟基红花黄色素A药用盐洗脱液，减压浓缩得浓缩液；
(5)将步骤(4)所得浓缩液经过滤或离心后采用截留分子量8000-10000道尔顿的超滤膜进行超滤得到超滤液；
(6)将步骤(5)所得超滤液经冷冻干燥，即得羟基红花黄色素A药用盐精品；
(7)将步骤(6)得到的羟基红花黄色素A药用盐精品溶解于注射用水，经采用0.22μm的微孔滤膜或者截留分子量8000-10000道尔顿的超滤膜过滤后分装于瓶中，冷冻干燥后，即得到羟基红花黄色素A药用盐冻干粉针；
其中：
所述的强酸性H型阳离子交换树脂是用001*7离子交换树脂或者大孔HB-8交换树脂；
所述的大孔吸附树脂是用大孔吸附树脂HZ801；
所述的葡聚糖凝胶层析是用葡聚糖凝胶LH-20。
9.权利要求1所述的羟基红花黄色素A药用盐或者权利要求6－8任一项所述的药物组合物在制备药物中的应用，其中所述的药物具有抗PAF或ADP诱导的血小板聚集作用。
10.权利要求1所述的羟基红花黄色素A药用盐或者权利要求6－8任一项所述的药物组合物在制备药物中的应用，其中所述的药物用于治疗或者预防涉及心肌缺血、脑缺血或血栓形成所致损伤的疾病。
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