CN104510747B - 一种环烯醚萜苷的药物新用途 - Google Patents
一种环烯醚萜苷的药物新用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104510747B CN104510747B CN201310462725.8A CN201310462725A CN104510747B CN 104510747 B CN104510747 B CN 104510747B CN 201310462725 A CN201310462725 A CN 201310462725A CN 104510747 B CN104510747 B CN 104510747B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- geniposide
- group
- cape jasmine
- gentiobioside
- virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
- A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/74—Rubiaceae (Madder family)
- A61K36/744—Gardenia
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Botany (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明属于医药领域,具体涉及一种环烯醚萜苷化合物‑‑京尼平‑1‑β‑D龙胆双糖苷及其与其他成分配伍形成的组合物作为有效成分用于制备抗病毒、抗菌、退热、抗炎、抗氧化药物的新用途。临床可用于治疗急性呼吸道感染、流感、肺炎、乙型病毒性肝炎、带状疱疹、疱疹病毒性角膜炎、病毒性心肌炎、EB病毒感染、逆转录病毒感染性疾病以及细菌感染性疾病。
Description
技术领域
本发明属于医药领域,具体涉及一种环烯醚萜苷化合物--京尼平-1-β-D龙胆双糖苷及其与其他成分配伍形成的组合物用于制备抗病毒、抗菌、退热、抗炎、抗氧化药物中的新用途。
背景技术
急性呼吸道感染不仅是临床常见病、多发病,尤其近年来SARS、人群禽流感、H1N1流感及H7N9流感的出现使人类随时处于大流行的危险之中,现有抗感染药物及疫苗不能有效应对不断变化的感染源。因此,寻找有效安全的治疗药物是21世纪人类面临的重大问题。
乙型病毒性肝炎呈世界性流行,是一个世界范围的公共卫生难题,具有传染性强、传播途径复杂、流行面广、发病率高等特点。中国是HBV高感染、乙肝高流行国家。WHO已将中国划为慢性乙型病毒性肝炎高发地区。《2012年中华人民共和国卫生统计年鉴》披露:在28种传染病报告发病及死亡数统计中,病毒性肝炎高踞第五位,中国每年用于治疗乙型病毒性肝炎及其引发疾病的费用高达300-500亿元人民币。
现有治疗乙型病毒性肝炎的药物主要有:普通干扰素α-2b、拉米夫定、聚乙二醇干扰素α-2a、阿德福韦、恩替卡韦(Entecavir)替诺福韦酯(TDF)等。干扰素的优点是疗程比较固定,对转氨酶比较高、病毒水平不很高的病人疗效比较好,E抗原转换率也比较高。它的缺点也是显而易见的,需要注射,并且打干扰素会产生白细胞减少、发热、骨髓抑制、类流感样症状等不良反应,虽然有固定的疗程,小部分患者能从“大三阳”转成“小三阳”,但是大部分还是不能转阴。核苷酸类药物是口服药物,服用方便,基本上没有直接的毒副作用,疗效比较快速,服药以后病毒很快就能降低。它的缺点是疗程比较长,而且疗程不是特别确定,有的人需要两年,有的可能更长,需要长期服药治疗。还有一个缺点是在长期服药的过程中会产生耐药的问题。因此,目前临床仍然急需安全有效的、具有抗HBV作用的乙型肝炎治疗药物。
EB病毒在人群中的感染有快速上升趋势。幼儿感染后多数无明显症状,或引起轻症咽炎和上呼吸道感染。青年期发生原发感染,约有50%出现传染性单核细胞增多症。主要通过唾液传播,也可经输血传染。EB病毒在口咽部上皮细胞内增殖,然后感染B淋巴细胞,这些细胞大量进入血液循环而造成全身性感染,并可长期潜伏在人体淋巴组织中。当机体免疫功能低下时,有可能引发多种肿瘤。
有关EB病毒感染的治疗,无环鸟苷(AC)和丙氧鸟苷(DHPG)可抑EBV复制,均有一定疗效。目前有二种疫苗问世,其中之一为我国用基因工程方法构建的同时表达EBVgp320和HBsAg的痘苗疫苗,重点使用在鼻咽癌高发区。另一为提纯病毒gp320膜蛋白疫苗,正在英国作小规模接种,以期观察该疫苗是否能降低传染性单核细胞增多症的发病率。因此,治疗EB病毒感染的药物将有广泛的市场前景及临床应用价值。
环烯醚萜是含有环戊烷结构单元的环状单萜衍生物,广泛分布于自然界,茜草科、木犀科、龙胆科和玄参科等植物多含有该类成分。环烯醚萜类化合物具有多种药理活性,如降血压、保肝利胆、抗肿瘤、抗炎、保护神经、治疗糖尿病及并发症等。
京尼平-1-β-D龙胆双糖苷为栀子等植物中所含的环烯醚萜类有效成分,该化合物也可由人工合成获得。公告号为CN1706858的中国专利公开了从栀子分离纯化京尼平-1-β-D龙胆双糖苷的方法;中国专利CN102000102A公开了京尼平-1-β-D龙胆双糖苷在制备治疗心力衰竭疾病药物中的应用;《中药药理与临床》2013年第2期第39页至41页报道京尼平-1-β-D龙胆双糖苷可通过提高心脏的收缩功能及降低其前负荷,改善戊巴比妥钠引起的心力衰竭;《中药新药与临床药理》2009年第1期第8页至第10页报道,含有京尼平-1-β-D龙胆双糖苷的栀子总环烯醚萜苷可干预脑出血后的炎症反应,阻止神经元凋亡。
发明内容
为此,本发明所要解决的技术问题在于提供一种京尼平-1-β-D龙胆双糖苷(CAS号:29307-60-6)及其组合用于制备抗病毒、抗菌、退热、抗炎、抗氧化,以及用于治疗急性呼吸道感染、流感、肺炎、气管炎、支气管炎、咳嗽、乙型病毒性肝炎、带状疱疹、疱疹病毒性角膜炎、病毒性心肌炎、EB病毒感染、逆转录病毒感染性疾病以及细菌感染性疾病药物的新用途。
上述技术问题由如下方案解决:
一种具有抗病毒、抗菌、退热、抗炎、抗氧化作用药物,所述药物以京尼平-1-β-D龙胆双糖苷为活性组分。
本发明还公开了一种用于治疗急性呼吸道感染、流感、肺炎、气管炎、支气管炎、咳嗽、乙型病毒性肝炎、带状疱疹、疱疹病毒性角膜炎、病毒性心肌炎、EB病毒感染、逆转录病毒感染性疾病以及细菌感染性疾病的药物,所述药物以京尼平-1-β-D龙胆双糖苷为活性组分。
所述药物的活性组分组成为京尼平-1-β-D龙胆双糖苷或者京尼平-1-β-D龙胆双糖苷与京尼平苷(CAS号:24512-63-8)和/或山栀苷甲酯(CAS号:64421-28-9)的混合物。
优选的,所述药物的活性组分组成为:
京尼平-1-β-D龙胆双糖苷1-8重量份,京尼平苷1-8重量份;或者
京尼平-1-β-D龙胆双糖苷0.5-6重量份,京尼平苷0.5-6重量份,山栀苷甲酯0.2-4重量份。
同样的,所述药物的活性组分组成为:
京尼平-1-β-D龙胆双糖苷1重量份、京尼平苷1重量份;或
京尼平-1-β-D龙胆双糖苷3重量份、京尼平苷1重量份;或
京尼平-1-β-D龙胆双糖苷6重量份、京尼平苷1重量份;或
京尼平-1-β-D龙胆双糖苷1重量份、京尼平苷3重量份;或
京尼平-1-β-D龙胆双糖苷1重量份、京尼平苷6重量份;或
京尼平-1-β-D龙胆双糖苷1重量份、京尼平苷1重量份、以及山栀苷甲酯0.5重量份。
所述药物制成临床或药学上可接受的片剂、胶囊剂、颗粒剂、水针剂、粉针剂、冻干粉针剂、喷雾剂、栓剂。
本发明还公开了上述药物在制备抗病毒、抗菌、退热、抗炎、抗氧化药物中的应用。
所述抗病毒是指抗流感病毒、抗副流感病毒、抗呼吸道合胞病毒、抗鼻病毒、抗腺病毒、抗乙肝病毒、抗柯萨奇病毒、抗埃柯病毒、抗疱疹病毒、抗EB病毒以及抗逆转录病毒。
本发明还公开了上述药物在制备治疗急性呼吸道感染、流感、肺炎、气管炎、支气管炎、咳嗽、乙型病毒性肝炎、带状疱疹、疱疹病毒性角膜炎、病毒性心肌炎、EB病毒感染、逆转录病毒感染性疾病以及细菌感染性疾病药物中的应用。
所述药物的给药途径包括临床上可接受的口服给药、注射给药、静脉滴注给药、舌下给药、喷雾吸入及直肠给药。
本发明还公开了一种栀子提取物作为活性成分用于制备抗病毒、抗菌、退热、抗炎、抗氧化药物的应用,所述栀子提取物由如下方法制备::
取栀子1重量份,切碎,用5--10体积份30-60%的乙醇浸渍0.5-1小时,回流提取1-2小时,再以4-8体积份的30-60%乙醇回流提取0.5-2小时,滤过,合并滤液,-9Pa,40-80℃减压回收乙醇,得提取液,将提取液于NKA-2大孔树脂上样,以1-4倍柱体积水洗脱,洗脱液于S-8大孔树脂上样,以1-4倍柱体积、浓度为20-50%的乙醇洗脱,洗脱液减压回收乙醇,继续减压浓缩,浓缩液用无水乙醇处理,得含有京尼平-1-β-D龙胆双糖苷、京尼平苷两种成分为主的提取物;或者
取栀子1重量份,切碎,用5--10体积份30-60%的乙醇浸渍0.5-1小时,回流提取 1-2小时,再以4-8体积份的30-60%乙醇回流提取0.5-2小时,滤过,合并滤液,-9Pa,40-80℃减压回收乙醇,得提取液,将提取液于ADS-17大孔树脂上样,以1-4倍柱体积水洗脱,洗脱液于LSA308大孔树脂上样,以1-4倍柱体积、浓度为20-50%的乙醇洗脱,,洗脱液减压回收乙醇,继续减压浓缩,浓缩液用无水乙醇处理,得含有京尼平-1-β-D龙胆双糖苷、京尼平苷和山栀苷甲酯三种成分为主的提取物;或者
取栀子1重量份,切碎,用7-11体积份的室温水搅拌浸渍提取1-5小时,再用5-10体积份室温水提取1-3小时,滤过,合并滤液,得提取液,将提取液于ADS-17大孔树脂上样,以1-4倍柱体积水洗脱,洗脱液于NKA-2大孔树脂上样,以1-4倍柱体积、浓度为20-50%的乙醇洗脱,洗脱液减压回收乙醇后再于NKA-2大孔树脂上样,继续以1-4倍柱体积、浓度为30-70%的乙醇洗脱,洗脱液减压回收乙醇,继续减压浓缩,浓缩液用无水乙醇处理,得含有京尼平-1-β-D龙胆双糖苷、京尼平苷和山栀苷甲酯三种成分为主的提取物;或者
取栀子1重量份,切碎,用7-11体积份的水室温浸渍0.5-1小时,煎煮提取1-3小时,再用5-10体积份水煎煮0.5-2小时,滤过,合并滤液,得提取液,将提取液于LSA308大孔树脂上样,以1-3倍柱体积水洗脱,洗脱液于S-8大孔树脂上样,以1-4倍柱体积、浓度为20-50%的乙醇洗脱,洗脱液减压回收乙醇后再于NKA-2大孔树脂上样,继续以1-4倍柱体积、浓度为30-70%的乙醇洗脱,洗脱液减压回收乙醇,继续减压浓缩,浓缩液用丙酮处理,得含有京尼平-1-β-D龙胆双糖苷、京尼平苷和山栀苷甲酯三种成分为主的提取物;
所述重量份与体积份的关系为g/ml的关系。
本发明还公开了上述方法制备得到的栀子提取物作为活性成分用于制备治疗急性呼吸道感染、流感、肺炎、气管炎、支气管炎、咳嗽、乙型病毒性肝炎、带状疱疹、疱疹病毒性角膜炎、病毒性心肌炎、EB病毒感染、逆转录病毒感染性疾病以及细菌感染性疾病药物中的应用。
本发明所述药物可以通过已知化合物京尼平-1-β-D龙胆双糖苷、京尼平苷和/或山栀苷甲酯直接制备得到;或者利用中国专利CN1706858A的公开的从栀子中分离纯化京尼平-1-β-D龙胆双糖苷、京尼平苷和山栀苷甲酯的方法,并直接加以利用制备。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点:
1、所述京尼平-1-β-D龙胆双糖苷以及其与京尼平苷和/或山栀苷甲酯的混合物,对H1N1流感病毒FM1株感染ICR小鼠肺炎模型,可降低感染动物的肺指数、降低动物死亡率、延长存活时间、降低感染后肺组织中病毒载量;
2、所述京尼平-1-β-D龙胆双糖苷以及其与京尼平苷和/或山栀苷甲酯的混合物,对副流感病毒、呼吸道合胞病毒感染BALB/C小鼠肺炎模型,可降低感染动物的肺指数;
3、所述京尼平-1-β-D龙胆双糖苷以及其与京尼平苷和/或山栀苷甲酯的混合物,对疱疹病毒感染家兔角膜炎模型,可减轻角膜病变程度;
4、所述京尼平-1-β-D龙胆双糖苷以及其与京尼平苷和/或山栀苷甲酯的混合物,对CoXB3病毒Nacy株感染ICR小鼠心肌炎病毒模型,可降低动物死亡率、减轻心脏指数,降低心肌组织中AST、LDH含量,以及减轻病毒感染后心肌组织的病理损伤程度;
5、所述京尼平-1-β-D龙胆双糖苷以及其与京尼平苷和/或山栀苷甲酯的混合物,对鸭乙型肝炎病毒模型,可降低血清中DHBV-DNA及DHBsAg滴度;
6、所述京尼平-1-β-D龙胆双糖苷以及其与京尼平苷和/或山栀苷甲酯的混合物,对CNE-2Z细胞裸小鼠移植瘤模型,可抑制肿瘤的生长;
7、在体外试验中,所述京尼平-1-β-D龙胆双糖苷以及其与京尼平苷和/或山栀苷甲酯的混合物,对H1N1流感病毒FM1株、PR8株、PIV-1、HSV-1、HSV-2、RSV、CoxB3、CoxB5、Ad3、Ad7、鼻病毒均有明显的抑制作用;
8、所述京尼平-1-β-D龙胆双糖苷以及其与京尼平苷和/或山栀苷甲酯的混合物,对体外培养的金黄色葡萄球菌(标准株26003、331、360、361)、白色葡萄球菌(26101)、表皮葡萄球菌(标准株、104、108)、乙型溶血性链球菌(10、12)、肺炎链球菌(31001、160、162、163)大肠杆菌(标准株44113、107、178)、绿脓杆菌(10102、209、210、211)、白色念珠菌(标准株)、肺炎杆菌(11、14)、卡他球菌(29108)体外生长均有明显的抑制作用;
9、所述京尼平-1-β-D龙胆双糖苷以及其与京尼平苷和/或山栀苷甲酯的混合物,对脂多糖所致家兔发热模型有明显的退热作用;
10、所述京尼平-1-β-D龙胆双糖苷以及其与京尼平苷和/或山栀苷甲酯的混合物,可显著降低流感病毒感染后小鼠肺组织MDA、INF-r及TNF-a含量,降低冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性,表明具有明显的抗炎作用。
11、各给药组动物按0.2ml/10g体重腹腔注射给予最大浓度的各药液2次后(间隔4小时),各组动物未出现死亡,且体重增长正常,表明9个受试物无明显毒性作用。
12、供试药1、2、7、8、9以人临床拟用量的15倍至70倍的剂量灌胃给予大鼠,连续4周,停药后恢复2周,大鼠灌胃给予供试药1、2号20g/kg/d、10g/kg/d、5g/kg/d;供试药7号15g/kg/d、7.5g/kg/d、3.25g/kg/d及供试药8、9号25g/kg/d、12.5g/kg/d、6.25g/kg/d,连续1个月,停药后继续观察2周。结果显示:给药期间动物的一般活动正常、精神状态良好;大小便正常,无呕吐发生;毛发光滑、未见脱落现象;未见异常出血倾向。对体重、进食量、心电无明显影响;各项生化指标、外周血象及重要脏器的重量指数均在正常范围内波动;各脏器肉眼检查均未见明显病理改变;组织病 理学观察亦未见由于药物所引起的病理形态学改变;未见由药物引起的毒副反应。
13、以安慰剂为对照评价受试药物治疗急性呼吸道感染临床有效性及安全性。给药方案为每次2粒,每天3次,3天为1个疗程。通过双盲试验结果显示,供试药1、2、7、8、9在治愈率、总显效率、总有效率等方面均显著优于安慰剂组,说明所试药物对急性呼吸道感染有明显疗效且安全。
实验例
下述各实验例证明本发明所述的技术效果。
下述实验例1-15中所涉及的供试药物1-9分别按照如下配方进行实验:
供试药1:京尼平-1-β-D龙胆双糖苷;
供试药2:京尼平-1-β-D龙胆双糖苷与京尼平苷以重量比1:1混合;
供试药3:京尼平-1-β-D龙胆双糖苷与京尼平苷以重量比3:1混合;
供试药4:京尼平-1-β-D龙胆双糖苷与京尼平苷以重量比6:1混合;
供试药5:京尼平-1-β-D龙胆双糖苷与京尼平苷以重量比1:3混合;
供试药6:京尼平-1-β-D龙胆双糖苷与京尼平苷以重量比1:6混合;
供试药7:京尼平-1-β-D龙胆双糖苷、京尼平苷以及山栀苷甲酯以重量比1:1:0.5混合;
供试药8:实施例8中提取得到的含有京尼平-1-β-D龙胆双糖苷和京尼平苷的栀子提取物;
供试药9:实施例9中提取得到的含有京尼平-1-β-D龙胆双糖苷和京尼平苷和山栀苷甲酯的栀子提取物。
实验例1:对流感病毒FM1株感染ICR小鼠肺炎模型的作用
取ICR小鼠按体重等级随机分为11组,分别为正常对照组、模型对照组、9个供试药物组,每组10只。除正常对照组外,将小鼠用***轻度麻醉,以15个LD50流感病毒液(FM1株)滴鼻感染,每只30ul。感染当天开始给药,每次按0.2ml/10g腹腔注射给药,每天1次,连续5天,正常对照组和模型对照组在同等条件下生理盐水。第5天给药1小时后称重后解剖,称肺重,计算肺指数及肺指数抑制率见表1,并留标本用于测定肺组织中病毒载量及细胞因子。结果采用组间比较t检验进行统计学处理。
肺指数=肺湿重(g)/体重(g)
表1对流感病毒FM1株感染ICR小鼠肺炎模型的作用
注:与正常组比较##P<0.01;与模型对照组比较,**P<0.01,*P<0.05
表1结果显示:采用甲型H1N1流感病毒FM1株病毒感染小鼠后,小鼠肺指数明显增高,与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01);感染当天开始给予供试药治疗5天后,各组肺指数有明显降低,与模型对照组比较有显著性差异(P<0.05、P<0.01)。
实验例2:对呼吸道合胞病毒、副流感病毒感染BALB/C小鼠肺炎模型的作用
取Balb/c小鼠,按体重等级随机分为11组,分别为正常对照组、模型对照组、9个供试药组,每组10只。除正常对照组外,将小鼠用***轻度麻醉,病毒液滴鼻感染(呼吸道合胞病毒以10000个LD50,副流感病毒以1000个LD50),每只30ul。感染当天开始给药,每次按0.2ml/10g腹腔注射,每天1次,连续5天,正常对照组和模型对照组在同等条件下生理盐水。第5天称重后解剖,称肺重,计算肺指数及肺指数抑制率,见表2。结果采用组间比较t检验进行统计学处理。
肺指数=肺湿重(g)/体重(g);
表2对病毒感染BALB/C小鼠肺炎模型的作用
注:与正常组比较##P<0.01;与模型对照组比较,**P<0.01,*P<0.05
表2结果显示:采用呼吸道合胞病毒和副流感病毒感染小鼠后,小鼠肺指数明显增高,与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01);感染当天开始给予供试药治疗5天后,感染小鼠肺指数均有明显降低作用,与模型对照组比较有显著性差异(P<0.01、P<0.05)。
实验例3:对流感病毒FM1株感染ICR小鼠肺炎模型的死亡保护作用
取ICR小鼠,按体重等级随机分为10组,分别为模型对照组、9个供试药组,每组10只。各组动物用***轻度麻醉,以2个LD50流感病毒液FM1株滴鼻感染,每只30ul,然后各组小鼠每次按0.2ml/10g腹腔注射给药,每天1次,连续5天,模型对照组在同等条件下生理盐水。观察感染后2周内动物的死亡情况,计算死亡率、死亡保护率、平均存活天数和生命延长率,结果见表3。结果采用组间比较卡方检验和t检验进行统计学处理。
死亡率=死亡数/动物总数×100%
表3对流感病毒FM1株感染ICR小鼠肺炎模型的死亡保护作用
注:与模型对照组比较,**P<0.01
表3结果显示:采用甲型H1N1流感病毒FM1株病毒感染小鼠2周内,模型组动物死亡率为100%,平均存活天数为5.80天;给与供试药连续5天,各组动物的死亡数 明显减少,平均存活天数明显延长,与模型对照组比较有显著性差异(P<0.05)。
实验例4:对流感病毒FM1株感染小鼠肺组织中病毒载量的影响
本实验例所述试验动物及对动物模型的处理取材于实验例1的动物。
引物设计与合成:针对流感病毒(H1N1)基因序列的上下游引物分别是:
5′-GACCAATCCTGTCACCTCTGAC-3′和
-5′-GGGCATTTGGACAAACGTCTACG-3′;
针对看家基因GAPDH(监控总RNA的使用量,以消除不同样本间加样导致的误差)基因序列的引物分别是:
5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′和
5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′。
Real-time RT-PCR扩增:使用TRIzol试剂提取肺组织中的RNA后,分别用上述H1N1和GAPDH引物进行逆转录反应,反应体积为20μl,反应体系含样本RNA2.5μl,逆转录引物1μl,逆转录酶1μl,RNA酶抑制剂1μl,逆转录反应液5μl。反应条件为:65℃灭活5min,42℃逆转录1h。PCR反应,反应体系25μl:取cDNA2.5μl,上下游引物各1μl,PCR反应液12.5μl,剩余用DEPC处理的水补足。95℃预变性5min,1个循环;95℃变性30sec,59℃退火30sec,72℃延伸45sec,共40个循环。反应结束后进行熔解曲线分析,以鉴定PCR产物的特异性,结果见表4。使用Sequence Detection System软件分析PCR过程各检测样本的Ct(Threshold ofcycle)值。
结果计算方法及统计方法:本实验使用相对定量的方法,以GAPDH作为内对照,选择一个样品(Con)作为Calibrator,计算方法如下:
Con△Ct=Con Ct-Con GAPDH Ct;
样本△Ct=样本Ct-样本GAPDH Ct;
样本△△Ct=样本△Ct-Con△Ct;
2-ΔΔCt是各处理组基因表达相对Calibrator的倍数改变;
相对含量的变化=2-ΔΔCt×100%。
结果采用组间比较t检验进行统计学处理。
表4对流感病毒FM1株感染小鼠肺组织中病毒载量的影响
注:与模型对照组比较,*P<0.05.
表4结果显示:采用甲型H1N1流感病毒FM1株病毒感染小鼠后,肺组织中有明显的病毒基因表达;感染当天开始给予供试药治疗5天后,可明显降低病毒表达量,与模型对照组比较有显著性差异(P<0.01、P<0.05)。
实验例5:对家兔单纯疱疹病毒性角膜炎模型的作用
取家兔66只,随机分为空白对照组、模型组对照组、9个供试药组,每组6只。采用1%盐酸丁卡因溶液对家兔左右眼进行表面麻醉后,给药组及模型对照组家兔用无菌手术尖刀片交叉划伤左右眼角膜上皮层呈“+”字形,长为5.0-6.0mm,深度约为0.5mm。然后吸取40μL含HSV-1病毒的DMEM液滴于左右眼角膜表面,被动闭合兔眼,轻轻按摩家兔的眼睑30秒;空白对照组家兔的左右眼角膜划伤后滴50μL不含病毒的DMEM。接种病毒24-48h后,将兔眼以2%荧光素钠生理盐水溶液染色,观察角膜感染情况,当兔角膜出现点状、树枝状或地图状病灶时,说明病毒感染成功,动物模型制成功。
造模48小时后各给药组开始滴眼给药,每日6次,并与给药1、3、5天后观察病变情况,结果见表5。
角膜病变(角膜上皮着色及基质混浊)评分标准:
0级:无着色和混浊;
1级:着色和混浊的范围为角膜面积的25%以内;
2级:着色和混浊的范围为角膜面积的25%-50%之间;
3级:着色和混浊的范围为角膜面积的51%-75之间;
4级:着色和混浊的范围为角膜面积的75%以上。
表5对家兔单纯疱疹病毒性角膜炎模型的治疗作用
与模型对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
表5结果显示:试验期间内空白对照组动物角膜均无病变产生;造模48小时后其余各组荧光素钠染色后均呈阳性反应,眼角膜病变程度均衡;各供试药组在给药第3天后均可不同程度减轻病毒感染后兔眼角膜病变,与模型对照组比较有显著性差异(p<0.05)。
实验例6:对CoXB3-Nacy株病毒感染致Balb/c小鼠心肌炎模型的影响
220只雄性Balb/c小鼠分为:正常对照组(10只),模型对照组(30只),9个供试药组(各组20只)。除正常对照组外,每组腹腔接种10-4稀释的CoXB3-Nacy株病毒液0.1ml。然后各组小鼠每次按0.2ml/10g腹腔注射给药,每天1次,连续12天,观察至第15天,记录动物死亡情况、试验结束后称体重,取血离心得血清测心肌酶谱,心脏称重,计算心指数,置***中做心脏病理切片,结果见表6。
表6对CoXB3-Nacy株病毒感染致Balb/c小鼠心肌炎模型的影响
与模型对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
表6结果显示:CoXB3- Nacy株病毒感染致Balb/c小鼠心肌炎模型后,模型组心脏指数增加、血清中AST、LDH含量明显增高,与正常对照组比较有显著性差异;感染当天开始给予供试药治疗12天后,各组动物死亡数明显减少、心脏指数、血清中AST、LDH含量明显降低,心肌组织病理损伤程度明显减轻,与模型对照组比较有显著性差异(P<0.01、P<0.05)。
实验例7:对EB病毒转染细胞致裸小鼠移植肿瘤模型的影响
裸小鼠适应性饲养1周,在无菌室内常规消毒,在右腋皮下接种鼻咽癌CNE-2Z细胞悬液0.2ml(约0.2x106个细胞)。接种肿瘤细胞后,将裸鼠送回笼罩,定期观察小鼠的精神、饮食及排便等情况。接种1周左右,可见接种部位皮下有肿瘤结节生长,为移植瘤模型建成。待裸鼠皮下移植瘤生长两周后,取合格小鼠(肿瘤体积>100cm3)随机分为10组,分别为模型对照组,9个供试药组,每组6只,各给药组按照设定剂量腹腔注射给药,0.2ml/kg/d,模型对照组在同等条件下腹腔注射生理盐水。各组每1天给药1次,连续15次,第16天称重后处死裸小鼠,取出肿瘤组织,计算每组平均瘤重、肿瘤生长抑制率,结果见表7,结果采用组间比较T检验进行统计学处理。
表7药物对CNE-2Z细胞导致的裸鼠移植瘤模型的影响
注:与模型对照组比较*P<0.05,**P<0.01.
表7结果显示:供试药给药15天后可明显抑制CNE-2Z细胞导致的裸小鼠移植肿瘤生长,肿瘤肿瘤与模型对照组比较有显著性差异。
实验例8:对鸭乙型病毒性肝炎模型的影响
将感染阳性鸭60只,按DHBV DNA和HBsAg的值均衡分为10组,分别为模型对照组、9个供试药组,每组6只,动物饲养至2周龄开始给药。给药组分别口腔灌喂给药,每日1次,对照组给淀粉胶囊。实验用药时间为28天,停药观察7天。观察指标如下:
1、血清DHBV DNA改变情况:于用药7天、14天、21天、28天、停药7天分别颈外静脉抽血,分离血清于-20℃保存,各时间点血清样本统一待检。采用斑点杂交法,用罗氏公司的地高辛标记试剂盒制备DHBV DNA探针统一检测,用Vuego Scan(Brisa-620ST)扫描仪进行膜片扫描;用the Discovery Series Quantity One软件对斑点进行定量分析,斑点值为volume(volume=intensity×mm2)。统计学采用spss软件配对t检验,比较各不同时间点给药组与模型组的差异;
2、血清DHBsAg改变情况:于用药7天、14天、21天、28天、停药7天分别颈外静脉抽血,分离血清于-20℃保存待检。各时间点血清统一检测。采用ELISA快速法、酶标阅读仪(Bio-TEK公司)490nm读取O.D值。统计学采用spss软件配对t检验,比较各不同时间点给药组与模型组的差异。
结果显示:
1、用药后不同时间点血清DHBV-DNA滴度改变情况:模型对照组(淀粉胶囊)用药期间血清DHBV DNA滴度随时间的延长呈现逐渐上升趋势;各供试药组用药后血清DHBV DNA滴度保持一平稳状态,且从第3周开始血清DHBV DNA滴度明显降低,与模型组比较有显著性差异(P<0.01),结果见表8-1;
2、各组用药后血清DHBsAgO.D值改变情况:模型对照组(淀粉胶囊)在3周之内血清DHBsAgO.D值随时间的延长呈现逐渐上升趋势,第4周开始有一定回落,但未低于给药前;供试药各组用药后DHBsAgO.D值保持一平稳状态,无明显的上升,且从第3周开始血清DHBVDNA滴度有一定程度的降低,与模型对照组比较有显著性差异(P<0.01),且停药1周之内无明显回升,结果见表8-2。
表8-1药物对鸭乙肝模型血清中DHBV-DNA滴度的影响 单位:volume
与模型对照组比较:**P<0.01*P<0.05
表8-2药物对鸭乙肝模型血清中DHBsAgOD值的影响 单位:OD值
与模型对照组比较:**P<0.01*P<0.05
实验例9:供试药体外抗病毒作用
取已长成单层细胞的培养板,倒掉培养液,用细胞维持液冲洗细胞面3遍后,分别接种不同稀释度的流感病毒液,FM1株10-2.5稀释度、PR8株10-2稀释度,PIV-1、HSV-1、HSV-2、RSV、CoxB3、CoxB5均为100TCID50,Ad3、Ad7为10-2稀释度、鼻病毒为10-1.5稀释度,每种毒株100μL/孔。流感病毒感染MDCK细胞;PIV-1、HSV-1、HSV-1、HSV-2、RSV、CoxB3、CoxB5感染Hep-2细胞;Ad3、Ad7、鼻病毒感染Hela细胞。置37℃5%CO2培养箱中吸附1h后,再加入相应稀释度的供试药药液100μL/孔,同时设正常细胞对照和病毒对照。置37℃5%CO2培养箱中培养,每日倒置显微镜下观察细胞病变情况,当病毒对照组细胞病变为++++时记录试验结果。
细胞病变按6级标准判断:
-:细胞生长正常,无病变出现;
±:细胞病变少于整个单层的10%;
+:细胞病变约占整个单层细胞的25%以下;
++:细胞病变约占整个单层细胞的50%以下;
+++:细胞病变约占整个单层细胞的75%以下;
++++:细胞病变约占整个单层细胞的75%以上。
按Reed-Muench计算50%抑制浓度(IC50)和治疗指数(TI),TI=TC50/IC50,结果见表9。
表9供试药体外抗病毒作用(治疗指数)
表9结果显示:9个供试药在体外对H1N1流感病毒FM1株、PR8株、PIV-1、HSV-1、HSV-2、RSV、CoxB3、CoxB5、Ad3、Ad7、鼻病毒均有明显的抑制作用。
实验例10:体外抑菌试验
母液的配制:实验前将各药物用去离子水配成50mg/ml的母液。
实验时用肉汤培养基将各药物母液做1:2-1:128倍倍比稀释后,加至96孔一次性细胞培养板中,每孔150ul,再加入106个菌/ml的各种菌液,15ul/孔。同时设细菌对照和PS对照。置37℃温箱中培养18小时,倒置显微镜下观察各孔中细菌生长情况,确定无细菌生长的最低药物浓度(MIC),结果见表10。
表10药物体外对细菌生长的抑制作用
一:表示无细菌生长 +:表示有细菌生长
表10结果显示:经18小时培养后,细菌对照管均有细菌生长。各供试药物对体外培养的金黄色葡萄球菌(标准株26003、331、360、361)、白色葡萄球菌(26101)、表皮葡萄球菌(标准株、104、108)、乙型溶血性链球菌(10、12)、肺炎链球菌(31001、160、162、163)大肠杆菌(标准株44113、107、178)、绿脓杆菌(10102、209、210、211)、白色念珠菌(标准株)、肺炎杆菌(11、14)、卡他球菌(29108)体外生长均有 明显的抑制作用。
实验例11:对脂多糖致家兔发热模型的退热作用
脂多糖配置:试验前用精密天平称取脂多糖,用无菌生理盐水配置成2.5ug/ml/kg剂量。
家兔的选择:取家兔分别在试验前2天晨测基础肛温,使动物适应此操作,同时筛选动物。
正式试验:试验当天晨测体温,选择基础肛温值在38.5~39.5℃之间的动物均匀分组,分别为空白对照组、模型对照组9个供试药组,每组6只。各给药组动物按2ml/kg腹腔注射给药1次,空白对照和模型对照组在同等情况下给蒸馏水。给药1小时后除空白对照组外其余各组动物按2ml/kg体重耳缘静脉注射脂多糖造模,空白对照组给药生理盐水注射。分别测定造模后1h、2h、3h、4h的肛温,以不同时间肛温与基础肛温之差值为体温变化的指标,结果采用组间比较t检验进行统计学处理。
表11对脂多糖所致家兔发热模型体温的影响 (X±SD,n=6)
注:与正常组比较##P<0.01;与模型对照组比较,**P<0.01,*P<0.05
表10结果显示:试验期间正常对照组动物体温保持在正常范围内波动;模型组动物体温保持在造模后平稳状态;供试药组在给药后第2小时至4小时对脂多糖所致家兔发热模型有明显的退热作用,与模型组比较有显著性差异(P<0.05)。
实验例12:抗炎实验
1、对流感病毒FM1株感染小鼠肺炎模型肺组织中炎性因子的影响
测定标本来源于试验实验例1中病毒感染后的肺组织。测定方法按试剂盒进行,结果见表12-1。
表12-1对流感病毒FM1株感染小鼠肺组织中过氧化物含量的影响
注:正常对照组比较#P<0.05;与模型对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
表12-2对流感病毒FM1株感染小鼠肺组织中炎性因子含量的影响
注:正常对照组比较##P<0.01;与模型对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
表12-1和12-2结果显示:采用甲型H1N1流感病毒FM1株感染小鼠,感染当天开始给予供试药治疗5天后,可显著降低小鼠肺组织MDA、INF-r及TNF-a含量,与模型对照组比较有显著性差异(P<0.01,P<0.05)。
2、对冰醋酸致毛细血管通透性的影响
取ICR小鼠,体重19±1g,随机分为正常对照组、模型对照组、9个供试药组。各给药组每次按0.2ml/10g腹腔注射给药,每日1次,连续3天,于第3天给药后1小时小鼠称重,尾静脉注射0.5%依文思蓝溶液0.1ml/10g。随即腹腔注射0.6%冰醋酸溶液,0.2ml/10g。脱臼处死小鼠,并腹腔注射生理盐水,8ml/只。轻柔按摩腹部20下,抽取腹腔液。3000r/mim离心15min,吸取上清液,于波长630nm下检测吸光度,结果见表12-3。
表12-3对冰醋酸致小鼠毛细血管通透性的影响
注:正常对照组比较#P<0.05;与模型对照组比较,*P<0.05,**P<0.01
表12-3结果显示:供试药组均能降低冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性,与模型对照组比较有显著性差异(P<0.01)。
实验例13:小鼠急性毒性试验
药物浓度设计:每个受试药物用蒸馏水配制成最大可注射浓度,分别为:
供试物1:250mg/ml;
供试物2、3、4、5、6:200mg/ml;
供试物7:150mg/ml;
供试物8、9:130mg/ml;
取小鼠160只,雌雄各半,饲养在20-22℃的室温环境中,5只一笼,自由摄取饲料及水。禁食12小时后按体重随机分为10组,正常对照组及9个供试药给药组,每组20只,雌性各半。各给药组按0.2ml/10g体重腹腔注射给予最大浓度的各药液,共2次,间隔4小时,对照组给以等体积的生理盐水。给药后观察动物的不良反应和死亡情况,连续7天。计算总给药量和临床倍数。
最大给药量(g/kg)=最大给药浓度×最大给体积/10g×100×给药次数
试验结果显示:各组动物给药后,出现活动减少,对刺激反应迟缓,症状通常在给药后5-15分钟出现,在给药后5小时之内恢复;体重增长正常。
体重变化及总给药量数据见表13。
表13小鼠急性毒性试验 单位:g
急性毒性试验结果表明,9个供试药均无明显毒性。
实验例14:大鼠长期毒性试验
1试验材料
1.1受试药物:供试药1、2、7、8、9。
1.2试验动物:健康Wistar大鼠,SPF/VAF级,雌雄各半,体重130±10g。由北京维通利华试验动物技术有限公司提供。
1.3试剂盒:肌酐(CRE),批号:20110808;谷丙转氨酶(ALT),批号:20110829;谷丙转氨酶(AST),批号:20110824;钾(K),批号:20110330;钠(Na),批号:20110729;北京北化康泰临床试剂有限公司产品。碱性磷酸酶(AKP),批号:110461;总蛋白(TP),批号:110391;白蛋白(ALB),批号:110461;总胆固醇(CHOL),批号:111201;葡萄糖(GLU),批号:110551;总胆红素(TBIL),批号:110671;尿素氮(UREA),批号:110801;γ-谷氨酰基转移酶(GGT),批号:110591;甘油三酯(TG),批号:114731;肌酸激酶(CK),批号:110741;氯(Cl),批号:110551,北京中生北控生物技术股份公司产品。凝血酶原时间(PT)测定试剂盒,批号:STG20102-48;活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂盒,批号:ST20201-53,北京世帝科学仪器公司产品。
1.4检验仪器:全自动五分类血液分析仪,型号:Sysmex XT-2000iv;血小板聚集凝血因子分析仪,型号:LG-PABER-1;体重电子天平,Precisa XS4250C Max:420g d=0.01g,瑞士precisa公司产品;半自动生化分析仪RT9000型,深圳雷杜生命科学股份有限公司产品;心电图仪ECG-6851K型,日本NIHON KOHDEN CORPORATION公司产品。尿检仪CLINITEK50型,德国Bayer公司产品。
2试验方法
2.1.试验周期:临床最长疗程7天,长期毒性取其3倍以上,故定为连续给药1个月,停药后恢复期2周。
2.2剂量设计
2.2.1供试药1、2号:20g/kg/d、10g/kg/d、5g/kg/d;
2.2.2供试药7号:15g/kg/d、7.5g/kg/d、3.25g/kg/d
2.2.3供试药8、9号:25g/kg/d、12.5g/kg/d、6.25g/kg/d,
2.3药液配制:试验前用蒸馏水配制成1、2号药物含2.0g/ml的药液、7号药物1.5g/ml的药液、8、9号药物含2.5g/ml的药液,按1.0ml/100g体重灌胃给药做为大剂量组,中、小剂量组做2倍倍比稀释,各剂量组用等容不等浓灌胃给药,每日1次,正常对照组给予等容积的蒸馏水。
2.4试验方法:取大鼠120只,雌雄各半,室温环境下分笼饲养,自由取食及摄水,适应性饲养3天后按体重随机分为16组,分别为正常对照组、各药物三个剂量组,每组20只,雌雄各半。给药组每日灌胃给药1次,连续1个月,对照组在同等条件下给予蒸馏水。给药1个月后解剖动物,每组10只(雌性5只,雄性5只),其余动物停药观察,2周后解剖。
2.5观察指标
2.5.1一般情况:给药期间观察动物的精神、活动、进食量、毛发、大小便等有无异常情况。
2.5.2每周称体重,根据体重情况调整给药量;记录进食量。
2.5.3血常规:分别在给药后1个月、停药后2周测定红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、白细胞计数(WBC)、白细胞分类(LYM、NEU、MONO、EO、BASO)、血小板计数(PLT)、网织红细胞计数(RET)。
2.5.4血液生化指标:分别在给药后1个月、停药后2周测定血清中ALT、AST、CRE、TBIL、TP、ALB、GLU、ALP、CHO、GGT、TRIG、CK、Urea、K、Na、Cl含量。
2.5.5分别于给药后1个月、停药后2周描记心电图。
2.5.6重要脏器指数:分别于给药后1个月、停药后2周解剖动物称取心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、肾上腺、甲状腺、胃、子宫、卵巢、睾丸、附睾、***重量,计算脏器指数。
2.5.7病理组织学检查:分别于给药后1个月、停药后2周解剖动物,摘取心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、肾上腺、胃、十二指肠、子宫和卵巢等主要脏器,肉眼检查及病理组织学检查。
2.5.8相关的病理切片,HE染色,10×20放大拍照
3试验结果
大鼠灌胃给予供试药1、2号20g/kg/d、10g/kg/d、5g/kg/d;供试药7号15g/kg/d、7.5g/kg/d、3.25g/kg/d及供试药8、9号25g/kg/d、12.5g/kg/d、6.25g/kg/d,连续1个月,停药后继续观察2周,结果显示:给药期间动物的一般活动正常、精神状态良好;大小便正常,无呕吐发生;毛发光滑、未见脱落现象;未见异常出血倾向。对体重、进食量、心电无明显影响;各项生化指标、外周血象及重要脏器的重量指数均在正常范围内波动;各脏器肉眼检查均未见明显病理改变;组织病理学观察亦未见由于药物所引起的病理形态学改变;未见由药物引起的毒副反应。
实验例15:受试药物治疗急性呼吸道感染临床研究
以安慰剂为对照评价受试药物治疗急性呼吸道感染临床有效性及安全性。
1、试验药品、给药方案
1.1试验药品:
A组30例:供试药1,规格:50mg/粒(采用实施例12方法制得);
B组30例:供试药2,规格:100mg/粒(采用实施例15方法制得);
C组30例:供试药7,规格:120mg/粒(采用实施例16方法制得);
D组30例:供试药8,规格:200mg/粒(采用实施例24方法制得);
E组30例:供试药9,规格:250mg/粒(采用实施例25方法制得)。
1.2对照药品:F组30例:安慰剂(模拟剂)。
1.3给药方案:每次2粒,每天3次。3天为1个疗程。
2观察指标
2.1人口学资料及背景资料
3.1.1人口学指标:年龄、性别、婚姻、身高、体重、民族、职业
3.1.2背景资料:感冒病程、合并疾病及其治疗史等
2.2安全性检测
2.2.1一般体检项目,包括体温、呼吸、心率、心律等。
2.2.2血常规;
2.2.3尿常规;
2.2.4大便常规;
2.2.5肝功能(ALT、AST)、肾功能(Cr、BUN);
2.2.6心电图;
2.2.7可能出现的任何不良反应。
2.3疗效性检测指标
2.3.1主要疗效指标
ⅰ主要相关症状、体征(包括体温-口腔温度);
ⅱ降温起效时间;
ⅲ解热时间。
2.3.2次要疗效指标
ⅰ次要症状、体征;
ⅱ舌、脉象;
ⅲ白细胞总数及相关炎症指标。
2.4诊断指标
2.4.1咽拭子培养;
2.4.2胸部X线检查。
2.5观察时点
2.5.1体温测试:服药后4小时内每1小时测量、记录1次,服药后5-24小时,每2小时观察1次。服药后第2-3天每4小时记录1次。住院患者由护士测量,门诊患者由受试者自行测量、记录。
2.5.2症状、体征、舌象、脉象及白细胞计数于疗前后观察、记录1次。
2.5.3安全性指标及疗效性指标于治疗前、后各检查1次。
2.5.4诊断性指标仅治疗前检测1次。
2.6时间窗的规定:用药后72-96小时进行访视,时间窗不得超过1天。
3疗效判定标准
3.1疾病疗效判定标准
3.1.1痊愈:治疗3天以内,体温恢复正常,感冒症状全部消失。
3.1.2显效:治疗3天以内,体温恢复正常,感冒的大部分症状消失。
3.1.3有效:治疗3天以内,体温较以前降低,感冒的主要症状部分消失。
3.1.4无效:治疗3天以内体温未降或升高,感冒的主要症状无改善。
3.1.5总显效率=(痊愈+显效)/总例数×100%
3.1.6总有效率=(痊愈+显效+有效)/总例数×100%
3.2中医证候疗效判定标准(按积分法判断疗效)
3.2.1疗效指数(n)=(疗前积分-疗后积分)/疗前积分×100%
3.2.2痊愈:症状体征全部消失,n=100%。
3.2.3显效:临床症状明显好转,证候总积分较疗前减少≥70%。
3.2.4有效:临床症状减轻,证候总积分较疗前减少≥30%。
3.2.5无效:临床症状无明显好转或加重,证候总积分较疗前减少<30%。
3.2.6总显效率=(痊愈+显效)/总例数×100%
3.2.7总有效率=(痊愈+显效+有效)/总例数×100%
3.3降温起效时间:从服药开始到体温下降0.5℃(>=0.5)或/和恢复正常(<=37.3℃)所需时间。
3.4解热时间:从服药开始到体温首次降到37.3℃(<=37.3)所需时间。
4统计结果
4.1感冒疗效
PP分析:感冒疗效A、B、C、D、E、F组痊愈率分别为和48%、45%、35.8%、38%、40%和15.0%、;总显效率分别为88.1%、86%、76%、78%、82%、和32.0%,总有效率分别为96.2%、94%、84%、88%、92%、和78.0%。感冒疗效痊愈率、总显效率、总有效率A、B、C、D、E组均优于F组(P<0.05)。
ITT分析:感冒疗效A、B、C、D、E、F组痊愈率分别为54.7%、52.7%、34.7%、44.7%、48.7%、和15.1%;总显效率分别为88.5%、84.7%、64.7%、74.7%、78.7%、和42.1%,总有效率分别为94.9%、92.7%、78.7%、84.7%、87.7%、和66.5%。感冒疗效痊愈率、总显效率、总有效率A、B、C、D、E组均优于F组(P<0.05)。。
4.2中医证候疗效
PP分析:中医证候疗效A、B、C、D、E、F组痊愈率分别为48.0%、43.0%、33.0%、38.0%、40.0%、和14.0%;总显效率分别为89.7%、84.7%、61.7%、71.7%、78.7%、和40.0%,总有效率分别为96.2%、94.2%、76.2%、84.2%、86.2%、和76.0%。中医证候疗效痊愈率、总显效率、总有效率A、B、C、D、E组均优于F组(P<0.05)。
ITT分析:中医证候疗效A、B、C、D、E、F组痊愈率分别为43.1%、41.1%、33.1%、36.1%、38.1%和13.4%;总显效率分别为85.2%、81.2%、71.2%、76.2%、78.2%、和41.2%,总有效率分别为97.9%、94.9%、84.9%、88.9%、90.9%、和74.8%。中医证候疗效痊愈率、总显效率、总有效率A、B、C、D、E组均优于F组(P<0.05)。
4.3降温起效时间
PP分析:治疗后中位降温起效时间A、B、E组为3.0h,C、D组为3.5h,各组与F组(为5.0h)比较,降温起效时间统计学有显著性差异(P<0.05)。
ITT分析:治疗后中位降温起效时间A、B、E组为4.0h,C、D组为5.0h,F组为6.0h,各给药组降温起效时间与F组比较统计学有显著性差异(P<0.05)。
4.4解热时间
PP分析:治疗后中位解热时间A、B、E组为4.0h,C、D组为4.5h,各组与F组(为7.0h)比较,解热起效时间统计学有显著性差异(P<0.05)。
ITT分析:治疗后中位解热时间A、B、E组为4.5h,C、D组为5.0h,各组与F组(为8.0h)比较,解热起效时间统计学有显著性差异(P<0.05)。
4.5安全性:试验期间未见明显由药物引起的不良反应。
5结论通过双盲试验结果显示,供试药1、2、7、8、9在治愈率、总显效率、总有效率等方面均显著优于安慰剂组,说明所试药物对急性呼吸道感染有明显疗效且安全。
具体实施方式
实施例1
取栀子500g,切碎,用4L30%(V/V)乙醇浸渍1小时,回流提取2小时,再以3L相同浓度乙醇回流提取1小时,滤过,合并滤液,减压回收乙醇(-9Pa,60℃),得提取液;将提取液于AB-8大孔树脂上样,以2倍柱体积水洗脱,洗脱液于ADS-7大孔树脂上样,以2倍柱体积、浓度为30%(V/V)的乙醇洗脱,洗脱液减压回收乙醇后再于ADS-7大孔树脂上样,继续以3倍柱体积、浓度为50%(V/V)的乙醇洗脱,洗脱液减压回收乙醇,继续减压浓缩,浓缩液用无水乙醇处理,得单体成分京尼平-1-β-D龙胆双糖苷。
实施例2
取栀子1000g,切碎,用8L70%(V/V)乙醇浸渍1小时,回流提取2小时,再以7L相同浓度乙醇提取1小时,滤过,合并滤液,减压回收乙醇(-9Pa,60℃),得提取液;将提取液于D101大孔树脂上样,以3倍柱体积水洗脱,洗脱液于S-8大孔树脂上样,以3倍柱体积、浓度为20%(V/V)的乙醇洗脱,洗脱液减压回收乙醇后再于S-8大孔树脂上样,继续以2倍柱体积、浓度为40%(V/V)的乙醇洗脱,洗脱液减压回收乙醇,继续减压浓缩,浓缩液用无水乙醇处理,得单体成分京尼平-1-β-D龙胆双糖苷。
实施例3
取栀子600g,切碎,用5.4L的室温水浸渍提取6小时,再以4.2L水浸渍提取4小时,浸渍过程需搅拌,滤过,合并滤液,得提取液,将提取液于AB-8大孔树脂上样,以2倍柱体积水洗脱,洗脱液于S-8大孔树脂上样,以2倍柱体积、浓度为20%(V/V)的乙醇洗脱,洗脱液减压回收乙醇后再于S-8大孔树脂上样,继续以2倍柱体积、浓度为40%(V/V)的乙醇洗脱,洗脱液减压回收乙醇,继续减压浓缩,浓缩液用无水乙醇处理,得单体成分京尼平-1-β-D龙胆双糖苷。
实施例4
取栀子800g,切碎,用7.2L的50℃水浸渍,50℃保温水浸渍提取5小时,再以5.6L50℃水提取3小时,浸渍过程需搅拌,滤过,合并滤液,得提取液,将提取液于AB-8大孔树脂上样,以2倍柱体积水洗脱,洗脱液于AB-8大孔树脂上样,以2倍柱体积、浓度为30%(V/V)的乙醇洗脱,洗脱液减压回收乙醇后再于NKA-2大孔树脂上样,继续以3倍柱体积、浓度为50%(V/V)的乙醇洗脱,洗脱液减压回收乙醇,继续减压浓缩,浓缩液用丙酮处理,得单体成分京尼平-1-β-D龙胆双糖苷。
实施例5
取栀子1000g,切碎,用9L水室温浸渍0.5小时,煎煮(100℃)提取1.5小时,再以7L水煎煮提取1小时,滤过,滤液合并,得提取液,将提取液于LSA308大孔树脂上样,以2倍柱体积水洗脱,洗脱液于ADS-7大孔树脂上样,以2倍柱体积、浓度为30%(V/V)的乙醇洗脱,洗脱液减压回收乙醇后再于ADS-7大孔树脂上样,继续以3倍柱体积、浓度为50%(V/V)的乙醇洗脱,洗脱液减压回收乙醇,继续减压浓缩,浓缩液用丙酮处理,得单体成分京尼平-1-β-D龙胆双糖苷。
实施例6
取栀子500g,切碎,用3.5L的50%(V/V)乙醇浸渍1小时,回流提取2小时,再以3L相同浓度乙醇回流提取1小时,滤过,滤液合并,减压回收乙醇(-9Pa,60℃),得提取液,将提取液于AB-8大孔树脂上样,以3倍柱体积水洗脱,洗脱液于S-8大孔树脂上样,以2倍柱体积、浓度为30%(V/V)的乙醇洗脱,洗脱液减压回收乙醇后再于LSA308大孔树脂上样,继续以3倍柱体积、浓度为60%(V/V)的乙醇洗脱,洗脱 液减压回收乙醇,继续减压浓缩,浓缩液用甲醇处理,得单体成分京尼平苷。
实施例7
取栀子800g,切碎,用8.8L的50%(V/V)乙醇浸渍1小时,回流提取2小时,再以4.8L相同浓度乙醇回流提取1小时,滤过,滤液合并,减压回收乙醇(-9Pa,60℃),得提取液,将提取液于ADS-17大孔树脂上样,以2倍柱体积水洗脱,洗脱液于NKA-2大孔树脂上样,以2倍柱体积、浓度为30%(V/V)的乙醇洗脱,洗脱液减压回收乙醇后再于NKA-2大孔树脂上样,继续以3倍柱体积、浓度为50%(V/V)的乙醇洗脱,洗脱液减压回收乙醇,继续减压浓缩,浓缩液用乙酸乙酯处理,得单体成分山栀苷甲酯。实施例8
取栀子600g,切碎,用5.4L的50%(V/V)乙醇浸渍1小时,回流提取2小时,再以3.6L相同浓度乙醇回流提取1小时,滤过,滤液合并,减压回收乙醇(-9Pa,60℃),得提取液,将提取液于NKA-2大孔树脂上样,以2倍柱体积水洗脱,洗脱液于S-8大孔树脂上样,以2倍柱体积、浓度为30%(V/V)的乙醇洗脱,洗脱液减压回收乙醇,继续减压浓缩,浓缩液用无水乙醇处理,得含有京尼平-1-β-D龙胆双糖苷、京尼平苷两种成分为主的药效部位。
实施例9
取栀子1000g,切碎,用10L的50%(V/V)乙醇浸渍1小时,回流提取2小时,再以6L相同浓度乙醇回流提取1小时,滤过,滤液合并,减压回收乙醇(-9Pa,60℃),得提取液,将提取液于ADS-17大孔树脂上样,以2倍柱体积水洗脱,洗脱液于LSA308大孔树脂上样,以2倍柱体积、浓度为30%(V/V)的乙醇洗脱,洗脱液减压回收乙醇,继续减压浓缩,浓缩液用无水乙醇处理,得含有京尼平-1-β-D龙胆双糖苷、京尼平苷和山栀苷甲酯三种成分为主的药效部位。
实施例10
取栀子600g,切碎,用4.2L的室温水浸渍提取6小时,再以4.2L室温水浸渍提取4小时,浸渍过程需搅拌,滤过,滤液合并,得提取液,将提取液于ADS-17大孔树脂上样,以3倍柱体积水洗脱,洗脱液于NKA-2大孔树脂上样,以2倍柱体积、浓度为20%(V/V)的乙醇洗脱,洗脱液减压回收乙醇后再于NKA-2大孔树脂上样,继续以3倍柱体积、浓度为40%(V/V)的乙醇洗脱,洗脱液减压回收乙醇,继续减压浓缩,浓缩液用无水乙醇处理,得含有京尼平-1-β-D龙胆双糖苷、京尼平苷和山栀苷甲酯三种成分为主的药效部位。
实施例11
取栀子800g,切碎,用8.8L水室温浸渍0.5小时,煎煮(100℃)提取1.5小时, 再以5.6L水煎煮提取1小时,滤过,滤液合并,得提取液,将提取液于LSA308大孔树脂上样,以2倍柱体积水洗脱,洗脱液于S-8大孔树脂上样,以3倍柱体积、浓度为20%(V/V)的乙醇洗脱,洗脱液减压回收乙醇后再于NKA-2大孔树脂上样,继续以3倍柱体积、浓度为40%(V/V)的乙醇洗脱,洗脱液减压回收乙醇,继续减压浓缩,浓缩液用丙酮处理,得含有京尼平-1-β-D龙胆双糖苷、京尼平苷和山栀苷甲酯三种成分为主的药效部位。
实施例12
取京尼平-1-β-D龙胆双糖苷50g(购于成都曼斯特生物科技有限公司),粉碎,过120目筛,与干燥的淀粉约250g混合均匀,过120目筛,充分混匀,分装填入空胶囊中,共制成1000粒。所述胶囊的用药方式为口服。
实施例13
取京尼平-1-β-D龙胆双糖苷25g(采用实施例1方法制得的单体成分),乳糖120g,淀粉95g,用5%乙基纤维素乙醇液制成适宜湿颗粒,过80目筛,60℃通风干燥,用20目筛整粒,加入滑石粉约6g,硬脂酸镁约1g,混合均匀,压片,制成1000片。所述片剂的用药方式为口服。
实施例14
取京尼平-1-β-D龙胆双糖苷50g(采用实施例3方法制得的单体成分),加入糊精950g,用24目筛湿法制粒,70℃通风干燥,制成1000g颗粒剂。所述颗粒剂的用药方式为温开水冲服。
实施例15
取京尼平-1-β-D龙胆双糖苷50g与京尼平苷50g(两种单体均购于成都曼斯特生物科技有限公司),混合并粉碎,过120目筛,与干燥的淀粉约200g混合均匀,过120目筛,充分混匀,分装填入空胶囊中,共制成1000粒。所述胶囊的用药方式为口服。
实施例16
分别取京尼平-1-β-D龙胆双糖苷48g、京尼平苷48g以及山栀苷甲酯24g(三种单体均购于成都曼斯特生物科技有限公司),粉碎,过120目筛,与干燥的淀粉约180g混合均匀,过120目筛,充分混匀,分装填入空胶囊中,共制成1000粒。所述胶囊的用药方式为口服。
实施例17
取京尼平-1-β-D龙胆双糖苷与京尼平苷组合(两种单体均购于成都曼斯特生物科技有限公司,重量比为1:3)5g,甘露醇0.6g,在无菌环境下加无菌注射用水约900ml,搅拌使充分溶解,加无菌注射用水至1000ml,加0.2g活性炭,搅拌约15分钟,用经灭 菌的G6垂熔漏斗过滤,分装于安瓿中,冷冻干燥后无菌熔封,即得冻干粉针剂。所述冻干粉针剂的用药方式为①用无菌注射用水溶解后肌肉注射;②与0.9%氯化钠注射液或5%葡萄糖注射液混合后按常规静脉滴注。
实施例18
取京尼平-1-β-D龙胆双糖苷8g(购于成都曼斯特生物科技有限公司),甘露醇1g,在无菌环境下加无菌注射用水约900ml,搅拌使充分溶解,加无菌注射用水至1000ml,用经灭菌的G6垂熔漏斗过滤,分装于安瓿中,冷冻干燥后无菌熔封,即得冻干粉针剂。所述冻干粉针剂的用药方式为①用无菌注射用水溶解后肌肉注射;②与0.9%氯化钠注射液或5%葡萄糖注射液混合后按常规静脉滴注。
实施例19
取京尼平-1-β-D龙胆双糖苷20g(采用实施例4方法制得的单体成分),乳糖155g,糖粉65g,混合,用15%淀粉浆适量,湿法制粒(14目筛),60℃通风干燥,与约0.6g硬脂酸镁混合,压片制成1000片,即得舌下片剂。所述舌下片剂的用药方式为舌下含服。
实施例20
取京尼平-1-β-D龙胆双糖苷15g(采用实施例5方法制得的单体成分),粉碎至微粉状,与适量油酸混匀成糊状,加入适量F11,用混合器混合,灌装,封接剂量阀门装置,压注F12,制成1000瓶,即得喷雾吸入剂。所述喷雾吸入剂的用药方式为摇匀后喷雾至口腔咽喉部。
实施例21
取95g半合脂肪酸酯,在水浴上加热熔化,加入8g京尼平-1-β-D龙胆双糖苷(购于成都曼斯特生物科技有限公司),搅拌均匀,注入涂有润滑剂的栓模中,室温冷却后启模,制成100粒***栓剂。所述***栓剂的用药方式为按常规***给药。
实施例22
取京尼平-1-β-D龙胆双糖苷,京尼平苷,山栀苷甲酯三种成分组合(三种单体分别采用实施例1、6和7方法制得,重量比为0.5:2:0.2)8g,注射用氯化钠7g,加入注射用水约800ml,搅拌使充分溶解,加注射用水至1000ml,加0.2g活性炭,搅拌约15分钟,过滤,灌入中性安瓿,100℃加热灭菌30分钟,即得水针剂。所述水针剂的用药方式为①肌肉注射;②与0.9%氯化钠注射液或5%葡萄糖注射液混合后按常规静脉滴注。实施例23
取京尼平-1-β-D龙胆双糖苷,京尼平苷,山栀苷甲酯三种成分组合(三种单体均购于成都曼斯特生物科技有限公司,重量比为1:1:0.5)12g,甘露醇1.2g,在无菌环境下 加无菌注射用水约900ml,搅拌使充分溶解,加无菌注射用水至1000ml,加0.2g活性炭,搅拌约15分钟,用经灭菌的G6垂熔漏斗过滤,分装于安瓿中,冷冻干燥后无菌熔封,即得冻干粉针剂。所述冻干粉针剂的用药方式为①用无菌注射用水溶解后肌肉注射;②与0.9%氯化钠注射液或5%葡萄糖注射液混合后按常规静脉滴注。
实施例24
取本说明书实施例8所提取的含有京尼平-1-β-D龙胆双糖苷和京尼平苷两种成分为主的药效部位200g,与约100g淀粉混合均匀,70℃通风干燥,粉碎,过80目筛,装填至空胶囊,制成1000粒。所述胶囊的用药方式为口服。
实施例25
取本说明书实施例9所提取的含有京尼平-1-β-D龙胆双糖苷、京尼平苷和山栀苷甲酯三种成分为主的药效部位250g,与约50g淀粉混合均匀,70℃通风干燥,粉碎,过80目筛,装填至空胶囊,制成1000粒。所述胶囊的用药方式为口服。
实施例26
取本说明书实施例9所提取的含有京尼平-1-β-D龙胆双糖苷、京尼平苷和山栀苷甲酯三种成分为主的药效部位45g,乳糖118g,淀粉90g,用15%乙基纤维素乙醇液制成适宜颗粒,过80目筛,60℃通风干燥,用20目筛整粒,加入滑石粉约6g,硬脂酸镁约0.8g,混合均匀,压片,制成1000片。所述片剂的用药方式为口服。
实施例27
取本说明书实施例9所提取的含有京尼平-1-β-D龙胆双糖苷、京尼平苷和山栀苷甲酯三种成分为主的药效部位18g,甘露醇1.4g,在无菌环境下加无菌注射用水约900ml,搅拌使充分溶解,加无菌注射用水至1000ml,加0.3g活性炭,搅拌约15分钟,用经灭菌的G6垂熔漏斗过滤,分装于安瓿中,冷冻干燥后无菌熔封,即得冻干粉针剂。所述冻干粉针剂的用药方式为①用无菌注射用水溶解后肌肉注射;②与0.9%氯化钠注射液或5%葡萄糖注射液混合后按常规静脉滴注。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (1)
1.京尼平-1-β-D龙胆双糖苷作为唯一活性成分在制备对流感病毒FM1株感染的肺炎具有死亡保护作用的药物中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310462725.8A CN104510747B (zh) | 2013-09-30 | 2013-09-30 | 一种环烯醚萜苷的药物新用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310462725.8A CN104510747B (zh) | 2013-09-30 | 2013-09-30 | 一种环烯醚萜苷的药物新用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104510747A CN104510747A (zh) | 2015-04-15 |
CN104510747B true CN104510747B (zh) | 2018-03-02 |
Family
ID=52786986
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201310462725.8A Active CN104510747B (zh) | 2013-09-30 | 2013-09-30 | 一种环烯醚萜苷的药物新用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN104510747B (zh) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106309462B (zh) * | 2015-06-18 | 2020-01-21 | 樊向德 | 一种治疗脑缺血性疾病的药物及组合物 |
KR102503110B1 (ko) * | 2015-12-24 | 2023-02-22 | 주식회사 엘지생활건강 | 제니핀-1-베타-d-젠티오비오사이드를 포함하는 피부상태 개선용 조성물 |
CN107163095A (zh) * | 2017-06-07 | 2017-09-15 | 上海中药标准化研究中心 | 乌奴龙胆苷a的提取方法及其制备止咳药物的用途 |
CN107573392B (zh) * | 2017-10-16 | 2020-12-22 | 南开大学 | 一类糖基取代的京尼平衍生物及其制备和应用 |
CN108836960A (zh) * | 2018-05-29 | 2018-11-20 | 王国芹 | 化合物在制备治疗病毒性心肌炎的药物中的用途 |
CN113662951B (zh) * | 2020-05-15 | 2024-02-02 | 中国科学院上海药物研究所 | 一种环烯醚萜苷化合物的医药用途 |
CN114681477B (zh) * | 2020-12-29 | 2024-06-11 | 中国科学院上海药物研究所 | 一种环烯醚萜苷化合物调节肠道菌群的用途 |
CN113181202A (zh) * | 2021-03-24 | 2021-07-30 | 上海中医药大学附属曙光医院 | 环烯醚萜苷化合物在制备治疗dusp9表达异常相关疾病的药物中的应用 |
CN113861157B (zh) * | 2021-08-23 | 2022-11-29 | 广州中医药大学(广州中医药研究院) | 一种具有抗病毒活性的环烯醚萜类化合物及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1272290C (zh) * | 2002-07-12 | 2006-08-30 | 范崔生 | 栀子环烯醚萜总提物及其制备方法和用途 |
CN101066311B (zh) * | 2007-06-07 | 2012-05-23 | 北京本草天源药物研究院 | 一种栀子总苷提取物及其制备方法 |
CN103211829B (zh) * | 2012-01-13 | 2015-10-07 | 樊向德 | 具有抗病毒作用的化合物及其组合物 |
-
2013
- 2013-09-30 CN CN201310462725.8A patent/CN104510747B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN104510747A (zh) | 2015-04-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104510747B (zh) | 一种环烯醚萜苷的药物新用途 | |
CN102114044B (zh) | 一种人工加工熊胆粉及其制备方法 | |
CN103623046A (zh) | 一种对化学性和酒精性肝损伤有辅助保护作用的组合物和制备方法及其在保健食品中的应用 | |
CN101116670B (zh) | 可提供活性甲基或参与甲基转移的化合物作为制备治疗病毒性疾病的药的应用 | |
CN102274234B (zh) | 灵芝酸y在制备治疗或预防肠道病毒71型感染药物中的应用 | |
CN105362736A (zh) | 一种治疗鸡球虫病的药物及其制备方法 | |
CN1249072C (zh) | 一种金丝桃苷的制备方法及药物新用途 | |
CN1118471C (zh) | 鞣料云实素的制备工艺 | |
CN1135979C (zh) | 槐果碱作为制备柯萨奇b病毒性心肌炎病因治疗药物的用途及其制法 | |
CN101040890A (zh) | 繁缕中磺酸总黄酮苷类成份的组合物及其抗病毒应用和制备方法 | |
CN101485672B (zh) | 异丙景糖酐在制备治疗人HBeAg阳性慢性乙型肝炎药物中的应用 | |
CN100415232C (zh) | 一种可用于治疗病毒性肝炎的药物组合物及其制备方法 | |
CN1969937B (zh) | 一种治疗肝炎的药物组合物 | |
CN102210725B (zh) | 田基黄总黄酮用于制备治疗肝纤维化的药物的用途 | |
CN101190935A (zh) | 用于病毒性感染的化合物 | |
CN100421700C (zh) | 仙香乙肝药物及其生产方法 | |
CN101190936A (zh) | 具有抗病毒活性的化合物 | |
CN1985988B (zh) | 一种用于治疗肝脏疾病的新的药物组合物 | |
CN104069149A (zh) | 一种采用熊胆为基质的中药饮片炮制方法 | |
CN101843612B (zh) | 异荭草苷作为制备抗呼吸道合胞病毒的药物的用途 | |
CN100402050C (zh) | 一种治疗病毒性心肌炎的中药组合物及其制备方法 | |
CN102727503A (zh) | 一种从老鹳草中提取的老鹳草素在制备抗疱疹病毒药物中的应用 | |
CN108236607A (zh) | 二苯乙烯二聚体在制备治疗肝脏相关疾病的药物中的应用 | |
CN103800312A (zh) | 盐酸甜菜碱作为制备防治肝病的药和保健食品的应用 | |
CN112999233A (zh) | 一类来源于赤芍的单萜苷类化合物及其制法和应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |