CN104152474B - 烟草番茄红素β环化酶基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种烟草番茄红素β环化酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。本发明研究了Ntβ‑LCY基因在烟草不同时期不同器官中的转录水平表达模式，发现该基因主要表达在幼叶中；利用OE和RNAi两种方法研究了Ntβ‑LCY基因在表达量变化情况下对烟草植株生长发育情况及色素含量的影响，分析了Ntβ‑LCY基因在烟草中的重要功能。首先是先得到基因，可以明确而有针对性地对该基因开展研究；其次是采用稳定的转基因技术分析基因功能。

Description

烟草番茄红素β环化酶基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体地，本发明涉及烟草类胡萝卜素合成关键基因，涉及β-番茄红素环化酶基因(Ntβ-LCY)在类胡萝卜素合成及植物生长发育中的重要作用。

背景技术

类胡萝卜素是生物体内通过类异戊二烯途径合成而呈现黄色、橙红色和红色的一类萜类物质。类胡萝卜素在植物光合作用中承担着光吸收的重要功能，主要存在于植物叶片的叶绿体及许多花和果实的有色体中，具有吸收和传递电子的能力，并在清除光合作用中产生的叶绿素三线态和单线态及超氧阴离子等自由基方面起着重要的作用。另一方面，类胡萝卜素在光抑制条件下能通过叶黄素循环，以非光化学辐射的方式耗散光***II(PSII)的过剩能量，保护叶绿素免受氧化损伤的破坏。此外，类胡萝卜素也是植物激素脱落酸(ABA)合成的前体物，ABA广泛地参与植物生长周期发育的各个环节和抗逆过程。所以类胡萝卜素在植物生长发育过程中具有重要的作用。

番茄红素环化是植物体内类胡萝卜素生物合成途径的一个重要分枝点。植物体中存在两种环化酶，一种是番茄红素β-环化酶(β-LCY)，在其催化下，番茄红素转化为β-胡萝卜素，进而生成玉米黄质、紫黄质、新黄质等叶黄素，另一种是番茄红素ε-环化酶(ε-LCY)，与β-LCY共同作用下生成α-胡萝卜素，进而生成黄体素等。β-LCY和ε-LCY两个酶的活性在一定程度上决定了两个分枝产物β-胡萝卜素、紫黄质、玉米黄质和黄体素等类胡萝卜素物质的比例及类胡萝卜素的总量。

烟草是重要的经济作物，在发展地方经济、增加国家财政积累方面有突出作用。烟叶中类胡萝卜素含量与烟叶品质之间存在正相关关系，一方面烟叶外观品质与类胡萝卜素成分含量直接相关，另一方面类胡萝卜素是烟草香气成分的重要前提物质，对烟草的香气量和香气质有直接作用。研究表明类胡萝卜素是影响烤烟香气质量重要的萜烯类化合物，其降解产物占烟叶总挥发性香气成分的8％-12％。类胡萝卜素的降解和热裂解产物可生成近百种香气化合物，如巨豆三烯酮、β-大马酮等，这些香味物质阈值相对较低，刺激性较小，对烟叶香气贡献率大，是形成烤烟细腻、高雅和清新香气的主要成分。因此，在烟草中寻找类胡萝卜素合成过程中起关键作用的基因并探索其应用将具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是通过同源克隆的方式，从栽培烟草红花大金元体内克隆获得Ntβ-LCY基因编码区序列，并且进行了表达模式分析。利用稳定的转基因技术过量表达(overexpression,OE)和RNA干涉(RNA interference,RNAi)方法研究了Ntβ-LCY基因在表达量变化情况下对烟草植株的生长发育情况的影响及类胡萝卜素含量的影响。本发明旨在探索Ntβ-LCY基因在烟草中的功能，是否直接控制着类胡萝卜素的含量，该研究结果能够为利用基因工程技术培育优良品种提供理论依据和基因资源。

本发明的技术方案是：烟草番茄红素β环化酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

烟草番茄红素β环化酶基因，其RNAi序列如SEQ ID NO：2所示。

所述的烟草番茄红素β环化酶基因的应用，所述烟草番茄红素β环化酶基因提高烟草类胡萝卜素含量。

一种提高烟草类胡萝卜素含量的方法，通过过表达和RNA干涉技术研究了该基因功能，获得类胡萝卜素含量提高的烟草转化植株。

所述的提高烟草类胡萝卜素含量的方法，以所述烟草番茄红素β环化酶基因的编码核酸片段作为功能序列，将该序列***到含有35S启动子的表达框下，该表达框属于植物双源表达载体的一部分，构建烟草番茄红素β环化酶基因的过表达载体。

首先，研究了Ntβ-LCY基因在烟草不同时期不同器官中的转录水平表达模式，发现该基因主要表达在幼叶中；利用OE和RNAi两种方法研究了Ntβ-LCY基因在表达量变化情况下对烟草植株生长发育情况及色素含量的影响，分析了Ntβ-LCY基因在烟草中的重要功能。首先是先得到基因，可以明确而有针对性地对该基因开展研究；其次是采用稳定的转基因技术分析基因功能。

附图说明

图1：定量PCR分析普通烟草中不同时期、(stage1-stage4分别为还苗期、打顶期、盛花期和成熟期)的各类器官(根-R、茎-S、叶-L(5叶位-5L，10叶位-10L，15叶位-15L)、花-F，)中Ntβ-LCY基因的转录表达模式；

图2：定量PCR分析低温弱光胁迫下Ntβ-LCY基因表达模式，CON为正常条件下基因相对表达量；LL为低温弱光下基因相对表达量；

图3：Ntβ-LCY转基因表型，CON为烟草未转基因对照植株；OE为Ntβ-LCY过表达植株；RNAi为Ntβ-LCY-RNAi转基因植株；

图4：Ntβ-LCY-RNAi转基因沉默效果，NT为未转基因对照植株；Ntβ-LCY-RNAi为转基因植株；

图5：Ntβ-LCY-RNAi转基因株系中色素含量，NT为未转基因对照植株；Ntβ-LCY-RNAi为转基因植株；

图6：Ntβ-LCY-OE转基因植株筛选；

图7：Ntβ-LCY-OE转基因植株β-LCY基因表达量分析，NT为未转基因对照植株；Ntβ-LCY-OE为转基因植株；

图8：Ntβ-LCY-OE转基因株系中色素含量，NT为未转基因对照植株；Ntβ-LCY-OE为转基因植株。

具体实施方式

烟草番茄红素β环化酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

烟草番茄红素β环化酶基因，其RNAi序列如SEQ ID NO：2所示。

所述的烟草番茄红素β环化酶基因的应用，所述烟草番茄红素β环化酶基因提高烟草类胡萝卜素含量。

一种提高烟草类胡萝卜素含量的方法，通过过表达和RNA干涉技术研究了该基因功能，获得类胡萝卜素含量提高的烟草转化植株。

所述的提高烟草类胡萝卜素含量的方法，以所述烟草番茄红素β环化酶基因的编码核酸片段作为功能序列，将该序列***到含有35S启动子的表达框下，该表达框属于植物双源表达载体的一部分，构建烟草番茄红素β环化酶基因的过表达载体。

1、Ntβ-LCY基因的同源克隆

通过NCBI-Blastn搜索到Ntβ-LCY基因所有的EST序列，在ATG和TGA处设计保守引物。分别以普通烟草cDNA和基因组DNA为模板进行PCR扩增，回收目的片段，T-A连接，转化大肠杆菌(DH5α)感受态，37℃培养，菌落PCR鉴定得到阳性克隆。阳性质粒提取，最后进行质粒酶切鉴定和测序得到普通烟草Ntβ-LCY编码区全长及基因全长序列。获得Ntβ-LCY编码区(CDS)全长序列1503bp，共编码500个氨基酸，Ntβ-LCY基因全长1503bp，所以Ntβ-LCY基因在烟草中不存在内含子。

具体步骤如下所述：

所用引物为5’-ATGGATACATTGTTGAAAACCCCAAAT-3’和5’-TTCTGTATCCTGTAACAAATTGTTGATC-3’。作为模板的cDNA和DNA都来自栽培烟草红花大金元旺长期幼叶片(RNA和DNA提取按照QIAGEN公司RNA或DNA提取试剂盒说明书进行)。按照Reverse transcription system试剂盒说明书，以Oligo(dT)18(TaKaRa公司)为引物合成cDNA第一链。PCR反应条件为94℃，3min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，1.5min，35cycles；72℃，10min；4℃，pause。反应体系50μL：cDNA或DNA模板2μL，上下游引物各2.5μL(10μM)，dNTPs 4μL(10μM)，10×Buffer 5μL，HiFi酶(北京全式金生物技术有限公司)0.5μL，无菌水33.5μL。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶提取试剂盒(GelExtraction KIT，购自QIAGENE)从琼脂糖凝胶上纯化目标Ntβ-LCY DNA片段(方法参照试剂盒说明书)，用Eppendorf公司BioPhotometer测定浓度后用于酶切、连接或存-20℃备用。纯化的Ntβ-LCYDNA片段与pMD19-T载体(TaKaRa公司，氨苄霉素抗性)连接(Solution I，TaKaRa公司，按照试剂盒说明书操作)，热激转化(42℃90s)入大肠杆菌DH5α(TaKaRa公司)。从得到的克隆转化子中用菌落PCR(引物为上述扩增引物)鉴定阳性克隆，提取阳性克隆质粒(小提质粒试剂盒，QIAGENE，方法参照试剂盒说明书进行)。

2、Ntβ-LCY表达模式分析

采集栽培烟草的各个时期(还苗期、打顶期、盛花期和成熟期)的各类器官(根、茎、5叶位，10叶位，15叶位、花)样品，并提取它们的总RNA，反转录成为cDNA(方法如1所述)。定量PCR(BIO-RAD,USA)分析Ntβ-LCY时空表达模式及低温弱光胁迫条件下的表达模式。如附图1中所示，Ntβ-LCY在盛花期表达量较高，且多表达在幼叶中(表达水平：10叶位＞15叶位＞5叶位＞花≥茎＞根)。在低温弱光胁迫下，Ntβ-LCY表达量有显著变化，说明该基因是受低温弱光胁迫条件诱导表达基因。Ntβ-LCY表达量在6h时呈下升趋势，12h以后表达量逐渐提高，在24h达到最大(见图2)。转录水平表达模式的研究结果表明，该基因与植物的生理状态密切相关，在烟株光合生理较为强盛的幼嫩组织表达量较高，且能够被光抑制条件诱导，参与烟株抵御光抑制的过程，其生物学功能应该与光合生理过程存在密切的关系。

表达模式分析所用烟草器官样品均在云南大田采样，所用的定量引物为Ntβ-LCY-Q-F/R，5’-GATGACAATACAACTAAAGATCTTGATAG-3和5’-CATAAGCTACTTGATATCCAGGAT-3’。采用26s RNA作为内参。PCR扩增反应条件：95℃预变性3min；95℃20s,60℃20s,40个循环。反应体系：1μL cDNA，10μL SYBR Green，上下游引物各1μL(10μmol/L)，补ddH₂O至20μL。低温弱光处理条件：100μmol m^–2s^–1，4℃。

3、烟草中RNAi介导的基因沉默研究Ntβ-LCY基因功能

为了更确切的了解Ntβ-LCY基因在烟草中的功能，我们利用稳定的转基因技术采用RNAi方法对该基因进行体内功能研究。构建Ntβ-LCY基因RNAi载体转化农杆菌GV3101，利用农杆菌介导的遗传转化技术转化SR1普通烟草，采用卡那抗性基因进行阳性植株筛选，得到转化成功的烟草植株。转基因烟草植株叶片出现明显的光漂白或黄化现象，植株严重矮化(图3)，生长的进行，叶片越发漂白，部分植株逐渐的死掉。并对生存下来的烟株样品进行培养，直至接种子，然后用T2代烟株烟叶进行Ntβ-LCY基因转录表达分析及代谢物分析。定量PCR结果显示，在RNAi转基因烟株中Ntβ-LCY基因表达量显著降低(图4)，沉默效率高达90％。利用HPLC对类胡萝卜含量进行分析，发现β-胡萝卜素、紫黄质、新黄质及黄体素(Lutein)类胡萝卜素及叶绿素a和b含量明显下降(图5)。转基因RNAi结果表明，Ntβ-LCY基因对烟株的双环叶黄素的生成有重要影响，而双环叶黄素对植株生长发育起着至关重要的作用，是生物体不可或缺的重要组成部分，主要控制着植物类胡萝卜素等色素物质合成，进而影响着植物的光合作用。

具体方法如下所述：

采用Gateway重组技术，利用pHellsgate2(壮观霉素抗性)载体构建转化烟草的RNAi载体。引物是5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACGAGGAAGCTAAATCTATGC-3’(带有attB1接头)和5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATACGTAATCCAGGACGAGCAAC-3’(带有attB2接头)。PCR反应以1中Ntβ-LCY-T为模板进行扩增，产物胶回收纯化。然后进行BP重组实验。体系如下：attB-PCR产物(100ng/μL)2.5μL，pHellsgate 2 vector(400ng/μL)0.4μL，BP clonase II enzyme mix 2μL，补充TE Buffer(pH 8.0)5.1μL至10μL体系，25℃反应3h，加入1μL K蛋白，37℃温浴10min，然后取1μL反应液热激转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR鉴定阳性克隆，并提质粒进行酶切验证，确认正确后，得到pHellsgate2-Ntβ-LCY-RNAi质粒。然后转入农杆菌感受态GV3101中，挑取适量的转化菌斑PCR鉴定无误后摇菌转化烟草植株。

质粒转化农杆菌：取pHellsgate2-Ntβ-LCY-RNAi质粒1μL，加入含0.1mL的GV3101农杆菌感受态的EP管中，冰上放置30min；将含有该质粒的农杆菌感受态放入液氮速冻1min，然后37℃温育5min；加入1mL LB液体培养基，28℃震荡培养3h；5,000rpm离心1min，弃去上清，加入200μL LB液体培养基，重悬沉淀；取200μL重悬液(即转化产物)均匀地涂于含25mg/mL利福平(Rif,Sigma)和50mg/mL壮观霉素(Spe,Sigma)的LB平板上，28℃培养2-3天；挑取适量的转化菌斑PCR鉴定无误后，摇菌转化SR1普通烟苗。

农杆菌转化烟草：将鉴定无误的农杆菌接种于5mL LB液体培养基中(含25mg/mL利福平和50mg/mL壮观霉素)，28℃震荡培养过夜，次日以1:100的比例转移至50mL LB液体培养基中(含25mg/mL利福平和50mg/mL壮观霉素)，28℃震荡培养至OD₆₀₀为0.8左右；离心收集菌体，用50mL转化培养基MS₀(pH 5.9，Murashige&Shoog Medium，购自Duchefa Biochemia)悬浮该农杆菌，采用浸泡法转化烟草叶片，即将切成片状的叶片浸泡在含有目标载体的农杆菌培养基中2min。然后取出叶片贴在不含抗生素的MS固体培养基上28℃暗培养2天，2天后移到含有卡那霉素和头孢霉素(购自Sigma)的MS分化培养基上等待分化，7-10天换一次培养基。分化后转移到生根培养基上直至长出根后，移栽在土中，按正常的方法培育植株至结实，收获成熟种子。

烟草正常培养条件：培养条件为(28±1)℃，光照16h，黑暗8h，(60±2)％的相对湿度。

4、烟草中过量表达Ntβ-LCY基因，能够增加类胡萝卜素含量

类胡萝卜素不但对植物的生长发育有重要影响，而且对烟草的香味品质有重要的贡献，为了更全面的了解Ntβ-LCY基因在烟草中的功能，探索如何增加烟草中类胡萝卜素含量，利用稳定的转基因技术采用过量表达的方法对Ntβ-LCY的功能进行了进一步的研究。首先构建Ntβ-LCY基因OE载体转化农杆菌GV3101，利用农杆菌介导的遗传转化技术转化SR1普通烟草，采用跨目标基因和标签蛋白Flag基因引物进行阳性植株筛选(图6)，并对β-LCY表达量进行定量PCR分析，发现转基因烟株β-LCY表达量显著升高(图7)，得到转化成功的烟草植株。对T2代Ntβ-LCY基因过量表达转基因烟株烟叶样品进行代谢分析，发现β-胡萝卜素、紫黄质、新黄质及黄体素类胡萝卜素及叶绿素a和b含量明显增加(图8)，烟草植株生长状态良好(图3)。转基因RNAi和OE结果表明，Ntβ-LCY基因对烟株类胡萝卜素合成及生长发育至关重要，是类胡萝卜素合成通路上的关键基因，其表达水平直接关系到烟草的生长状况，进而影响着烟草烟叶的产量及质量。在烟草中开展Ntβ-LCY基因的功能研究为其它植物的研究工作打下了很好的基础，同时该研究结果可以从源头上提高烟叶品质，为烟草利用基因工程技术培育优良品种提供理论依据和基因资源。

Ntβ-LCY-OE载体构建具体方法如下所述：

构建Ntβ-LCY-OE所用引物是Ntβ-LCY-sp1300-SpeI-F：5’-GCACTAGTATGGATACATTGTTGAAAACCCCAAATAAG-3’(带有SpeI酶切位点)和Ntβ-LCY-sp1300-KpnI-R：5’-TAGGTACCTTCTGTATCCTGTAACAAATTGTTGATCAT-3’(带有KpnI酶切位点)。PCR反应以1中Ntβ-LCY-T为模板进行扩增，产物胶回收纯化，使用SpeI和KpnI酶切PCR回收片段和spCAMBIA1300载体(由pCAMBIA1300，载体改造而来，在多克隆酶切位点后加入Flag标签蛋白)，回收目的片段并连接，转化细菌(DH5α，TaKaRa公司)，菌落PCR鉴定阳性克隆，提质粒得到目的载体Ntβ-LCY-OE，酶切验证并测序确认序列正确并无移码情况。然后转入农杆菌感受态GV3101中，菌落PCR鉴定阳性后，摇菌，按照3中步骤转化烟草植株。跨目标基因和标签蛋白Flag基因引物序列为：Ntβ-LCY-OE-JC-F5’-CGGTATGGATATTCTTCTGAAGCTTG-3和Flag-R5’-CTTATCGTCATCGTCCTTGTAATCG-3’。

质粒转化农杆菌：将Ntβ-LCY-OE质粒按照3中步骤转入农杆菌，然后将转化产物均匀地涂于含25mg/mL利福平(Rif,Sigma)和50mg/mL卡那霉素(kana,Sigma)的LB平板上，28℃培养2-3天；挑取适量的转化菌斑PCR鉴定无误后，摇菌转化SR1普通烟苗。

农杆菌转化烟草：将鉴定无误含有Ntβ-LCY-OE质粒的农杆菌按照3中方法转化烟草，培养菌所用培养基中含25mg/mL利福平和50mg/mL卡那霉素。

Claims (1)

1.一种提高烟草类胡萝卜素含量的方法，其特征在于：以低温弱光胁迫条件诱导烟草番茄红素β环化酶基因表达，获得类胡萝卜素含量提高的烟草植株，所述烟草番茄红素β环化酶基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示。