CN103712967B - 检测nk细胞活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测NK细胞活性的方法。该方法为：利用转染技术使靶细胞特异性表达荧光蛋白，得到转染靶细胞；将待测NK细胞与转染靶细胞共孵育，得到第一混合细胞液；向第一混合细胞液中加入第一荧光染料，孵育，得到第二混合细胞液；向第二混合细胞液中加入第二荧光染料，混合，得到第三混合细胞液；利用流式细胞仪检测所述第三混合细胞液，得到活的、早期凋亡的、晚期凋亡的、以及死亡的靶细胞的细胞数比例；其中，第一荧光染料为荧光素标记的磷脂结合蛋白，第二荧光染料为核酸染料，并且荧光蛋白、第一荧光染料和第二荧光染料的发射波长互不相同。本发明的检测NK细胞活性的方法，可以更加全面地反映NK细胞的活性。
Description
技术领域
本发明涉及细胞检测领域，具体而言，涉及检测NK细胞活性的方法。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)是机体天然免疫***中重要的效应细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染有关，并且具有免疫调节功能，在某些情况下参与超敏反应及自身免疫疾病的发生。NK细胞活性的检测是医学研究或临床研究中的一项重要工作。
针对NK细胞活性的检测，目前已先后研究出多种检测方法，例如51Cr释放法、乳酸脱氢酶（LDH）释放法、噻唑蓝（MTT）比色法和流式细胞术法等。其中，流式细胞术法由于具有无放射性污染、稳定性高等优点，因此得到越来越广泛的关注。
相关技术中，流式细胞术法检测NK细胞活性常用的手段是：首先通过瞬时转染使靶细胞特异性表达绿色荧光蛋白（GFP）；然后共孵育靶细胞和NK细胞；孵育一段时间后再使用碘化丙啶（PI）标记死亡细胞；最后检测活的靶细胞的荧光强度和死亡的靶细胞的荧光强度，根据两者的比值得到NK细胞的活性。这种检测方法主要存在以下缺点：PI是一种核酸荧光染料，仅能标记细胞膜失去完整性的晚期凋亡细胞及死亡细胞，因此上述检测方法无法反映NK细胞对靶细胞杀伤过程中所致细胞早期凋亡（此时细胞膜完整性仍然存在）的比例。
发明内容
本发明的目的在于提供检测NK细胞活性的方法，以解决上述的问题。
在本发明的实施例中提供了检测NK细胞活性的方法，包括下列步骤：
利用转染技术使靶细胞特异性表达荧光蛋白，得到转染靶细胞；
将待测NK细胞与转染靶细胞共孵育，得到第一混合细胞液；
向第一混合细胞液中加入第一荧光染料，孵育，得到第二混合细胞液；
向第二混合细胞液中加入第二荧光染料，混合，得到第三混合细胞液；
利用流式细胞仪检测第三混合细胞液，得到活的靶细胞的细胞数比例，早期凋亡的靶细胞的细胞数比例，晚期凋亡的靶细胞的细胞数比例以及死亡靶细胞的细胞数比例；
其中，第一荧光染料为荧光素标记的磷脂结合蛋白，第二荧光染料为核酸染料，并且荧光蛋白、第一荧光染料和第二荧光染料的发射波长互不相同。
进一步地，转染技术为：
构建表达荧光蛋白的慢病毒质粒载体，并包装形成慢病毒；
用慢病毒侵染靶细胞，将目的基因整合到靶细胞的基因组中。
进一步地，荧光蛋白为以下中的一种：绿色荧光蛋白、青色荧光蛋白、红色荧光蛋白、橙色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白或紫色荧光蛋白。
进一步地，第一荧光染料中，荧光素为以下中的一种：藻红蛋白、异硫氰酸荧光素、增强型荧光蛋白、别藻蓝蛋白。
进一步地，第二荧光染料为以下中的一种：7-氨基放线菌素D、碘化丙啶、溴化乙锭、吖啶橙、4,6-二脒基-2-苯基吲哚或赫克斯特。
进一步地，靶细胞为下中的一种：K-562细胞、海拉细胞或恶性黑色素瘤细胞系。
本发明上述实施例的检测NK细胞活性的方法通过双染的方法实现了同时检测不同状态的靶细胞（即活的靶细胞、早期凋亡的靶细胞、晚期凋亡和死亡的靶细胞）的比例的目的，可以更加全面地反映NK细胞的活性。
以上检测方法的具体原理是：首先通过转染技术使靶细胞特异性表达荧光蛋白，从而实现特异性识别靶细胞的目的，即若发出上述荧光蛋白的荧光则为靶细胞。其次，将待测NK细胞与转染靶细胞共孵育，发生特异性结合引起靶细胞凋亡。再向第一混合细胞液中加入第一荧光染料，使其特异性地与暴露在细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸（PS）结合；再向第二混合细胞液中加入第二荧光染料，使其特异性标记细胞结构完整性破坏的凋亡及死亡细胞的细胞核。由于在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中，因此早期凋亡的靶细胞能够被第一荧光染料显著染色。而在细胞凋亡的晚期，虽然细胞膜的破坏程度较大，但是还存在一定量的外翻的细胞膜，因此，晚期凋亡的靶细胞也能够被第一荧光染料染色，并且由于晚期凋亡的靶细胞膜的结构已不完整，因此，第二荧光染料（核酸染料）可以透过晚期凋亡的靶细胞膜进入细胞核内将细胞核染色。而死亡的靶细胞的细胞膜基本被完全破坏，因此几乎无法被第一荧光染料染色，但死亡靶细胞的核酸物质仍然存在，因此可以被第二荧光染料染色。
由此可见，通过以上步骤达到以下目的：以步骤101中的荧光蛋白为绿色荧光蛋白为例，所有靶细胞发出绿色荧光；早期凋亡的靶细胞发出绿色荧光和第一荧光染料的荧光，对第二荧光染料拒染，不发出第二荧光染料的荧光；晚期凋亡的靶细胞可发出绿色荧光、第一荧光染料的荧光和第二荧光染料的荧光；死亡的靶细胞可发出绿色荧光和第二荧光染料的荧光。最后，结合以上四种状态的靶细胞的发光特点，利用流式细胞仪进行检测，即可得到活的靶细胞的细胞数比例，早期凋亡的靶细胞的细胞数比例，晚期凋亡的靶细胞的细胞数比例以及死亡的靶细胞的细胞数比例。
附图说明
图1示出了GFP-K562细胞在10×10倍显微镜下的成像图；
图2示出了GFP-K562细胞在10×40倍显微镜下的成像图；
图3示出了流式细胞仪测定的GFP-K562细胞GFP表达率的散点图；
图4示出了流式细胞仪测定的GFP-K562细胞GFP表达率的峰值图；
图5示出了流式细胞仪检测的单纯GFP-K562细胞自然凋亡比例分布图；
图6示出了流式细胞仪检测的正常人的NK细胞对GFP-K562细胞的活性结果；
图7示出了流式细胞仪检测的患者的NK细胞对GFP-K562细胞的活性结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明做进一步的详细描述。
实施例一
一种检测NK细胞活性的方法，包括下列步骤：
步骤101：利用转染技术方法使靶细胞特异性表达荧光蛋白，得到转染靶细胞。
步骤102：将待测NK细胞与转染靶细胞共孵育，得到第一混合细胞液。
步骤103：向第一混合细胞液中加入第一荧光染料，孵育，得到第二混合细胞液。
步骤104：向第二混合细胞液中加入第二荧光染料，混合，得到第三混合细胞液。
步骤105：利用流式细胞仪检测第三混合细胞液，得到活的靶细胞的细胞数比例，早期凋亡的靶细胞的细胞数比例，晚期凋亡的靶细胞的细胞数比例以及死亡的靶细胞的细胞数比例。
其中，第一荧光染料为荧光素标记的磷脂结合蛋白，第二荧光染料为核酸染料，并且荧光蛋白、第一荧光染料和第二荧光染料的发射波长互不相同。
以上检测方法通过双染的方法实现了同时检测不同状态的靶细胞（即活的靶细胞、早期凋亡的靶细胞、晚期凋亡的靶细胞和死亡的靶细胞）的比例的目的，可以更加全面地反映NK细胞的活性。
以上检测方法的具体原理是：首先通过细胞转染技术使靶细胞特异性表达荧光蛋白，从而实现特异性识别靶细胞的目的，即若发出上述荧光蛋白的荧光则为靶细胞。其次，将待测NK细胞与转染靶细胞共孵育，发生特异性结合引起靶细胞凋亡。再向第一混合细胞液中加入第一荧光染料，使其特异性地与暴露在细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸（PS）结合；再向第二混合细胞液中加入第二荧光染料，使其特异性标记细胞结构完整性破坏的凋亡及死亡细胞的细胞核。由于在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中，因此早期凋亡的靶细胞能够被第一荧光染料显著染色。而在细胞凋亡的晚期，虽然细胞膜的破坏程度较大，但是还存在一定量的外翻的细胞膜，因此，晚期凋亡的靶细胞也能够被第一荧光染料染色，并且由于晚期凋亡的靶细胞膜的结构已不完整，因此，第二荧光染料（核酸染料）可以透过晚期凋亡的靶细胞膜进入细胞核内将细胞核染色。而死亡的靶细胞的细胞膜基本被完全破坏，因此几乎无法被第一荧光染料染色，但死亡靶细胞的核酸物质仍然存在，因此可以被第二荧光染料染色。
由此可见，通过以上步骤达到以下目的：以步骤101中的荧光蛋白为绿色荧光蛋白为例，所有靶细胞发出绿色荧光；早期凋亡的靶细胞发出绿色荧光和第一荧光染料的荧光，对第二荧光染料拒染，不发出第二荧光染料的荧光；晚期凋亡的靶细胞可发出绿色荧光、第一荧光染料的荧光和第二荧光染料的荧光；死亡的靶细胞可发出绿色荧光和第二荧光染料的荧光。最后，结合以上四种状态的靶细胞的发光特点，利用流式细胞仪进行检测，即可得到活的靶细胞的细胞数比例，早期凋亡的靶细胞的细胞数比例，晚期凋亡的细胞数比例以及死亡的靶细胞的细胞数比例。
另外，以上检测方法还具有以下优点：
通过细胞转染使靶细胞本身可以特异性表达荧光蛋白，从而省去了每次实验前需预先进行细胞染色或抗体标记的冗繁过程，同时也避免了非特异性染色结果不准确的问题，避免了共孵育前标记靶细胞影响靶细胞功能的问题。
由于本实施例的检测方法灵敏度提高，因此，当检测血液中NK细胞的活性时，所需的血量大大减少，并且经过试验证明，本发明的检测方法用于检测血液中NK细胞的活性时，抽血量为传统技术（51Cr释放法、LDH释放法、MTT比色法）的25%。
本实施例的检测方法不需要放射性物质，因此，不存在放射性污染。
检测时间短：本实施例的检测方法的检测时长约为2-4h，而传统技术（LDH释放法、MTT比色法等）的检测时间需要18-24h，由此可见，本实施例的检测时间大大缩短。
综上所述，本实施例的检测方法具有检测全面、准确度高、灵敏度高、检测效率高、样品所需量小等诸多优点。
在以上实施例的检测方法中，各步骤的反应条件或者所用的试剂类别、加入量及孵育时间都可以作优选改进，以改善技术效果。具体如下。
步骤101中，细胞转染技术可采用慢病毒介导的细胞稳定转染的手段，以避免瞬时转染（指外源基因进入靶细胞后，存在于游离的载体上，不整合到靶细胞的基因组中）后靶细胞经过多次传代目的基因片段丢失导致不表达GFP的问题。稳定转染的具体方法为：构建表达荧光蛋白的慢病毒质粒载体并包装形成慢病毒；用上述慢病毒侵染靶细胞，将目的基因整合到靶细胞的基因组中。并且，其中的荧光蛋白可采用多种颜色的荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋白(CFP)、红色荧光蛋白(RFP)、橙色荧光蛋白、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白或紫色荧光蛋白等。另外，细胞转染也可采用其它的转染技术，例如物理介导、化学介导和其它生物介导等不同技术的细胞转染方法。
步骤103中，第一荧光染料需满足特异性标记早期凋亡和晚期凋亡的靶细胞的条件，即荧光素标记的磷脂结合蛋白（Annexin V）。由于磷脂酰丝氨酸（PS）正常位于细胞膜脂质双分子层的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中，Annexin V能与PS高亲和力、特异性地结合。将Annexin V进行荧光素标记，可将早期凋亡和晚期凋亡的细胞染色。其中，Annexin V标记的荧光素为多种，例如藻红蛋白（PE，发黄色荧光）、异硫氰酸荧光素（FITC，发黄绿色荧光）、增强型荧光蛋白（EGFP，发绿色荧光）、别藻蓝蛋白（APC，发蓝色荧光）以及艾利克斯系列荧光染料（Alexa Fluor）等。为了区分荧光蛋白、第一荧光染料和第二荧光染料的荧光，还须要求三种物质发射的荧光波长不同。
步骤104中，第二荧光染料要满足特异性标记晚期凋亡和死亡的靶细胞的条件，核酸染料不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期细胞和死细胞的细胞膜完整性遭到破坏，使其能够透过细胞膜而使细胞核红染，因而，核酸染料可以特异性标记晚期凋亡和死亡的靶细胞。其中，可用的核酸染料有多种，例如7-氨基放线菌素D（7AAD，发深红色荧光）、PI（发红色荧光）、溴化乙锭（EB）、吖啶橙（AO）、4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）或赫克斯特（Hoechst）等。其中7AAD与PI有着相似的荧光特性，但7AAD的发射光谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，因此在多色荧光分析中是PI的最佳替代品，可与Annexin V-PE联合使用，检测准确度更高。
另外，步骤101、103和104中所涉及的荧光蛋白、第一荧光染料和第二荧光染料在满足检测条件的前提下，可以采用多种物质进行组合，例如荧光蛋白为绿色荧光蛋白、第一荧光染料为AnnexinV-PE、第二荧光染料为7AAD的组合，或者其它组合（此处不赘述）。
本实施例的检测方法中，所用的靶细胞可采用NK细胞能特异性识别的多种靶细胞，例如，K-562细胞、海拉细胞或恶性黑色素瘤细胞系。其中，由于K-562细胞是NK细胞的天然靶细胞，NK细胞对其更灵敏，因此优选采用K-562细胞。当采用K-562细胞时，步骤102的实际操作中，待测NK细胞与转染靶细胞（效/靶细胞）共孵育时间在1～6h范围内均可观测到相对较为稳定的NK细胞对靶细胞不同程度的杀伤作用，其中更优选为2～4h，原因是该孵育时间段内检测结果较优且利于检测工作的完成，并且继续延长孵育时间，检测结果并不随之继续增加。此外，待测效应细胞的浓度范围可选择5×105cells/mL～1×107cells/mL，效/靶比例范围可选择5:1～40:1，同样在实际检测过程中可采用上述范围内的任意值。其中，更优选的待测效应细胞的浓度为5×106cells/mL，效/靶比例为10:1，该选择条件下检测结果数据相对更优，所需相对较少的抽血量，且更大限度地充分利用试剂、节省检测试剂的用量(效应细胞浓度过低或效/靶细胞比例过低会造成数据偏小，导致正常人与患者样本差异不明显；效应细胞浓度过高或效/靶细胞比例过高将增加检测所需的抽血量，同时增加检测试剂的耗用量)。另外，共孵育所需的温度、CO2或者其它培养液均可采用常规技术中的条件，例如37℃，5%CO2等。
实施例二
本实施例所用的待测样品为人空腹静脉血，NK细胞活性的检测方法具体如下。
注：下文中所涉及的溶液的浓度、各试剂之间的配比、每个步骤的反应时间、温度等条件，在实际工作中，可酌情调整或进一步优化，并且本发明对以上参数的保护范围不限于下文中所采用的值。
1、GFP-K562细胞株（即转染靶细胞）的建立
K562细胞株为人NK细胞的天然靶细胞，首先构建携带GFP目的基因的慢病毒质粒载体，并进行慢病毒包装，然后用上述慢病毒侵染K562细胞，通过抗性培养基进行筛选，挑取由单细胞扩增形成的群落进行培养，进一步筛选出GFP目的基因与K562细胞基因组整合的细胞株，并进行实时荧光定量核酸扩增检测***（qPCR）验证，最终得到1株稳定表达GFP的K562稳定细胞系（下文简称为GFP-K562细胞），如图1至4所示。
2、效应细胞、靶细胞的制备
取人空腹静脉血2mL，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝无菌试管中，磷酸盐缓冲液（PBS）稀释1倍后缓加在淋巴细胞分离液上，2000r/min、20min离心分离单个核细胞，PBS洗2次，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液制成细胞浓度为5×106/mL外周血单个核细胞（PBMC）悬液备用。将培养的GFP-K562细胞用PBS洗2次，用台盼蓝检测细胞成活率95％以上，然后用RPMI-1640培养液将细胞浓度调整为5×105cells/mL备用。
3、效应细胞和靶细胞共孵育
取上述效应细胞PBMC悬液和靶细胞GFP-K562细胞悬液各100μL于环氧树脂（EP）管中混匀，效/靶细胞浓度比例为10:1，放入37℃，5%CO2培养箱中共孵育2h。
4、流式细胞术检测NK细胞杀伤活性
将孵育后的细胞混悬液收集于流式细胞仪检测管，微量离心机1500r/min、5min离心，弃培养基，分别用冷PBS和1X连接缓冲液（Binding Buffer）洗涤细胞1次，将细胞悬浮于100μL1X BindingBuffer中，浓度大约为1～5×106cells/mL，加入5μL Annexin V-PE，轻轻混匀后于室温避光孵育10-15分钟，以1X Binding Buffer洗涤后以200μL重悬细胞，加入5μL7AAD轻轻混匀后室温避光孵育3-5分钟，进行流式细胞仪检测。分别设单纯GFP-K562细胞AnnexinV-PE单染及7AAD单染孔作双参数分析时电压和补偿的调节。将单纯GFP-K562细胞Annexin V-PE/7AAD双染孔作为靶细胞自然凋亡背景对照，背景对照如图5所示。
5、数据分析
分别以GFP和侧向角散射SSC为坐标横轴和纵轴作二维散点图，并对GFP-K562细胞进行设门，每管样本获取10,000个GFP-K562细胞进行数据分析。分别以Annexin V-PE和7AAD为坐标横轴和纵轴作二维散点图，分析获取的GFP-K562细胞中活细胞、早期凋亡、晚期凋亡及死亡细胞各自比例（如图5、6、7所示）。效、靶细胞共同作用后，靶细胞的凋亡比例即反映了NK细胞的杀伤活性。NK细胞杀伤活性(%)=(样本孔GFP-K562细胞的凋亡比例-单纯GFP-K562靶细胞的自然凋亡比例)×100%。
以图5为例，单纯GFP-K562细胞的总的自然凋亡比例(%)=(100-94.07)%=5.93%。以图6为例，正常人效/靶细胞共孵育2h后靶细胞凋亡比例(%)=(100-82.50-5.93)%=11.57%，即所测的正常人的NK细胞总的杀伤活性为11.57%。以图7为例，患者效/靶细胞共孵育2h后靶细胞凋亡比例(%)=(100-88.11-5.93)=5.96%，即所测患者的NK细胞杀伤活性为5.96%。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种检测NK细胞活性的方法，其特征在于，包括下列步骤：
利用转染技术使靶细胞特异性表达荧光蛋白，得到转染靶细胞；
将待测NK细胞与所述转染靶细胞共孵育，得到第一混合细胞液；
向所述第一混合细胞液中加入第一荧光染料，孵育，得到第二混合细胞液；
向所述第二混合细胞液中加入第二荧光染料，混合，得到第三混合细胞液；
利用流式细胞仪检测所述第三混合细胞液，得到活的靶细胞的细胞数比例，早期凋亡的靶细胞的细胞数比例，晚期凋亡的靶细胞的细胞数比例以及死亡的靶细胞的细胞数比例；
其中，所述第一荧光染料为荧光素标记的磷脂结合蛋白，所述第二荧光染料为核酸染料，并且所述荧光蛋白、所述第一荧光染料和所述第二荧光染料的发射波长互不相同；
所述第一荧光染料中，所述荧光素为以下中的一种：藻红蛋白、异硫氰酸荧光素、增强型荧光蛋白、别藻蓝蛋白；
所述第二荧光染料为以下中的一种：7-氨基放线菌素D、碘化丙啶、溴化乙锭、吖啶橙、4,6-二脒基-2-苯基吲哚或赫克斯特；
所述转染技术为：
构建表达荧光蛋白的慢病毒质粒载体，并包装形成慢病毒；
用所述慢病毒侵染靶细胞，将目的基因整合到靶细胞的基因组中。
2.根据权利要求1所述的检测NK细胞活性的方法，其特征在于，所述荧光蛋白为以下中的一种：绿色荧光蛋白、青色荧光蛋白、红色荧光蛋白、橙色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白或紫色荧光蛋白。
3.根据权利要求1所述的检测NK细胞活性的方法，其特征在于，所述靶细胞为以下中的一种：K-562细胞、海拉细胞或恶性黑色素瘤细胞系。
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