CN103529005A

CN103529005A - 高效毛细管电泳－激光诱导荧光检测设备及诊断的试剂盒在乳腺癌症早期诊断的应用

Info

Publication number: CN103529005A
Application number: CN201310485378.0A
Authority: CN
Inventors: 成晓亮; 季军; 马银法
Original assignee: Jiangsu He Er Thinks Bio Tech Ltd
Current assignee: Jiangsu He Er Thinks Bio Tech Ltd
Priority date: 2013-10-16
Filing date: 2013-10-16
Publication date: 2014-01-22
Anticipated expiration: 2033-10-16
Also published as: CN103529005B

Abstract

高效毛细管电泳－激光诱导荧光检测设备及诊断的试剂盒在乳腺癌症早期诊断的应用，高效毛细管电泳-激光诱导荧光的检测设备包括365纳米波带滤波片、1厘米聚焦镜头、样品检测窗、样品池、滤光片、信号放大器、光电信号电压转换器、数字信号转换器、显示器,及样品处理方法和配套的试剂盒来快速检测人体尿样中乳腺癌症标记物的浓度,并使用该方法筛选了多个乳腺癌症患者和健康人体的样品，有益效果：成本降低,灵敏度大大提升,无需昂贵仪器的支持,仪器维护费用降低,所需要的溶剂量减少,需要的样品量较小,且样品处理过程简化.整个测试时间减少。

Description

高效毛细管电泳-激光诱导荧光检测设备及诊断的试剂盒在乳腺癌症早期诊断的应用

技术领域

本发明涉及一组癌症标记物分子及其检测设备,属于生物医药技术领域，具体涉及癌症早期分子诊断领域。

背景技术

癌症是全球死亡的第二大原因，也是全世界所有死亡的13％左右的原因。癌症死亡率每年类型的癌症是肺癌（140万例/年），胃癌（866,000例/年），肝癌（653,000例/年），结肠癌（677,000例/年），和乳腺癌（548,000例/年）。全世界癌症死亡人数预计将继续上升，估计2030年有1200万人死于癌症。这些统计数据充分表明了在全球范围癌症发生的密度和强度.许多研究机构和科学家专注于癌症研究，因为它是现代世界的最严重的健康问题之一。

癌症发生时，在身体的一部分细胞开始生长失控。正常的细胞***和生长在一种有序的方式，但癌细胞没有，他们排挤正常细胞。虽然有许多种癌症，都有着共同的特点。癌症发展迅速，早期诊断和治疗的机会大大提高，病人将生存和生活的积极和富有成效的生活。此外，如果在早期阶段癌症诊断，病人将有一个更大的机会成功的治疗和更多的治疗选择。目前，在过去的几十年中，癌症的诊断主要依据影像学评估，如***X光检查，X射线计算机断层扫描（CT），磁共振成像（MRI），正电子发射断层扫描（PET）和肿瘤的病理形态学检查活检标本。但这种方法有显着的局限性，不能为早期诊断和预测肿瘤的潜在的进展提供相对应治疗的反应。

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完全明确，大量资料表明，长期大量吸烟与肺癌的发生有非常密切的关系。已有的研究证明：长期大量吸烟者患肺癌的概率是不吸烟者的10～20倍，开始吸烟的年龄越小，患肺癌的几率越高。此外，吸烟不仅直接影响本人的身体健康，还对周围人群的健康产生不良影响，导致被动吸烟者肺癌患病率明显增加。

和其他许多癌症类似，肺癌的发生源于癌基因的激活，或抑癌基因的丧失活性。癌基因指的是那些使人容易得癌症的基因。通常认为原癌基因在遇到致癌物以后会变成癌基因。大鼠肉瘤蛋白(RAS)原癌基因的基因突变大约造10-30%肺腺癌。表皮生长因子受体(EGFR)控制着细胞的***，凋零，抑制血管生成，和肿瘤侵蚀EGFR基因突变和扩增在非小细胞肺癌中很常见，因此才有采用EGFR抑制剂的治疗基础。但Her2/neu蛋白很少受影响。染色体损伤会导致基因杂合缺失。这可造成抑癌基因丧失活性。在小细胞肺癌中，经常见到3p，5q，13q，和17p染色体损伤。60-75%的病例在17p染色体上p53抑癌基因受影响。其他经常发生突变和扩增的基因有c-MET,NKX2-1,LKB1,PIK3CA,和BRAF多种基因多态性和肺癌有关，包括白细胞介素-1，细胞色素P450，细胞凋亡的促进因子(比如caspase-8)，和DNA修复分子(比如XRCC1)。有这些基因多态性的人在接触致癌物质后更容易得肺癌。

目前对肺癌的诊断主要是通过影像学的应用,例如X线检查,通过X线检查可以了解肺癌的部位和大小，可能看到由于支气管阻塞引起的局部肺气肿、肺不张或病灶邻近部位的浸润性病变或肺部炎变。支气管镜检查,通过支气管镜可直接窥察支气管内膜及管腔的病变情况。可采取肿瘤组织供病理检查，或吸取支气管分泌物作细胞学检查，以明确诊断和判定组织学类型。细胞学检查痰细胞学检查是肺癌普查和诊断的一种简便有效的方法，原发性肺癌病人多数在痰液中可找到脱落的癌细胞。中央型肺癌痰细胞学检查的阳性率可达70%～90%，周围型肺癌痰检的阳性率则仅约50%。剖胸探查术,肺部肿块经多种检查和短期诊断性治疗仍未能明确病变性质，肺癌的可能性又不能除外者，应作剖胸探查术。这样可避免延误病情致使肺癌患者失去早期治疗的机会。ECT检,ECT骨显像可以较早地发现骨转移灶。X线片与骨显像都有阳性发现，如病灶部成骨反应静止，代谢不活跃，则骨显像为阴性，X线片为阳性，二者互补，可以提高诊断率。需要注意的是ECT骨显像诊断肺癌骨转移的假阳性率可达20%～30%，因此ECT骨显像阳性者需要作阳性区域骨的MRI扫描。纵隔镜检查,纵隔镜检查主要用于伴有纵隔***转移，不适合于外科手术治疗，而其他方法又不能获得病理诊断的病人。纵隔镜检查需在全麻下进行。在胸骨上凹部做横切口，钝性分离颈前软组织到达气管前间隙，钝性游离出气管前通道，置入观察镜缓慢通过无名动脉之后方，观察气管旁、气管支气管角及隆突下等部位的肿大***，用特制活检钳解剖剥离取得***组织送病理学检查。

而通常情况下，病人由于害怕在疾病的诊断过程中给样品会损害他们的器官和组织。他们也可能是不愿意给血液诊断测试。因此，早期癌症筛查的非侵入性诊断技术的发展是非常重要的，所有的人群。非侵入性诊断涉及到程序不穿透人体的机械，也不会刺破皮肤或涉及穿透体腔内。它不要求进入人体或切除生物组织的切口。目前，许多研究人员都专注于通过分析癌症生物标志物在尿，这样更容易比组织或血液样本收集非侵入性的方式来诊断癌症。

而在癌症检测中利用生物标志物，是良好的潜在的早期诊断工具。能对癌症早期诊断和预测肿瘤的潜在的进展提供更好的治疗反应。

在这些生物和生理指标可包括范围广泛的的生化实体，如核酸，蛋白质，糖类，脂类，和小的代谢物，以及全细胞，在任一特定的组织或流通。今天,循环肿瘤细胞正在成为一个强大的工具，在“微观”癌症筛查。检测的生物标志物，单独或作为较大的数据集或图案，可以通过各种各样的方法，包括从血液或组织样品的生化分析，生物医学成像。

蝶啶癌症筛选研究在过去的二十年中成为焦点，因为目标蝶啶水平已被证明反映不同的的癌症患者代谢产物中。这些蝶啶分布在生物体。蝶啶及其衍生物的某些维生素的合成中起重要作用，它们是细胞代谢过程中的重要辅助因子。蝶啶人尿中排出体外，它们可以作为潜在生物标志物在临床诊断。通过分析从癌症患者尿样中异黄蝶呤和比较它们从健康受试者没有癌症的证据。蝶啶水平要显着升高时，细胞免疫***被激活的某些疾病，如癌症，病毒感染，和肾脏病已报告。在肿瘤相关的疾病中不同的蝶啶衍生物可以扮演各种角色。每种类型的肿瘤很可能会导致不同模式的蝶啶浓度的变化。高性能液相色谱（HPLC）的方法已被用于蝶啶分析。但是,它费时昂贵，并导致了不能令人满意的分离，尤其是对真实的尿液样本,从而影响检测的准确率和灵敏度。另一方面，高效毛细管电泳法（HPCE）是快速而有效的，只需要一个小的样本大小。此专利开发并优化了高效毛细管电泳-激光诱导荧光的检测方法来定量分析尿样中的异黄蝶呤。

目前针对蝶呤类分子检测的手段多使用高性能液相色谱(HPLC)和高性能液相色谱连用质谱(LC-MS).无论是HPLC或者LC-MS,有以下缺点

1)昂贵的仪器作为支持,平均HPLC体系需要20万人民币,LC-MS高达百万人民币。

2)仪器维护费用高,每年仪器维护费用高到仪器价格的10-15%。

3)所需要的溶剂量巨大,给环境带来很大污染.分析同样一个样品。

4)需要的样品量较大。

5)因为需要液相色谱的分离,所以要求相对简单的样品,也就是说需要预处理样品,把样品中的其他杂质在分析前除去,这就加大了样品准备的难度,增加了分析时间和成本,因为需要额外的工具和耗材来处理样品。

6)灵敏度偏低。

7)每个样品的分析时间偏长。

发明内容

发明目的：解决蝶呤类分子检测仪器造价高，检测过程过程中污染大，需样大，时间长，长本高，检测结果灵敏底偏底等问题。

技术方案：一种高效毛细管电泳－激光诱导荧光检测设备，本发明将Milles GriotOmnichrome系列的365纳米波段激发的激光器(35微瓦)作为激发光源固定在设备底部,此激光器是提供激发样品中所需能量的特殊波段光源.在激光通过的方向间隔一定距离固定一个365纳米的滤波器(Ealing,Holliston,MA;model UG-11),其距离最佳为离光源10厘米处；此处滤波器的作用是为了降低杂散光和散射光的干扰,提升有效波段激光的强度.继续在激光方向距离滤波器5厘米处固定一个一厘米直径的聚焦镜片,将毛细管中部的样品视窗正放在激光对焦点,毛细管长度为50厘米长；内直径50微米，材质为二氧化硅。此处需要精细调节,确保激光距焦在样品视窗,此处聚焦镜片的作用是聚焦光源激光,使其强度最大化.然后将毛细管两端固定在样品池中,样品池固定在光路的两侧.毛细管中段距离阳极25厘米设有一个1平方厘米的视窗。在毛细管样品视窗的上方大概1厘米的位置,垂直于激光光路的方向固定一个400–539nm的滤波器(Ealing,model35-532).此处滤波器的作用也是为了降低杂散光和散射光的干扰,提升灵敏度.继续在垂直的方向固定一个聚焦镜头,此处需要精细调节镜头的位置,确保从样品发出的发射激光在镜头处聚焦最大化.此处聚焦镜头的作用是接受样品中收到激发的分子所发射出来的发射光,也就是目标物的光信号.然后在距焦镜头的垂直方向的焦点处固定一个光电倍增管的接收器(使用的是R982Hamamatsu photomultiplier tube,Bridgewater),调节其位置确保接收到最大的光信号.然后将光电倍增管接收器用电缆连接电压信号转换器,电压信号转换器固定在远离激光光源的方向,此时光信号已被放大并转换成电压信号,再将一个模拟信号转化器通过AVI数据线连接到电压信号转换器(VerniersSoftware and Technology,Beaverton,OR),电压信号转换器和模拟信号转化器都可以固定在远离激光源的一端,节省空间!再将模拟信号转化器连接到普通显示器即可.

一种检测早期癌症的试剂盒，包括以下组分：

试剂A：质量/体积为低于15%碘化钾(KI)和低于15%的碘(I2)；

试剂B：1摩尔每升的氢氧化钠和1摩尔每升的氯化钠；

试剂C：40微摩尔每升的磷酸氢钠(Na2HPO4)和磷酸的混合物,PH值为弱碱性剂D：500微升去离子纯净水；

试剂E：500微升低于5摩尔每升的氯化氢；

试剂F：500微升0.1摩尔每升Tris,0.1摩尔每升borate,低于5摩尔每升EDTA。

试剂盒制备方法：试剂A：制备及保存具体过程如下:首先溶解碘化钾在1升电离水中,充分搅拌至全部溶解,再将碘加入到溶液,在37摄氏度下中速搅拌45分钟.最终溶液需分装在放铝箔纸包裹的2毫升样品罐中,每个2毫升样品罐中存有500微升处理试剂.试剂需放置在4摄氏度冰箱中；试剂B：组成为1摩尔每升的氢氧化钠和1摩尔每升的氯化钠,储存形式为200微升每2毫升样品罐中；试剂C：40微摩尔每升的磷酸氢钠(Na2HPO4)和磷酸的混合物,PH值为7.5,300微升每2毫升样品罐中存放；试剂D：500微升去离子纯净水,同样存于2毫升样品罐中；试剂E：500微升1摩尔每升的氯化氢,同样存于2毫升样品罐中；试剂F：500微升0.1摩尔每升Tris,0.1摩尔每升borate,2摩尔每升EDTA同样存于2毫升样品罐中。

利用上述设备与试剂盒来检测病人尿样蝶呤类物质的含量，比如异黄蝶呤或黄蝶呤，从含量判定早期癌症情况。

检测病人尿样过程中对尿样的处理，样品拿到后迅速放置-80摄氏度冰箱中保存；将尿样转移至试剂A的2毫升样品罐中,轻摇并静至5分钟,再将试剂B的200微升加入该2毫升样品罐中,充分混合然后放置4度冰箱15分钟,完成后在8000转冷冻离心机下离心10分钟；转移100微升上清液到试剂C的2毫升样品罐中,充分混合后等待进样。

进样品前,用预处理毛细管,用试剂C和试剂D分别进样3分钟.紧接着进样试剂E和试剂D3分钟,最有用试剂F进样10分钟,样品进样保持20秒,具体电泳参数如下:保持电压18千伏9分钟.每一个样品结束后需要重复预处理步骤:用试剂C和试剂D分别进样3分钟.紧接着进样试剂E和试剂D3分钟,最后用试剂F进样10分钟.异黄蝶呤或黄蝶呤的特征峰在6.5分钟的时候出现.在完成所有样品后,再进样标准溶液1－5从而得到标准曲线。标准液为蝶呤类物质溶于磷酸氢钠(Na2HPO4)和磷酸的混合物。

标准溶液1－5如下：

标准溶液1为0.01克每升的蝶呤类物质溶于40微摩尔每升的磷酸氢钠(Na2HPO4)和磷酸的混合物；

标准溶液2为1x10-3克每升的蝶呤类物质溶于40微摩尔每升的磷酸氢钠(Na2HPO4)和磷酸的混合物；

标准溶液3为1x10-4克每升的蝶呤类物质溶于40微摩尔每升的磷酸氢钠(Na2HPO4)和磷酸的混合物；

标准溶液4为1x10-5克每升的蝶呤类物质溶于40微摩尔每升的磷酸氢钠(Na2HPO4)和磷酸的混合物；

标准溶液5为1x10-6克每升的蝶呤类物质溶于40微摩尔每升的磷酸氢钠(Na2HPO4)和磷酸的混合物。

有益效果：成本降低,灵敏度大大提升,无需昂贵仪器的支持,仪器维护费用降低,所需要的溶剂量减少,需要的样品量较小,且样品处理过程简化.整个测试时间减少。

说明书附图

图1高效毛细管电泳－激光诱导荧光检测设备结构图；

图2异黄蝶呤标准样品的电泳图；

图3患者与健康人尿样中异黄蝶呤含量图。

图4黄蝶呤标准样品的电泳图；

图5患者与健康人尿样中黄蝶呤含量图。

具体实施方式

一种高效毛细管电泳－激光诱导荧光检测设备，如图1所示。365纳米波带滤波片、聚焦镜头、样品检测窗、样品池、滤光片、信号放大器、光电信号电压转换器、数字信号转换器、显示器，365纳米波带滤波片后按顺序间隔一定距离设置1厘米聚焦镜头、样品检测窗、滤光片、聚焦镜头、信号放大器，样品池通过毛细管连接于样品检测窗上，毛细管长50厘米，内直径50微米，材质为二氧化硅。毛细管中段距离阳极25厘米设有一个1平方厘米的视窗。信号放大器后按顺序连接光电信号电压转换器、数字信号转换器、显示器。为了降低杂散光和散射光的干扰,提升有效波段激光的强度,我们使用了一个365纳米的滤波器.然后激光信号通过一个1厘米的聚焦镜头聚焦在毛细管的样品检测窗口,样品中的异黄蝶呤受到激发后会发射特殊发射波,光波通过一个虑波片和聚焦镜头聚焦在光电倍增管的接收器上,光信号被放大并通过光电倍增管的电流所产生的输出转换到电压信号,然后该模拟信号被数字化，并呈现在显示仪器界面。

一种检测早期乳腺癌的试剂盒，包括以下组分：

试剂A：质量/体积为低于15%碘化钾(KI)和低于15%的碘(I2)；

试剂B：1摩尔每升的氢氧化钠和1摩尔每升的氯化钠；

试剂E：500微升低于5摩尔每升的氯化氢；

试剂盒制备方法：试剂A：制备及保存具体过程如下:首先溶解30.04克碘化钾在1升电离水中,充分搅拌至全部溶解,再将30.25克碘加入到溶液,在37摄氏度下中速搅拌45分钟.最终溶液需分装在放铝箔纸包裹的2毫升样品罐中,每个2毫升样品罐中存有500微升处理试剂.试剂需放置在4摄氏度冰箱中；试剂B：组成为1摩尔每升的氢氧化钠和1摩尔每升的氯化钠,储存形式为200微升每2毫升样品罐中；试剂C：40微摩尔每升的磷酸氢钠(Na2HPO4)和磷酸的混合物,PH值为7.5,300微升每2毫升样品罐中存放；试剂D：500微升去离子纯净水,同样存于2毫升样品罐中；试剂E：500微升1摩尔每升的氯化氢,同样存于2毫升样品罐中；试剂F：500微升0.1摩尔每升Tris,0.1摩尔每升borate,2摩尔每升EDTA同样存于2毫升样品罐中。

利用上述设备与试剂盒来检测病人尿样蝶呤类物质的含量，从含量判定早期癌症情况。

进样品前,用预处理毛细管,用试剂C和试剂D分别进样3分钟.紧接着进样试剂E和试剂D3分钟,最有用试剂F进样10分钟,样品进样保持20秒,具体电泳参数如下:保持电压18千伏9分钟.每一个样品结束后需要重复预处理步骤:用试剂C和试剂D分别进样3分钟.紧接着进样试剂E和试剂D3分钟,最后用试剂F进样10分钟.蝶呤类物质的特征峰在6.5分钟的时候出现.在完成所有样品后,再进样标准溶液1－5从而得到标准曲线。如图2、图4所示。异黄蝶呤检测限达到1x10-10克每毫升,标准曲线从1x10-9克每毫升到1x10-5克每毫升的R2达到0.9763。黄蝶呤检测限达到2x10-10克每毫升,标准曲线从5x10-9克每毫升到5x10-5克每毫升的R2达到0.9865

标准溶液1－5如下：

实验室人员将消过毒的容器交给患者和参与试验的健康人体,自行取尿样,取样后试验人员用放有干冰的冷冻盒把样品转移至-80冰柜.第二天将样品取出,按照本发明的样品处理步骤,将1毫升尿样转移至试剂A的2毫升样品罐中,轻摇并静至5分钟,再将试剂B的200微升加入该2毫升样品罐中,充分混合然后放置4度冰箱15分钟,完成后在8000转冷冻离心机下离心10分钟；转移100微升上清液到试剂C的2毫升样品罐中,充分混合后等待进样。样品分析后,将数据移至分析处理电脑进行数据处理.方法验证的结果是标准样品的偏差小于(CV<15%,N=4),保证了数据的准确,并对于两种癌症分别进行和健康人体数据的对比,p值均远远小于0.05,可以结论病患和健康人体尿样中蝶呤类物质含量有重大差别.

人体尿样结果：乳腺癌患者的10个人体尿样来自于Ellis Fischel Cancer Center,Columbia MO USA,患者均未接受过化学或者放射治疗的,患者的地域分布为美国密苏里州,年龄在26-70岁之间,期间没有对患者的饮食和运动有任何限制.18个健康人体的尿液样本来自于美国密苏里大学的在校学生志愿者,没有采取任何药物包括维生素补充剂,年龄范围在22-45岁。如图3所示。

肺癌癌患者的9个人体尿样来自于Ellis Fischel Cancer Center,Columbia MO USA,患者均未接受过化学或者放射治疗的,患者的地域分布为美国密苏里州,年龄在26-70岁之间,期间没有对患者的饮食和运动有任何限制.10个健康人体的尿液样本来自于美国密苏里大学的在校学生志愿者,没有采取任何药物包括维生素补充剂,年龄范围在22-45岁.如图5所示。

Claims

1.一种高效毛细管电泳－激光诱导荧光检测设备，其特征在于，包括365纳米波带滤波片、1厘米聚焦镜头、样品检测窗、样品池、滤光片、信号放大器、光电信号电压转换器、数字信号转换器、显示器，365纳米波带滤波片后按顺序间隔一定距离设置1厘米聚焦镜头，1厘米在聚焦镜头的焦点处设置样品检测窗，其后间隔一定距离设置滤光片、聚焦镜头，确保从样品发出的发射激光在镜头处聚焦最大化，样品池通过毛细管连接于样品检测窗上，在聚焦镜头的焦点处设置信号放大器，信号放大器后按顺序连接光电信号电压转换器、数字信号转换器、显示器。

2.根据权利要求1所述的高效毛细管电泳－激光诱导荧光检测设备，其特征在于，毛细管长50厘米，内直径50微米，材质为二氧化硅。

3.根据权利要求1或2所述的高效毛细管电泳－激光诱导荧光检测设备，其特征在于，毛细管中段距离阳极25厘米设有一个1平方厘米的视窗。

4.一种检测早期癌癌的试剂盒，其特征在于，包括以下组分：

试剂A：质量/体积为3%碘化钾(KI)和3%的碘(I2)；

试剂B：1摩尔每升的氢氧化钠和1摩尔每升的氯化钠；

试剂C：40微摩尔每升的磷酸氢钠(Na2HPO4)和磷酸的混合物,PH值为7.5；

试剂D：500微升去离子纯净水；

试剂E：500微升1摩尔每升的氯化氢；

试剂F：500微升0.1摩尔每升Tris,0.1摩尔每升borate,2摩尔每升EDTA。

5.权利要求4的制备方法，其特征在于：

试剂A：制备及保存具体过程如下:首先溶解碘化钾在电离水中,充分搅拌至全部溶解,再将碘加入到溶液搅拌，最终溶液需分装在放铝箔纸包裹的2毫升样品罐中,每个2毫升样品罐中存有500微升处理试剂.试剂需放置在冰箱冷冻层中；

试剂B：组分为1摩尔每升的氢氧化钠和1摩尔每升的氯化钠,储存形式为200微升每2毫升样品罐中；

试剂C：40微摩尔每升的磷酸氢钠(Na2HPO4)和磷酸的混合物,PH值为7.2-7.7300微升每2毫升样品罐中存放；

试剂D：500微升去离子纯净水,同样存于2毫升样品罐中；

试剂E：500微升1摩尔每升的氯化氢,同样存于2毫升样品罐中；

试剂F：500微升0.1摩尔每升Tris,0.1摩尔每升borate,2摩尔每升EDTA同样存于2毫升样品罐中。

6.一种检测早期癌症的方法，其特征在于，利用权利要求1或2或3的设备与权利要求4的试剂盒来检测病人尿样蝶呤类物质的含量，从含量判定早期癌症情况。

7.根据权利要求6所述的检测早期癌症的方法，其特征在于，蝶呤类物质为异黄蝶呤类或黄蝶呤类。

8.根据权利要求6或7所述的检测早期癌症的方法，其特征在于，检测病人尿样，其过程中对尿样的处理，样品拿到后迅速放置-80摄氏度冰箱中保存；将尿样转移至试剂A的样品罐中,轻摇并静,再将试剂B加入样品罐中,充分混合然后放置4度冰箱15分钟,完成后在8000转冷冻离心机下离心10分钟；转移100微升上清液到试剂C的样品罐中,充分混合后等待进样。

9.根据权利要求6或7所述的检测早期乳腺癌的方法，其特征在于，利用权利要求1或2或3的设备，进样品前,用预处理毛细管,用试剂C和试剂D分别进样3分钟.紧接着进样试剂E和试剂D3分钟,最有用试剂F进样10分钟,样品进样保持20秒,具体电泳参数如下:保持电压18千伏9分钟.每一个样品结束后需要重复预处理步骤:用试剂C和试剂D分别进样3分钟.紧接着进样试剂E和试剂D3分钟,最后用试剂F进样10分钟；蝶呤类物质的特征峰在6.5分钟的时候出现.在完成所有样品后,再进样标准溶液1－5从而得到标准曲线，标准液为蝶呤类物质溶于磷酸氢钠(Na2HPO4)和磷酸的混合物。

10.根据权利要求8所述的检测早期乳腺癌的方法，其特征在于，标准溶液1－5如下：