CN103374585A - 萝卜花蕾败育相关的液泡加工酶基因RsVPE1 - Google Patents
萝卜花蕾败育相关的液泡加工酶基因RsVPE1 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103374585A CN103374585A CN2013102697400A CN201310269740A CN103374585A CN 103374585 A CN103374585 A CN 103374585A CN 2013102697400 A CN2013102697400 A CN 2013102697400A CN 201310269740 A CN201310269740 A CN 201310269740A CN 103374585 A CN103374585 A CN 103374585A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- radish
- rsvpe1
- bud
- flower buds
- cdna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了萝卜花蕾败育相关的液泡加工酶基因RsVPE1，以萝卜败育花蕾，半败育花蕾和正常花蕾为试材，通过cDNA-AFLP分析，获得差异表达的TDF72，采用RACE方法获得了萝卜液泡加工酶（vacuolar processing enzyme）基因RsVPE1的gDNA和cDNA，分别为2346bp和1470bp。将基因RsVPE1的cDNA序列用BLAST软件进行同源性测定，比对结果表明与拟南芥gamma-VPE同源性最高。进一步分析了基因RsVPE1在萝卜败蕾材料可育株和不育株正常花蕾和败育花蕾的萼片，花瓣，雄蕊和雌蕊中的表达情况，结果在可育株和不育株中在败育花蕾不同部位的表达量均高于正常花蕾的相应部位，并且败育花蕾萼片、花瓣中的表达量明显高于正常花蕾。为加快败蕾基因在十字花科作物育种实践上的利用具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学中的基因领域，特别是一种萝卜花蕾败育相关的液泡加工酶基因RsVPE1。
背景技术
萝卜（Raphanus sativus L.）是原产于中国的一种重要的蔬菜作物，古称“莱菔”。萝卜营养丰富，药食皆宜，深受人们青睐。我国萝卜种植面积在120万公顷左右，位居各种蔬菜种植面积的前三位。
萝卜是十字花科萝卜属一年生草本植物，一般经过春化后开始花芽分化，在正常生长条件下,通过正常的现蕾、开花和结果，完成一个生命周期。在多年的育种实践中，在大白菜、萝卜等植物中经常遇到败蕾现象发生，即花蕾败育，也就是植株花蕾不能完成正常的生长发育过程，中途夭亡的现象。这种现象对于植物本身繁殖是不利的，而且花蕾败育现象在雄性不育材料、高代自交材料中发生普遍，严重者不能开花，难以留种，研究这种现象发生的机理对于认识和利用这一现象是必要的。目前，有关植物败蕾方面的研究报道很少，对于其败育死亡机理更不清楚。
液泡加工酶（vacuolar processing enzyme，VPE）属于半胱氨酸蛋白酶，在许多植物和动物中都相当保守。VPE最初是从蓖麻种子中分离出来的一种新的半胱氨酸蛋白酶。VPE可以分为以下三类：营养型VPE，种子型VPE和种皮型VPE。在植物发育和细胞程序化死亡中，VPE起着重要的作用。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种萝卜花蕾败育相关的液泡加工酶基因RsVPE1。
为了实现上述任务，本发明以萝卜败育花蕾，半败育花蕾和正常花蕾为试材，通过cDNA-AFLP分析，获得差异表达的TDF72，采用RACE方法获得了萝卜液泡加工酶基因RsVPE1的gDNA和cDNA，分别为2346bp和1470bp。
上述萝卜败蕾相关的液泡加工酶基因RsVPE1的cDNA序列如下：
1 ATGCCACCTG TCCCCGTCGC CGTTCTCCTG CTCTCCTTGA TCGCCGTATCCGCCGCGAGA
61 CAAAACCCCG AAGACGACGT CATCAAACTC CCCTCGCAAG CTTCTAGGTTCTTCCGCCCT
121 CCCAACAACG ACGACGATTC TTCATCATCC GGCACTAGGT GGGCTGTTCTAGTCGCCGGA
181 TCGAGTGGTT ACTGGAACTA CAGGCATCAG GCGGATGTTT GTCATGCTTATCAACTTCTG
241 AGGAAAGGAG GATTGAAAGA GGAGAATATA GTGGTGTTCA TGTATGATGATATCGCTGAT
301 AACGAAGAGA ATCCGAGGAA AGGGATCATT ATCAACAGTC CTCATGGAAGTGATGTCTAT
361 CAAGGAGTTC CCAAGGATTA CACTGGAGAT GATGTTACTG TTGATAATCTGTTTGCTGTG
421 ATTCTTGGAG ACAAGAGTTC TGTTAAGGGA GGGAGTGGGA AGGTTGTGGATAGTGGTCCA
481 AATGATCATA TCTTCATATT CTACAGTGAC CATGGTGGTC CTGGAGTTCTCGGGATGCCG
541 ACTTCTCCTT ACTTATATGC TAATGATTTG AATGATGTGT TGAAGAAAAAACACTCTTCC
601 GGAAACTACA AAAGTTTGGT GTTTTATCTT GAAGCTTGTG AATCTGGAAGTATCTTTGAA
661 GGGCTTCTTG AAGAGGGTTT AAACATCTAC GCCACAACTG CATCGAACGCAGTAGAAAGC
721 AGTTGGGGTA CCTATTGCCC CGGAGAGGAG CCTAGCCCTC CACCTGAGTATGAAACTTGC
781 TTAGGTGACT TATACAGTGT TGCCTGGATG GAAGACAGTG GCGTGCACAATCTACAAACT
841 GAGACTCTGC GCCAACAATA TGAACTTGTG AAAAGGAGGA CTGTAGGTTCTGGGTCGAGT
901 TATGGTTCTC ATGTCATGCA ATACGGCGAT GTAGGACTTA ACAAGAATAAGCTCGACCTT
961 TACATGGGAA CAAACCCTGC CAACGACAAC TTCACCTTTG TGGATGCTAATTCACTGACG
1021 CCACCACCTT CAAGAGTTAC AAACCAGCGT GATGCAGATC TTGTCCATTTCTGGGATAAG
1081 TACCGAAAGG CACCAGAAGG TTCCACCAGA AAAACGGAAG CTCAGAAGCAAGTCCTTGAA
1141 GCCATGTCTC ACAGACTTCA CGTTGACAAC AGTGTGAAAC TCGTCGGCAAACTCTTGTTT
1201 GGCATCTCAG AAGGTTCTGA AGTGCTAAAC AAAGTACGTC CTGCTGGACAACCACTGGCC
1261 GATGACTGGA GCTGCCTTAA AAACATGGTG AGAGCTTTTG AGAGACACTGTGGATCCCTG
1321 TCACAGTACG GTATCAAGCA CATGAGGTCC TTTGCAAACA TCTGCAACGAAAGGATCCAA
1381 ATGGAGCAAA TGGAAGAGGC AGCTTCACAG GCTTGCACCT CAATCCCACCTGGTCCTTGG
1441 AGCTCTCTTC ACCGTGGATT CAGTGCTTAA。
萝卜败蕾相关的液泡加工酶基因RsVPE1的gDNA序列如下：
1 ATGCCACCTG TCCCCGTCGC CGTTCTCCTG CTCTCCTTGA TCGCCGTATCCGCCGCGAGA
61 CAAAACCCCG AAGACGACGT CATCAAACTC CCCTCGCAAG CTTCTAGGTTCTTCCGCCCT
121 CCCAACAACG ACGACGATTC TTCATCATCC GGCACTAGGT GGGCTGTTCTAGTCGCCGGA
181 TCGAGTGGTT ACTGGAACTA CAGGCATCAG GTAATCGTCT CGATTCCTCCTCCGTTTTAA
241 TCGAATTTCG CCTCTGATCG AGATAACGTT TATGGATCCA TGAGCTTTTAGTGTGAACTC
301 TTCTAGTGTT TATGATGATG ATGAGGTTGT AACTAACTTT TTTGCAGGCGGATGTTTGTC
361 ATGCTTATCA ACTTCTGAGG AAAGGAGGAT TGAAAGAGGA GAATATAGTGGTGTTCATGT
421 ATGATGATAT CGCTGATAAC GAAGAGAATC CGAGGAAAGG GATCATTATCAACAGTCCTC
481 ATGGAAGTGA TGTCTATCAA GGAGTTCCCA AGGTTGCTTT TGCTTTCTCTTTGGTTTGTG
541 CTATCTAAAA GATTCTCTCA CTTAATAATC TGTTTGTGTG TGGCAGGATTACACTGGAGA
601 TGATGTTACT GTTGATAATC TGTTTGCTGT GATTCTTGGA GACAAGAGTTCTGTTAAGGG
661 AGGGAGTGGG AAGGTTGTGG ATAGTGGTCC AAATGATCAT ATCTTCATATTCTACAGTGA
721 CCATGGTGGT CCTGGAGTTC TCGGTGAGTT CTGTGAAATC CAAGAGAGGAGGATGGTTTT
781 TGATTTAAAA TATACTGATG GTTCTGTATG CAGGGATGCC GACTTCTCCTTACTTATATG
841 CTAATGATTT GAATGATGTG TTGAAGAAAA AACACTCTTC CGGAAACTACAAAAGTTTGG
901 TGAGTCGCTG AGGTTTCTTA TGATATGTTT TTTGTTGTTT GTACTGCATGTGTGAGTAAA
961 ATACTAAAAC AAGCAAATCT GTAGGTGTTT TATCTTGAAG CTTGTGAATCTGGAAGTATC
1021 TTTGAAGGGC TTCTTGAAGA GGGTTTAAAC ATCTACGCCA CAACTGCATCGAACGCAGTA
1081 GAAAGCAGTT GGGGTACCTA TTGCCCCGGA GAGGAGCCTA GCCCTCCACCTGAGTATGAA
1141 ACTTGCTTAG GTGACTTATA CAGTGTTGCC TGGATGGAAG ACAGGTAAGCTGAAGGATCC
1201 CAAGGCGCTG ATATTAGGTT ATCATGTTTA GGAATCTCTG TGAATGTCCTGTATATTGGT
1261 TCTGATATTT ATTTATTATG CAACAGTGGC GTGCACAATC TACAAACTGAGACTCTGCGC
1321 CAACAATATG AACTTGTAAG CTTCTTGTTT TCTCTGCAGA TCTTGTAATACTAATGATGG
1381 AGATGAGCTT TCTCAACTGT AACTTGGCTA GTTGGCTTCT TTGGCTAATGTGTGTCCTTG
1441 TGTTTTCAGG TGAAAAGGAG GACTGTAGGT TCTGGGTCGA GTTATGGTTCTCATGTCATG
1501 CAATACGGCG ATGTAGGACT TAACAAGAAT AAGCTCGACC TTTACATGGGAACAAACCCT
1561 GCCAACGACA ACTTCACCTT TGTGGATGCT AATTCACTGA CGCCACCACCTTCAAGAGTT
1621 ACAAACCAGC GTGATGCAGA TCTTGTCCAT TTCTGGGATA AGGTTCTTTTTTCTTATCTT
1681 CTTTACATAT TTTAGATACT TCAGTAGTTT CTGTTAGTTC CGGTGAATTTACAATTCTTT
1741 GGCCTTGTTA TTGTTTTCGT GAAGTACCGA AAGGCACCAG AAGGTTCCACCAGAAAAACG
1801 GAAGCTCAGA AGCAAGTCCT TGAAGCCATG TCTCACAGAC TTCACGTTGAAAACTCGTCG
1861 GCAAACTCTT GTTTGGCATC TCAGAAGGTT CAACAGTGTG CTGAAGTGCTAAACAAAGTA
1921 CGTCCTGCTG GACAACCACT GGCCGATGAC TGGAGCTGCC TTAAAAACATGGTAAATAAA
1981 TTCTTTACTT GCCAATCTTA TCATCAGCTC TTTACATCAT TGCAACGGGATCTCTATTTA
2041 TTTATGAGGT TAGCATTGAA AAACGTATTG GCATGGGCAT GAGATTACATCTATCATACT
2101 ATAAGAATAT AAGATAGAAA AGTCAGTTTG TGGAAAACAC ATAACCTTCGTTGTATGGTG
2161 TAGGTGAGAG CTTTTGAGAG ACACTGTGGA TCCCTGTCAC AGTACGGTATCAAGCACATG
2221 AGGTCCTTTG CAAACATCTG CAACGAAAGG ATCCAAATGG AGCAAATGGAAGAGGCAGCT
2281 TCACAGGCTT GCACCTCAAT CCCACCTGGT CCTTGGAGCT CTCTTCACCGTGGATTCAGT
2341 GCTTAA。
上述萝卜败蕾相关的液泡加工酶基因RsVPE1的cDNA序列包含一个1470bp的完整开放阅读框（ORF），推测编码489个氨基酸，预测编码蛋白质的分子量为53.735kD，等电点为5.38。通过NCBI搜索该氨基酸序列的保守功能域，发现在近N端的从53-324位氨基酸预测为Peptidase_C13典型结构域特征。
对测序得到的萝卜败蕾相关的液泡加工酶基因RsVPE1的cDNA和gDNA序列进行分析，该萝卜败蕾相关的液泡加工酶RsVPE1基因由9个外显子和8个内含子组成，将RsVPE1基因的cDNA序列用BLAST软件进行同源性测定，比对结果表明与拟南芥gamma-VPE同源性最高。进一步分析了基因RsVPE1在萝卜败蕾材料可育株和不育株正常花蕾和败育花蕾的萼片，花瓣，雄蕊和雌蕊中的表达情况，结果在可育株和不育株败育花蕾不同部位的表达量均高于正常花蕾的相应部位，并且败育花蕾萼片、花瓣中的表达量明显高于正常花蕾。这些结果暗示，基因RsVPE1可能通过在萼片、花瓣中的正向高表达调控花蕾败育。对于阐明其与萝卜败蕾发生的关系，加深对植物败蕾的认识，丰富有关植物败蕾的理论，进而加快败蕾基因在十字花科作物育种实践上的利用具有重要意义。
附图说明
图1是萝卜败蕾相关的液泡加工酶基因RsVPE1结构图；
图2是萝卜败蕾相关的液泡加工酶基因RsVPE1在萝卜败蕾材料09L9可育株和不育株不同组织中的表达分析，其中（a）和（c）是不育株；（b）和（d）为可育株；图中，NFB：正常花蕾；AFB：败育花蕾；L：叶片；FS：花茎；YS：幼嫩果荚；NSE：正常花蕾的萼片；NPE：正常花蕾花瓣；NST：正常花蕾雄蕊；NPI：正常花蕾雌蕊；ASE：败育花蕾萼片；APE：败育花蕾花瓣；AST：败育花蕾雄蕊；API：败育花蕾雌蕊。
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
申请人采用cDNA-AFLP技术，选择西北农林科技大学园艺学院白菜研究室提供的萝卜细胞质雄性不育系B-T18（萝卜花蕾败育过程中的组织细胞学特征观察，西北农业学报，2008，17（5）:272-276）配制的测交一代09L9（以下称萝卜败蕾材料09L9）的萌动种子经低温春化后播种于温室，开花期取同一株上停止生长并开始转黄的败育花蕾，败育过渡花蕾和正常花蕾的基因表达谱进行了分析，获得了54个TDFs，其中由引物A7T19扩增产生的TDF72大小189bp与拟南芥Arabidopsis lyrata subsp.lyrata的GAMMA-VPE相似，在“花蕾败育→过渡花蕾→正常花蕾”中的表达为：“有→有→无”（类型Ⅰ）。进一步采用RACE技术获得了该基因全长。
获得萝卜液泡加工酶基因RsVPE1的cDNA序列和genomic DNA（gDNA）序列的具体操作步骤如下：
1、以萝卜败蕾材料09L9的败育花蕾、半败育花蕾和正常花蕾为试材进行cDNA-AFLP分析（参照Bachem et al.1996），酶切组合为TaqI+AseI，获得表现为“有→有→无”表达的TDF72。
其序列长度189bp，两端为T19引物的序列和A7引物的反向互补序列，其中：
T19引物的序列为：GATGAGTCCTGACCGACC；
A7引物的反向互补序列为：GCATTAGGTACGCAGTC；
TDF72的全长序列为：
GATGAGTCCTGACCGACCCAGAACCTACAGTCCTCCTTTTCACAAGTTCATATTGTTGGCGCAGAGTCTCAGTTTGTAGATTGTGCACGCCACTGTCTTCCATCCAGGCAACACTGTATAAGTCACCTAAGCAAGTTTCATACTCAGGTGGAGGGCTAGGCTCCTCTCCGGGGCATTAGGTACGCAGTC。
表1：TDF72的Blastn比对及其表达模式
2、5′-RACE和3′-RACE的引物设计与引物合成
根据TDF72的序列（与拟南芥γVPE基因的序列同源性达89%），按照SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit说明书中的引物设计原则，采用Primer Premier5.0软件设计5′-RACE和3′-RACE引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
引物1（5′-RACE 特异引物）：5′GSP（5′-GATGAGTCCTGACCGACCCAGAACCTACA-3′）
引物2（3′-RACE 特异引物）：3′GSP（5′-CCCTCCACCTGAGTATGAAACTTGCTTAG-3′）。
3、5′-cDNA 序列和3′-cDNA序列的获得
通过cDNA末端快速克隆（rapid-amplification of cDNA ends，RACE）获得5′-cDNA 序列和3′-cDNA序列。具体操作步骤如下：
（1）RNA的提取
采集萝卜花蕾败育材料09L9的花蕾，立即放入液氮速冻，-80℃保存备用。采用E.Z.N.A.TMPlant RNA Kit（OMEGA，USA）提取RNA，具体操作步骤如下：
第一步，材料经液氮研磨后，收集≤100mg样品至离心管，加入500uLBuffer RB马上涡旋混匀；
第二步，室温，14，000×g离心5min；
第三步，gDNA过滤柱子放在2ml的收集管中，转移上清至gDNA过滤柱，室温，14，000×g离心2min；
第四步，取滤液，加滤液0.5倍体积的无水乙醇，用枪吸打5-10次将其充分混匀；
第五步，RNA柱子放在新的2ml的收集管中，将第三步的混合液转移至RNA柱中，室温10,000×g离心1min，弃滤液；
第六步，加400uL RWC Wash Buffer至第五步RNA柱子中，室温10,000×g离心1min，弃收集管和滤液；
第七步，将第六步的RNA柱子放在一个新的收集管中，加500uL RNAWash Buffer II（无水乙醇稀释），室温10,000×g离心1min，弃滤液；
第八步，重复第七步；
第九步，将第八步的RNA柱子放在一个新的1.5ml离心管中，取30-50uL DEPC水，准确添加在结合膜中央，常温放置2min，10,000×g室温离心1min，洗脱RNA。
（2）RACE
操作方法参照说明书进行，具体操作步骤如下：
A、一链cDNA的合成
第一步，在两个PCR管中依次加入以下试剂，轻轻混匀，短暂离心将溶液聚集于PCR管底部。
| 组分 | 体积（μL） | 试剂 | 体积（μL） | |
| 总RNA | 2.0 | 总RNA | 2 | |
| 5′-CDS primer A | 1.0 | 3′-CDS primer A | 1 |
| SMART Ⅱ A oligo | 1.0 | |||
| Sterile H2O | 0.75 | Sterile H2O | 1.75 |
第二步，72℃，3min；42℃，2min；冰上急冷2min，短暂离心聚集于PCR管底部。
第三步，在上述PCR管中依次加入下列试剂：
5×First-Strand buffer：2.0μL；
DTT（20μM）：1.0μL；
dNTP Mix（10μM）：1.0μL；
RNase Inhibitor（40U/μL）：0.25μL；
SMARTScribeTM Reverse Transcriptase(100U/μL)：0.5μL。
第四步，轻轻混匀，短暂离心，42℃，1.5h。
第五步，各加入100μL Tricine-EDTA Buffer稀释一链cDNA产物；
第六步，72℃保温7min，冰上冷却；
第七步，将得到的cDNA一链保存于-20℃备用。
B、RACE扩增体系和程序
分别用引物1、引物2和SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit中提供的通用引物（10×Universal primer A Mix，简称UPM）组合，以萝卜花蕾的cDNA一链为模板，进行PCR扩增。
UPM Long（0.4μM）：
CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTUPM Short(2μM)：CTAATACGACTCACTATAGGGCRACE扩增体系：
PCR扩增程序：
①95℃，1min；
②95℃，30s；
③68℃，30s；
④72℃，3min；
⑤从②至④共38个循环；
⑥72℃，10min
⑦4℃
（3）产物回收，连接，转化和测序
用1%的琼脂糖凝胶对PCR产物（5′-cDNA序列和3′-cDNA序列）进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD18-T载体中，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，挑取阳性克隆，送上海生工生物工程有限公司进行测序和拼接。
5′-cDNA序列的全长为1088bp，其一端为5′-RACE特异引物（GATGAGTCCTGACCGACCCAGAACCTACA），另一端为通用引物（ACTCTGCGTTGATACCACTGCTTGCCCTATAGTGAGTCGTATTA），5′-cDNA序列的全长如下：
GATGAGTCCTGACCGACCCAGAACCTACAGTCCTCCTTTTCACAAGTTCATATTGYTGSCGCAGAGTCTCAGTTTGTAGATTGTGCACGCCACTGTCTTCCATCCAGGCAACACTGTATAAGTCACCTAAGCAAGTTTCATACTCAGGTGGAGGGCTAGGCTCCTCTCCGGGGCAATAGGTACCCCAACTGCTTTCTACTGCGTTCGATGCAGTTGTGGCGTAGATGTTTAAACCCTCTTCAAGAAGCCCTTCAAAGATACTTCCAGAYTCACAAGCTTCRAGATAAAACACCAAACTTTTGTAGTTTCCGGAAGAGTGTTTTTTCTTCAACACATCATTCAAATCATTAGCRTATAAGTAAGGAGAAGTCGGCATCCCGAGAACTCCAGGACCACCATGGTCACTGTAGAATATGAAGATATGATCATTTGGACCACTATCCACAACCTTCCCACTCCCTCCCTTAACAGAACTCTTGTCTCCAAGAATCACAGCAAACAGATTATCAACAGTAACATCATCTCCAGTGTAATCCTTGGGAACTCCTTGATAGACATCACTTCCATGAGGACTGTTGATAATGATCCCTTTCCTCGGATTCTCTTCGTTATCAGCGATATCATCATACATGAACACCACTATATTCTCCTCTTTCAATCCTCCTTTCCTCAGAAGTTGATAAGCATGACAAACATCCGCCTGATGCCTGTAGTTCCAGTAACCACTCGATCCGGCGACTAGAACAGCCCACCTAGTGCCGGATGATGAAGAATCGTCGTCGTTGTTGGGAGGGCGGAAGAACCTAGAAGCTTGCGAGGGGAGTTTGATGACGTCGTCTTCGGGGTTTTGTCTCGCGGCGGATACGGCGATCAAGGAGAGCAGGAGAACGGCGACGGGGACAGGTGGCATGGTTGGGTAGGCGTTTGGTGACGTGGATATGAATCTTTCCCGGGGGACTATTTATTAATGAATCTTTTTTTCTTTTTGTTtGTTTTTGTCAACCAATCAATCAATATTGtAAAATgAatCTTCTTCCCCATGTACTCTGCGTTGATACCACTGCTTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAG。
5′-cDNA序列的的反向互补序列全长为1088bp，其中，一端为通用引物反向互补序列（CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT），另一端为5′RACE引物的反向互补序列（TGTAGGTTCTGGGTCGGTCAGGACTCATC），5′-cDNA序列的全长如下：
CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGGGAAGAAGATTCATTTTACAATATTGATTGATTGGTTGACAAAAACAAACAAAAAGAAAAAAAGATTCATTAATAAATAGTCCCCCGGGAAAGATTCATATCCACGTCACCAAACGCCTACCCAACCATGCCACCTGTCCCCGTCGCCGTTCTCCTGCTCTCCTTGATCGCCGTATCCGCCGCGAGACAAAACCCCGAAGACGACGTCATCAAACTCCCCTCGCAAGCTTCTAGGTTCTTCCGCCCTCCCAACAACGACGACGATTCTTCATCATCCGGCACTAGGTGGGCTGTTCTAGTCGCCGGATCGAGTGGTTACTGGAACTACAGGCATCAGGCGGATGTTTGTCATGCTTATCAACTTCTGAGGAAAGGAGGATTGAAAGAGGAGAATATAGTGGTGTTCATGTATGATGATATCGCTGATAACGAAGAGAATCCGAGGAAAGGGATCATTATCAACAGTCCTCATGGAAGTGATGTCTATCAAGGAGTTCCCAAGGATTACACTGGAGATGATGTTACTGTTGATAATCTGTTTGCTGTGATTCTTGGAGACAAGAGTTCTGTTAAGGGAGGGAGTGGGAAGGTTGTGGATAGTGGTCCAAATGATCATATCTTCATATTCTACAGTGACCATGGTGGTCCTGGAGTTCTCGGGATGCCGACTTCTCCTTACTTATAYGCTAATGATTTGAATGATGTGTTGAAGAAAAAACACTCTTCCGGAAACTACAAAAGTTTGGTGTTTTATCTYGAAGCTTGTGARTCTGGAAGTATCTTTGAAGGGCTTCTTGAAGAGGGTTTAAACATCTACGCCACAACTGCATCGAACGCAGTAGAAAGCAGTTGGGGTACCTATTGCCCCGGAGAGGAGCCTAGCCCTCCACCTGAGTATGAAACTTGCTTAGGTGACTTATACAGTGTTGCCTGGATGGAAGACAGTGGCGTGCACAATCTACAAACTGAGACTCTGCGSCARCAATATGAACTTGTGAAAAGGAGGACTGTAGGTTCTGGGTCGGTCAGGACTCATC。
3′-cDNA序列的全长为937bp，其一端为3′-RACE特异引物（CCCTCCACCTGAGTATGAAACTTGCTTAG），3′-cDNA序列如下：
CCCTCCACCTGAGTATGAAACTTGCTTAGGTGACTTATACAGTGTTGCCTGGATGGAAGACAGTGGCGTGCACAATCTACAAACTGAGACTCTGCRGCAACAATATGAACTTGTGAAAAGGAGGACTGTAGGTTCTGGGTCGAGTTATGGTTCTCATGTCATGCAATACGGCGATGTAGGACTTAACAAGAATAAGCTCGACCTTTACATGGGAATAAACCCTGCCAACGACAACTTCACCTTTGTGGATGCTAATTCACTGACGCCACCACCTTCAAGAGTTACAAACCAGCGTGATGCAGATCTTGTCCATTTCTGGGRTAAGTACCGAAAGGCACCAGAAGGTTCCACCAGAAAAACAGAAGCGCAGAAGCAAGTCCTTGAAGCCATGTCTCACAGACTTCATGTTGATAACAGTGTGAAACTTGTAGGCAAACTCTTATTTGGCATTTCAGAAGGTTCTGAAGTACTAAACAAAGTAAGGCCTGCTGGACAACCACTCGCCGATGACTGGAGTTGCCTTAAAAACATGGTGAGAGCTTTTGAGAGACACTGTGGATCCCTGTCGCAGTACGGTATCAAGCACATGAGGTCCTTTGCAAACATCTGCAACGAAGGGATCCAAATGGAGCAAATGGACGAGGCAGCTTCACAGGCTTGCACCTCAATCCCACCTGGTCCTTGGAGCTCTCTTCACCGYGGATTCAGTGCTTAAAAACCCTAATCCCTCTTTGCATTTGTTAATACTAGTACCAATGCGCAAATATTCTTATTCCTGTTTCGATTTGTAATGGTTAATCTCCCTGTATCTCATTATCAGTTCCCTCTTCATTGTGTAATTACAGATTATCCATTTGCTRATGTACAAAATGCTTGTAGAAGCTGAAGTTAATGTATACAAAGGTTTGCTTATTATaaAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
4、基因全长的引物设计
根据RACE产物的拼接结果设计扩增基因全长的特异引物。特异引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
引物3（正义引物）：5'-ATGCCACCTGTCCCCGTCGCCGTT-3'
引物4（反义引物）：5'-TTAAGCACTGAAT CCACGGTGA-3'
5、基因全长的获得
（1）gDNA的提取
采用CTAB法，以萝卜花蕾败育材料09L9叶片为材料进行gDNA提取。
（2）总RNA提取及cDNA第一链的合成
采集萝卜花蕾败育材料09L9的花蕾，立即放入液氮速冻，-80℃保存备用。采用E.Z.N.A.TMPlant RNA Kit（OMEGA，USA）提取RNA。将其利用PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time)合成cDNA一链，具体操作步骤参见说明书。
反转录反应体系：
| 组分 | 体积（μL） |
| ddH2O | 5.5 |
| 5×PrimeScript Buffer（for Real Time） | 2.0 |
| Oligo dT Primer（50μM） | 0.5 |
| Random6mers（100μM） | 0.5 |
| PrimeScript RT Enzyme Mix I | 0.5 |
| Total RNA（500ng/μL） | 1.0 |
| 总体积 | 10.0 |
反转录反应条件：
①37℃，15min；
②85℃，5s；
③4℃；
（3）PCR扩增体系和程序
用上述引物3和引物4，分别以萝卜花蕾败育材料09L9花蕾的cDNA一链和萝卜花蕾败育材料09L9叶片的gDNA为模板，扩增获得了该基因的cDNA序列和gDNA序列。
PCR扩增体系：
PCR扩增程序：
①98℃，10s；
②68℃，1.5min(cDNA一链)/3min（DNA）；
③从①至②，30个循环
④72℃，10min
⑤4℃
（4）产物回收，连接，转化和测序
用1%的琼脂糖凝胶对PCR产物进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD18-T载体中，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，挑取阳性克隆，送上海生工生物工程有限公司进行测序。
基因RsVPE1的cDNA全长序列如下：
1 ATGCCACCTG TCCCCGTCGC CGTTCTCCTG CTCTCCTTGA TCGCCGTATCCGCCGCGAGA
61 CAAAACCCCG AAGACGACGT CATCAAACTC CCCTCGCAAG CTTCTAGGTTCTTCCGCCCT
121 CCCAACAACG ACGACGATTC TTCATCATCC GGCACTAGGT GGGCTGTTCTAGTCGCCGGA
181 TCGAGTGGTT ACTGGAACTA CAGGCATCAG GCGGATGTTT GTCATGCTTATCAACTTCTG
241 AGGAAAGGAG GATTGAAAGA GGAGAATATA GTGGTGTTCA TGTATGATGATATCGCTGAT
301 AACGAAGAGA ATCCGAGGAA AGGGATCATT ATCAACAGTC CTCATGGAAGTGATGTCTAT
361 CAAGGAGTTC CCAAGGATTA CACTGGAGAT GATGTTACTG TTGATAATCTGTTTGCTGTG
421 ATTCTTGGAG ACAAGAGTTC TGTTAAGGGA GGGAGTGGGA AGGTTGTGGATAGTGGTCCA
481 AATGATCATA TCTTCATATT CTACAGTGAC CATGGTGGTC CTGGAGTTCTCGGGATGCCG
541 ACTTCTCCTT ACTTATATGC TAATGATTTG AATGATGTGT TGAAGAAAAAACACTCTTCC
601 GGAAACTACA AAAGTTTGGT GTTTTATCTT GAAGCTTGTG AATCTGGAAGTATCTTTGAA
661 GGGCTTCTTG AAGAGGGTTT AAACATCTAC GCCACAACTG CATCGAACGCAGTAGAAAGC
721 AGTTGGGGTA CCTATTGCCC CGGAGAGGAG CCTAGCCCTC CACCTGAGTATGAAACTTGC
781 TTAGGTGACT TATACAGTGT TGCCTGGATG GAAGACAGTG GCGTGCACAATCTACAAACT
841 GAGACTCTGC GCCAACAATA TGAACTTGTG AAAAGGAGGA CTGTAGGTTCTGGGTCGAGT
901 TATGGTTCTC ATGTCATGCA ATACGGCGAT GTAGGACTTA ACAAGAATAAGCTCGACCTT
961 TACATGGGAA CAAACCCTGC CAACGACAAC TTCACCTTTG TGGATGCTAATTCACTGACG
1021 CCACCACCTT CAAGAGTTAC AAACCAGCGT GATGCAGATC TTGTCCATTTCTGGGATAAG
1081 TACCGAAAGG CACCAGAAGG TTCCACCAGA AAAACGGAAG CTCAGAAGCAAGTCCTTGAA
1141 GCCATGTCTC ACAGACTTCA CGTTGACAAC AGTGTGAAAC TCGTCGGCAAACTCTTGTTT
1201 GGCATCTCAG AAGGTTCTGA AGTGCTAAAC AAAGTACGTC CTGCTGGACAACCACTGGCC
1261 GATGACTGGA GCTGCCTTAA AAACATGGTG AGAGCTTTTG AGAGACACTGTGGATCCCTG
1321 TCACAGTACG GTATCAAGCA CATGAGGTCC TTTGCAAACA TCTGCAACGAAAGGATCCAA
1381 ATGGAGCAAA TGGAAGAGGC AGCTTCACAG GCTTGCACCT CAATCCCACCTGGTCCTTGG
1441 AGCTCTCTTC ACCGTGGATT CAGTGCTTAA
基因RsVPE1的gDNA全长如下：
1 ATGCCACCTG TCCCCGTCGC CGTTCTCCTG CTCTCCTTGA TCGCCGTATCCGCCGCGAGA
61 CAAAACCCCG AAGACGACGT CATCAAACTC CCCTCGCAAG CTTCTAGGTTCTTCCGCCCT
121 CCCAACAACG ACGACGATTC TTCATCATCC GGCACTAGGT GGGCTGTTCTAGTCGCCGGA
181 TCGAGTGGTT ACTGGAACTA CAGGCATCAG GTAATCGTCT CGATTCCTCCTCCGTTTTAA
241 TCGAATTTCG CCTCTGATCG AGATAACGTT TATGGATCCA TGAGCTTTTAGTGTGAACTC
301 TTCTAGTGTT TATGATGATG ATGAGGTTGT AACTAACTTT TTTGCAGGCGGATGTTTGTC
361 ATGCTTATCA ACTTCTGAGG AAAGGAGGAT TGAAAGAGGA GAATATAGTGGTGTTCATGT
421 ATGATGATAT CGCTGATAAC GAAGAGAATC CGAGGAAAGG GATCATTATCAACAGTCCTC
481 ATGGAAGTGA TGTCTATCAA GGAGTTCCCA AGGTTGCTTT TGCTTTCTCTTTGGTTTGTG
541 CTATCTAAAA GATTCTCTCA CTTAATAATC TGTTTGTGTG TGGCAGGATTACACTGGAGA
601 TGATGTTACT GTTGATAATC TGTTTGCTGT GATTCTTGGA GACAAGAGTTCTGTTAAGGG
661 AGGGAGTGGG AAGGTTGTGG ATAGTGGTCC AAATGATCAT ATCTTCATATTCTACAGTGA
721 CCATGGTGGT CCTGGAGTTC TCGGTGAGTT CTGTGAAATC CAAGAGAGGAGGATGGTTTT
781 TGATTTAAAA TATACTGATG GTTCTGTATG CAGGGATGCC GACTTCTCCTTACTTATATG
841 CTAATGATTT GAATGATGTG TTGAAGAAAA AACACTCTTC CGGAAACTACAAAAGTTTGG
901 TGAGTCGCTG AGGTTTCTTA TGATATGTTT TTTGTTGTTT GTACTGCATGTGTGAGTAAA
961 ATACTAAAAC AAGCAAATCT GTAGGTGTTT TATCTTGAAG CTTGTGAATCTGGAAGTATC
1021 TTTGAAGGGC TTCTTGAAGA GGGTTTAAAC ATCTACGCCA CAACTGCATCGAACGCAGTA
1081 GAAAGCAGTT GGGGTACCTA TTGCCCCGGA GAGGAGCCTA GCCCTCCACCTGAGTATGAA
1141 ACTTGCTTAG GTGACTTATA CAGTGTTGCC TGGATGGAAG ACAGGTAAGCTGAAGGATCC
1201 CAAGGCGCTG ATATTAGGTT ATCATGTTTA GGAATCTCTG TGAATGTCCTGTATATTGGT
1261 TCTGATATTT ATTTATTATG CAACAGTGGC GTGCACAATC TACAAACTGAGACTCTGCGC
1321 CAACAATATG AACTTGTAAG CTTCTTGTTT TCTCTGCAGA TCTTGTAATACTAATGATGG
1381 AGATGAGCTT TCTCAACTGT AACTTGGCTA GTTGGCTTCT TTGGCTAATGTGTGTCCTTG
1441 TGTTTTCAGG TGAAAAGGAG GACTGTAGGT TCTGGGTCGA GTTATGGTTCTCATGTCATG
1501 CAATACGGCG ATGTAGGACT TAACAAGAAT AAGCTCGACC TTTACATGGGAACAAACCCT
1561 GCCAACGACA ACTTCACCTT TGTGGATGCT AATTCACTGA CGCCACCACCTTCAAGAGTT
1621 ACAAACCAGC GTGATGCAGA TCTTGTCCAT TTCTGGGATA AGGTTCTTTTTTCTTATCTT
1681 CTTTACATAT TTTAGATACT TCAGTAGTTT CTGTTAGTTC CGGTGAATTTACAATTCTTT
1741 GGCCTTGTTA TTGTTTTCGT GAAGTACCGA AAGGCACCAG AAGGTTCCACCAGAAAAACG
1801 GAAGCTCAGA AGCAAGTCCT TGAAGCCATG TCTCACAGAC TTCACGTTGAAAACTCGTCG
1861 GCAAACTCTT GTTTGGCATC TCAGAAGGTT CAACAGTGTG CTGAAGTGCTAAACAAAGTA
1921 CGTCCTGCTG GACAACCACT GGCCGATGAC TGGAGCTGCC TTAAAAACATGGTAAATAAA
1981 TTCTTTACTT GCCAATCTTA TCATCAGCTC TTTACATCAT TGCAACGGGATCTCTATTTA
2041 TTTATGAGGT TAGCATTGAA AAACGTATTG GCATGGGCAT GAGATTACATCTATCATACT
2101 ATAAGAATAT AAGATAGAAA AGTCAGTTTG TGGAAAACAC ATAACCTTCGTTGTATGGTG
2161 TAGGTGAGAG CTTTTGAGAG ACACTGTGGA TCCCTGTCAC AGTACGGTATCAAGCACATG
2221 AGGTCCTTTG CAAACATCTG CAACGAAAGG ATCCAAATGG AGCAAATGGAAGAGGCAGCT
2281 TCACAGGCTT GCACCTCAAT CCCACCTGGT CCTTGGAGCT CTCTTCACCGTGGATTCAGT
2341 GCTTAA
（5）对基因RsVPE1结构与同源性的分析
用NCBI中的软件Spidey软件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/spidey/）对测序得到的萝卜败蕾相关的液泡加工酶基因RsVPE1cDNA和gDNA序列进行分析，结果该基因有9个外显子和8个内含子组成（图1），如下：
将基因RsVPE1的cDNA序列用BLAST软件进行同源性测定，比对结果表明与拟南芥gamma-VPE同源性最高，如下：
（6）RsVPE1基因的表达模式
采用Real-time PCR检测了基因RsVPE1在萝卜败蕾材料09L9可育株和不育株的叶片，花茎，正常花蕾，败育花蕾和幼嫩果荚的mRNA表达水平（图2a、图2b）。结果显示RsVPE1在这些组织中均有表达，但是表达水平差异较大，在败育花蕾中的表达量最高，在花茎中的表达量最低，说明RsVPE1的表达范围很广泛。
进一步分析了RsVPE1在萝卜败蕾材料09L9可育株和不育株正常花蕾和败育花蕾的萼片，花瓣，雄蕊和雌蕊中的表达情况。结果在可育株和不育株中在败育花蕾不同部位的表达量均高于正常花蕾的相应部位，并且败育花蕾萼片、花瓣中的表达量明显高于正常花蕾最高。这些结果暗示RsVPE1基因可能通过在萼片、花瓣中的正向高表达调控花蕾败育。
Claims (2)
1.萝卜败蕾相关的液泡加工酶基因RsVPE1，其特征在于，该萝卜败蕾相关的液泡加工酶基因RsVPE1的cDNA序列如下：
1 ATGCCACCTG TCCCCGTCGC CGTTCTCCTG CTCTCCTTGA TCGCCGTATCCGCCGCGAGA
61 CAAAACCCCG AAGACGACGT CATCAAACTC CCCTCGCAAG CTTCTAGGTTCTTCCGCCCT
121 CCCAACAACG ACGACGATTC TTCATCATCC GGCACTAGGT GGGCTGTTCTAGTCGCCGGA
181 TCGAGTGGTT ACTGGAACTA CAGGCATCAG GCGGATGTTT GTCATGCTTATCAACTTCTG
241 AGGAAAGGAG GATTGAAAGA GGAGAATATA GTGGTGTTCA TGTATGATGATATCGCTGAT
301 AACGAAGAGA ATCCGAGGAA AGGGATCATT ATCAACAGTC CTCATGGAAGTGATGTCTAT
361 CAAGGAGTTC CCAAGGATTA CACTGGAGAT GATGTTACTG TTGATAATCTGTTTGCTGTG
421 ATTCTTGGAG ACAAGAGTTC TGTTAAGGGA GGGAGTGGGA AGGTTGTGGATAGTGGTCCA
481 AATGATCATA TCTTCATATT CTACAGTGAC CATGGTGGTC CTGGAGTTCTCGGGATGCCG
541 ACTTCTCCTT ACTTATATGC TAATGATTTG AATGATGTGT TGAAGAAAAAACACTCTTCC
601 GGAAACTACA AAAGTTTGGT GTTTTATCTT GAAGCTTGTG AATCTGGAAGTATCTTTGAA
661 GGGCTTCTTG AAGAGGGTTT AAACATCTAC GCCACAACTG CATCGAACGCAGTAGAAAGC
721 AGTTGGGGTA CCTATTGCCC CGGAGAGGAG CCTAGCCCTC CACCTGAGTATGAAACTTGC
781 TTAGGTGACT TATACAGTGT TGCCTGGATG GAAGACAGTG GCGTGCACAATCTACAAACT
841 GAGACTCTGC GCCAACAATA TGAACTTGTG AAAAGGAGGA CTGTAGGTTCTGGGTCGAGT
901 TATGGTTCTC ATGTCATGCA ATACGGCGAT GTAGGACTTA ACAAGAATAAGCTCGACCTT
961 TACATGGGAA CAAACCCTGC CAACGACAAC TTCACCTTTG TGGATGCTAATTCACTGACG
1021 CCACCACCTT CAAGAGTTAC AAACCAGCGT GATGCAGATC TTGTCCATTTCTGGGATAAG
1081 TACCGAAAGG CACCAGAAGG TTCCACCAGA AAAACGGAAG CTCAGAAGCAAGTCCTTGAA
1141 GCCATGTCTC ACAGACTTCA CGTTGACAAC AGTGTGAAAC TCGTCGGCAAACTCTTGTTT
1201 GGCATCTCAG AAGGTTCTGA AGTGCTAAAC AAAGTACGTC CTGCTGGACAACCACTGGCC
1261 GATGACTGGA GCTGCCTTAA AAACATGGTG AGAGCTTTTG AGAGACACTGTGGATCCCTG
1321 TCACAGTACG GTATCAAGCA CATGAGGTCC TTTGCAAACA TCTGCAACGAAAGGATCCAA
1381 ATGGAGCAAA TGGAAGAGGC AGCTTCACAG GCTTGCACCT CAATCCCACCTGGTCCTTGG
1441 AGCTCTCTTC ACCGTGGATT CAGTGCTTAA。
2.萝卜败蕾相关的液泡加工酶基因RsVPE1，其特征在于，该萝卜败蕾相关的液泡加工酶基因RsVPE1的gDNA序列如下：
1 ATGCCACCTG TCCCCGTCGC CGTTCTCCTG CTCTCCTTGA TCGCCGTATCCGCCGCGAGA
61 CAAAACCCCG AAGACGACGT CATCAAACTC CCCTCGCAAG CTTCTAGGTTCTTCCGCCCT
121 CCCAACAACG ACGACGATTC TTCATCATCC GGCACTAGGT GGGCTGTTCTAGTCGCCGGA
181 TCGAGTGGTT ACTGGAACTA CAGGCATCAG GTAATCGTCT CGATTCCTCCTCCGTTTTAA
241 TCGAATTTCG CCTCTGATCG AGATAACGTT TATGGATCCA TGAGCTTTTAGTGTGAACTC
301 TTCTAGTGTT TATGATGATG ATGAGGTTGT AACTAACTTT TTTGCAGGCGGATGTTTGTC
361 ATGCTTATCA ACTTCTGAGG AAAGGAGGAT TGAAAGAGGA GAATATAGTGGTGTTCATGT
421 ATGATGATAT CGCTGATAAC GAAGAGAATC CGAGGAAAGG GATCATTATCAACAGTCCTC
481 ATGGAAGTGA TGTCTATCAA GGAGTTCCCA AGGTTGCTTT TGCTTTCTCTTTGGTTTGTG
541 CTATCTAAAA GATTCTCTCA CTTAATAATC TGTTTGTGTG TGGCAGGATTACACTGGAGA
601 TGATGTTACT GTTGATAATC TGTTTGCTGT GATTCTTGGA GACAAGAGTTCTGTTAAGGG
661 AGGGAGTGGG AAGGTTGTGG ATAGTGGTCC AAATGATCAT ATCTTCATATTCTACAGTGA
721 CCATGGTGGT CCTGGAGTTC TCGGTGAGTT CTGTGAAATC CAAGAGAGGAGGATGGTTTT
781 TGATTTAAAA TATACTGATG GTTCTGTATG CAGGGATGCC GACTTCTCCTTACTTATATG
841 CTAATGATTT GAATGATGTG TTGAAGAAAA AACACTCTTC CGGAAACTACAAAAGTTTGG
901 TGAGTCGCTG AGGTTTCTTA TGATATGTTT TTTGTTGTTT GTACTGCATGTGTGAGTAAA
961 ATACTAAAAC AAGCAAATCT GTAGGTGTTT TATCTTGAAG CTTGTGAATCTGGAAGTATC
1021 TTTGAAGGGC TTCTTGAAGA GGGTTTAAAC ATCTACGCCA CAACTGCATCGAACGCAGTA
1081 GAAAGCAGTT GGGGTACCTA TTGCCCCGGA GAGGAGCCTA GCCCTCCACCTGAGTATGAA
1141 ACTTGCTTAG GTGACTTATA CAGTGTTGCC TGGATGGAAG ACAGGTAAGCTGAAGGATCC
1201 CAAGGCGCTG ATATTAGGTT ATCATGTTTA GGAATCTCTG TGAATGTCCTGTATATTGGT
1261 TCTGATATTT ATTTATTATG CAACAGTGGC GTGCACAATC TACAAACTGAGACTCTGCGC
1321 CAACAATATG AACTTGTAAG CTTCTTGTTT TCTCTGCAGA TCTTGTAATACTAATGATGG
1381 AGATGAGCTT TCTCAACTGT AACTTGGCTA GTTGGCTTCT TTGGCTAATGTGTGTCCTTG
1441 TGTTTTCAGG TGAAAAGGAG GACTGTAGGT TCTGGGTCGA GTTATGGTTCTCATGTCATG
1501 CAATACGGCG ATGTAGGACT TAACAAGAAT AAGCTCGACC TTTACATGGGAACAAACCCT
1561 GCCAACGACA ACTTCACCTT TGTGGATGCT AATTCACTGA CGCCACCACCTTCAAGAGTT
1621 ACAAACCAGC GTGATGCAGA TCTTGTCCAT TTCTGGGATA AGGTTCTTTTTTCTTATCTT
1681 CTTTACATAT TTTAGATACT TCAGTAGTTT CTGTTAGTTC CGGTGAATTTACAATTCTTT
1741 GGCCTTGTTA TTGTTTTCGT GAAGTACCGA AAGGCACCAG AAGGTTCCACCAGAAAAACG
1801 GAAGCTCAGA AGCAAGTCCT TGAAGCCATG TCTCACAGAC TTCACGTTGAAAACTCGTCG
1861 GCAAACTCTT GTTTGGCATC TCAGAAGGTT CAACAGTGTG CTGAAGTGCTAAACAAAGTA
1921 CGTCCTGCTG GACAACCACT GGCCGATGAC TGGAGCTGCC TTAAAAACATGGTAAATAAA
1981 TTCTTTACTT GCCAATCTTA TCATCAGCTC TTTACATCAT TGCAACGGGATCTCTATTTA
2041 TTTATGAGGT TAGCATTGAA AAACGTATTG GCATGGGCAT GAGATTACATCTATCATACT
2101 ATAAGAATAT AAGATAGAAA AGTCAGTTTG TGGAAAACAC ATAACCTTCGTTGTATGGTG
2161 TAGGTGAGAG CTTTTGAGAG ACACTGTGGA TCCCTGTCAC AGTACGGTATCAAGCACATG
2221 AGGTCCTTTG CAAACATCTG CAACGAAAGG ATCCAAATGG AGCAAATGGAAGAGGCAGCT
2281 TCACAGGCTT GCACCTCAAT CCCACCTGGT CCTTGGAGCT CTCTTCACCGTGGATTCAGT
2341 GCTTAA。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2013102697400A CN103374585A (zh) | 2013-06-28 | 2013-06-28 | 萝卜花蕾败育相关的液泡加工酶基因RsVPE1 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2013102697400A CN103374585A (zh) | 2013-06-28 | 2013-06-28 | 萝卜花蕾败育相关的液泡加工酶基因RsVPE1 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103374585A true CN103374585A (zh) | 2013-10-30 |
Family
ID=49460417
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2013102697400A Pending CN103374585A (zh) | 2013-06-28 | 2013-06-28 | 萝卜花蕾败育相关的液泡加工酶基因RsVPE1 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103374585A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050155102A1 (en) * | 2003-12-15 | 2005-07-14 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for altering the functional properties of seed storage proteins in soybean |
| CN101583720A (zh) * | 2006-12-21 | 2009-11-18 | 巴斯福植物科学有限公司 | 具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法 |
| CN102586244A (zh) * | 2012-03-09 | 2012-07-18 | 西北农林科技大学 | 一种萝卜胞质雄性不育分子标记及其辅助选择育种的方法 |
-
2013
- 2013-06-28 CN CN2013102697400A patent/CN103374585A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050155102A1 (en) * | 2003-12-15 | 2005-07-14 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for altering the functional properties of seed storage proteins in soybean |
| CN101583720A (zh) * | 2006-12-21 | 2009-11-18 | 巴斯福植物科学有限公司 | 具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法 |
| CN102586244A (zh) * | 2012-03-09 | 2012-07-18 | 西北农林科技大学 | 一种萝卜胞质雄性不育分子标记及其辅助选择育种的方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| BAKKER,E.等: ""GenBank Accession No：XM _002867173.1"", 《GENBANK》 * |
| JING ZHANG 等: ""A Vacuolar Processing Enzyme RsVPE1 Gene of Radish Is Involved in Floral Bud Abortion under Heat Stress"", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES》 * |
| MOYANG WANG 等: ""The role of vacuolar processing enzyme"", 《AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY》 * |
| YAMADA，K. 等: ""GenBank Accession No：AY059104.1"", 《GENBANK》 * |
| 王莹 等: ""液泡加工酶：植物中具有胱天蛋白酶功能的蛋白酶"", 《生命的化学》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110845590B (zh) | 野葡萄VyPPR基因及其编码蛋白在干旱胁迫中的应用 | |
| CN107840872B (zh) | 蜡梅CpWOX13基因及其编码的蛋白和应用 | |
| CN109430051A (zh) | 一种油用牡丹矮化抗逆品种选育技术 | |
| CN107858371B (zh) | 番茄基因SlSAUR58在调控番茄生长和抗旱性中的应用 | |
| CN102812803B (zh) | 一种豌豆ems突变体库构建的方法 | |
| CN103214564B (zh) | 香蕉MYB转录因子MaMYB的克隆及表达载体构建 | |
| CN106497935A (zh) | 超表达GhJAZ1基因增强植物抗低温胁迫 | |
| CN103014019A (zh) | 大豆开花基因GmCOL1b及其编码蛋白 | |
| CN106929518B (zh) | 一种橡胶树HbAG基因及其应用 | |
| CN110592255B (zh) | 一种与辣椒簇生花序基因紧密连锁的Indel分子标记，引物及应用 | |
| CN103374585A (zh) | 萝卜花蕾败育相关的液泡加工酶基因RsVPE1 | |
| CN102604963B (zh) | 柑橘早花基因PtELF5的分离克隆及应用 | |
| CN115088557B (zh) | 一种姬松茸菌株zjjsr001及其栽培方法 | |
| Dai et al. | Two-step identification of taro (Colocasia esculenta cv. Xinmaoyu) using specific psbE-petL and simple sequence repeat-sequence characterized amplified regions (SSR-SCAR) markers | |
| CN105274219B (zh) | CL5547.Contig2基因在南瓜基因表达实时荧光定量PCR分析中作为内参基因的用途 | |
| CN116120413A (zh) | SlHAT5基因及其在番茄抗高温胁迫中的应用 | |
| CN104160908A (zh) | 一种猕猴桃自然杂交种质的发掘与新品种培育方法 | |
| CN109371036B (zh) | 一种紫花苜蓿耐盐基因MsPIP2；2及其应用 | |
| Zhao et al. | Identification and characterization of sex related genes in Actinidia arguta by suppression subtractive hybridization | |
| Bogomolova et al. | Study of density of raspberry fruits in view of mechanized harvesting | |
| CN109055599B (zh) | 用于猕猴桃金美品种鉴定的分子标记引物及应用 | |
| CN106399529A (zh) | 一种香蕉黑星病菌分子检测引物及检测方法 | |
| CN103215276B (zh) | 一种紫花苜蓿抗旱耐盐基因 | |
| CN104561041A (zh) | 大豆生育期基因j及其编码蛋白 | |
| CN103923929A (zh) | 甘蓝型油菜控制开花相关的BnGI基因序列 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20131030 |