CN103327822B - 糖苷酶在制备奶制品中的用途 - Google Patents

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Abstract

一种制备奶制品(例如酸奶)的方法，包括向奶中添加有效量的N-连接糖苷酶和/或O-连接糖苷酶。

Description

糖苷酶在制备奶制品中的用途
技术领域
本发明涉及制备奶制品(milkproduct)(例如酸奶)的方法，包括向奶中添加有效量的N-连接糖苷酶和/或O-连接糖苷酶。
背景技术
奶制品诸如例如发酵奶制品(例如酸奶)在本领域中是众所周知的。
如本领域中已知的-诸如粘度和凝胶硬度的特性对于相关奶制品是重要的特性。
一般来说-如果使用相同的奶成分可以制成更高的粘度和/或凝胶硬度，则可以使用较少的奶(或其他)固体制成相同的粘度/凝胶硬度，由此节省原料(或获得更高的产率)。
对于低脂发酵奶制品诸如例如低脂酸奶，其可能难以获得产品的最佳优选质地-更准确地问题可能是例如在这样的低脂产品中得到足够高的质地粘度。
添加蛋白质，典型地脱脂奶粉或基于乳清的蛋白，可以被看做是改善低脂酸奶质地的标准程序。然而，这种解决方案是昂贵的，并且不能完全符合低脂/低热量产品的概念，因为添加的蛋白质也促进总能含量。
关于质地的改善-US2005/0095316A1第[0005]段记载了添加所谓的质构剂(texturingagent)(增稠剂、胶凝剂)诸如淀粉、果胶或明胶。然而，如已知的那样-例如在例如酸奶产品中具有额外的胶质或明胶可能不是优选的。
近几年来基于细胞外多糖(EPS)产生的所谓膨体培养物(texturizingculture)，已经显著地改善了此类低脂奶制品的粘度-例如WO2007/095958A1(Chr.HansenA/S)记载了嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)菌株合成了EPS，其可以赋予发酵奶制品以所需要的“可拉成丝的”或粘性质地。
因此，可以说对于例如低脂酸奶，目前的质地粘度问题通过使用例如这些产生EPC的培养物得以如此很好地解决。
然而，如A.N.Hassan等(J.DairySci：86：1632-1638；2003)的文章中所述，与不产生EPS的培养物相比，当使用这种产生EPS的培养物时所谓的凝胶硬度可能会显著下降。
因此-可以说目前的情况是对于例如低脂酸奶产品，通过使用产生EPS的培养物基本上解决了早先的粘度问题-然而，EPS培养物的使用可能已“形成”与减少的凝胶硬度相关的新问题。
在A.N.Hassan等的文章中，在摘要中提到较低的粘弹性模量-如专业技术人员已知的，此粘弹性模量特征与凝胶硬度有关，其意义是如果产品具有较低的粘弹性模量则其将具有较低的凝胶硬度。
在该文章的图1中显示了EPS酸奶的剪应力高得多，对于本领域技术人员来说这直接对应于较高的粘度。
如上所述-对于通常的奶制品诸如例如发酵奶制品(例如酸奶)-所谓的凝胶硬度是非常相关的特性。
例如，低凝胶硬度可以使得奶制品具有不期望的口感。
此外，如果例如酸奶具有低凝胶硬度，则其似乎是稀薄的并且太容易流动-例如在勺上或例如在碗中。
此外，如果例如酸奶具有低凝胶硬度，则其可能由于乳清分离而易于脱水收缩(见下)。
如本领域所公知的，乳凝固酶，诸如蛋白酶凝乳酶(chymosin)(别称凝乳酵素(rennin))用来制备乳酪，其中凝乳酶导致凝固和凝乳形成。
如公知的，乳酪制备包括三个步骤或阶段，所有三个步骤或阶段都由于添加乳凝固酶而发生：1)形成凝块(或软凝胶)，固化，或此凝块的硬化，以及乳清的最终排出，后一过程也称为脱水收缩(syneresis)。
显然的-当制备例如酸奶时，人们通常对发生此脱水收缩作用并不感兴趣-即，奶分离成固体凝乳和液体乳清。
因此，当人们想要制备例如酸奶时，类似凝乳酶的乳凝固酶的使用通常不是优选的。
US2005/0095317A1(Danone)记述了具有κ-酪蛋白水解活性的蛋白酶在发酵奶制品诸如酸奶制备中的用途。
所述蛋白酶可以是例如凝乳酶-参见例如该美国专利申请的[0028]。
所述蛋白酶(例如凝乳酶)水解奶中的酪蛋白-因此初步看来人们应当相信所述蛋白酶(例如凝乳酶)可能为酸奶制备带来不需要的脱水收缩作用。
然而，章节[0008]解释到，令人惊奇地和出人意料地显示蛋白酶诸如例如凝乳酶的使用“改善质地，且特别地增加酸奶和发酵奶的粘度，不会导致诱发脱水收缩，脱水收缩对于此类发酵乳制品将是无法接受的”。
US2005/0095316A1(Danone)基本上涉及与上述US2005/0095317A1(Danone)中相同的技术教导内容-然而，在此美国申请中相关的蛋白酶被限定为细菌蛋白酶(凝乳酶来自母牛-即，其不是细菌蛋白酶)。
US7560127B2(DSM)记述了特定的去糖基化酶在乳酪制备中的用途。该去糖基化酶被限定为可以将奶中存在的κ酪蛋白(kappa-酪蛋白)去糖基化的酶。如下面所讨论的-酪蛋白是具有所谓O-连接糖基化的蛋白。因此，在该美国专利中提到的去糖基化酶是可以去糖基化O-连接糖基化蛋白诸如κ-酪蛋白(κ-酪蛋白是一种所谓的O-连接糖蛋白)的酶。
该美国专利在第1栏，51-58行中提到：
“令人惊奇地发现κ-酪蛋白的去糖基化将导致凝固，因为与κ-酪蛋白缔合的糖类携带负电荷，而负电荷稳定酪蛋白微胶粒。奶以此方式的凝固导致这样的过程，其中κ-酪蛋白的较大部分保留在乳酪中并且可以比使用凝乳酶的蛋白水解活性获得更高的产率。”
简言之，可以说此US7560127B2专利基本上记述了通过使用所提到的O-连接相关的去糖基化酶代替凝乳酶，可以为乳酪制备获得所需要的凝固。由于此US7560127B2专利涉及乳酪的制备并且在权利要求1中提到可以在不使用蛋白酶(诸如凝乳酶)的条件下获得乳酪，专业技术人员将隐含地理解O-连接相关的去糖基化酶的使用必定会导致大量的脱水收缩。
在此相关联地注意到US7560127B2涉及乳酪的制备，其中需要大量的脱水收缩。因此，专业技术人员将不会期望将其应用于发酵奶制品如酸奶，其中脱水收缩通常是非常不合乎需要的。
此外，US7560127B2没有明确地提到关于本文的相关的凝胶硬度特性的任何内容-即，可以说其仅明确地涉及归因于使用所述O-连接去糖基化酶代替凝乳酶的凝固/脱水收缩作用。
E.Cases等(JournalofFoodScience；Vol.68，Nr.8，2003，2406-2410页)的文章记述了用O-连接去糖基化酶(神经氨酸苷酶；EC3.2.1.18)对化学酸化奶的去糖基化。
将奶用化学GDL化学酸化(参见第2407页，章节“酸奶凝固”)-因此，在E.Cases等的文章中没有提到用相关微生物接种的″发酵奶″制品(例如酸奶)。
E.Cases等的文章记述了利用O-连接去糖基化酶神经氨酸苷酶(EC3.2.1.18)赋予酶处理的和化学酸化的奶以较高的最终凝胶硬度。
在此相关联地注意到E.Cases等的文章没有提到本文关于使用O-连接去糖基化酶神经氨酸苷酶(EC3.2.1.18)的可能脱水收缩作用的相关性的任何内容。
在E.Cases等的文章中，没有提供所使用的神经氨酸苷酶(EC3.2.1.18)O-连接去糖基化酶制剂的纯度的相关证据。
鉴于此-提出，使用的酶制剂可能已经包含了一些相关的蛋白酶酶活性，并且此蛋白酶酶活性可能是引起所述凝胶硬度效果的原因-如上所述，US2005/0095317A1(Danone)记述了使用蛋白酶可以改善凝胶硬度。
此猜测的相关性进一步得到下述事实的加强：产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)，在E.Cases等的文章中由其获得神经氨酸苷酶的微生物(参见材料和方法部分)已知含有超过140种蛋白水解酶-参见例如权威的Merops肽酶数据库(http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/speccards？sp＝sp000283；type＝peptidase)。
在没有关于所提供的酶制剂的纯度的信息的情况下，这因此似乎是非常合理的，即其未被纯化以排除在E.Cases等的文章中所述的本身可能对凝胶硬度有作用的任何相关蛋白水解酶。
如本领域中已知的-O-连接去糖基化酶神经氨酸苷酶(EC3.2.1.18)也可能具有一些N-连接糖苷酶活性。然而，当在上面讨论的E.Cases等的文章中讨论神经氨酸苷酶的本文相关酶活性时，E.Cases等的文章仅提到了神经氨酸苷酶(EC3.2.1.18)的O-连接糖苷酶活性。
EP1489135A1可以被视为涉及去糖基化橄榄苦苷(获自橄榄叶提取物)用于增加酸化乳清奶和酸奶的凝胶硬度的用途。β-糖苷酶(β-1，6-葡萄糖苷酶)和乳糖酶在该文献中被“简单地”用于去糖基化橄榄苦苷-即，所述酶在此不是用于增加奶/酸奶的凝胶硬度的活性成分。橄榄苦苷不是具有酶活性的蛋白/肽。β-糖苷酶既不是N-连接糖苷酶也不是O-连接糖苷酶。本发明的方法优选地不包括向动物奶底物添加活化的橄榄叶提取物(或其他提取物)，如EP1489135A1中所公开的那样。
发明内容
本发明要解决的问题可视为是提供一种改善/增加相关奶制品-例如发酵奶制品如酸奶-特别是低脂发酵奶制品如低脂酸奶，的凝胶硬度的新方法。
此外-该新方法应当优选地不负面地影响产品的粘度。
该解决方案基于：本发明人已经确定通过使用去糖基化酶(即糖苷酶)，可以得到具有显著提高/改善的凝胶硬度的奶制品(例如酸奶)。此外，本发明人确定本文相关糖苷酶的使用可以以下面的方式完成，其中不存在显著的脱水收缩作用-如上所讨论的，不具有显著的脱水收缩作用例如关于制造发酵奶制品诸如酸奶是巨大的优势。特别地，关于使用O-连接糖苷酶，对于本发明人令人惊讶的是其可以使用而没有显著的脱水收缩作用。本发明人还确定去糖基化酶的使用没有负面地影响产品的粘度。
在本文的实施例4中显示糖苷酶PNGase-F的使用得到具有显著增加/改善的凝胶硬度的低脂酸奶，而对低脂酸奶的粘度没有任何负面的作用。
如本文实施例1中所述-分析了在本文工作实施例中使用的糖苷酶酶制剂并且发现不含污染物-即，它们不包含污染物诸如蛋白酶酶活性。
在此感兴趣的注意到PNGase-F是一种作用于“N-连接聚糖”的糖苷酶-即，去糖基化N-连接糖蛋白。
如上所述-酪蛋白是包含O-连接聚糖的糖蛋白，PNGase-F因此可以本身不对酪蛋白进行去糖基化-因此，PNGase-F赋予本文的有利凝胶硬度的原因不能因此归因于与酪蛋白去糖基化有关的机制，如例如US7560127B2(见上)中所讨论的那样。
总之并且不受限于理论-本发明人证明N-连接糖苷酶如PNGase-F在本发明背景下起作用(即，赋予改善的凝胶硬度)的事实表明关于在乳酪的制备中使用O-连接糖苷酶作为凝乳酶的替代物(见上)，得到本文相关的改善的凝胶硬度后面的基本机制与在US7560127B2中提议的基于“酪蛋白的去糖基化”的机制完全不同。
换句话说，可以说N-连接糖苷酶如PNGase-F在本发明背景下起作用(即，赋予改善的凝胶硬度)的事实可视为就现有技术如例如US7560127B2而言，对于专业技术人员来说是非常令人惊讶的。
不受限于理论-对于使用这样的糖苷酶可以赋予本文相关的改善的凝胶硬度的可能解释是糖苷酶从相关的非酪蛋白乳清蛋白去除聚糖。
例如，N-连接糖苷酶如PNGase-F可以从一些乳清糖蛋白诸如α-乳清蛋白去除N-聚糖，这些乳清糖蛋白已知是N-糖基化的。乳清蛋白在一定程度上也接合在蛋白-网络中，产生凝胶硬度特性。
亲水聚糖的去除和通过脱氨反应施加的电荷变化可以有利于较刚性的蛋白网络的形成并且因此得到改善的凝胶硬度。
不受限于理论-相信一些本文相关的乳清糖蛋白也包含O-连接聚糖。
因此，本发明人测试了O-连接糖苷酶是否也可以赋予本文相关的改善的凝胶硬度。
在本文的实施例5中证明O-连接糖苷酶如GalNAC的使用也可以赋予本文相关的改善的凝胶硬度。
从理论观点的角度来看-人们会相信本文相关的使用N-连接糖苷酶如PNGase-F的优势将是受限的(或没有)不希望的脱水收缩作用，例如，关于制备酸奶制品。
对于此理论观点的一个原因是N-连接糖苷酶如PNGase-F对酪蛋白不起作用并且如例如US7560127B2中所讨论的，对于乳酪制备，可能通过使用所提到的O-连接相关的去糖基化酶(以去糖基化酪蛋白)代替凝乳酶得到所需的凝固(脱水收缩)。
在本文的实施例4中证明关于制备酸奶，N-连接糖苷酶PNGase-F没有产生本文不需要的脱水收缩作用。
本发明人测试了关于例如对于O-连接糖苷酶如GalNAC制备酸奶的本文不需要的脱水收缩作用。
如本文实施例6所示-可以说令本发明人惊讶的是-当O-连接糖苷酶GalNAC用于酸奶制备时关于制备酸奶不存在本文不需要的脱水收缩作用。
在本文的实施例7中-证明糖苷酶(在此PNGase-F)的使用在乳酸菌(LAB)和化学酸化奶两者中均赋予本文相关的改善的凝胶硬度。
不受限于理论，这提示糖苷酶对凝胶硬度的作用是物理效应(即，如上所讨论的乳清蛋白的去糖基化)-而不是生物学效应(即，其中糖苷酶基本上仅影响某些关于LAB本身的功能性的效应)。
在上面讨论的实施例中已经使用了热处理的奶-即在相关热处理后向奶中加入糖苷酶。
不受限于理论-当加入至原料奶(即，未热处理的奶)中接着进行本文相关的热处理时，糖苷酶如例如PNGase-F应该也起作用(即赋予本文相关的凝胶硬度改善)。
因此，本发明的第一个方面涉及一种制备奶制品的方法，其包括下列步骤：
(i)：向奶底物添加N-连接糖苷酶和/或O-连接糖苷酶；和
(ii)任选地酸化(例如，发酵)所述奶底物，和/或任选地进行适当的步骤以得到奶制品，其中所述适当的步骤在其中有效量的所述糖苷酶-由于其存在-增加乳品奶制品凝胶硬度的条件下进行。
奶底物可以选自由以下各项组成的组：来自动物(诸如奶牛、绵羊、母羊、山羊、水牛或骆驼)的奶和植物来源的奶(诸如豆奶、燕麦奶、米奶、杏仁奶)。
第一个方面的实施方案涉及一种制备乳品动物奶制品的方法，其包括以下步骤：
(i)：向动物奶底物添加有效量的N-连接糖苷酶和/或O-连接糖苷酶；和
(ii)：进行适当的步骤以得到乳品动物奶制品，其中所述适当的步骤在其中有效量的所述糖苷酶-由于其存在-增加所述乳品奶制品凝胶硬度的条件下进行；
前提条件是如果所述糖苷酶仅是能够对所述奶中存在的κ-酪蛋白进行去糖基化的O-连接糖苷酶(诸如α-半乳糖苷酶、N-乙酰半乳糖胺酶[GalNAC]和神经氨酸苷酶)，则所述乳品动物奶制品是用相关微生物接种的发酵奶制品(发酵奶制品不是大量去除奶清的奶酪制品)。
第一方面的步骤(ii)中的术语“有效量的糖苷酶-由于其存在-增加所述乳品奶制品的凝胶硬度”可以替代地称为“有效量的糖苷酶-由于其存在-改善所述乳品奶制品的凝胶硬度”。
步骤(ii)中的术语“进行适当的步骤以得到奶制品”应当理解为制备目的奶制品(例如酸奶)的相关适当步骤。
显然，专业技术人员完全知晓此类适当步骤-例如关于制备酸奶的适当步骤包括用合适的乳酸菌(LAB)培养物接种。
测量目的奶制品(例如酸奶)的凝胶硬度对于专业技术人员来说是常规工作。
在本文实施例2中提供了用于测量目的奶制品的凝胶硬度的合适标准方法-优选本文相关的凝胶硬度依照此实施例2的方法测量。
上述A.N.Hassan等(J.DairySci：86：1632-1638；2003)的文章也记述了用于测量凝胶硬度的合适标准方法。
参见例如该文章的材料和方法部分，其中测定了弹性模量和粘弹性模量-如本文实施例2中所见，参数弹性模量和粘弹性模量用于测定凝胶硬度并且从其中可以任选地获得所谓的复数模量，如本文实施例2中所述。
由于测量目的奶制品的凝胶硬度对于专业技术人员来说是容易的，-关于是否“有效量的糖苷酶-由于其存在-改善所述奶制品的凝胶硬度”确定第一方面的方法中的步骤(ii)的要求对于专业技术人员来说当然也是容易的。
为了确定此要求-专业技术人员应简单地在存在和不存在有效量的糖苷酶的条件下执行步骤(ii)中的“适当的步骤以得到奶制品”-并且然后确定存在添加量的糖苷酶的本文相关的凝胶硬度作用。
如果存在改善/增加的凝胶硬度，则已根据第一方面的步骤(i向奶底物添加了有效量的糖苷酶，且步骤(ii)的适当步骤也已经在其中有效量的糖苷酶-由于其存在-改善所述乳品奶制品的凝胶硬度的条件下进行。
如专业技术人员已知的-测量凝胶硬度的不同方法可以得到绝对值不同的结果。然而，关于对如本文讨论的改善的凝胶硬度的测量，基本上测量凝胶硬度的相对改善-即在存在和不存在有效量的糖苷酶的条件下的改善。
如专业技术人员所理解的-测量凝胶硬度的方法，如例如在本文实施例2和A.N.Hassan等的文章中所述，将(在相对微小的测量不确定度范围内)得到相同的相对结果-即不依赖于使用的特定测量方法，关于凝胶硬度的相对改善将得到相同的结果。
第一方面的方法的前提条件可以视作是关于上面讨论的US7560127B2和上面讨论的E.Cases等的文章(JournalofFoodScience；Vol.68，Nr.8，2003，2406-2410页)的免责声明。
如上面所讨论的-在E.Cases等的文章中没有记载用相关微生物接种的″发酵奶″制品(例如酸奶)。
如上面所讨论的-US7560127B2没有明确地提到关于本文的相关的凝胶硬度特性的任何内容-即，可以说其仅涉及归因于使用所述O-连接去糖基化酶代替凝乳酶的凝固/脱水收缩作用。
然而，可以说，在制备乳酪奶制品的过程期间通过向奶底物添加US7560127B2中所述的O-连接去糖基化酶-在理论上可能隐含添加有效量的糖苷酶可能赋予本文相关的改善的凝胶硬度。
所述前提条件涉及这种情况，其中所述糖苷酶仅是O-连接糖苷酶)-US7560127B2没有记载本文关于N-连接糖苷酶的使用相关性的任何内容-因此，如果在第一方面的步骤(i)中添加的有效量的糖苷酶(即，涵盖一种或多种糖苷酶)是N-连接糖苷酶和O-连接糖苷酶的混合物，则其将不是这种情况(其中所述糖苷酶仅是O-连接糖苷酶)。
在本发明的背景下-专业技术人员可以常规地确定奶制品是否是如US7560127B2中所述的乳酪制品或另一种本文相关的奶制品诸如例如发酵奶制品如例如酸奶。
定义
术语“聚糖”指多糖或寡糖。聚糖可以是单糖残基的均聚物或杂聚物，并且可以是直链的或支链的。聚糖也可以用来指糖缀合物诸如糖蛋白、糖脂或蛋白聚糖的碳水化合物部分。
术语“糖蛋白”是含有与多肽侧链共价连接的寡糖链(聚糖)的蛋白。碳水化合物在共翻译或翻译后修饰中与蛋白连接。
术语“糖苷酶”(也成为糖苷水解酶)指催化糖苷连接/键的水解的酶-糖苷键是一类共价键，其将碳水化合物(糖)分子与另一基团连接，所述另一基团可以是或可以不是另一种碳水化合物。部分或完全将N-连接聚糖去糖基化的糖苷酶在本文中可以称为N-连接糖苷酶。同样，部分或完全将O-连接聚糖去糖基化的糖苷酶在本文中可以称为O-连接糖苷酶。
术语N-连接糖苷酶在本领域中是一个公认的术语，并且专业技术人员知晓特定的目的糖苷酶是否是N-连接糖苷酶。
同样，术语O-连接糖苷酶在本领域中是一个公认的术语，并且专业技术人员知晓特定的目的糖苷酶是否是O-连接糖苷酶。
糖苷酶在本文中也可以称为去糖基化酶。
术语“糖基化”是将聚糖与蛋白、脂质或其他有机分子连接的酶促过程。
术语“N-连接聚糖”指与通常天冬酰胺或精氨酸侧链的氮连接的聚糖。
术语“O-连接聚糖”指与通常丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、羟赖氨酸、或羟脯氨酸侧链的羟基氧连接，或与脂质诸如神经酰胺上的氧连接的聚糖。
术语″乳酸菌″表示革兰氏阳性、微需氧或厌氧的细菌，其发酵糖类产生酸类包括乳酸作为主要产生的酸、乙酸和丙酸。工业上最有用的乳酸菌存在于目“乳杆菌目(Lactobacillales)”内，该目包括乳球菌属某些种(Lactococcusspp.)、链球菌属某些种(Streptococcusspp.)、乳杆菌属某些种(Lactobacillusspp.)、明串珠菌属某些种(Leuconostocspp.)、假明串珠菌属某些种(Pseudoleuconostocspp.)、片球菌属某些种(Pediococcusspp.)、短杆菌属某些种(Brevibacteriumspp.)、肠球菌属某些种(Enterococcusspp.)和丙酸杆菌属某些种(Propionibacteriumspp.)。另外，属于严格厌氧菌，双歧杆菌属，即，双歧杆菌属某些种的群的产乳酸菌通常包括在乳酸菌的群中。这些经常单独或与其他乳酸菌组合用作食品培养物。
术语“奶底物”可以是任何未经加工和/或经加工的奶原料，其可以经历根据本发明的方法的酶处理(和可能的发酵)。因此，有用的奶底物包括，但不限于，任何奶或奶样制品的溶液/混悬液，所述奶样制品包含蛋白，诸如全脂或低脂奶、脱脂奶、酪乳、复配奶粉、炼乳、奶粉、乳清、乳清渗透物、乳糖、来自乳糖结晶的母液、乳清蛋白浓缩物或奶油。显而易见的，所述奶底物可以源自任何动物(哺乳动物)或非动物来源，例如，为基本上纯的奶、或复配奶粉。优选地，奶底物中至少部分蛋白是奶中天然存在的蛋白，诸如酪蛋白或乳清蛋白。然而，所述蛋白的一部分可以是在奶中非天然存在的蛋白。在发酵前，奶底物可以依照本领域中已知的方法被匀浆化处理和巴氏消毒。
术语“奶″要被理解为通过对任何哺乳动物(诸如母牛、绵羊、母羊、山羊、水牛或骆驼)挤奶获得的乳状分泌物。在优选的实施方案中，奶是母牛的奶。术语奶也包括非动物或植物来源的“奶”(例如，来自蔬菜或谷类来源)，诸如豆奶、燕麦(oak)奶、米奶、杏仁奶。其他来源为棉花、小麦、麦芽、玉米、马铃薯、豆、羽扇豆和高粱。任选地奶被酸化，例如通过添加酸(诸如柠檬酸、乙酸或乳酸)，或与例如水混合。奶可以是未经加工或经加工的，例如通过过滤、灭菌、巴氏消毒、匀浆化处理等，或其可以是复配的奶粉。根据本发明“牛奶”的重要实例是经巴氏消毒的牛奶。要理解，奶可以在用细菌接种之前、期间和/或之后被酸化，用糖苷酶处理，混合或加工。
在本发明的背景下，术语乳制品(dairyproduct)是通过用N或O连接的葡萄糖苷酶处理奶底物制备的产品，任选地所述产品也是发酵的或酸化的。该术语包括发酵奶制品(其可以是可饮用的、搅拌的或凝固的)和乳酪。
“匀浆化处理”当在本文中使用时是指充分混合以获得可溶的混悬液或乳液。如果匀浆化处理在发酵前进行，则其可以进行以便将乳脂破碎成较小的尺寸使得其不再与奶分离。这可以通过在高压下迫使奶通过小孔口来实现。
在本发明的方法中“发酵”是指通过微生物的作用将碳水化合物转变成醇类或酸类。优选地，本发明的方法中的发酵包括乳糖转变成乳酸。
乳酸菌，包括乳杆菌某个种和嗜热链球菌的细菌，通常作为用于生产发酵剂扩大培养(bulkstarterpropagation)的冷冻或冻干培养物或作为所谓的“直投式发酵剂(DirectVatSet)”(DVS)培养物供应至乳品工业，期望用于直接接种至发酵容器或缸用于生产乳制品(诸如发酵奶制品)。此类培养物通常称为“发酵剂培养物”或“发酵剂”。
任选地，发酵奶底物可以经历热处理以灭活微生物。
用于生产发酵奶制品的发酵工艺是公知的，并且本领域技术人员会知晓如何选择合适的工艺条件，诸如温度、氧、微生物的量和特性以及加工时间。显而易见的是，选择发酵条件从而支持实现本发明，即，获得发酵奶制品。
在本发明的背景下，酸乳酪发酵剂培养物优选是包含至少一种乳杆菌属菌株(例如，保加利亚乳杆菌菌株)和至少一种嗜热链球菌菌株的细菌培养物。根据本发明，酸奶是可通过用乳杆菌属菌株和嗜热链球菌菌株接种和发酵奶获得的发酵奶制品。
术语“可勺的(spoonable)”应当被理解为使用勺进食。术语“可勺取型奶制品(spoonablemilkproduct)”包括搅拌产品。术语″搅拌型产品″具体指在发酵后接受机械处理，导致在发酵阶段时形成的凝结物破坏和液化的发酵奶制品。机械处理典型地但不唯一地通过将凝胶搅拌、泵送、过滤或匀浆，或通过将凝胶与其他成分混合而获得。
术语“凝固型产品(set-typeproduct)”包括基于已经用发酵剂培养物(例如起子培养物)接种并且在接种步骤后被包装然后在包装中发酵的奶的产品。
术语“饮用型产品(drinkableproduct)”包括饮料诸如“饮用酸奶”和类似物。术语“饮用酸奶”典型地涵盖通过乳杆菌属的种和嗜热链球菌的组合通过发酵制备的奶制品。饮用酸乳酪典型地具有8％以上的奶非脂固形物含量。此外，用于饮用酸奶饮品的活菌计数典型地为至少10E6细胞形成单位(CFU)/ml。
具体实施方式
乳品动物奶制品(Dairyanimalmilkproduct)
一般来说-本文优选的奶制品，包括乳品动物奶制品(即，基于动物奶的产品)的pH是pH3至pH6.5的pH-更优选pH3.5至pH5.75。
如专业技术人员已知的-可以通过例如，用合适的乳酸菌培养物发酵得到奶制品的相关pH。
然而，如专业技术人员已知的，可以简单地添加合适的酸(诸如乳酸)以获得要求的pH。
备选的，可以添加内酯(例如，GDL内酯)以得到要求的pH或使用其他合适的已知方法(例如，酶促方法或采用二氧化碳的加压曝气(pressureatiation))以得到要求的pH。
如上面所讨论的-对于所谓的低脂奶制品，如本文所述的使用糖苷酶改善凝胶硬度可以是特别有用的。
因此，在优选的实施方案中，在第一方面的方法的步骤(i)中使用的奶底物是具有低脂肪含量的奶底物-即脂肪含量小于3.5％脂肪，更优选脂肪含量小于1.5％且甚至更优选脂肪含量小于0.75％。
如上面所讨论的-如所述的使用糖苷酶改善凝胶硬度的优势可以是不需要增加例如低脂奶制品的蛋白含量从而得到充分足够的凝胶硬度，并且由此进一步使最终低脂奶制品(例如，低脂酸奶)的总热/能含量最小化。
因此，在优选的实施方案中，最终奶制品(例如酸奶)的总热/能含量小于150千卡/100g奶制品，更优选最终奶制品(例如酸奶)的总热/能含量小于100千卡/100g奶制品。
如已知的-对于专业技术人员来说确定目的奶制品的热量(caloriescontent)是常规工作。
奶制品的合适实例是发酵奶制品或乳酪。
在优选的实施方案中，奶制品是发酵奶制品。
在优选的实施方案中-发酵奶制品是选自由下列各项组成的组的至少一种发酵奶制品：酸奶、交替培养酸奶(alternatecultureyogurt)、酪乳(buttermilk)、嗜酸乳(acidophilusmilk)、酸乳酒(kefir)、乳酒(kumys)和夸克奶酪(quark)。最优选地，发酵奶制品是酸奶。
在本发明的背景下-术语″酸奶″和″发酵奶″具有它们普遍的含义。在US2005/0095316A1和US2005/0095317A1(两者申请人均为Danone)中，这些术语根据法国相关的官方法令/规章进行定义-下面基本上提及这些术语的相同的标准已知定义。
如专业技术人员已知的-为获得″酸奶或发酵奶″制品，特别地想到必须不能显著地去除乳清并且必须具有至少与巴氏消毒法等效的热处理。
用于制备发酵奶制品诸如例如酸奶的合适的相关热处理是，例如，85-98℃热处理15秒至30分钟。
因为应用至少与标准巴氏消毒法等效的热处理，奶底物的乳清蛋白或多或少被变性(大概它们的25-99％)。
如对专业技术人员显然的-由于对于酸奶或发酵奶制品“必须不能显著地去除乳清”-酸奶或发酵奶制品不是如US7560127B2(见上)中所述的乳酪制品。
术语″发酵奶″涉及用脱脂奶或全脂奶、或脱脂的或全脂的炼乳或奶粉(其富含或不富含奶成分)制备的乳制品，其已经经历至少与巴氏消毒法等效的热处理，用属于为每种产品特征的种的微生物接种。
在销售给消费者的时候它们所含有的游离乳酸的量应当优选不小于0.6克/100克。
发酵奶应当优选地在能够防止它们变质的温度下保持到销售给消费者的时候。
术语″酸奶″表示根据合理和传统惯例，优选地通过仅开发特定嗜热乳酸菌诸如例如德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)而获得的发酵奶，所述特定嗜热乳酸菌优选地应当以优选至少1000万个细菌/克(以含奶部分计)的比率同时接种并且优选地在最终产品中是活的。
发酵奶制品通常通过以下获得：
(A)：将105-1013cfu/ml(优选106-1011cfu/ml)乳酸菌(LAB)培养物接种至动物奶底物；和
(B)：在10℃-55℃的温度发酵奶底物2-120小时。
如专业技术人员已知的-乳酸菌的合适物种包括双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)(诸如德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)或瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus))、链球菌属(Streptococcus)(诸如嗜热链球菌)、乳球菌属(Lactococcus)(诸如乳酸乳球菌(Lactococcuslactis))、明串珠菌属(Leuconostoc)(诸如乳明串珠菌(Leuconostoclactis)、肠系膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides))。
当奶底物用由德氏乳杆菌保加利亚亚种的菌株和嗜热链球菌的菌株构成的发酵剂接种时，产品通常被理解为是酸奶。
如本领域中已知的-术语“交替培养酸奶”是指通过使用嗜热链球菌和乳杆菌属任意种的培养物制备的发酵奶制品。
如本领域中已知的-术语“嗜酸乳”是指通过使用嗜酸乳杆菌的培养物制备的发酵奶制品。
如本领域中已知的-术语“酸乳酒”是指通过使用由以强烈的特定关系生长的酸乳酒曲、开菲尔乳杆菌(Lactobacilluskefiri)、明串珠菌属的种、乳球菌属的种和醋杆菌属的种制备的发酵剂培养物制备的发酵奶制品。酸乳酒曲构成乳糖发酵酵母(***克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus))和非乳糖发酵酵母(单孢酵母(Saccharomycesunisporus)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和少孢酵母(Saccharomycesexiguus))两者。
如本领域中已知的-术语“乳酒”是指通过使用德氏乳杆菌保加利亚亚种和***克鲁维酵母的培养物制备的发酵奶制品。
在优选的实施方案中-奶制品是酸奶，其中酸奶通过用包含能够合成胞外多糖(EPS)的德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌的酸奶乳酸菌培养物接种来制备-如果酸奶是低脂酸奶，即其中在第一方面的方法的步骤(i)中使用的奶底物是具有低脂肪含量的奶底物-即，具有小于3.5％脂肪的脂肪含量，更优选具有小于1.5％的脂肪含量和甚至更优选具有小于0.75％的脂肪含量，则此优选实施方案可以是特别相关的。
如上面所讨论的-现有技术记述了许多产生EPS的此类嗜热链球菌菌株-参见例如WO2007/095958A1(Chr.HansenA/S)。
因此，专业技术人员可以常规地鉴定多种此类产生EPS的菌株，并且也可以常规地鉴定特定的目的菌株是否能够合成EPS。
本文可能相关的理论商业情节的实例可以是一家公司通过使用如本文所述的糖苷酶制备浓缩奶/奶粉，然后将此浓缩奶/奶粉销售给例如酸奶生产商，该酸奶生产商在其酸奶生产中利用其得到具有改善/增加的凝胶硬度的酸奶-即，他们可以得到改善的凝胶硬度而在这样的酸奶生产期间无需额外添加任何这样的糖苷酶。
如专业技术人员所理解的-这样的理论商业事件将是在如本文所讨论的第一方面的方法的范围内的一个方法实例。浓缩奶/奶粉可以视作是第一方面的方法的乳品动物奶制品的一个实例。此外，在本发明的背景下如专业技术人员所理解的-最终的酸奶由于之前向奶中添加糖苷酶而具有改善/增加的凝胶硬度-即，酸奶生产商也进行在如本文所讨论的第一方面的方法的范围内的行动。
糖苷酶
如上面所讨论的-术语“糖苷酶”(也称为糖苷水解酶)是指催化糖苷连接/键的水解的酶-糖苷键是一类共价键，其将碳水化合物(糖)分子与另一基团连接，所述另一基团可以是或可以不是另一种碳水化合物。
如上所述-在本文中糖苷酶也可以称为去糖基化酶。
糖苷酶可以是天然糖苷酶或其可以是天然糖苷酶的变异体/突变体-如专业技术人员已知的，可以制备目的酶(在此，糖苷酶)的突变变异体从而例如改善该酶的稳定性同时保持酶的关键酶活性(在此糖苷酶活性)。
为了例如获得最小程度的不需要的脱水收缩(特别是如果奶制品是发酵奶制品诸如酸奶)-可以优选所述糖苷酶是N-连接糖苷酶。
如上面所讨论的，术语N-连接糖苷酶是在本领域中公认的术语，并且专业技术人员知晓特定的目的糖苷酶是否是N-连接糖苷酶。
此外现有技术记述了许多不同的本文中适合的N-连接糖苷酶。
本文中合适的N-连接糖苷酶的实例可以是选自由下列各项组成的组的至少一种糖苷酶：肽-N(4)-(N-乙酰基-β-葡萄糖胺基)天冬酰胺酰胺酶(EC编号：3.5.1.52；别称：N-糖苷酶-F或PNGase-F)和内-β-N-乙酰基葡萄糖胺糖苷酶H(EC编号：3.2.1.96；别称：ENDO-H)。
上面刚提到的N-连接糖苷酶在本发明的背景下可以描述为具有N-连接糖苷酶活性并且没有本文提到的显著的O-连接糖苷酶活性的糖苷酶。
因此，在本文中可以优选所述N-连接糖苷酶是不具有本文相关的O-连接糖苷酶活性(诸如没有O-连接糖苷酶活性)的N-连接糖苷酶。
在所述方法中使用的N-糖苷酶-F，也称为PNGase-F，是天冬酰胺酰胺酶(EC3.5.1.52)，其可以源自脑膜炎败血黄杆菌(Flavobacteriummesingosepticum)。其催化从糖蛋白完全和完整地裂解N-连接寡糖。其可以名称PNGase-F从NewEnglandBiolabsInc.作为市售产品得到或在类似大肠杆菌的菌株中重组制备，如我们已经使用在本文实施例1中所述的质粒和方法所完成。
内-β-N-乙酰基葡萄糖胺糖苷酶H(EC3.2.1.96)，也称为ENDO-H，可以源自褶皱链霉菌(Streptomycesplicatus)。ENDO-H催化N-连接糖基化的两个N-乙酰基葡萄糖胺之间的糖苷键的水解。其可以名称ENDO-H从NewEnglandBiolabsInc.作为市售产品得到。
本文合适的O-连接糖苷酶的实例可以是选自由下列各项组成的组的至少一种糖苷酶：α-N-乙酰基-半乳糖胺酶(EC编号：3.2.1.49；别称：GalNAC)；α-半乳糖苷酶(EC编号：3.2.1.22)；和神经氨酸苷酶(EC编号：3.2.1.18)。
GalNAC是高度特异的外切糖苷酶，其催化α-连接的D-N-乙酰基-半乳糖胺残基从的水解。其可以作为NewEnglandBiolabsInc的市售产品得到。
如上面所讨论的，术语O-连接糖苷酶是在本领域中公认的术语，并且专业技术人员知晓特定的目的糖苷酶是否是O-连接糖苷酶。
此外现有技术记述了许多不同的本文中适合的O-连接糖苷酶。
糖苷酶的有效量/活性在本文中根据本领域技术确定。
根据现有技术-对于N-连接糖苷酶(诸如例如PNGase-F和ENDO-H)，一个活性单位定义为在1h内在37℃以10μl的总反应体积从10μg变性RNase-B去除＞95％碳水化合物所需的酶量。
对于GalNAC(一种O-连接糖苷酶)，一个活性单位定义为在1h内在37℃以10μl的总反应体积从1nmol(GalNAcα1-3)(Fucα1-2)Galα1-4Glc-7-氨基-4-甲基-香豆素(AMC)裂解＞95％的末端αα-D-N-乙酰基-葡萄糖胺所需的酶量。
许多本文相关的糖苷酶可从公司NewEnglandBiolabs商购-也可以参考产品目录NewEnglandBiolabs(如例如可在它们的网页上在线获得)以获得关于本文相关的糖苷酶活性单位的特定标准定义的进一步细节。
第一方面的方法的步骤(i)
本文所述的第一方面的方法的步骤(i)提到：“(i)：向动物奶底物添加有效量的N-连接糖苷酶和/或O-连接糖苷酶”。
在本发明的背景下如专业技术人员所理解的-N-连接糖苷酶和/或O-连接糖苷酶通常作为基本上纯的糖苷酶组合物添加至动物奶底物-例如一种糖苷酶组合物，其中糖苷酶活性占这样的糖苷酶组合物的总酶活性的至少5％。
其可以是一种糖苷酶组合物，其中糖苷酶活性占糖苷酶组合物的总酶活性的至少25％或一种糖苷酶组合物，其中糖苷酶活性占糖苷酶组合物的总酶活性的至少50％或这样的糖苷酶组合物。
许多情况下都将优选这种基本上纯的糖苷酶组合物是一种糖苷酶组合物，其中糖苷酶活性占糖苷酶组合物的总酶活性的至少90％。
有效量的糖苷酶可以是一种特定类型的糖苷酶(例如PNGase-F)或是本文相关的糖苷酶的混合物(例如两种不同的N-连接糖苷酶或一种N-连接糖苷酶和一种O-连接糖苷酶)。
当本文提到可以优选在第一方面的方法的步骤(i)中添加的糖苷酶是N-连接糖苷酶时，其当然意味着在步骤(i)中必须添加有效量的N-连接糖苷酶并且此N-连接糖苷酶-由于其存在-改善乳品奶制品的凝胶硬度。
然而，当提及优选N-连接糖苷酶时，其当然不意味着在步骤(i)中必须不添加任何O-连接糖苷酶。
当本文中提及优选O-连接糖苷酶时这同样适用-即，在步骤(i)中必须添加O-连接糖苷酶-但也可以添加N-连接糖苷酶。
相反且对于专业技术人员显然的-当本文中提及糖苷酶仅是O-连接糖苷酶时，则在第一方面的步骤(i)中必须不添加N-连接糖苷酶。当本文中提及糖苷酶仅是N-连接糖苷酶时这同样适用，则在第一方面的步骤(i)中必须不添加O-连接糖苷酶。
如本领域中已知的-乳品奶制品通常进行热处理。如本领域中已知的-热处理通常使用低于沸点的温度，因为在非常高的温度下，酪蛋白微胶粒会不可逆地聚集(或″凝结″)。
在本发明的背景下-术语“巴氏消毒的”就巴氏消毒的乳品动物奶制品而言涉及标准巴氏消毒步骤(即，包括对奶适当的热处理)。在本发明的背景下-显然专业技术人员知晓特定的目的奶制品是否是巴氏消毒的乳品动物奶制品。
如专业技术人员所理解的-标准巴氏消毒步骤可以是约71-72℃热处理约15-20秒。
如上面所讨论的-为获得″酸奶或发酵奶″制品，特别地要记住必须不能大量地去除奶清并且必须进行至少与巴氏消毒法等效的热处理。
用于制备发酵奶制品诸如例如酸奶的合适的相关热处理是，例如，从85至98℃热处理15秒至30分钟。
取决于使用的热处理的类型-热处理可以例如是通过使用65-150℃的温度热处理奶不足1秒至30分钟。
如上面所讨论的-当奶制品是发酵奶制品诸如例如酸奶时，必须具有至少与巴氏消毒法等效的热处理。
在步骤(i)中糖苷酶可以在热处理步骤之前或之后添加-所述热处理步骤即，通过使用65-150℃的温度热处理奶不足1秒至30分钟。
在一些情况下，可以优选将糖苷酶加入至已经热处理过的奶。
如上面所讨论的-当奶制品是发酵奶制品时，用相关的乳酸菌(LAB)培养物接种奶底物并且发酵。
当奶制品是发酵奶制品时-糖苷酶可以在用乳酸菌(LAB)培养物接种奶底物之前、一起或之后添加。
通常关于奶制品-可以优选糖苷酶在奶底物的pH达到pH6以下之前添加。
关于发酵奶制品-优选糖苷酶在相关乳酸菌发酵过程已经结束之前添加-即优选在奶底物的pH达到pH6以下之前。
本文相信添加10个活性单位/ml奶至1000个活性单位/ml奶的糖苷酶足以得到本文相关的有效量的糖苷酶-即足以得到本文相关的改善的凝胶硬度。
如果适用于特定目的-可以添加更多的糖苷酶，例如至多达20000个活性单位/ml奶的糖苷酶。
如上面所讨论的-糖苷酶的有效量/活性在本文中根据本领域技术确定。
第一方面的方法的步骤(ii)
本文所述的第一方面的方法的步骤(ii)提及：“(ii)：进行适当的(一个或多个)步骤以得到乳品动物奶制品，其中所述适当的(一个或多个)步骤在其中有效量的所述糖苷酶-由于其存在-改善所述乳品奶制品的凝胶硬度的条件下进行”。
如上面所讨论的-进行适当的(一个或多个)步骤以得到目的乳品动物奶制品对于专业技术人员来说是常规工作-例如如果奶制品是例如酸奶，则专业技术人员当然知晓得到目的酸奶的适当步骤。
关于其中有效量的糖苷酶赋予乳品奶制品以改善的凝胶硬度的条件-显然，这些条件应当是其中这样的糖苷酶在足够的时间段期间有活性的条件。
如在本文实施例中所示-本发明人已经确定许多不同的糖苷酶在正常适当条件(例如温度、pH等)期间具有适当的活性用于制备本文相关的奶制品诸如酸奶。
简言之且如专业技术人员所理解的-得到优选的本文相关的糖苷酶活性的优选条件将取决于使用的特定的一种或多种糖苷酶(例如PNGase-F)和要制备的特定奶制品(例如酸奶)。
在本发明的背景下-对于糖苷酶，得到本文相关的改善的凝胶硬度的合适反应条件的实例可以是：
-10-50℃的温度(诸如20-40℃)；
-pH3-pH9的pH(诸如pH4-pH7.5，从3至7或从3至6.5)；
-10分钟至120小时的时间段(诸如1小时至120小时，或0.5至5小时)
在优选的实施方案中，在步骤(ii)中糖苷酶的存在赋予乳品奶制品以1.25倍改善的凝胶硬度；更优选赋予乳品奶制品以1.50倍改善的凝胶硬度和甚至更优选在步骤(ii)中糖苷酶的存在赋予乳品奶制品以1.7倍改善的凝胶硬度。
如上面所讨论的-本发明人确定糖苷酶的使用没有负面地影响最终奶制品的粘度。
因此，在优选的实施方案中-步骤(ii)在其中有效量的所述糖苷酶-由于其存在-对所述乳品奶制品的粘度没有负面影响的条件下进行。
对于专业技术人员来说测量目的奶制品(例如酸奶)的粘度是常规工作。
在本文的实施例2中提供了一种测量目的奶制品粘度的合适标准方法-优选本文相关的粘度依照此实施例2的方法测量。
上面讨论的A.N.Hassan等(J.DairySci：86：1632-1638；2003)的文章还记述了测量粘度的合适标准方法。
参见例如该文章的材料和方法部分和图1，其中测定了剪应力-如本文实施例2中所见，使用参数剪应力作为粘度的量度。
由于对于专业技术人员来说测量目的奶制品的粘度是很容易的-对于专业技术人员来说当然也容易确定涉及是否“步骤(ii)在其中有效量的所述糖苷酶-由于其存在-对所述乳品奶制品的粘度没有负面影响的条件下进行”的第一方面的方法的步骤(ii)的优选实施方案。
为了确定此要求-专业技术人员应简单地在存在和不存在有效量的糖苷酶的条件下执行步骤(ii)中的“适当的步骤以得到奶制品”-并且然后确定添加量的糖苷酶的存在的本文相关的粘度作用。
如在本文实施例中所见-通过使用如本文所述的糖苷酶实际上可以获得改善的粘度。
因此，在优选的实施方案中，在步骤(ii)中糖苷酶的存在赋予乳品奶制品以1.10倍增加的粘度；更优选赋予乳品奶制品以1.20倍增加的粘度。
如专业技术人员所理解的-测量粘度的方法，如例如在本文实施例2和A.N.Hassan等的文章中所述的方法，将(在相对微小的测量不确定度范围内)得到相同的相对结果-即不依赖于使用的方法，关于粘度的相对改善将得到相同的结果。
如上面所讨论的-在本文实施例中证明就制备酸奶而言，N-连接糖苷酶和O-连接糖苷酶两者都不产生本文不希望的脱水收缩作用。
因此，在优选的实施方案中，步骤(ii)在其中有效量的所述糖苷酶-由于其存在-不增加乳品奶制品的脱水收缩作用的条件下进行。
当乳品奶制品是发酵奶制品诸如例如酸奶时，这-不增加脱水收缩作用-是特别相关的。
对于专业技术人员来说测量目的奶制品(例如酸奶)的脱水收缩作用是常规工作。
在本文的实施例3中提供了用于测量目的奶制品的脱水收缩的合适标准方法-优选根据此实施例3的方法测量本文相关脱水收缩。
基本上，实施例3的测量脱水收缩作用的标准方法基于目的奶制品的适宜相关储存和对所述目的奶制品的上部乳清量的测量。
由于对于专业技术人员来说容易测量目的奶制品的脱水收缩-对于专业技术人员来说当然也容易确定涉及是否“步骤(ii)在其中有效量的所述糖苷酶-由于其存在-不增加所述乳品奶制品的脱水收缩的条件下进行”的第一方面的方法的步骤(ii)的优选实施方案。
为了确定此要求-专业技术人员应简单地在存在和不存在有效量的糖苷酶的条件下执行步骤(ii)中的“适当的步骤以得到奶制品”-并且然后确定添加量的糖苷酶的存在的本文相关的脱水收缩作用。
此外，本发明涉及用于制备奶制品的方法，所述方法包括：
a)提供奶底物；
b)用具有N-连接糖苷酶活性的酶处理所述奶底物；以及
c)任选地用微生物，诸如乳酸菌发酵所述奶底物。
在一个令人感兴趣的实施方案中，步骤b)在步骤c)之前或期间进行。
如上面所讨论的，所述奶底物可来源于任何动物或非动物来源。
所述奶制品优选在基本上或完全不添加任何增稠剂和/或稳定剂，诸如果胶、明胶、淀粉、改性淀粉、角叉菜胶、藻酸盐和瓜尔胶的条件下制备。
在一个令人感兴趣的实施方案中，所述微生物是乳酸菌和/或产生多糖诸如胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)的微生物。
所述微生物可以是乳酸菌，并且优选地属于选自由下列各项组成的组的物种：嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.Bulgaricus)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcuslactissubsp.Cremoris)、肠膜明串珠菌乳脂亚种(Leuconostocmesenteroidessubsp.Cremoris)、假肠膜明串珠菌乳脂亚种(Pseudoleuconostocmesenteroidessubsp.Cremoris)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种(Lactococcuslactissubsp.lactisbiovar.diacetylactis)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacilluscaseisubsp.Casei)、类干酪乳杆菌类干酪亚种(Lactobacillusparacaseisubsp.Paracasei)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)。
本发明的任何方法的令人感兴趣的实施方案为：
-其中奶底物在酸化前经历巴氏消毒，并且在巴氏消毒之前进行酶处理的方法；
-其中奶底物在用具有N-连接糖苷酶活性的酶处理之前经历热处理的方法；
-其中奶制品选自由下列各项组成的组的方法：凝固型发酵奶制品、饮用型发酵奶制品和可勺取型发酵奶制品；
-其中奶制品具有小于8％的奶非脂固形物含量的方法；
-其中奶制品具有小于2％的脂肪含量的方法；
-其中奶制品具有小于0.5％的脂肪含量的方法；
-其中奶制品被包装的方法(即，所述方法包括进行包装)；和/或
-其中糖苷酶选自由下列各项组成的组的方法：α-N-乙酰基-半乳糖胺酶；GalNAC)；α-半乳糖苷酶；神经氨酸苷酶；肽-N(4)-(N-乙酰基-β-葡萄糖胺基)天冬酰胺酰胺酶；N-糖苷酶-F；PNGase-F；内-β-N-乙酰基葡萄糖胺糖苷酶H；ENDO-H和归类于EC3.2.1.49、EC3.2.1.18、EC3.2.1.22、EC3.5.1.52或EC3.2.1.96的任何酶。
在本发明的背景下，术语在合适的包装中“包装”(合适量的)产品涉及产品的最终包装以获得可分配形式的产品使得该产品可以被例如人或一群人摄入。因此合适的包装可以是瓶子、容器、包装或类似物，并且合适量可以是例如10ml至5000ml，但目前优选的是在包装中的量为50ml至1000ml。这种包装的产品是本发明的一部分。
在进一步的方面，本发明还涉及可通过本发明的方法获得的奶制品。
还在进一步的方面，本发明涉及可通过下面的方法获得的奶制品，该方法包括向奶底物添加N-连接糖苷酶和/或O-连接糖苷酶。该糖苷酶应当以“有效量”添加以得到所需的凝胶刚度。
本发明的奶制品可以在用所述糖苷酶处理之前和/或期间和/或之后已经通过用乳酸菌培养物接种而被发酵。
所述奶制品可以被包装在，例如容积在10-5000ml范围内的密封容器中，诸如在具有25ml-1500ml的容积或50ml-1000ml的容积的容器中。
在进一步的方面，本发明涉及N-连接葡萄糖苷酶在用于制备奶制品，诸如发酵奶制品(例如酸乳酪)或乳酪(例如新鲜乳酪、清爽干酪、夸克奶酪等)的方法中的用途。
此外，本发明涉及N-连接葡萄糖苷酶在用于改善奶制品，诸如发酵奶制品(例如酸乳酪)或乳酪(例如新鲜乳酪、清爽干酪、夸克奶酪等)的质地(诸如凝胶硬度或刚度)的方法中的用途。
在目前优选的实施方案中，本发明涉及具有N-连接和/或O-连接糖苷酶活性的酶用于改善奶制品诸如酸乳酪的口感的用途。
所述用途可以包括所述奶制品使用产生多糖诸如胞外多糖(EPS)的乳酸菌制备。
术语“一个”、“一”和“所述”以及类似指示对象的使用在描述本发明的背景下(特别是在下面权利要求的背景下)要解释为涵盖单数和复数形式，除非本文中以其他方式指明或上下文明显相悖。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”要理解为开放式术语(即，意指“包括，但不限于”)除非另外注明。本文中对数值范围的述及仅仅意在用作个别地提及落在该范围内的每个单独数值的简略法，除非本文中以其他方式指明，并且每个单独数值并入说明书中如同其在本文中被个别地述及一样。本文所述的所有方法可以以任何合适的次序执行，除非本文以其他的方式指明或否则上下文明显相悖。本文提供的任一个和所有实施例，或示例性表述(例如，“诸如”)的使用仅意在更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围施加任何限制，除非以其他方式声明。说明书中的表述不应被理解为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实施是必不可少的。
实施例
实施例1：糖苷酶
在如本文所述的方法中使用的糖苷酶的实例是天冬酰胺酰胺酶、乙酰基葡萄糖胺糖苷酶或半乳糖胺酶。
在所述方法中使用的N-糖苷酶-F，也称为PNGase-F，是天冬酰胺酰胺酶(EC3.5.1.52)，其可以源自脑膜炎败血黄杆菌。其催化从糖蛋白完全和完整地裂解N-连接寡糖。其可以名称PNGase-F从NewEnglandBiolabsInc.作为市售产品得到或在类似大肠杆菌的菌株中重组制备，如我们已经使用在Loo等(ProteinExpressionandPurification24，90-98，2002)中所述的质粒和方法所完成。
内-β-N-乙酰基葡萄糖胺糖苷酶H(EC3.2.1.96)，也称为ENDO-H，可以源自褶皱链霉菌(Streptomycesplicatus)。ENDO-H催化N-连接糖基化的两个N-乙酰基葡萄糖胺之间的糖苷键的水解。其可以名称ENDO-H从NewEnglandBiolabsInc.作为市售产品得到。
α-N-乙酰基-半乳糖胺酶(EC3.2.1.49)是高度特异的外切糖苷酶，其催化α-连接的D-N-乙酰基-半乳糖胺残基从苏氨酸或丝氨酸的水解。其可以名称α-N-乙酰基-半乳糖胺从NewEnglandBiolabsInc.作为市售产品得到。
对于内部制备的PNGase-F，我们已经使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后使用考马斯亮蓝(CBB)染色确认了高等级(＞95％)纯度。为了进一步确认纯度，通过SDS-PAGE并使用银染色分离汇集的酶。下一步出现的条带通过质谱分析进行分析，其确认了PNGase-F的存在并且仅有PNGase-F存在。
在使用牛-κ-酪蛋白(Sigma-Aldrich)作为底物的蛋白水解测定中评价内部纯化的PNGase-F的潜在的a-特异性蛋白水解活性。在此测定中我们测试了在模拟酸奶发酵中发生的天然pH下降的不同pH值下的蛋白水解活性。为了挑战该***，我们利用了比在本发明的方法中高20倍的酶浓度，并且在各个pH值下孵育4小时。在这些条件下，我们没有发现a-特异性蛋白水解活性的任何证据。
结论：
基于上述的结果-显然所谓的内部制备的PNGase-F不含污染物。
上述的另一种市售糖苷酶如供应商所述也不含污染物。
实施例2：测量凝胶硬度和粘度的方法
通过使用具有自动样品更换器的AntonPaar流变仪(PhysicaDSRRheometer+ASC)测量凝胶硬度。将测量锤(measuringbob)置于含有20ml样品的测量杯中，该样品已经手动搅拌过，并且加热至13℃。在锤已经置于样品中后，等待一段时间。接下来，通过振荡测量凝胶硬度。在此，将应变保持恒定于0.3％，并且频率从0.5Hz增加至30Hz。从测量值可以计算弹性模量(G’)和粘性模量(G”)，并且从它们获得复数模量(G*)：
G * G ′ 2 + G ′ ′ 2
在1Hz的G*用作凝胶硬度的量度并用于不同样品的比较。
使用相同的设备(AntonPaar流变仪)，通过将剪切率从0.27071/s增加至3001/s，以每10s一个测量点(剪应力)测量粘度。然后将剪切率从2751/s降低至0.27071/s，以每10s一个测量点。然后使用在3001/s时的剪切率作为产品的粘度的量度。
结论：
基于上面测量凝胶硬度和粘度的标准方法-对于专业技术人员来说确定根据如本文所述的制备乳品动物奶制品的方法通过添加糖苷酶是否存在对目的乳品奶制品的凝胶硬度和/或粘度的改善是常规工作。
实施例3：测量脱水收缩的方法
在本发明中使用了两种不同的用于测量脱水收缩量的方法：
方法1：将50ml酸奶(如在实施例4中制备)放入Eppendorf试管中，并置于冷保藏(5℃)14天，之后用尺子测量酸奶上部的乳清量(以mm剂)。
如专业技术人员所显而易见的-也可以通过保存目的奶制品并测量该目的奶制品上部的乳清量来测量不同于酸奶的另一种奶制品的脱水收缩作用。
方法2：脱脂奶用2％脱脂奶粉(SMP，生产商？)加强并置于冰箱中过夜。将批料在90℃热处理20分钟。将75ml奶溶液以及0.02％Advance2.0酸奶培养物(可以获自Chr.HansenA/S，丹麦)和酶(PNGase或GalNAC)一起倒入100ml容量瓶中。记录奶、培养物和酶的总重量。将溶液加热至43℃并发酵至pH4.55，之后将容量瓶置于冷保藏7天后。7天后，倒出酸奶上部的乳清并称重。此后脱水收缩量可以计算为百分比。
如专业技术人员所显而易见的-也可以通过例如用另一种非酸奶目的培养物发酵、保存和测量该目的奶制品上部的乳清量来测量不同于酸奶的另一种奶制品的脱水收缩作用。
结论：
基于上面测量脱水收缩作用的标准方法-对于专业技术人员来说确定根据如本文所述的制备乳品动物奶制品的方法通过添加糖苷酶是否存在对目的乳品奶制品的显著脱水收缩作用是常规工作。
实施例4：PNGaseF对凝胶硬度的作用(2l规模)
2升脱脂奶(0.1％脂肪，ArlaExpress，斯莱格思)用1.6％脱脂奶粉(SMP，生产商？)加强并置于冰箱中过夜。将溶液在90℃热处理20分钟，冷却至43℃，接种以0.02％Advance2.0(获自Chr.HansenA/S，丹麦)和10mlPNGase-F或在参照样品中含有50mMNaCl的10ml20mM磷酸钠缓冲液pH7.5并发酵至pH4.55。当达到pH4.55时，将酸奶搅拌并使其通过后处理装置(PTU)，其使酸奶在25℃经受2巴的反压。最终产品在第5天时进行流变仪分析。
表1
对于N-糖苷酶，一个活性单位定义为在1h内在37℃以10μl的总反应体积从10μg变性RNase-B去除＞95％碳水化合物所需的酶量。
表1中的数字显示PNGase-F增加低脂酸奶的凝胶硬度。在这些条件下，与参照相比增加75％。在PNGase-F的存在下获得的粘度与参照样品相当或比其稍好。在此处未显示的数据中，我们发现响应于PNGase-F处理的凝胶硬度的增加是剂量依赖的。我们还使用来自实施例3的方法1评价了脱水收缩并且发现响应于PNGase-F处理脱水收缩减少。
结论：
上面的结果证明PNGase-F增加低脂酸奶的凝胶硬度。在此实验的条件下与参照相比增加75％(即，1.75倍)。
此外发现响应于PNGase-F处理脱水收缩减少。
在PNGase-F的存在下获得的粘度与参照样品相当或比其稍好。
实施例5：测试低脂酸奶中的不同糖苷酶
在20ml流变仪杯中直接制备酸奶。由此获得凝固型酸奶。脱脂奶(0.1％脂肪，ArlaExpress，斯莱格思)用2％脱脂奶粉(SMP)加强并置于冰箱中过夜。将溶液在90℃热处理20分钟，冷却至43℃，接种以0.02％YoFlex2.0和不同的脱糖苷酶(deglycosidase)并发酵(表1)。
然后将样品置于冰箱中并根据实施例2在第3天测量流变学。
表2
对于N-糖苷酶PNGase-F和ENDO-H，29-个单位如表1中所定义。对于α-N-乙酰基-半乳糖胺酶，O-葡萄糖苷酶，一个单位定义为在1h内在37℃以10μl的总反应体积从1nmol(GalNAcα1-3)(Fucα1-2)Galα1-4Glc-7-氨基-4-甲基-香豆素(AMC)裂解＞95％的末端α-D-N-乙酰基-葡萄糖胺所需的酶量。
对于所有测试的糖苷酶，N-葡萄糖苷酶以及O-葡萄糖苷酶GalNAC，发现凝胶硬度显著改善。在测试的浓度下，发现市售获得的PNGase-F具有对低脂酸奶的凝胶硬度最有效的作用。
结论：
上面的结果证明对于所有测试的糖苷酶，N-葡萄糖苷酶以及O-葡萄糖苷酶GalNAC，发现凝胶硬度显著改善。
实施例6：使用作用于O-连接糖基化的糖苷酶的脱水收缩实验
在US7,560,127中，显示α-葡萄糖苷酶GalNAC可以导致乳酪凝乳/凝块形成。在此我们分析了GalNAC对低脂酸奶中的脱水收缩形成有何作用。如实施例3方法2中所述进行实验。在100ml流变仪杯中直接制备酸奶。由此获得凝固性酸奶。脱脂奶(0.1％脂肪，ArlaExpress，斯莱格思)用2％脱脂奶粉(SMP，ArlaExpress，斯莱格思)加强并置于冰箱中过夜。将溶液在90℃热处理20分钟，冷却至43℃，接种以0.02％YoFlex2.0和100U/ml奶的浓度的GalNAC。对于不含酶的参照样品，21天后乳清的百分比为0.3±0.04％，而对于酶处理样品，乳清部分为0.2±0.08％。令人惊讶地，因此发现当与用相同培养物发酵的参照样品相比时，用GalNAC处理不增加脱水收缩。此结果是出人意料的，因为US7,560,127指出O-连接聚糖的去除导致凝块形成并且因此导致乳清的分离。
结论：
上面的结果证明测试的O-连接糖苷酶在酸奶的制备期间不增加脱水收缩。
实施例7：LAB和化学酸化奶
在本实施例中，我们想要评估PNGase-F的作用是否依赖于酸化的机制。通过比较PNGase-F对发酵酸奶和用葡萄糖酸-δ-内酯(GDL)化学酸化的酸奶的作用实验性地解决了此问题。
由9.5％干物质组成的奶接种以Advance2.0或葡萄糖酸-δ-内酯(GDL)和PNGase-F，如表3中所示，加热至43℃并且发酵至pH4.55。在样品已经在5℃保存3天后，用搅拌机搅拌样品并将其倒入至流变仪杯中，并依照实施例2和3测量流变学。
表3中给出的结果证实PNGase-F的作用可以描述为物理现象。化学酸化的酸奶与Advance2.0培养物相比产生了更坚硬得多的凝胶。然而，对于两种酸化方法，显然，添加PNGase-F改善了凝胶硬度。
表3
结论：
上面的结果证明对于两种酸化方法，显然，添加PNGase-F改善了凝胶硬度。
在此描述了本发明的优选实施方案，包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳方式。对于本领域普通技术人员而言在阅读了前面的描述后那些优选实施方案的变化形式可以是显而易见的。本发明人预期熟练技术人员能够根据需要采用此类变化形式，并且本发明人期望本发明能够以与如本文具体描述不同的方式实施。因此，本发明包括如由可适用法律所允许的在后附的权利要求中述及的主题的所有改型和等效物。而且，在其所有可能变化形式中上述要素的任意组合包括在本发明的范围内，除非本文另外指明或另外上下文显然相悖。
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此专利文件中引用的所有参考文献均整体地通过引用并入本文。

Claims (16)

1.一种制备奶制品的方法，所述方法包括：
a)提供奶底物；
b)用具有N-连接糖苷酶活性的酶处理所述奶底物；以及
c)任选地，用微生物发酵所述奶底物，
其中，具有N-连接糖苷酶活性的酶是部分或完全将与天冬酰胺或精氨酸侧链的氮连接的聚糖去除的糖苷酶。
2.权利要求1所述的方法，其中所述微生物是乳酸菌。
3.权利要求1所述的方法，其中步骤b)在步骤c)之前或期间进行。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述微生物属于选自由下列各项组成的组的种：嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.Bulgaricus)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcuslactissubsp.Cremoris)、肠膜明串珠菌乳脂亚种(Leuconostocmesenteroidessubsp.Cremoris)、假肠膜明串珠菌乳脂亚种(Pseudoleuconostocmesenteroidessubsp.Cremoris)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种(Lactococcuslactissubsp.lactisbiovar.diacetylactis)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactobacilluscaseisubsp.Casei)、类干酪乳杆菌类干酪亚种(Lactobacillusparacaseisubsp.Paracasei)、两歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)和长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)。
5.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述N-连接糖苷酶是选自由以下各项组成的组的至少一种糖苷酶：肽-N(4)-(N-乙酰基-β-葡萄糖胺基)天冬酰胺酰胺酶(EC编号：3.5.1.52；别称：N-糖苷酶-F或PNGase-F)和内-β-N-乙酰基葡萄糖胺糖苷酶H(EC编号：3.2.1.96；别称ENDO-H)。
6.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述奶底物选自来自动物的奶和植物来源的奶。
7.权利要求6所述的方法，其中所述来自动物的奶来自奶牛、绵羊、母羊、山羊、水牛或骆驼。
8.权利要求6所述的方法，其中所述植物来源的奶是豆奶、燕麦奶、米奶或杏仁奶。
9.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述奶制品是发酵奶制品。
10.权利要求9所述的方法，其中所述发酵奶制品是选自由下列各项组成的组的至少一种制品：酸奶、酸乳酒、乳酒和夸克奶酪。
11.权利要求10所述的方法，其中所述酸奶是交替培养酸奶。
12.一种通过权利要求1-11中任一项所述的方法获得的奶制品。
13.一种制备乳品动物奶制品的方法，其包括以下步骤：
(i):向动物奶底物添加有效量的O-连接糖苷酶；和
(ii):进行适当的步骤以得到乳品动物奶制品,其中所述适当的步骤在其中有效量的所述糖苷酶——由于其中所述有效量的糖苷酶的存在——增加所述乳品奶制品的凝胶硬度的条件下进行；
其中所述O-连接糖苷酶是选自由下列各项组成的组的至少一种糖苷酶：α-N-乙酰基-半乳糖胺酶(EC编号:3.2.1.49；别称:GalNAC)；α-半乳糖苷酶(EC编号:3.2.1.22)；和神经氨酸苷酶(EC编号:3.2.1.18)；并且
其中所述奶制品是酸奶。
14.一种能通过权利要求13所述的方法获得的奶制品。
15.N-连接糖苷酶在用于权利要求1-11中任一项所述的制备奶制品的方法中的用途。
16.O-连接糖苷酶在用于权利要求13所述的制备乳品动物奶制品的方法中的用途。
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