CN103142624A

CN103142624A - 抗生素替加环素在制备抗癌药物中的应用

Info

Publication number: CN103142624A
Application number: CN2013100665250A
Authority: CN
Inventors: 崔红娟; 汤春铃; 杨丽群; 夏庆友; 向伸怀
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2013-03-01
Filing date: 2013-03-01
Publication date: 2013-06-12

Abstract

本发明公开了抗生素替加环素的一种新功能，即抗生素替加环素的抗癌功能。发明人通过实验发现：替加环素（TIG）能够抑制胃癌细胞系MKN-45及胃癌低传代细胞GAM-016的生长；替加环素（TIG）能够阻断胃癌细胞系MKN-45及胃癌低传代细胞GAM-016的细胞周期；替加环素（TIG）能够促进胃癌细胞系MKN-45及胃癌低传代细胞GAM-016的自噬；替加环素（TIG）在胃癌的荷瘤鼠模型上具有抑制胃癌生长的功能。

Description

抗生素替加环素在制备抗癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物新功能，尤其涉及的是抗生素替加环素(Tigcycline)具有抑制胃癌细胞增殖与诱导其自噬的抗癌新功能。

背景技术

目前在世界范围内，在癌症引发的死亡中胃癌的死亡率排名第二，而且晚期胃癌病人往往具有很低的生存率。在我国其发病率和死亡率居各类肿瘤的首位，严重威胁人类健康。虽然在过去的二十年中胃癌的发生率出现了一定程度的降低，但是这类疾病仍然具有很高的死亡率（700000人/年）。在东亚，东欧以及美洲南部和中部地区，胃癌仍然是最普遍的消化***恶性肿瘤。虽然近来在治疗消化***恶性肿瘤的方法上（包括外科手术、药物化学治疗以及放射化学治疗）取得了一定的进展，但是没有哪种方法能够对晚期癌症病人产生非常良好的疗效。鉴于过去几十年中胃癌的治疗方法都没有发生根本的变化，因此能够发现新的有效的治疗手段或者方法将对胃癌的治疗产生积极的影响。

我们基于这种想法，利用老药新用这一策略，积极的筛选有效的抵抗胃癌的药物，其中筛选得到替加环素（Tigcycline）就能够有效的抵抗胃癌。替加环素（Tigcycline），商品名泰格（Tygacil），是2005年由美国食品及药品管理局（FDA）批准上市的第一种甘氨环素类抗生素，其由米诺环素（一种半合成的四环素）衍生而来，化学名为：(4S,4aS,5aR,12aS)-9-(2-叔丁基氨基乙酰氨基)-4,7-双二甲氨基-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-八氢-3,10,12,12a-四羟基-1,11-二氧代-2-并四苯甲酰胺。目前临床上的替加环素是作为一种广谱类抗生素使用，与四环素类抗生素在结构、功能及作用机制上均具有非常大的相似性，同时又具有不同于旧一代四环素类抗生素的优越性。过去的研究表明，在黑色素瘤、乳腺癌、***癌等一些前期临床的肿瘤模型中，旧一代的四环素类抗生素如米诺环素、多西环素等均具有一定的抗癌效果。

肿瘤细胞最主要的特征是持续不断地增殖,主要原因之一就是肿瘤细胞细胞周期的不停滞性。细胞周期分为G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)、M期(有丝***期)4个时期,并存在G1/S(调节G1→S进程)、S/G2、G2/M三个调控点,其中G1/S是细胞周期关键调控点,一旦调节此调控点的基因过度表达将导致细胞不断地增殖。细胞周期素Cyclin E（CCNE）是S期标记物,在G1晚期合成,其过表达对G1→S进程过渡起着重要作用,是细胞周期G1/S调控点的关键调控因子之一。DNA合成期细胞比(S期细胞比,SPF)与肿瘤细胞增殖能力密切相关,是反映肿瘤细胞增殖周期和增殖潜能的主要指标之一。现有的多种抗肿瘤药物就是利用将细胞周期阻滞于G0/G1期而达到抑制肿瘤细胞增殖的抗肿瘤功效。

自噬现象是一种高度保守的细胞行为，是细胞内物质代谢的重要途径。相对于主要降解短半衰期蛋白质的泛素-蛋白酶体***，细胞的自噬被认为参与绝大多数长半衰期蛋白质的降解,表现为细胞浆中出现大量包裹着细胞浆和细胞器的空泡结构和溶酶体对空泡内成分的降解。自噬与细胞的生长，增殖以及肿瘤的发生密切相关。LC3是哺乳动物细胞中酵母ATG8基因的同源物，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面,是细胞自噬泡膜的通用标记物。细胞中新合成的LC3经过加工，成为胞浆可溶性LC3I(LC3A),后者经泛素样加工修饰过程,与自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺结合,称为LC3II(LC3B),LC3II含量的多少与自噬泡数量的多少成正比,因此LC3II含量的变化在某种程度上反映了细胞的自噬活性。

发明内容

发明人首次发现替加环素除了其自身的广谱抗生素特点之外，具有能够抵抗胃癌的新功能，主要包括抑制胃癌细胞生长，阻断细胞周期以及诱导其发生自噬，而且进一步的胃癌动物模型实验也证实了以上的实验结论，表明替加环素可以作为一种潜在的抗胃癌药物进行进一步的开发利用。。

本发明的技术方案如下：

抗生素替加环素在制备抗癌药物中的应用。

抗生素替加环素在制备抗胃癌药物中的应用。

根据上述的应用制备获得的抗癌药物。

发明人通过实验发现：替加环素（TIG）能够抑制胃癌细胞系MKN-45及胃癌低传代细胞GAM-016的生长；替加环素（TIG）能够阻断胃癌细胞系MKN-45及胃癌低传代细胞GAM-016的细胞周期；替加环素（TIG）能够促进胃癌细胞系MKN-45及胃癌低传代细胞GAM-016的自噬；替加环素（TIG）在胃癌的荷瘤鼠模型上具有抑制胃癌生长的功能。

附图说明

图1为替加环素（TIG）能够抑制胃癌细胞系MKN-45及胃癌低传代细胞GAM-016的生长；A.台盼蓝计数显示不同浓度(0uM,1uM,5uM,10uM)替加环素处理72小时对不同胃癌细胞的增殖抑制作用；B.MTT生长曲线测定不同浓度(0uM,5uM,10uM)替加环素对不同胃癌细胞的生长抑制作用；C.BrdU细胞增殖检测10uM浓度的替加环素处理72小时对不同胃癌细胞的增殖抑制作用；(注：*表示与对照组比较P<0.05，**表示与对照组比较P<0.01）；

图2为替加环素（TIG）能够阻断胃癌细胞系MKN-45及胃癌低传代细胞GAM-016的细胞周期；A.流式细胞周期检测10uM浓度的替加环素处理72小时对不同胃癌细胞的周期分布情况的影响；B.免疫印迹实验检测10uM浓度的替加环素处理72小时对不同胃癌细胞周期调控蛋白表达的影响；(注：*表示与对照组比较P<0.05，**表示与对照组比较P<0.01）；

图3为替加环素（TIG）能够促进胃癌细胞系MKN-45及胃癌低传代细胞GAM-016的自噬；A.MDC染色检测10uM浓度的替加环素对不同胃癌细胞处理不同时间(24h,48h)后细胞内自噬小体形成情况；B.细胞免疫荧光检测10uM浓度的替加环素对不同胃癌细胞分别处理不同时间(24h,48h)后细胞内LC3II表达情况；C.免疫印迹检测10uM浓度的替加环素对不同胃癌细胞分别处理不同时间(24h,48h)后LC3II蛋白表达水平；

图4为替加环素（TIG）在胃癌的荷瘤鼠模型上具有抑制胃癌生长的功能；A.肿瘤体积生长曲线；B.肿瘤形态大小展示；C.肿瘤组织相关蛋白表达水平检测；(注：*表示与对照组比较P<0.05，**表示与对照组比较P<0.01）。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实验方法与步骤

1.1、细胞培养

人胃癌细胞系MKN-45细胞呈贴壁生长，培养于含10%胎牛血清，青霉素、链霉素各100U/mL，的RPMI-1640培养基中，在37℃、5%CO₂条件下培养，每2-3天更换培养基或传代培养。人胃癌原代细胞GAM-016由病人胃癌组织培养而成，胃癌组织先经0.3%IV型胶原酶消化处理后，生长于含有20ng/L EGF以及20ng/L b-FGF的无血清RPMI-1640培养基中，形成一定数量的胃癌原代细胞后同MKN-45一样的条件进行培养。

1.2、药物处理

替加环素（商品名泰阁，Tygacil，Wyeth）采购辉瑞，溶解于100%的DMSO中，配制成100mM的存储液，分装，-20℃保存。按处理浓度稀释为1μM,10μM,100μM分别对胃癌细胞系MKN-45及胃癌原代细胞GAM-016进行处理，对照组添加等体积的DMSO，普通观察显微镜细胞形态。

1.3、台盼蓝计数

将实验组与对照组的细胞分别消化成细胞悬液，取10μL细胞悬液(可根据细胞数量进行稀释)与0.5%台盼蓝染色液按1:1体积比混合均匀后，将一小滴(约μL)滴于细胞计数池中，沉降1分钟，低倍镜下计数细胞计数板四大中格中结构完整的细胞，小细胞团计数为1；计数时如果细胞压在格上，则数上不数下，数左不数右，然后按下式计算出每毫升悬液中的细胞数:细胞数/每毫升细胞悬液=(四大中格细胞数/4)×10⁴×稀释倍数。

1.4、MTT生长曲线检测

将细胞悬液按400个/孔（200μl）接种于96孔板上，5孔/组，共接种7板，置于37℃、5％CO²的孵箱中培养。每日取出一板，弃去培养液，PBS漂洗一遍，每孔加20μl MTT(5g/L)，培养液200μl，继续培养4h，弃上清液，加DMSO200μl/孔，震荡器震荡10min，使紫色结晶充分溶解，置酶联免疫检测仪上测定波长570nm下的吸光度值，取吸光度值的平均值，然后以吸光度值为纵坐标，以时间（day）为横坐标绘制生长曲线。

1.5、免疫荧光

取处于对数生长期的细胞，稀释成3×10⁵个/ml，接种于24孔板（孔板上铺有NUNC玻片）。24h后见细胞基本贴壁，实验组10μM替加环素（TIG）分别作用MKN-45及GAM-016细胞一定时间后(阴性对照组只加等量DMSO)，取出玻片，PBS洗2次，用4％多聚甲醛固定细胞20min，并加入0.1％TritonX-10010min，PBS洗3次。在常温下用封闭液封闭1h后加入一抗，在室温下孵育2h，PBS洗3次。然后在避光下加入二抗，室温下孵育1h。PBS洗3次。再用DAPI染核，90％的甘油封片。最后在荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察。

1.6、细胞周期检测

流式细胞仪检测细胞周期，采用PI染色法。实验组10μM替加环素（TIG）分别作用MKN-45及GAM-016细胞72h后(阴性对照组只加等量DMSO)，分别收集各组细胞,每组各设3个复孔,PBS清洗1遍。注入预冷70%乙醇,固定18h。离心弃乙醇后用PBS洗1次。加入RNA酶37℃作用1～2h,加入TritonX-100PI(100μg/ml)100μl,混匀置冰上30min后,在流式细胞仪上检测。

1.7、蛋白免疫印迹

收集经处理的细胞，PBS洗涤2次，加入细胞裂解液100μl，12000rpm离心15min，定量蛋白，取50μg蛋白，加入上样缓冲液，95℃下变性5min。10％～15％的聚丙烯酰胺SDS凝胶电泳后，电转移至硝酸纤维膜上，5％脱脂牛奶封闭后依次加入一抗、二抗，在室温下孵育2h，TBST缓冲液（10mmol／L Tris-HCl，pH7.4，150mmol／LNaCl，0.1％Tween20）洗涤3次，每次10min，暗室ECL显色。

1.8、单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色

取处于对数生长期的细胞，稀释成3×10⁵个/ml，接种于24孔板（孔板上铺有NUNC玻片）。24h后见细胞基本贴壁，实验组10μM替加环素（TIG）分别作用MKN-45及GAM-016细胞一定时间后(阴性对照组只加等量DMSO)，加入0.05mM的单丹(磺)酰戊二胺(MDC)，37℃、5%CO₂条件下继续避光培养15min，取出玻片，PBS洗2次，用4％多聚甲醛固定细胞15min，PBS洗2次，最后在荧光显微镜下观察。

1.9、荷瘤鼠动物模型检测

取对数生长期的胃癌原代细胞GAM-016100万个注射到4周大的免疫缺陷鼠皮下。每只小鼠左右各注射一个点，在生长7天后出现肉眼可见肿瘤，形成荷瘤鼠模型，然后开始采取腹腔给药，实验组按100mg/kg剂量的替加环素给药，对照组注射等体积的溶剂DMSO，每组六个重复，连续5天后停止给药，然后每隔一天记录荷瘤鼠身上肿瘤的体积（体积=长×宽²×0.5236）变化情况，连续测量9天后，对荷瘤鼠进行解剖，取出肿瘤组织，拍照。

2.实验结果及分析

2.1替加环素（Tigcycline）能够抑制胃癌细胞系MKN-45及胃癌原代细胞GAM-016的生长

台盼蓝计数法表明，替加环素对胃癌细胞系MKN-45及胃癌原代细胞GAM-016的增殖具有明显的抑制作用，在替加环素处理72小时的情况下，10uM浓度（胃癌细胞MKN-45实验组50.03%，对照组100.00%；胃癌原代细胞实验组38.23%；对照组100.00%），100uM浓度（胃癌细胞MKN-45实验组18.08%，对照组100.00%；胃癌原代细胞实验组17.27%；对照组100.00%）的替加环素均能够明显的抑制胃癌细胞的增殖，并呈现出剂量依赖效应（如图1.A）。

MTT生长曲线测定结果显示，替加环素能够明显的抑制胃癌细胞的生长并呈现剂量依赖效应，对比于对照组，10uM，100uM浓度的替加环素均能够明显的抑制胃癌细胞的生长（如图1.B）。

BrdU细胞增殖检测，10uM浓度的替加环素处理72小时后的胃癌细胞，其BrdU的阳性率发生明显的降低（胃癌细胞MKN-45实验组27.01%，对照组39.00%；胃癌原代细胞实验组22.61%；对照组44.72%），表明10uM浓度的替加环素能够明显的抑制胃癌细胞的增殖（如图1.C）。（BrdU作为一种胸腺嘧啶核苷的类似物，像胸腺嘧啶核苷一样可掺入到细胞合成的DNA中。当细胞处于DNA合成期而同时又有BrdU存在时,就会有BrdU掺入新合成的DNA中，只要细胞不消亡，这种BrdU就在胞核的DNA中长期存留。掺入到DNA的BrdU可通过抗BrdU单克隆抗体得以显示，其阳性率直接反应了细胞的增殖率。）

2.2替加环素能够阻断胃癌细胞的细胞周期

流式细胞周期检测个时期细胞所占的比例，结果显示10uM浓度的替加环素处理胃癌细胞72小时后，处于细胞周期G1期的细胞发生了明显的增加（胃癌细胞MKN-45实验组70.02%，对照组48.92%；胃癌原代细胞实验组69.95%；对照组50.57%），而处于S期（胃癌细胞MKN-45实验组21.29%，对照组32.10%；胃癌原代细胞实验组21.86%；对照组30.96%），G2期（胃癌细胞MKN-45实验组8.68%，对照组19.01%；胃癌原代细胞实验组8.18%；对照组18.47%）的细胞均减少了（如图2.A），表明替加环素能够阻断胃癌细胞的正常周期，从而达到抑制其增殖的目的。

免疫印迹实验检测周期调控蛋白的表达情况，其中胃癌细胞中周期蛋白E1的表达量随着替加环素的处理发生了显著的下降（如图2.B），该蛋白主要是调控细胞周期G1期向S期运转，当其表达量下降时会导致细胞周期发生G1/S阻滞，从而使肿瘤细胞生长受到抑制。

2.3替加环素能够促进胃癌细胞的自噬

MDC染色检测自噬小体的形成情况，实验结果显示10uM浓度的替加环素处理后的胃癌细胞自噬小体明显的增加了，而且随着处理时间的延长，自噬小体呈现增加的趋势，表明替加环素能够诱导胃癌细胞自噬（如图3.A）。（单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法，是自噬发生过程中分析分子水平机制的一种特异的检测自噬体方法。自噬体形成依赖的第二个泛素样结合***(Apg8)是位于自噬囊泡膜上与MDC特异结合的生化标志，通过荧光染色，在荧光显微镜下可见核周区域阳性显色。）

自噬小体相关蛋白LC3II(LC3B)表达情况检测，细胞免疫荧光及免疫印迹实验结果均显示10uM浓度的替加环素处理后的胃癌细胞LC3II（LC3B）的表达情况发生了明显的增加（如图3.B,C）。而且随着替加环素处理时间的增加LC3II的表达水平也逐渐增加，进一步说明了替加环素能够诱导胃癌细胞发生自噬。

2.4替加环素在胃癌的荷瘤鼠模型上具有抑制胃癌生长的功能

肿瘤体积生长曲线测定，对免疫缺陷鼠采取皮下注射胃癌原代细胞GAM-016(100万个)，在生长7天后出现肉眼可见肿瘤，开始采取腹腔给药，实验组按100mg/kg剂量的替加环素给药，对照组注射等体积的溶剂DMSO,每组六个重复，连续5天后停止给药，然后每隔一天测量荷瘤鼠身上的肿瘤体积，连续测量9天后，对荷瘤鼠进行解剖，取出肿瘤。实验结果显示在不影响荷瘤鼠正常活动的情况下药物组荷瘤鼠肿瘤的生长情况明显受到抑制，表明替加环素在胃癌动物模型上也具有抗肿瘤的功能（如图4.A，B）。

免疫印迹实验检测组织水平相关蛋白表达情况，分别对实验组和对照组荷瘤鼠身上的肿瘤组织进行蛋白提取后检测周期蛋白E1(CCNE1)和微管相关蛋白-3(LC-3)表达量，实验结果显示注射替加环素治疗的荷瘤鼠肿瘤组织中的CCNE1蛋白表达量发生了明显的降低，而LC3II的表达量发生了明显的升高，这些结果分别表明替加环素在个体水平上能够导致肿瘤的周期阻滞以及诱导其发生自噬（如图4.C）,从而进一步说明了替加环素具有抗胃癌肿瘤的功能。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.抗生素替加环素在制备抗癌药物中的应用。

2.抗生素替加环素在制备抗胃癌药物中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用制备获得的抗癌药物。