CN103131722A - 一种猪基因表达的mck-dgat1载体及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪基因表达的MCK-DGAT1载体及制备方法，其步骤：A、根据DGAT1基因，获得了猪DGAT1基因的cDNA全长序列并合成该基因；B、设计了二对特异性引物扩增猪MCK基因启动子两端的两端特异序列，连接到pEGFP-N1载体上，通过基因抓捕技术，获得完整的猪MCK基因的启动子，启动子序列全长为7121bp；D、用猪DGAT1基因替换了pEGFP-N1-MCK载体上的GFP基因，完成了MCK-DGAT1表达载体的构建，实验结果表明，利用猪DGAT1基因及肌肉特异性表达基因MCK启动子构建的表达载体。明显增加动物个体肌肉中甘油三酯和脂肪酸的含量。提高了实验的可靠性与真实性，所鉴定的表达载体直接应用到猪转基因工程和分子育种。通过转基因获得高肌内脂肪的新品种，提高猪肉品质，缩短常规育种培育高肌内脂肪所需的时间。

Description

一种猪基因表达的MCK-DGAT1载体及制备方法

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种猪基因表达的MCK-DGAT1载体，同时还涉及一种猪基因表达的MCK-DGAT1载体的制备方法。

背景技术

基因的表达(gene expression)是指从DNA到蛋白质的过程，而对这个过程的调节称为基因的表达调控。而基因的表达调控是一个多层次的复杂过程，受不同的调节因素控制。它是通过多阶段水平的调节来实现的，即转录前、转录、转录后、翻译、翻译后五个水平的调控。高等生物的生长发育就是由不同基因在时间和空间上的有序表达和协同作用实现的，而在此过程中基因表达的开启、关闭、表达部位、表达量的高低等都将会受到各阶段水平的精细控制。启动子(promoter)是指一段能使基因进行转录的DNA序列，如果结构基因在组织或发育阶段特异性启动子的启动子的调控下，基因往往只在某些特定的组织器官中表达，并表现出发育调节的特性。

随着基因工程的飞速发展，如何使外源基因按照人们的意愿正确、高效和稳定的在生物体内表达成为研究的热点。利用一些重要的特异性的或特定条件能诱导的启动子构建一系列能够高效表达外源基因的表达载体，同时结合转基因技术将这些外源基因导入生物体内，培育出能够完全按照人们的设计初衷来表达外源基因的动植物新品种或新品系成为现代分子育种的最终落脚点。

Genetically Modified——转基因，简称GM，是指运用科学手段从某种生物中提取所需要的基因，将其转入另一种生物中，使与另一种生物的基因进行重组，从而产生特定的具有变异遗传性状的物质。利用转基因技术可以改变动植物性状，培育新品种。也可以利用其它生物体培育出期望的生物制品，用于医药、食品等方面。

肌肉肌酸激酶(Muscle Creatine Kinase，MCK)，被证实在骨骼肌和心肌组织中高水平的表达(Amacher，S.L，S.L.，J.N.Buskin，and S.D.Hauschka.1993；Dorit B.Donoviel，1996；Margaret A.Shield et al，1996；Jane E.Johnson et al，1989)，一些体外转染骨骼肌肌细胞和成纤维细胞的研究，已鉴定出2个MCK增强子元件和一个近端启动子元件，这些元件只在分化的骨骼肌细胞中表达，一个包含MCK5’端序列3300个核苷酸的整合基因显示出氯霉素乙酰基转移酶的活性水平在骨骼肌中，比其它肌肉组织，如肾、肝和脾高104，在新机种的表达也比其它非肌肉组织高2-3个数量级。

二酰基甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltrabsferase，DGAT)是脂肪细胞中控制TAG合成的核心酶(Cases S，Smith SJ and Zheng YW，1998；Li Liu，Nancy Chen and Xiaojing Shi，2007；Li Liu，1Xiaojing Shi etal.2009；Manco，M.，et al.2000；Scot J，Eric Yen and Chi-Liang，2008；Yen C-HE，Monetti M and Burri B J etal.，2005；Yu，Y.H.，and Ginsberg，H.N，2004；ZhangY，Oelkers P and Sturley SL，2002)，在细胞甘油脂类的代谢中起着重要的中心作用，其主要作用机制是使二酞甘油(diacylglycerol，DAG)加上脂肪酸酰基形成三酰甘油(triacylglycerol，TAG)，由于DGAT在三酞甘油合成和能量储存中存在重要作用，因而DGAT也可能在肠脂肪吸收，脂蛋白集合，血浆中甘油三醋浓度的调节及脂细胞中脂肪的沉积，肌肉中能量的代谢等方面发挥作用，并还能影响产奶量和产蛋量。

肉类是人类营养的主要来源，而猪肉在所有肉类消费中所占的比例是最大的。随着社会的发展与人们生活水平的提高，人们对肉类的消费观念已由原来的对量的追求向质的追求转变。过去的几十年里，传统的育种方法在提高猪的生长速度，瘦肉率以及饲料转化率等方面发挥了积极重要的作用，并取得了显著的成绩，育种计划相当成功。但同时随着对高生长率与高瘦肉率的强度选择导致了猪肉品质的严重下降，特别是导致了肌肉脂肪的大幅度下降，肌纤维增粗(快肌比例增加)，劣质猪肉的大量涌现(Bee G，Guex G，HerzogW；Pettigrew J E，Esnaola MA，2001)。因此转基因育种，将能促进肌内脂肪形成的优良靶基因构建到含肌肉特异表达启动子的载体中，然后通过转基因技术将目的基因导入猪体内，培育出高肌肉脂肪的优质转基因新品种猪，从而可以大大改善猪肉品质，创造巨大的经济效益和社会效益，更好的为人类生产生活服务，应用基因工程技术来改良猪肉品质不失为一个科学有效的方法。

本发明就是利用相关的分子生物学技术，将猪MCK基因启动子和DGAT1基因构建到不含EGFP(增强型绿色荧光蛋白)的pEGFP-N1载体中，并利用构建的载体通过原核显微注射获得转基因小鼠，通过检测肌肉组织中的甘油三酯和脂肪酸含量，验证了肌内脂肪的提高。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种猪基因表达的MCK-DGAT1载体，该载体具有肌肉表达特异性，并能够明显增加动物个体肌肉中甘油三酯和脂肪酸的含量。能通过转基因技术获得高肌内脂肪的新品种，提高猪肉品质，缩短常规育种培育高肌内脂肪所需的时间。

本发明的另一个目的是在于提供了一种猪基因表达的MCK-DGAT1载体的制备方法，该方法通过基因抓捕技术获得了猪MCK基因启动子的7kb序列，连接了猪DGAT1基因。

本发明是这样实现的：

在人与鼠上的研究表明，DGAT1基因是一个与甘油三酯水平紧密相关的基因，申请人通过合成猪cDNA全长序列，并将其与基因抓捕获得的MCK基因启动子连接，获得了pEGFP-N1-MCK-DGAT1表达载体，通过原核显微注射获得了阳性转基因小鼠，接着利用反转录PCR(以下简称RT-PCR)方法分析了猪DGAT1基因在小鼠不同组织中的表达情况，结果表明猪DGAT1基因在阳性转基因小鼠骨骼肌中的表达量明显高于其它所检测的组织和阴性小鼠。然后利用WesternBlot方法分析了猪DGAT1基因在小鼠骨骼肌中蛋白水平的表达情况，结果表明猪DGAT1基因在阳性转基因小鼠的骨骼肌中蛋白水平明显高于阴性小鼠骨骼肌中。然后，申请人测定了小鼠骨骼肌中的甘油三酯含量，结果表明小阳性转基因小鼠骨骼肌内的甘油三酯存贮增加了。最后，申请人制备了小鼠骨骼肌的肌肉切片并用油红进行染色，结果表明阳性转基因小鼠骨骼肌内的脂肪含量也增高。实验结果表明，利用猪DGAT1基因及肌肉特异性表达基因MCK启动子构建的表达载体，能够提高肌内脂肪的含量。

一种猪基因表达的MCK-DGAT1载体的制备方法，其步骤是：

A、通过大量的查找文献资料，根据以往文献所报道的DGAT1基因的生理生化功能，认为猪DGAT1基因是一个影响猪肌内脂肪含量的重要候选基因。利用美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站获得了猪DGAT1基因的cDNA全长序列并合成该基因。

B、接下来，申请人设计了二对特异性引物(其编号分别为T₁F，T₁R和T₂F和T₂R)扩增猪MCK基因启动子两端的两端特异序列，连接到pEGFP-N1载体(购自北京天恩泽基因科技有限公司，货号：100401)上，在此基础之上，通过基因抓捕技术，获得完整的猪MCK基因的启动子，启动子序列全长为7121bp。

C、接着，申请人用猪DGAT1基因替换了pEGFP-N1-MCK载体上的GFP基因，完成了MCK-DGAT1表达载体的构建。然后，通过原核显微注射获得了该表达载体的转基因小鼠，并在转基因小鼠上做了RNA水平和蛋白水平的检测。实验结果表明，利用猪DGAT1基因及肌肉特异性表达基因MCK启动子构建的表达载体，能够提高肌内脂肪的含量。

D、猪DGAT1基因定位于SSC4pl(Nonneman D，Rohrer G A，2002)，cDNA全长1935bp，包含了198bp的5′UTR，1470bp的编码序列及261bp的3′UTR，研究发现猪DGAT1基因cDNA编码区与鼠、人和牛的cDNA具有83％，88％和91％的核酸同源性，而cDNA编码蛋白的489个氨基酸则与鼠、人和牛蛋白具有85％，86％和92％的同源性。研究发现DGAT1缺陷小鼠白色脂肪组织内的甘油三酯水平降低了，且能通过增加能量消耗机制抵抗饮食诱导的肥胖，还增加了对瘦素和胰岛素的敏感性。这些结果表明在调节能量代谢的过程中DGAT1发挥着重要的作用。在脂肪组织过表达人DGAT1基因的C57BJ/L6小鼠，经高脂饲料饲喂，与阴性小鼠对比，体重增加了20％，并且脂肪细胞肥大。同样的在FVB小鼠脂肪组织中过表达人DGAT1基因，阳性小鼠的体重也明显增加，DAG摄取量增多，且脂肪组织中的TAG合成量显著增加。人MCK-DGAT1转基因小鼠DAG摄取量和TAG合成量也显著增加。

E、在上述步骤C中获得一种分离的MCK-DGAT1载体，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。由该载体获得的转基因小鼠，在RNA水平和蛋白水平，DGAT1基因表达显著增加，脂肪代谢通路上的一些基因也发生了显著的变化。小鼠个体肌肉组织中的TAG合成量和脂肪酸含量也明显提高。该表达载体可           最终用于制备转基因猪，能够提高猪肌内脂肪含量，从而可以大大改善猪肉品质，培育出高肌肉脂肪的优质转基因新品种猪。

本发明的优点在于：

(1)本发明首次将猪DGAT1基因与MCK基因启动子结合构成表达载体，为猪基因工程和分子育种提供了新的的表达载体资源。

(2)本发明同时利用转基因小鼠进行了验证，提高了实验的可靠性与真实性，所鉴定的表达载体可直接应用到猪转基因工程和分子育种。

(3)本发明构建的表达载体，能够显著提高动物个体的甘油三酯和肌内脂肪含量。

(4)RNA水平，DGAT1基因表达增加了上千倍，蛋白水平，DGAT1增加了约2倍，小鼠个体肌肉组织中的TAG合成量显著增加，提高了近20％，肌肉中的脂肪酸含量也明显提高，由肌肉切片可以看出阳性小鼠的脂肪沉积明显多于阴性小鼠。

附图说明

图1为一种试验流程图。

图2为一种MCK基因启动子同源臂1PCR扩增图。

图3为一种MCK基因启动子同源臂2PCR扩增图。

图4为一种同源臂1&2连接到pMD-18载体上PCR扩增检测图。

图5为一种同源臂1&2连接到pEGFP-N1载体上PCR扩增检测图。

图6为一种抓捕MCK启动子后PCR扩增检测图。

图7为一种连接DGAT1基因后PCR扩增检测图。

图8为一种质粒MCK-DGAT1结构示意图。

图9为一种转基因小鼠阳性和阴性PCR扩增检测图。

图10为一种二月龄和四月龄的转基因小鼠和非转基因小鼠的肌肉、肺、肾、肝、脑、心、肠、脾、脂肪、卵巢组织DGAT1的表达谱。

图11为一种转基因小鼠和非转基因小鼠DGAT1、DGAT2、ACC1、ACC2等基因的RT-PCR分析图。

图12为一种转基因小鼠和非转基因小鼠肌肉肌肉Western Blot分析。

图13为一种转基因小鼠和非转基因小鼠肌肉组织甘油三酯含量分析。

图14为一种转基因小鼠和非转基因小鼠肌肉组织切片脂肪含量分析。

具体实施方式

实施例1：

猪肌肉特异表达基因MCK(Genbank登录号为：AC139878)启动子与猪DGAT1基因(Genbank登录号为：NM-214051.1)构成表达载体。

1.主要试剂：Taq DNA聚合酶(Fermentas公司产品)、dNTP(Roche公司，4738284001)、DL-2000Marker(广州东盛生物科技有限公司)、TIANgen Mini琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根公司产品，DP208-02)、限制性内切酶SnaB I、Sal I、Nde I、Ase I、Not I、PspOM I、Swa I (NEB公司产品，R0130S、R0138S、R0111S、R0526S、R0653S、R0646S)、T4DNA连接酶(NEB公司产品，M0202S)、TIANprep Mini质粒小提试剂盒天根公司产品，DP103-02)、载体pMD18-T Vector(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号：D101A)等。

2.组织样品：猪肌肉组织DNA

3.构建载体：

以猪的MCK基因cDNA序列，其Genbank登录号为AC139878，采用Primer 5.0软件设计引物对扩增，同源臂引物(T₁F：5’-catatgGAGGTTCCCAGACTAG-3’，T₁R：5’-tacgtaGCACAGCGGGTTAAGGATC-3’，扩增的片段大小为355bp  ；T₂F：5’-tacgtaGGCAAATCACGCAGCCT-3’，T₂R：5’-gtcgacAAAGGACAGGACTGCAGCCCT-3’，扩增的片段大小为509bp)。(上述引物中，小写部分为酶切位点，依次分别是Nde I、SnaB I、SnaB I、Sal I)。

(1)配制融合PCR反应体系：12.5μl2×GC Bμffer，0.5μl10mM dNTP，0.25μl5U/μlTaq Polymerase，以猪肌肉组织DNA 1μl为模板，补灭菌超纯水至25μl。

(2)PCR产物的融合：94℃预变性4min；94℃变性40s；60℃退火80s；72℃延伸80s。

PCR产物的回收纯化：扩增的同源臂1、2的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外灯下从琼脂糖凝胶上将含有目的片段的凝胶切下，放入1.5mLEpendorff管中，然后用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(货号：DP208-02，购自天根公司)纯化PCR产物。

连接反应：将纯化的同源臂1、2的PCR产物分别与pMD18-T载体(购自TAKARA公司)连接，连接反应总体积是10μl，其中包括2.5μl2×ligation buffer，0.3μl载体，7.2μl纯化PCR产物，4℃过夜连接。

转化：无菌状态下取50～100μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中，将5～10μl的连接产物加入轻轻混匀，在冰上放置30min后42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后迅速冰浴3～4min，加入200μl无抗生素的LB培养液，37℃，220rpm/min温浴复苏45-60min。然后5000rpm/min离心5min，去除上清，将剩余的菌体与培养基轻轻混匀，含氨苄青霉素(Amp)浓度为100μg/mL的平板上，涂匀，37℃正置培养1h后倒置培养，14-16小时后观察有无菌落长出。

阳性克隆子的鉴定及测序：从平板上挑取单克隆接入1.5mL含500μL氨苄青霉素(Amp)浓度为100μg/mL的LB培养液中，并于37℃摇床220rpm/min培养约4-6h左右。以菌液为模板，选用扩增特异性引物T₁F&T₁R，T₂F&P₁R(CAGCTATGACCATGATTACGCCAAG)，进行鉴定。

鉴定正确后，用质粒小提试剂盒(货号：DP103-02，购自天根公司)提取质粒。接着用Sal I和SnaBI双酶切质粒，回收后获得的含有同源臂1的片段，连接到用SnaB I单酶切的含有同源臂2的质粒上，继续进行转化。用扩增特异性引物T₁F&T₂R进行PCR电泳检测鉴定，获得阳性克隆子，将阳性克隆子的菌液送去测序，序列测定由北京奥科生物技术有限责任公司完成。测序结果显示所扩增的序列为猪MCK基因启动子的同源臂序列。用Nde I和Sal I双酶切质粒，回收后获得含有同源臂1&2的片段。pEGFP-N1质粒用AseI酶切后加入了一个14bp含有Swa I酶切位点的片段，接着用Ase I和Sal I双酶切，连接上面获得的同源臂1&2片段，接着进行转化，用扩增特异性引物T₁F&T₂R进行PCR电泳检测鉴定，获得阳性克隆子pEGFP-N1-TYB1&2，将阳性克隆子的菌液送去测序，序列测定由北京奥科生物技术有限责任公司完成。接着利用军事医学科学院陈红星老师的专利——基因抓捕技术，从猪BAC中抓捕出MCK基因启动子序列7121bp。用扩增特异性引物对P₂F  (GCTTCTGGCCTGGCTTTGAGTC)&P₂R(GCCTCCTCACTACTTCTGGAAT)进行PCR鉴定。鉴定正确后最后将猪DGAT1基因连接到启动子下游，用扩增特异性引物对P₂F(GCTTCTGGCCTGGCTTTGAGTC)&P₃RGAGCGACAGCCACACAGCCGCGTTG进行PCR鉴定，获得构建好的表达载体，该载体中中EGFP基因已经被DGAT1基因替代。

4.表达载体经送交Invitrogen(上海)公司合成转基因小鼠。

在上述步骤最终获得一种分离的MCK-DGAT1载体，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

实施例2：

转基因小鼠组织总RNA的提取、cDNA的合成、组织表达分析和荧光定量PCR检测。

1.主要试剂：

试验用的DNA提取试剂盒(购自Bio Teke公司，货号：DP1901)；TransEco FastPfu DNAPolymerase(购自北京全式金生物技术有限公司，货号：AP231)；2×GC Buffer(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号：DRR20GCI)、LA Taq聚合酶(购自宝生物工程(大连)有限公司，货号：DRR20BG)、dNTP(购自Roche公司，货号：47382001)、DL-2000Marker(购自广州东盛生物科技有限公司)、TIANgel Mini琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根公司产品，DP208-02)等。

2.转基因小鼠组织总RNA的提取与cDNA的合成：

各组织总RNA的提取采用Invitrogen公司的Trizol Reagent试剂盒，按照该试剂盒的说明书进行操作，总RNA利用琼脂糖胶电泳来检测它的完整性(28S、18S两条主带清晰)，总RNA的纯度利用NanoDrop 2000Spectrophotometer  (美国NanoDrop公司)检测(OD260/OD280＝1.8-2.0)。总RNA质量合格后才进行后续试验。cDNA第一链的合成利用TOYOBO公司ReverTra

qPCR RT Kit试剂盒进行，按该试剂盒的说明书操作。具体步骤如下：首先取1μg各组织总RNA溶液于200μl的灭菌小PCR管中，于65℃变性5min，使二级结构打开，然后立即置于冰上。然后分别加入4μl5×RT buffer，1μlPrimer Mix，1μlRT EnzymeMix，再补Nuclease-free Water 20μl，于37℃逆转录15min，接着98℃进行5min酶灭活，反应结束后于-20℃保存。

3.转基因小鼠DGAT1基因的组织表达分析：

以所合成的转基因小鼠20个组织样的第一链cDNA为模板，利用设计的检测目的基因DGAT1的半定量引物进行PCR扩增，同时对进行纠正的小鼠的内参基因β-actin进行扩增。PCR反应条件：94℃5min，94℃40sec，65℃40sec，72℃20sec，30个循环，72℃10min。PCR产物经琼脂糖胶电泳检测。检测结果见附图2所示。结果显示，DGAT1基因在转基因阳性小鼠骨骼肌中的表达量显著高于其它所检测的组织。

4.转基因小鼠肌肉组织的荧光定量PCR检测：

以所合成的转基因小鼠肌肉组织样的第一链cDNA为模板，利用设计的荧光定量的引物进行PCR扩增，同时对进行纠正的小鼠的内参基因β-actin进行扩增。荧光定量PCR反应条件：95℃5min，94℃20sec，60℃30sec，72℃20sec，35个循环，72℃5min

表1本发明所设计的引物序列信息

实施例3：

转基因小鼠蛋白水平的检测及甘油三酯含量的测定：

1.主要试剂：

RIPA裂解液(购自碧云天公司，货号：P0013D)、PMSF(购自碧云天公司，货号：ST506)、DGAT1一抗(购自abcam公司，货号：ab59034)、HRP兔抗羊二抗(购自antgene公司、货号：ANT013)、预染蛋白Marker(购自Fermentas公司、货号：SM0441)、2*Loading Buffer(购自天根公司、货号)、OCT包埋剂(购自SakuraFinetek公司，货号：4583)等。

2.Western Blot

(1)、收集蛋白样品(Protein sample preparation)

可以使用碧云天RIPA裂解液，裂解组织样品。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，利用NanoDrop 2000Spectrophotometer(美国NanoDrop公司)测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

(2)、电泳(Electrophoresis)

SDS-PAGE凝胶配制：

配制9％分离胶(15ml)：双蒸水6.55ml，1.5MTris-HCl(pH8.8)3.75ml，30％丙烯酰胺储存液(Acry/Bis)4.5ml，10％SDS 150ml，10％过硫酸铵(APS)50ml，混匀后加入3.75ml TEMED，立即混匀，灌入装好的垂直板中，至距离短玻璃顶端约2cm处。检查是否有气泡，如果有，用滤纸条吸出。在胶液上面加一层双蒸水，静置，待凝胶与水的界面清晰时，说明分离胶已聚合(约30分钟)，去除水相，用滤纸吸干残存的液体。

配制4％浓缩胶(10ml)：双蒸水6.1ml，0.5M Tris-HCl(pH6.8)2.5ml，30％丙烯酰胺储存液(Acry/Bis)1.3ml，10％SDS 100ml，10％过硫酸铵(APS)50ml，混匀后加入10ml TEMED，立即混匀，灌入垂直板中至短玻璃顶端，***梳子，避免产生气泡，静置，约60分钟后，胶聚合，拔去梳子，用电极缓冲液冲洗加样孔，以去除未聚合的丙烯酰胺。

将凝胶固定在电泳槽中，上下槽各加入1′Tris-甘氨酸电泳缓冲液，驱除两玻璃板间凝胶底部的气泡。

样品处理：

在收集的蛋白样品中加入10μl 2X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。

上样与电泳：

冷却到室温(20-25℃，以下相同)后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，使用预染蛋白质分子量标准。

电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90-120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。

(3)、转膜(Transfer)

申请人在Western实验中选用PVDF膜，使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，需把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。

(4)、封闭(Blocking)

转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。去除洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，可以在4℃封闭过夜。

(5)、一抗孵育(Primary antibody incubation)

参考一抗(购自Abcam公司)的说明书，按照适当比例用Western一抗稀释液稀释一抗。去除封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。回收一抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

(6)二抗孵育(Secondary antibody inucubation)

参考二抗(购自Pierce公司)的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。去除洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

(7)、蛋白检测(Detection of proteins)

参考TIANgen增强型HRP-DAB底物显色试剂盒(货号：PA110，购自天根有限公司)检测蛋白。

3.甘油三酯的测定

(1)动物组织裂解，离心管精确称重，加入组织块后再称重，二者相减，得到50mg组织，1mg组织加入20μl裂解液，可显著减少各样品间的蛋白和脂质含量变异，并强烈推荐裂解液用量在1ml左右匀浆。

(2)取500μl裂解液转移到1.5ml离心管，70℃加热10min，组织量多时可能出现絮状沉淀，指纹2000rpm离心5min，上层清夜即可用于酶学测定。

(3)配置工作溶液：按4∶1比例，取4ml试剂R1与1ml试剂R2混合即可，立即使用或4℃保存少于1天。

(4)标准品稀释：4mM甘油标准品用蒸馏水稀释为1000，500，250，125，62.5，31.25，15.625，注意设置0浓度与对照反应管。

(5)推荐以10μl为起始加样量，如测量值超过线性范围可适当稀释，根据稀释倍数计算浓度。

37℃10分钟或25℃20分钟，反应平衡后颜色在60分钟内稳定，先用蒸馏水空白管调零，然后测定各管OD值。绘制标准曲线并计算甘油三酯浓度，Excel作图——各标准管OD值为y轴，得出标准曲线的公式，y-0.7689x-0.0043，R²＝0.9998

4.肌肉组织切片油红染色

肌肉组织的冷冻处理：使组织快速冷冻，避免切片冰晶形成。

OCT包埋剂包埋后切片：包埋动作要快，防止组织解冻；切片要取组织的横切面；切片可稍厚，7～10μm；切片置-20℃保存。

染色步骤：

(1)冻切片

(2)蒸馏水充分洗涤。

(3)油红稀释液染10-15分钟，避光、密封。油红稀释液的配制：

(4)取油红饱和液6毫升，加蒸馏水4毫升，静置5-10分钟后过滤后使用。

(5)60％乙醇镜下分化至间质清晰。

(6)水洗。

(7)Marry氏苏木素复染核。

(8)水洗。

(9)甘油或甘油明胶封片。

结果：脂肪呈鲜红色，细胞核呈蓝色，间质无色。

Claims (2)

1.一种分离的MCK-DGAT1载体，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的一种猪基因表达的MCK-DGAT1载体的制备方法，其步骤是：

A、根据DGAT1基因，获得了猪DGAT1基因的cDNA全长序列并合成该基因；

B、设计了二对特异性引物扩增猪MCK基因启动子两端的两端特异序列，连接到pEGFP-N1载体上，通过基因抓捕技术，获得完整的猪MCK基因的启动子，启动子序列全长为7121bp；

C、用猪DGAT1基因替换了pEGFP-N1-MCK载体上的GFP基因，完成了MCK-DGAT1表达载体的构建，然后，通过原核显微注射获得了该表达载体的转基因小鼠，并在转基因小鼠上做了RNA水平和蛋白水平的检测，实验结果表明，利用猪DGAT1基因及肌肉特异性表达基因MCK启动子构建的表达载体。

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