CN102994511A - 一种牛屠宰性状相关基因cmya4的克隆及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种牛屠宰性状相关基因CMYA4的克隆及应用，在CMYA4基因的第8外显子1092bp处有一个与牛屠宰性状相关的SNP标记位点，为T/C突变，基因CMYA4的克隆制备步骤包括：获得CMYA4基因mRNA序列；CMYA4基因的染色体定位以及基因结构分析和蛋白特点分析；设计引物扩增含SNP位点的基因组DNA；RFLP-PCR多态性检测，将基因CMYA4中与牛屠宰性状相关的SNP标记作为西门塔尔牛牛肉分子育种遗传标记。本发明为牛基因组数据库提供新的信息，为优质性状基因利用提供了参考，本发明公开的SNP多态性位点的应用为检测牛屠宰性状提供了新的技术指标，为牛的标记辅助育种提供了新的标记。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种牛屠宰性状相关基因CMYA4的克隆及应用。
背景技术
动物体内的肌肉可以分为三大类：骨骼肌、心肌和平滑肌。骨骼肌占体重的40-60%，决定着家畜的产肉量。骨骼肌由大量的肌纤维（myofiber）组成，每个肌纤维就是一个肌细胞。肌纤维可根据代谢特点分为：红肌纤维（缓慢有氧收缩型）和白肌纤维（快速糖酵解收缩型），另外还有一种肌纤维所含的酶系活性居于这两类肌纤维之间，呈粉红色，为中间型肌纤维。CMYA家族基因与动物的肌肉组织的组成具有密切的关系。骨骼肌的生长过程涉及大批基因的表达及转录与翻译水平的调控，不同个体或不同品种牛的产肉性状差异与胚胎期和生后期基因的表达调控密切相关。CMYA是原发性心肌症相关蛋白(cardiomyopathy associated protein,CMYA)，目前关于CMYA家族基因的研究主要集中于对该基因与肌蛋白的相互作用。
CMYA4基因又名UNC-45B（unc-45homolog B）或骨骼肌UNC-45（Skeletalmuscle UNC-45)。通过遗传实验得出该基因与粗丝的组装有关，发现其具有分子伴侣的作用。线虫UNC-45分子量大小为107kDa，氨基端含有34个氨基酸的重复序列，大约400个氨基酸残基的中心区域以及UNC-45/Cro1/She4p(UCS)结构域。UNC-45在肌肉组织中表达，并且免疫荧光染色显示它与重链肌球蛋白共定位于躯干肌肉A-带粗丝。研究发现在哺乳动物体内具有2种UNC-45蛋白，分别为GC UNC-45和SM UNC-45。总体上这两种蛋白质氨基酸的同源性74%左右，而小鼠和人最高，分别达到95%和98%。分别检测了它们在成年小鼠不同组织的分布情况显示GC UNC-45广泛表达于各组织，而SM UNC-45只在骨骼肌和心肌中表达，并利用原位杂交技术检测了它们在胚胎不同发育时期的表达，结果显示SM UNC-45基因在小鼠胚胎发育的第8.75天开始仅在心脏中表达，而GC UNC-45基因在胚胎发育的第8天就开始广泛表达。在培养的C2C12细胞系中，GC-UNC45基因在增殖期表达量最高，而SM UNC-45在分化阶段表达，参与肌细胞的成熟以及肌管的形成。通过以上结果作者得出SM UNC-45在肌肉发育中起着重要作用。对斑马鱼敲除SM UNC-45基因后出现瘫痪以及心脏功能的异常，进一步研究发现瘫痪是由于躯干肌肉肌小节中肌球蛋白丝的缺乏。以上实验结果进一步说明了SM UNC-45在肌肉发育中的重要作用。
在实际工作中，人们试图寻找一种简便的评定胴体品质的方法，以减少经济损失，因此大量研究致力于寻找胴体组成的最佳预测指标。而目前DNA分子标记技术的发展和应用，为胴体品质的快速评定开辟了新途径。分子遗传标记则可能克服这一缺点而较早地对种牛进行选择，因此合适的遗传标记对于开展标记辅助选择，加快遗传进展，并最终实现分子育种是极其重要的。另外，研究突变位点在群体中的多态性，并进行性状关联分析是研究基因功能的一个强有力的手段。在群体中通过性状关联分析寻找与牛重要经济性状相关的基因，进行分子育种始终是育种工作者的一项重要而艰巨的任务。
CMYA4基因是一个重要的肌肉生长发育相关基因，将该基因用在分子辅助标记选择中具有重要意义，分离克隆牛屠宰性状相关基因CMYA4并进行其多态性与屠宰性状的关联分析，可以开发用于检测牛屠宰性状指标的新技术，为牛的标记辅助育种提供了新的标记。
通过对国内公开专利文献的检索，未检索到与牛屠宰性状相关基因CMYA4技术的相关专利文献。
发明内容
本发明的目的在于分离牛屠宰性状相关基因CMYA4，获得CMYA4基因mRNA序列，实现对牛屠宰性状相关基因CMYA4的克隆，通过对克隆基因的RFLP多态性检测，RFLP多态性与胴体性状的关联分析，建立RFLP多态性用于检测牛屠宰性状指标的技术，并为牛的标记辅助育种提供新的标记。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种牛屠宰性状相关基因CMYA4，在CMYA4基因的第8外显子1092bp处有一个与牛屠宰性状相关的SNP标记位点，为T/C突变。
一种牛屠宰性状相关基因CMYA4的克隆，制备步骤如下：
第一步，通过查询NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）和Ensembl数据库（http://asia.ensembl.org/index.html）利用比较基因组学方法获得CMYA4基因mRNA序列：
⑴查询数据库获得Homo sapiens cardiomyopathy-associated protein 4(CMYA4),mRNA序列NM_173167.2和Mus musculus cardiomyopathy-associatedprotein 4(CMYA4),mRNA序列NM_178680.4；
⑵利用NCBI BLAST工具利用Highly similar sequences(megablast)比对牛表达序列标签EST，选取同源性大于80%的表达序列标签序列.EDY048664.1,EE373716.1,EE381791.1,EE376524.1,DV933195.1,DV930911.1,DV797178.1,CB438141.1,通过DNAstar（Madison,WI,USA)程序拼接获得CMYA4mRNA全长序列3430bp；
第二步，根据CMYA4基因mRNA序列，利用比对的方法进行CMYA4基因的染色体定位以及基因结构分析和蛋白特点分析：
第三步，找出CMYA4基因的SNP位点，设计引物扩增含SNP位点的基因组DNA；
⑴找出CMYA4基因的一个SNP位点；
⑵根据基因序列设计引物扩增出待测SNP所在的核苷酸片段；
第四步，RFLP-PCR多态性检测。
而且，所述制备步骤第三步的第⑵步中设计引物扩增出待测SNP所在的核苷酸片段的引物序列如SEQ ID NO:3~4所示。
一种牛屠宰性状相关基因CMYA4的应用，是将基因CMYA4中与牛屠宰性状相关的SNP标记作为牛肉分子育种遗传标记。
而且，将基因CMYA4中与牛屠宰性状相关的SNP标记作为牛分子育种遗传标记的步骤如下：
第一步，牛CMYA4基因HindIII-RFLP基因型与部分性状的关联分析；
第二步，确定基因CMYA4及其SNP位点用于检测个体毛重、胴体重、胴体长、胴体深、皮重等胴体性状。
本发明的优点和效果是：
1、本发明分离牛屠宰性状相关基因CMYA4，利用比较基因组学方法获得CMYA4基因mRNA序列，并确定CMYA4基因的染色体定位以及基因的结构，可以为牛基因组数据库提供新的信息，为优质性状基因利用提供参考。
2、CMYA4基因是一个重要的肌肉生长发育相关基因，将该基因用在分子辅助标记选择中具有重要意义，本发明选取CMYA4基因的一个SNP位点，根据基因序列设计引物扩增出待测SNP所在的核苷酸片段，用HindIII进行RFLP-PCR。在分析的牛群中，利用一对引物针对突变位点，通过PCR-RFLP检测SNP位点的基因型及等位基因频率。并用130头13个月大F3代西门塔尔牛进行性状关联分析，确认可用的牛分子育种遗传标记，可以开发用于检测牛屠宰性状指标的新技术，为牛的标记辅助育种提供了新的标记。
附图说明
图1是本发明中使用在线软件http://cn.expasy.org/tools/预测CMYA4蛋白功能域预测结果图；
图2是本发明T1092-C1092位点基因型显示图。
具体实施方式
下面结合具体实施方案对本发明进一步说明，其具体实施方案应该理解为仅为举例说明，不是限定性的，不能以下述举例说明来限定本发明的保护范围。
本发明的技术路线为：通过查询NCBI数据库和Ensembl数据库利用比较基因组学方法获得CMYA4基因mRNA序列、利用比对的方法进行CMYA4基因的染色体定位以及基因结构分析和蛋白特点分析、设计引物扩增含SNP位点的基因组DNA、RFLP多态性检测、RFLP多态性与胴体性状的关联分析，确认可以用作牛肉分子育种遗传标记SNP位点。
一种牛屠宰性状相关基因CMYA4的克隆步骤如下：
第一步，通过查询NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）和Ensembl数据库（http://asia.ensembl.org/index.html）利用比较基因组学方法获得CMYA4基因mRNA序列：
⑴查询数据库获得Homo sapiens cardiomyopathy-associated protein 4(CMYA4),mRNA序列NM_173167.2和Mus musculus cardiomyopathy-associatedprotein 4(CMYA4),mRNA序列NM_178680.4；
⑵利用NCBI BLAST工具利用Highly similar sequences(megablast)比对牛表达序列标签EST，选取同源性大于80%的表达序列标签序列。EDY048664.1,EE373716.1,EE381791.1,EE376524.1,DV933195.1,DV930911.1,DV797178.1,CB438141.1,通过DNAstar（Madison,WI,USA)程序拼接获得CMYA4mRNA全长序列3430bp，序列如SEQ ID NO:1所示，
CMYA4mRNA序列：SEQ ID NO:1如下：
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tatcctgtttcccctgctgtttgactgcggctgcctggaaatgcatgtttcagcagcagtgcccgtcccagacgcgtgcgcattcctttcacttaactatgatggaaataca
gctgatgttcagt
第二步，根据CMYA4基因mRNA序列，利用比对的方法进行CMYA4基因的染色体定位以及基因结构分析和蛋白特点分析：
牛的基因组草图已经绘制完成，我们得到了CMYA4基因mRNA序列，所以我们利用了比对的方法进行CMYA4基因的染色体定位以及基因的结构分析；
⑴CMYA4位于染色体Chromosome 19:15233409-15265756bp，有十九个外显子十八个内含子，转录本长3430bp氨基酸序列长929residues，推导出来的蛋白质等电点(Isoelectric point)：7.7698，分子量（Molecular weight）:103,549.83g/mol。CMYA4蛋白序列：序列如SEQ ID NO:2所示，
CMYA4蛋白序列：SEQ ID NO:2如下：
MAEAEAMQLKEEGNQHFQLQDYKAATKSYSQALKLTKDKALLATLYRNRAACGLKMESYVQAASDAS
RAIDINSSDIKALYRRCQALEHLGKLDQAFKDVQRCATLEPQNQSFQETLRRLNTSIQEKLRVQFSTDSRV
QTMFEILLDRNSEADKLEKAANNLIVLSREEAGAERIFQNNGVALLMQLLDTKRPELMLAAVRTLSGVCS
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AGGTDYALRQFAEGSTEKLAKQCRKWLCNASIDTRTRKWAVEGLAYLTLDADVKDDFVQDIPALQAMFE
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AAVSNPDIAFPGERVYEVVRPLVSLLNTQRDGLQNYEALLGLTNLSGRSDKLRKKIFKEKALPDIENYMFE
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CFKMTEVTTQWLEILQRLCLHDRLSVQHRGLVIAYNLLAADAELAKKLVESELLEILTVVGKQEPDEKRA
AVVQTARECLIKCMDYGFIKPVA
⑵使用在线软件http://cn.expasy.org/tools/预测CMYA4蛋白功能域：
如图1所示，基因结构域预测显示CMYA 4蛋白含有一个TPR-like超家族结构域，一个ARM重复超家族结构域，一个肌浆球蛋白结合中心结构域。
第三步，找出CMYA4基因的SNP位点，设计引物扩增含SNP位点的基因组DNA；
⑴找出CMYA4基因的两个SNP位点：
通过查询NCBI数据库选取CMYA4基因的一个SNP位点SNP：rs109057450，位于Chromosome 19:15250730bp，CMYA4基因第8外显子1092bp，为T/C同义突变位点（T1092-C1092）；
⑵根据基因序列设计引物扩增出待测SNP所在的核苷酸片段：
①引物序列如下：
SEQ ID NO:37450-F GCTGACGGTGCCGTTTCTGTG
SEQ ID NO:47450-R GGCCGGCATCTTACGCTTGCT
②PCR扩增条件：
PCR反应总体积20μL，其中牛基因组DNA约100ng，含1×buffer(Promega)，1：5mmol/L MgCl2，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0：2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶（Promega）。PCR扩增程序是:94℃4min，循环5次94℃45s，62℃45s，72℃1min，然后再循环30次94℃45s，57℃45s，72℃1min，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，得到467bp长的目的片段；
第四步，RFLP-PCR多态性检测：
⑴针对SNP位点选择适当的内切酶进行RFLP-PCR：
T1092-C1092位点用HindIII进行RFLP-PCR，PCR产物酶切反应体积是15μL，其中1×buffer 1.5μL，PCR产物3~5μL，限制性内切酶为0.5μL(5U)，用H2O补足15μL，将样品混匀后离心，37℃水浴4h，用2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照，T1092-C1092位点基因型如图2所示；
⑵对单核苷酸多态性在牛群中的分布进行统计：
在分析的牛群中，利用一对引物针对突变位点，通过PCR-RFLP检测SNP位点的基因型及等位基因频率，统计结果如表1所示；
表1.SNP rs109057450(T1092-C1092)等位基因基因频率
由表可以看出T1092-C1092位点，在牛群体中，CC型高于CT型及TT型，C等位基因为优势基因，其频率大于T等位基因。
一种牛屠宰性状相关基因CMYA4的应用，步骤如下：
首先，我们确定性状关联分析用130头13个月大F3代西门塔尔牛进行，牛群按照国家饲养标准NY/T 815-2004饲养在内蒙古科尔沁的一个农场，所有牛的饲养条件一致，胴体和肉质性状测按照国家牛肉分割标准GB/T 17238-2008进行，
牛CMYA4基因HindIII-RFLP基因型与部分性状的关联分析：
利用牛屠宰性状相关基因CMYA4的克隆，获得的HindIII-RFLP基因型检测结果，对目标牛群进行基因型与胴体性状以及肉质性状间的关联分析，在消除了品种、屠宰批次以及性别之间的差异后，基因型间性状的简单均数和标准差分析结果总结于表2，结果发现，SNP rs109057450与牛部分屠宰性状有性状关联：SNP rs109057450与毛重（kg）极显著相关（p=0.008<0.01),CT型毛重极显著高于TT型，高出36.8Kg；与胴体重（kg)显著相关（P=0.033<0.05）,CT型胴体重显著高于TT型，高出17.3Kg；与胴体长(cm)显著相关（P=0.023<0.05），CT型胴体长显著高于TT型，高出3.3cm；与胴体深(cm)显著相关（P=0.016<0.05），CT型胴体深显著高于TT型，高出2.02cm；与皮重(kg)显著相关（P=0.023<0.05），CT型皮重显著高于TT型，高出3.01Kg；SNP rs109057450可以作为牛分子育种的遗传标记，根据CMYA4基因第8外显子第1092位核苷酸为C还是T，从而确定该个体在该突变位点的等位基因型，并以此来评估该个体毛重、胴体重、胴体长、胴体深、皮重等性状的差异，可以应用到牛的分子标记辅助育种当中；
表2.SNP rs 109057450性状关联分析
注：表中不同基因型间小写字母标注表示差异显著，P<0.05；大写字母标注表示差异极显著，P<0.01。
综上所述，本发明的牛屠宰性状相关基因CMYA4及其SNP位点可用于检测个体毛重、胴体重、胴体长、胴体深、皮重等胴体性状，从而为牛的分子育种提供了一个新的遗传标记，并将在牛的育种中发挥重要作用。
Claims (5)
1.一种牛屠宰性状相关基因CMYA4，其特征在于：在CMYA4基因的第8外显子1092bp处有一个与牛屠宰性状相关的SNP标记位点，为T/C突变。
2.一种牛屠宰性状相关基因CMYA4的克隆，其特征在于：制备步骤如下：
第一步，通过查询NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）和Ensembl数据库（http://asia.ensembl.org/index.html）利用比较基因组学方法获得CMYA4基因mRNA序列：
⑴查询数据库获得Homo sapiens cardiomyopathy-associated protein 4(CMYA4),mRNA序列NM_173167.2和Mus musculus cardiomyopathy-associatedprotein 4(CMYA4),mRNA序列NM_178680.4；
⑵利用NCBI BLAST工具利用Highly similar sequences(megablast)比对牛表达序列标签EST，选取同源性大于80%的表达序列标签序列.EDY048664.1,EE373716.1,EE381791.1,EE376524.1,DV933195.1,DV930911.1,DV797178.1,CB438141.1,通过DNAstar（Madison,WI,USA)程序拼接获得CMYA4mRNA全长序列3430bp。
第二步，根据CMYA4基因mRNA序列，利用比对的方法进行CMYA4基因的染色体定位以及基因结构分析和蛋白特点分析：
第三步，找出CMYA4基因的SNP位点，设计引物扩增含SNP位点的基因组DNA：
⑴找出CMYA4基因的一个SNP位点；
⑵根据基因序列设计引物扩增出待测SNP所在的核苷酸片段；
第四步，RFLP-PCR多态性检测。
3.根据权利要求2所述的牛屠宰性状相关基因CMYA4的克隆，其特征在于：所述制备步骤第三步的第⑵步中设计引物扩增出待测SNP所在的核苷酸片段的引物序列如SEQ ID NO:3~4所示。
4.一种牛屠宰性状相关基因CMYA4的应用，其特征在于：将基因CMYA4中与牛屠宰性状相关的SNP标记作为西门塔尔牛牛肉分子育种遗传标记。
5.根据权利要求4所述的牛屠宰性状相关基因CMYA4的应用，其特征在于：将基因CMYA4中与牛屠宰性状相关的SNP标记作为牛肉分子育种遗传标记的步骤如下：
第一步，牛CMYA4基因HindIII-RFLP基因型与部分性状的关联分析；
第二步，确定基因CMYA4及其SNP位点用于检测个体毛重、胴体重、胴体长、胴体深、皮重等胴体性状。
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