CN102633901A

CN102633901A - 一种螺旋藻多糖及其提取方法

Info

Publication number: CN102633901A
Application number: CN2012101343546A
Authority: CN
Inventors: 丁侃; 李俊; 姚健; 倪鑫淼
Original assignee: Kunming Zhenhua Pharmaceutical Factory Co ltd; Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Yunnan Plant Pharmaceutical Industry Co., Ltd.; Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2012-05-03
Filing date: 2012-05-03
Publication date: 2012-08-15
Anticipated expiration: 2032-05-03
Also published as: CN102633901B

Abstract

本发明是一种螺旋藻多糖及其提取方法。按以下步骤进行： 1）取螺旋藻生药材，用工业乙醇室温下浸泡七天，倾去乙醇，固体物晾干，然后用沸水进行多次提取，流动水透析2天，透析内液浓缩后离心，加入三氯乙酸溶液去除蛋白，加NAOH溶液中和至pH值为6.5～7.5后，流动水透析、浓缩后离心，上清液加入三倍体积的工业乙醇，静置过夜，离心收集沉淀，分别经无水乙醇和丙酮洗涤后，干燥，得水提螺旋藻粗多糖；2）固体残渣碱提得碱提螺旋藻粗多糖；粗多糖经分离、洗脱后得纯多糖。螺旋藻多糖化学结构特征为：主链由1,4-连接α-D-葡萄糖构成，平均每8个主链残基上有一个分支，取代在分支点的6位，分支由1个或2个1?6连接的葡萄糖构成。本发明的螺旋藻多糖的提取方法简单，方便，重现性好。

Description

一种螺旋藻多糖及其提取方法

技术领域

本发明涉及一种螺旋藻多糖及其提取方法。

背景技术

螺旋藻是一类低等植物，属于蓝藻门，颤藻科。它们与细菌一样，细胞内没有真正的细胞核，所以又称蓝细菌。蓝藻的细胞结构原始，且非常简单，它生长于水体中，在显微镜下可见其形态为螺旋丝状。有关螺旋藻多糖抗肿瘤活性研究已有报道，但多数为粗多糖，抗肿瘤活性是来源于哪种多糖，其明确结构如何，未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种螺旋藻多糖以及它的提取方法。

本发明的技术方案为：

螺旋藻多糖的提取方法按以下步骤进行：

1）取螺旋藻生药材（5 kg），加质量浓度 95%工业乙醇室温下浸泡七天，倾去乙醇，固体物晾干，然后用沸水进行多次提取，每次提取时间为4小时，用苯酚-硫酸法检测提取液的糖含量，至糖反应不明显为止，每次的提取液经过滤后合并，加热浓缩至小体积，对流动水透析2天，透析内液浓缩后离心，加入质量浓度30%的三氯乙酸(体积比，1：1 v/v) 溶液去除蛋白，在4度条件下反应4小时，加质量浓度10% NAOH溶液（v/v）中和至pH值为6.5～7.5后，扎袋对流动水透析48小时，透析内液浓缩后离心，上清液加入三倍体积的质量浓度95%工业乙醇，静置过夜，离心收集沉淀，分别经无水乙醇和丙酮洗涤后，于80 ℃干燥，得水提螺旋藻粗多糖；

2）沸水提取后的固体残渣在4 ℃下用5% v/v NaOH溶液浸提3小时，间歇搅拌，过滤，用10% ( v/v) HCl溶液中和至pH 6.5～7.5，扎袋对流动水透析2天，透析内液浓缩后离心，上清液加入三倍体积的 (v/v) 95%工业乙醇沉淀，静置过夜，离心收集沉淀，分别经无水乙醇和丙酮洗涤后，于80 ℃干燥，得碱提螺旋藻粗多糖；

3）水提螺旋藻粗多糖用DEAE-纤维素阴离子交换柱层析进行分离，用去离子水和不同离子强度0.1，0.2，0.3和0.5 mol/L的NaCl溶液进行分步洗脱，分别从去离子水、0.1、0.2，0.3和0.5 mol/L NaCl溶液的洗脱液中分离得到五个组分，洗脱液对去离子水透析，透析内液减压浓缩并冷冻干燥，所得产物分别命名为LXZ-W，LXZ-0.1，LXZ-0.2，LXZ-0.3，LXZ-0.5，取LXZ-W样品用0.2mol/L氯化钠溶解，离心，上清液上S-300凝胶柱，用0.2 mol/L氯化钠洗脱液洗脱得LXZ-W-300组分，经HPLC检测为一纯多糖，分子量在3～10 × 10⁴Da。

所述的螺旋藻多糖化学结构特征为：主链由1, 4-连接α-D-葡萄糖构成，平均每8个主链残基上有一个分支，取代在分支点的6位，分支由1个或2个1®6连接的葡萄糖构成，结构式如下：

本发明的螺旋藻多糖螺旋藻多糖具有抗肿瘤、α糖苷酶抑制、降糖、NF-KB免疫活性、以及抗氧化等功效。

对S180小鼠肉瘤实验，发现小鼠口服螺旋藻多糖的水提和碱提部分均有部分抑制肿瘤生长的作用。进一步实验，用水提多糖的水洗、0.2、0.3、0.5 mol/l Nacl洗脱对小鼠脾细胞进行增殖实验的研究，发现水提多糖的水洗脱部分有较强的促进脾细胞增殖的作用，再在体内验证其组分对S180肉瘤的抑制作用。结果表明，螺旋藻水洗灌胃给药方式对S180肿瘤有抑制作用，给药结束时，螺旋藻水提水洗多糖100mg/kg的T/C%为58.95%，肿瘤重量与对照组比较有显著差异（p < 0.05）。

用小鼠免疫器官的脾细胞进行免疫细胞的增殖实验，结果表明：螺旋藻水洗多糖40、200、1000ug/ml均对脾细胞有促进增殖作用，T/C%分别为148.96%、166.89%、182.99%与不加药组有显著差异（p < 0.05）。螺旋藻0.2mol/l Nacl洗脱多糖8ug/ml和40ug/ml对脾细胞也有促进增值作用，T/C%分别为179.88%和202.81%与不加药组有显著差异（p < 0.05）。

用细胞在内毒素LPS等外界刺激物作用下，LPS通过结合到TLR4 受体后，导致通过MyD88 依赖的和TRIF 的两条途径激活NF-κB，实验时同时给予受试药物，检测在药物作用下是否抑制NF-κB的激活。同时不给予外界刺激，单独给予药物处理，检测在药物作用下是否激活NF-κB。结果，螺旋藻水提水洗40、200、1000ug/ml剂量组均对NF-κB有抑制，抑制率分别为：99.9%、97.6%和92.0%。

用大鼠小肠提取a糖苷酶，检测药物是否对a糖苷酶有抑制作用，结果未见明显抑制。

用双氧水诱导PC12细胞损伤模拟老年患者由于ROS的过度积累而导致的神经元退化，研究多糖的抗衰老作用及其可能的机制。结果，螺旋藻多糖四组分在40、200ug/ml的时候，均对PC12细胞有抗氧化作用，与H2O2-400uM组比较均有显著性差异。

本发明的螺旋藻多糖的提取方法简单，方便，重现性好。

附图说明

图1是本发明的螺旋藻多糖红外图谱。

图2、图3是本发明的螺旋藻多糖HPLC图谱。

图4是本发明的螺旋藻多糖LXZ-W-S300的气相图谱。

图5是本发明的螺旋藻多糖LXZ-W-S300的¹H-NMR图。

图6是本发明的螺旋藻多糖LXZ-W-S300的¹³C-NMR图。

图7是本发明的螺旋藻多糖的提取工艺流程图。

具体实施方式

取5.0 kg 螺旋藻生药材，加20 L 95%工业乙醇，室温下浸泡七天，以除去脂溶性小分子。倾去乙醇，固体物置于通风处晾干，然后用沸水进行提取，每次加入水约30 L，提取时间为4小时，用苯酚-硫酸法检测提取液的糖含量，至糖反应不明显为止，共计提取5次。每次的提取液经过滤后合并，加热浓缩至小体积，对流动水透析2天，透析内液浓缩后离心，1：1(v/v)加入30%的三氯乙酸溶液去除蛋白，在4度条件下反应4小时、加10%NAOH溶液中和至pH值为7左右后扎袋对流动水透析48小时，透析内液浓缩后离心，上清液加入三倍体积的95%工业乙醇，静置过夜。离心收集沉淀，分别经无水乙醇和丙酮洗涤后，于80 ℃干燥，得水提粗多糖LXZ-W为99 g。

沸水提取后的固体残渣在4 ℃下用5% (v/v) NaOH溶液20 L浸提3小时，间歇搅拌，过滤，用10%(v/v) HCl溶液中和至pH 7左右，扎袋对流动水透析2天，透析内液浓缩后离心，上清液加入三倍体积的95%工业乙醇沉淀，静置过夜，离心收集沉淀，分别经无水乙醇和丙酮洗涤后，于80 ℃干燥，得碱提粗多糖LXZ-N 6.4 g。

水提螺旋藻粗多糖用DEAE-纤维素阴离子交换柱（50 cm × 5 cm）层析进行分离，用去离子水和不同离子强度（0.1，0.2，0.3和0.5 mol/L）的NaCl溶液进行分步洗脱，利用DEAE-纤维素对不同结构多糖的吸附力不同的特点将粗多糖分成不同的组分多糖。水提粗多糖LXZ（10 g）上样（10 g样品溶于100 ml去离子水，离心后上样），分别从去离子水、0.1、0.2，0.3和0.5 mol/L NaCl溶液的洗脱液中分离得到五个组分，洗脱液对去离子水透析，透析内液减压浓缩并冷冻干燥，所得产物分别命名为LXZ-W，LXZ-0.1，LXZ-0.2，LXZ-0.3，LXZ-0.5。

取LXZ-W样品100 mg，用10ml的0.2mol/L氯化钠溶解，离心，上清液上S-300凝胶柱，用0.2 mol/L氯化钠洗脱液洗脱得LXZ-W-300组分，经HPLC检测为一纯多糖，分子量在7.4 × 10⁴Da左右。

仪器设备：

SHB－III循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸易有限公司。

85-2型恒温磁力搅拌器：上海思乐仪器有限公司。

DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司。

N-1100D-WD真空旋转蒸发仪：日本EYELA公司。

UV260 可见分光光度计：日本Shimadzu。

GL-21M低温高速离心机：上海离心机研究所有限公司。

Labconco大型冷冻干燥机：美国Labconco公司。

Edwards小型冷冻干燥机：英国Edwards公司。

LKB 2211 自动收集器：瑞典 LKB公司。

Claims

1.一种螺旋藻多糖的提取方法，其特征在于按以下步骤进行：

1）取螺旋藻生药材，加质量浓度 95%工业乙醇室温下浸泡七天，倾去乙醇，固体物晾干，然后用沸水进行多次提取，每次提取时间为4小时，用苯酚-硫酸法检测提取液的糖含量，至糖反应不明显为止，每次的提取液经过滤后合并，加热浓缩至小体积，对流动水透析2天，透析内液浓缩后离心，加入质量浓度30%的三氯乙酸(体积比，1：1 v/v)溶液去除蛋白，在4度条件下反应4小时，加质量浓度10% NAOH溶液v/v中和至pH值为6.5～7.5后，扎袋对流动水透析48小时，透析内液浓缩后离心，上清液加入三倍体积的质量浓度95%工业乙醇，静置过夜，离心收集沉淀，分别经无水乙醇和丙酮洗涤后，于80 ℃干燥，得水提螺旋藻粗多糖；

2）沸水提取后的固体残渣在4 ℃下用5% v/v NaOH溶液浸提3小时，间歇搅拌，过滤，用10% v/v HCl溶液中和至pH 6.5～7.5，扎袋对流动水透析2天，透析内液浓缩后离心，上清液加入三倍体积的 v/v 95%工业乙醇沉淀，静置过夜，离心收集沉淀，分别经无水乙醇和丙酮洗涤后，于80 ℃干燥，得碱提螺旋藻粗多糖；

2.一种用权利要求1所述的螺旋藻多糖的提取方法提取得到的螺旋藻多糖，其化学结构特征为：主链由1, 4-连接α-D-葡萄糖构成，平均每8个主链残基上有一个分支，取代在分支点的6位，分支由1个或2个1®6连接的葡萄糖构成，结构式如下：

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