CN102448314B - 获得二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的酯的浓缩物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了获得二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的酯的浓缩物的方法，所述二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的酯的浓缩物作为药物成分或食物成分用于大规模常规人类消耗，所述浓缩物的特征在于，其具有中性、稳定的器官感受性，没有与海洋生物油衍生物有关的常见副作用，并且具有较低含量的持久性有机污染物。

Description

获得二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的酯的浓缩物的方法
技术领域
本发明涉及用于由粗制或精制海洋生物油获得二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的酯的浓缩物的方法。
背景技术
ω-3型长链多不饱和脂肪酸，即(全顺式)-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸(以下称EPA)和(全顺式)-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(以下称DHA)对食物或药物产品成分的重要性是公知并有记载的，因为其可用于防止动脉硬化和心血管疾病、缓解炎性病症和延迟肿瘤生长等用途。因此，专家推荐每日摄入所述脂肪酸0.5g～10g。
EPA和DHA的最丰富的来源之一为诸如沙丁鱼、茄克鲭鱼、凤尾鱼、鲑鱼和鳕鱼等不同来源的鱼油。通常，所述油中EPA和DHA的总含量为约10重量％～35重量％。因此，用来提供富含EPA和DHA的食物补充剂和药物的最初尝试基于精制鱼油，以除去其特有的令人不悦的气味和味道，从而将其作为成分用于适于人类消耗的食物或药物产品。这些精制方法主要采取了植物油精制油用传统方法并对所述方法进行了专门改造以使其适于有关的原材料(Lindsay，美国专利4,915,876号；Chang，美国专利4,874,629号；Marschner，美国专利4,804,555号；Stage，美国专利4,599,143号；Merck，美国专利4,838,997号)。
然而，目前由精制海洋生物油提供适于作为食物和药物产品用成分的EPA和DHA的尝试还未能成功提供器官感受性可接受并且没有如胃反流、胃和皮肤刺激以及腹积气等常见副作用的产品。这些作用在EPA和DHA消耗量高于1g、也就是相当于约5g鱼油的剂量时恶化，并在使用者中产生所述的副作用。
因此，提供EPA和DHA的努力已针对于由海洋生物油生产这些酸的浓缩物。这些浓缩物可以含有40重量％～95重量％的游离酸形式或酯(通常为乙酯或甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯)形式的EPA和DHA。这些方法的目标在于提供EPA和DHA的浓缩物，该浓缩物具有更好的味道、气味和颜色方面的器官感受性，并可以通常作为活性药物成分或作为食物成分而直接用于人类治疗用产品中。但是，现有技术没有提供能够提供下述产品的方法，所述产品满足具有良好的感官性质、长期储存和氧化稳定性的特性从而随时间推移而保持其理想的器官感受性，也就是这样一种产品，其中不会发生迟早恢复到鱼的气味和味道，并且其没有海洋生物油及其衍生物的常见副作用，如胃反流、胀气和过敏等。
如今市售的EPA和DHA的浓缩物并未直接用作食物成分，而是其以糖浆(其中味道进行了伪装)形式或以糖包衣或微胶囊化的片剂形式进行使用，所有这些均是为了隐藏所述产品中迟早发展的不良的味道或气味，或使其最小化。另外，这些浓缩物并不适于通常需要较高剂量(每日数克)EPA或DHA的治疗用途，因为在这些剂量时浓缩物的不良副作用甚至会更加恶化。
提供来源于海洋生物油的人类消耗用EPA或DHA的另一途径是开发获得纯EPA或DHA的方法，如美国专利6,846,942号中所公开的。然而，获得纯EPA或DHA意味着首先经过获得EPA和DHA的混合物的步骤；在商业上似乎这种途径并不具有优势，并且从表1的文献可见，大部分公开的方法涉及制备含有游离酸形式或酯形式的EPA和DHA的浓缩物。
表1中示出了现有技术中公开的多种方法，其致力于由油获得ω-3脂肪酸的浓缩物。
欧洲专利第0409903号公开了一种用于由动物油或植物油制备含有EPA和DHA的混合物的方法。该方法包括以下步骤：将原材料(即动物或植物油)皂化，立即将皂化的混合物酸化，然后用石油醚提取形成的酸直至竭尽。然后用水清洗提取物，除去溶剂并在0.133Pa的压力和110℃～120℃的温度下对残余物进行一步或多步的分子蒸馏。获得了含有35％～90％EPA和DHA的馏出物。
表1：用于生产DHA和EPA的方法或工艺的专利和专利申请
Figure BDA0000114427410000021
Figure BDA0000114427410000031
美国专利5,130,061公开了一种由鱼油制备高度浓缩的EPA和DHA的乙酯的混合物的方法。该公开的方法包括以下步骤：使鱼油和乙醇进行酯交换，然后用己烷提取酯交换的产物，并通过硅胶色谱法纯化提取物。然后，在约0.001mmHg的压力和约65℃～70℃的温度下对纯化产物进行一步或多步的分子蒸馏。可选地，在蒸馏前，由色谱法所得的产物可以在-40℃于丙酮中结晶，然后进行蒸馏。
很多所公开的方法可以提供具有可接受的器官感受性的产品，但是所有这些方法均会产生上述副作用，并随时间推移发生恢复到鱼的气味和味道，而不像在通过本发明的方法获得的产品中这样，可以在室温的保存条件下保持其中性的器官感受性至少三个月的时间，而不会在使用者中产生明显的副作用。中性的器官感受性是指在不存在用来掩盖其味道或气味的添加剂的情况下具有可接受的器官感受性的产品，而可接受的器官感受性可以理解为这样的产品：由至少9名成员组成的训练有素的感官小组评价，该小组在评价如外观、风味和味道等产品性质时以各个参数大于或等于该参数最大值的60％为合格，在评价酸败性质时以大于或等于该参数最大值的80％为合格。
除了可接受的器官感受性和稳定性的要求以外，EPA和DHA的浓缩物还必须符合一系列关于其污染性有机化合物含量的监管规定，该污染性有机化合物称为持久性有机污染物(POP)，其是在环境中持久存在、在食物链中积累并隐含对人类健康和环境造成不良影响的风险的化学物质。在现今包括2007年5月的斯德哥尔摩公约第三次缔约方会议中认定的17种物质的这些污染物中，其是二氧杂芑、呋喃、多氯联苯、多环芳香烃等的衍生物，这些污染物在鱼油中的浓度随时间而一直增大，因此正在努力开发能够从鱼油中除去这些污染物的方法。在斯德哥尔摩公约的缔约方中，如今对于POP在人类消耗用产品(其中包括鱼油和衍生自鱼油的产品)中的最大容许限度有严格的标准。专门致力于除去POP的方法可见于专利申请US 2005/0256326号和US2004/0022923号以及国际申请WO 02/06430号中公开的方法等。另一组规定污染物为诸如砷、汞、镉和铅等重金属。
欧洲专利第0409903号和美国专利US 5,130,061号中描述的生产EPA和DHA的浓缩物的方法并未提及存在POP的问题。因此，为了比较该公开的方法除去污染物的效率和本发明的方法对于同一目的的效力，用具有已知POP浓度的原材料来再现所述方法，并与由本发明的方法获得的产品进行比较。比较例1和2示出了结果。
美国专利6,846,946中提到了多氯联苯(PCB)的问题，但没有公开关于除去其的方案。
意想不到的是，已经发现本发明的方法不同于现有技术的方法，能够提供具有可接受的器官感受性的产品，而在室内条件储存至少三个月的时间内不会发生恢复到鱼的气味和味道，而且还不同于现有技术的方法，其也能够有效地减少或消除POP和重金属。另外，所公开的方法不会引起具有未知代谢性质的EPA和DHA异构体的不希望的顺式-反式异构化，相反，大为意外的是，所公开的方法在原料中存在反式异构体时降低了其含量。
Pronova BioPharma(www.pronova.com)公开了一种制备用作活性药物成分的EPA和DHA的乙酯的浓缩物的方法。在该方法中，首先将粗制鱼油去酸化以获得精制鱼油，并对该精制鱼油进行提馏工艺，该工艺专门针对于利用美国专利申请2005/0256326号中公开的方法除去污染物。然后将获得的精制鱼油用乙醇进行酯交换。对经酯交换的产物进行数个步骤的分子蒸馏。将馏出物用脲处理，然后进行漂白和分子再蒸馏，获得最终产物，该最终产物具有多达90％的EPA至DHA之间的长链ω-3脂肪酸。该方法的缺点在于提馏步骤中可能发生反式异构化。另外，该市售产品会恢复到鱼的气味和味道，并在摄入该产品时可观察到所有前述的副作用。
由Napro Pharma(www.napro-pharma.no/production)开发的用于制备EPA和DHA的乙酯的浓缩物的方法与Pronova BioPharma的方法类似，但是其不具有提馏步骤和脲处理步骤，但是该产品也会恢复到鱼的气味和味道，并在摄入该产品时也可观察到所有前述的副作用。
与现有的技术中的方法获得的EPA和DHA的浓缩物相比，由本发明的方法获得的浓缩物相对于现有技术具有令人惊讶且预料不到的优点，其优点将由本发明的具体描述而变得明显。这些优点包括以下特性：器官感受为中性且稳定的产品，其不具有副作用，且持久性有机污染物的水平符合国际监管标准。另外，如上所述，该方法不仅可防止顺式-反式异构体的形成，而且相反，以令人惊讶且预料不到的方式，其在原料中存在反式异构体时降低了这些异构体的浓度。由于所有这些结合的特性，由本发明的方法获得的产品特别适合用于需要高剂量EPA和DHA的疗法，并适于用作食物成分。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种用于由海洋生物油制备EPA和DHA的酯的浓缩物的新型方法，该浓缩物具有中性的器官感受性、稳定性以及低于容许限度的持久性有机污染物含量，因此适于作为药物或食物成分供人类消耗。
所述目的通过由包括下述步骤的方法获得的包含EPA和DHA的乙酯的浓缩物而实现：
a)在不高于100℃的温度下使粗制或精制海洋生物油接触一种或多种碱和水，直至获得包含皂化的海洋生物油的混合物；
b)使皂化的所述混合物与一种或多种有机溶剂接触以形成精制相和提取相，所述精制相包含碱的脂肪酸盐；
c)使所述提取相与所述精制相分离；
d)混合所述精制相和酸水溶液，以形成水相和包含脂肪酸的非水相；
e)使所述水相与所述非水相分离；
f)在不超过150℃的温度下将经分离的所述非水相与醇和酯化催化剂混合，直至获得包含脂肪酸的酯的酯化混合物；
g)从所述酯化混合物中除去所述催化剂，以获得不含催化剂的酯化混合物；
h)从所述不含催化剂的酯化混合物中除去溶剂，以获得脂肪酸的酯；和
i)将所述酯在短程蒸馏塔中于至多180℃的温度和小于1mbar的压力下进行蒸馏，以获得包含EPA和DHA的酯的浓缩物。
该方法的各步骤以配合方式协同达成本发明的目的。
具体实施方式
原材料
要实施本发明，可以使用含有EPA或DHA的任何原材料，优选鱼油。适合本发明的原材料有例如沙丁鱼、凤尾鱼、茄克鲭鱼、太平洋鲭鱼、吞拿鱼、鳕鱼、鲑鱼、磷虾和软体动物的油以及这些油的混合物，海生动物加工的副产品(如海生动物内脏)的油，以及如微拟球藻(Nannochioropsis sp)等微藻类和浮游生物的油。在本发明中，术语“油”还包括含有EPA或DHA的脂肪或蜡以及它们的副产物，如甘油酯和脂肪酸。
虽然优选使用Totox值(总氧化值)低于30的原材料，但是本发明的方法还可以使用如实施例中所示的Totox值更高的原材料来实施。
要实施本发明的方法，使用碱来将粗制或精制海洋生物油皂化，以使粗制或精制海洋生物油中存在的脂肪酸的甘油酯或其他酯水解，从而获得皂化的混合物，所述皂化的混合物包含粗制或精制海洋生物油中可皂化化合物的碱盐和不可皂化的物质。为此，使粗制或精制海洋生物油与水和一种或多种合适的碱以及可选的一种或多种溶剂(如醇和烃)或一种或多种合适的抗氧化剂接触。用于皂化过程的合适的碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂和氢氧化镁以及这些氢氧化物的混合物。碱的量为每100g粗制或精制海洋生物油用5克～40克碱，但是碱与粗制或精制海洋生物油的优选比率为约15克碱/100g粗制或精制海洋生物油。水的用量为10g～500g水/100g粗制或精制海洋生物油，但是水与粗制或精制海洋生物油的优选比率为50g～200g水/100g粗制或精制海洋生物油。在使用如乙醇等醇时，醇的量为10g～500g醇/100g粗制或精制海洋生物油，但是醇与粗制或精制海洋生物油的优选比率为50g～200g醇/100g粗制或精制海洋生物油。在使用如己烷等烃时，溶剂的量为10g～500g溶剂/100g粗制或精制海洋生物油，优选为50g～200g溶剂/100g粗制或精制海洋生物油。在使用合适的抗氧化剂(如BHT、生育酚或抗坏血酸以及它们的衍生物)时，抗氧化剂的用量优选不大于1g/100g粗制或精制海洋生物油。粗制或精制海洋生物油、水、一种或多种碱和可选的一种或多种溶剂之间的接触可以在搅拌下的容器中于10℃～100℃的温度(优选40℃～85℃的温度)和0.1bar～5bar的压力(优选大气压)下连续地或分批地进行。在分批操作的情况下粗制或精制海洋生物油的皂化完成所用的时间，或在连续操作的情况下的停留时间为10分钟～400分钟，优选为30分钟～120分钟。
将包含皂化的海洋生物油的混合物与一种或多种有机溶剂接触直至形成提取相和与该提取相不相溶的精制相，该提取相包含有机溶剂和溶解物质，精制相包含碱的脂肪酸盐。这些相通过沉降或离心分离。包含皂化的粗制或精制海洋生物油的混合物与有机溶剂间的接触可以在10℃～100℃的温度(优选20℃～80℃)和0.1bar～5bar的压力(优选大气压)下分批地或连续地进行。适用于提取的溶剂或有机溶剂混合物可以选自由石油醚、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、环己烷、甲基环己烷、丙酮、甲苯、二甲苯、甲基二甲苯、乙苯、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二甲亚砜和四氢呋喃组成的组。不过，优选的溶剂包括脂肪烃，如石油醚、戊烷、己烷、庚烷、辛烷或这些溶剂的混合物。所述一种或多种溶剂与皂化的混合物的比率为50g～1000g/100g混合物，优选为100g～500g/100g混合物。在将精制相与提取相分离后，需要时，可以再次将其在所公开的条件下与一种或多种溶剂接触，以形成二次提取相和二次精制相，需要时还可以进行进一步提取精制相的过程。
在酸化步骤中，将精制相与如硫酸、盐酸、磷酸、乙酸、三氯乙酸或碳酸等酸的溶液接触，直至形成水相和包含脂肪酸的非水相。酸化步骤中酸的用量可以是皂化步骤中使用的碱的化学计量的至多1.5倍，优选是精制相的全部中和所需的碱的化学计量的1.05倍。使精制相酸化所需的酸的量可以通过测量精制相的总碱度来确定。可以在搅拌下的容器中于10℃～100℃(优选为20℃～60℃)的温度和0.1bar～5bar(优选为大气压)的压力下分批地或连续地进行精制相与酸的接触以形成酸化混合物，在连续操作的情况下停留时间为1分钟～120分钟，优选为5分钟～60分钟。可选地，混合物还可以包括诸如BHT、生育酚或抗坏血酸以及它们的衍生物等抗氧化剂或多种抗氧化剂的混合物。随后，通过沉降或离心将非水相与水相分离。将分离的非水相用包含水、一元醇、丙酮的混合物或者硫酸钠或氯化钠的水溶液在10℃～100℃的温度(优选20℃～60℃)和0.1bar～5bar的压力(优选大气压)下进行清洗。经清洗的非水相可以可选地进行过滤来清除不溶固体。以下使用的术语“非水相”指代在前述酸化步骤后获得的经清洗的非水相以及经清洗和过滤的非水相。
可选地，上述非水相的任一种可以通过优选在减压和低于150℃的温度下蒸发溶剂来部分地或全部地脱除溶剂，所得的产物称为部分或全部脱除溶剂的非水相。
可选地，上述非水相或部分或全部脱除溶剂的非水相中的任一种可以进行结晶步骤。为此，将该相与溶剂或溶剂混合物混合，所述溶剂或溶剂混合物选自由石油醚、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、环己烷、甲基环己烷、甲苯、二甲苯、甲基二甲苯、乙苯、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烯、三氯乙烯、全氯乙烯、二甲亚砜、二甲基甲酰胺和四氢呋喃、甲醇、乙醇、丙酮和甲乙酮组成的组。优选的溶剂为己烷、乙醇、丙酮或这些溶剂的混合物。该步骤中溶剂的用量可以为50g～1000g/100g被结晶的相，优选为100g～500g/100g被结晶的相。随后将形成的混合物冷却到0℃～-50℃、优选为-20℃～-40℃的温度，直至在液相中形成固态结晶相。可以分批地或连续地并优选在大气压下进行结晶的操作。随后将结晶的固相和液相优选在相同的结晶最终温度下通过过滤或离心来分离。然后，通过蒸发溶剂来部分地或全部地除去液相中的溶剂，获得的产物随后被称作在结晶步骤中生成的第一部分或全部脱除溶剂的相，该相包含的EPA和DHA的浓度高于使用的粗制或精制海洋生物油中的浓度。
可选地，非水相的任一种、或部分或全部脱除溶剂的非水相或在结晶步骤中生成的第一部分或全部脱除溶剂的相中的任一种可以使用脲或与脂肪酸或其衍生物形成络合物或加合物的其他化合物进行处理。为此，在50℃～100℃的温度下形成溶体，其中该溶体由5g～40g经脲处理的相/100g形成络合物或加合物的化合物在有机溶剂中的溶液构成，该溶液优选为脲的乙醇溶液，其含有约30g脲/100g乙醇。然后，将溶体冷却至室温以下，形成包含络合物或加合物的固相和不含固体的液相。通过过滤或离心将络合物或加合物与不含固体的液相分离，并且用水或酸性溶液清洗该不含固体的液相，直至将溶解在该相中的形成络合物或加合物的剩余化合物提取尽。然后，部分地或全部地除去不含固体的液相中的溶剂，以获得下述相，该相被称作在络合物形成步骤中生成的第二部分或全部脱除溶剂的相，且包含的EPA和DHA的浓度高于原材料中的浓度。
然后，对非水相的任一种、或部分或全部脱除溶剂的非水相、在结晶步骤中生成的第一部分或全部脱除溶剂的相或在络合物形成步骤中生成的第二部分或全部脱除溶剂的相中的任一种进行酯化步骤。为此，将该相与如甲醇或乙醇等一元醇或与如甘油等多元醇以500g醇/100g该相～20g醇/100g该相的比率(优选为20g～200g)混合，并与如硫酸、对甲苯磺酸、甲磺酸或乙磺酸等催化剂或者与如安伯莱特等树脂以0.05g～10g催化剂/100g该相的比率混合。酯化步骤可以分批地或连续地在搅拌下的反应器中于10℃～150℃的温度(优选30℃～80℃)和0.1bar～5bar的压力(优选大气压)下进行。在分批操作的情况下酯化的时间或在连续操作情况下的停留时间为30分钟～600分钟，优选为60分钟～240分钟。在酯化步骤结束时获得了包含脂肪酸的酯的酯化混合物。然后，在固态催化剂的情况下通过过滤从酯化混合物中除去催化剂，或者在液态催化剂的情况下通过中和并用水溶液清洗来除去催化剂，以形成不含催化剂的酯化混合物。优选在减压和低于150℃的温度下对不含催化剂的酯化混合物进行脱除溶剂蒸发，以获得包含脂肪酸的酯的脱除溶剂的混合物。
随后，将脱除溶剂的脂肪酸的酯的混合物在短程蒸馏塔中进行蒸馏，以获得馏出物和残余物。
馏出物或残余物可以在上述条件下再次蒸馏以获得第二馏出物和第二残余物。可以重复该过程直至获得含有所需浓度的EPA和DHA的酯或EPA和DHA浓缩物的馏出物或残余物。蒸馏可以在低于180℃(优选低于150℃)的温度和低于1mbar(优选低于0.1mbar)的压力下进行。所得的浓缩物可以包含多达95重量％的EPA和DHA酯。
含有EPA和DHA或任何酯的流分可以进一步进行一个或多个其他纯化步骤，如通过在低于-5℃的温度下冷却并经过滤或离心分离固体来进行分馏；在减压和低于200℃(优选低于150℃)的温度下使用用于除臭的氮气或蒸汽在填充柱或盘式柱中除臭；通过使用硅藻土、活性炭、沸石和分子筛等进行吸附。
同样，可选地，EPA和DHA的浓缩物可以用甘油进行酯交换，以形成EPA和DHA的浓缩甘油酯。
可以向EPA和DHA的浓缩物中添加一种或多种合适的抗氧化剂，如生育酚、生育酚酯、抗坏血酸和它们的衍生物、迷迭香提取物、博尔多叶提取物等。优选的是，浓缩物中抗氧化剂的量小于浓缩物的1重量％，优选小于0.5％。
获得的EPA和DHA的浓缩物没有与使用鱼油衍生物有关的不良副作用，如胃反流、胃和皮肤刺激和腹积气等。另外，令人惊讶的是EPA和DHA的浓缩物并不表现出恢复到鱼的气味或味道，使得其能够用作食物或药物产品的成分，而无需借助味道和气味掩盖剂、胶囊化和微胶囊化。而且，所公开的方法显著减少了鱼油中可能存在的持久性有机污染物和重金属的含量，使之低于国际上允许的最大水平。此外，该方法不会生成反式脂肪酸，而且令人惊讶并预料不到的是，其还可以在原料中存在反式脂肪酸时降低其含量。
附图说明
参照图1，通过管道1将粗制鱼油供应到皂化反应器4(搅拌下的容器)，还经由管道2以等于油的皂化指数或至多超过20％的比率将氢氧化钠溶液流供应到该反应器，并且经由管道3将50％的乙醇水溶液流供应给该反应器。反应器4在40℃～85℃的温度和1bar～2bar的压力下运行，停留时间为45分钟，以生成皂化的混合物。所述皂化的混合物经由管道7供应到在2bar～5bar的压力和20℃～60℃的温度下运行的反向流提取柱8。经由管道9向提取柱8供给沸点为60℃～80℃的脂肪烃的混合物，以经由管道10回收包含脂肪烃混合物和该相中提取的物质的提取相，并经由管道11回收包含碱的脂肪酸盐的精制相。精制相经由管道11供应到酸化反应器12，并通过管道13以等于精制相的总碱度或至多超过10％的比率将盐酸流供应到该反应器。反应器12在搅拌下于20℃～70℃的温度、1bar～2bar的压力和至多30分钟的停留时间下运行，以生成酸化混合物。酸化混合物经由管道14供应到沉降器15中，以使非水相与酸化的水相分离。沉降器15在20℃～70℃的温度、1bar～2bar的压力和5分钟～60分钟的停留时间下运行。经由管道16除去水相来进行其后续处理，以回收溶剂和甘油。经由管道17将在沉降器15分离的非水相供应到清洗反应器18中，在此将其于搅拌下与包含50％乙醇水溶液的流19接触，以产生清洗混合物。反应器18在20℃～70℃的温度、1bar～2bar的压力和1分钟～30分钟的停留时间下运行。反应器18的清洗混合物经由管道20供应到沉降器21中，以将轻相与清洗混合物的重相分离。沉降器21在20℃～70℃的温度、1bar～2bar的压力和5分钟～60分钟的停留时间下运行。经由管道22除去重相来进行其后续处理，以回收溶剂或将其部分或全部再循环至清洗反应器18。经由管道23将沉降器21中分离的轻相供应到酯化反应器24，还经由管道25向该反应器供应对甲苯磺酸溶于乙醇的溶液流。反应器24在搅拌下于40℃～85℃的温度、0.5bar～2bar的压力和180分钟的停留时间下运行，以产生酯化混合物。酯化混合物经由管道26供应到清洗中和反应器27，在此其在搅拌下于20℃～70℃的温度、1bar～2bar的压力和1分钟～30分钟的停留时间下与包含5％碳酸钠水溶液的流28接触，以生成经中和的清洗混合物。清洗反应器27的经中和的清洗混合物经由管道30供应到沉降器31，以分离脂肪酸酯的混合物和水相。沉降器31在20℃～70℃的温度、1bar～2bar的压力和6分钟～60分钟的停留时间下运行。经由管道32除去水相来进行其后续处理，以回收溶剂。经由管道33将沉降器31中分离的脂肪酸酯的混合物供应到降膜蒸发器34，该降膜蒸发器在50℃～180℃的温度、1mbar～100mbar的压力和不多于30分钟的停留时间下运行，以获得馏出物和包含脂肪酸酯的脱除溶剂的残余物。馏出物经由管道35供应到未示出的储罐中。脱除溶剂的脂肪酸酯经由管道36供应到短程蒸发器37，该短程蒸发器在50℃～180℃的温度、0.001mbar～1mbar的压力下运行。经由管道38从短程蒸发器37中除去馏出物，并经由管道39取出短程蒸发器37中的蒸馏残余物并供应到短程蒸发器40。短程蒸发器40在50℃～180℃的温度、0.001mbar～1mbar的压力下运行。经由管道41除去短程蒸发器40中的蒸馏残余物，并经由管道42取出短程蒸发器40中的馏出物，该馏出物包含EPA和DHA的酯的浓缩混合物。
实施例
实施例1～11示出了可以实施本发明的方式以及所得浓缩物的优异的器官感受性和氧化稳定性。
比较例1(EP 0409903)
根据EP 0409903公开的方法来由鲑鱼油制备EPA和DHA的乙酯浓缩物。
将300g特征如表2所示的鲑鱼油(样品M1)、150g乙醇和150g 28％的氢氧化钠蒸馏水溶液放入2000ml锥形瓶中。对混合物进行回流，并用氮气吹扫1小时，使得鲑鱼油充分皂化，然后加入160g 26％的盐酸水溶液，并强烈摇动该混合物5分钟。然后，加入450ml石油醚并再次摇动。将该混合物放入2000ml分液漏斗中，使其沉降以分离成上层相和下层相。除去上层相，并用将下层水相用450ml石油醚提取两次以上。将石油醚提取物收集在2000ml漏斗中，并用水清洗直至中性。将经清洗的提取物在10mbar和60℃下运行的旋转蒸发器中蒸发。随后，除去微量的石油醚，并将旋转蒸发器中的蒸发残余物供应到短程蒸馏塔KDL5UIC，其流速为1250ml/h，夹套温度为90℃，冷凝器温度为-4℃，辊速为350rpm且压力为4mbar。获得了鲑鱼油的脂肪酸混合物(样品M2)，其具有30.1％的长链ω-3脂肪酸。
将鲑鱼的脂肪酸混合物供应到短程蒸馏塔KDL5 UIC中，其流速为100ml/h，夹套温度为65℃，冷凝器温度为4℃，辊速为350rpm且压力为0.005mbar；并获得第一馏出物和第一残余物。对第一残余物在温度为85℃进行第二步骤的短程蒸馏，获得第二馏出物和第二残余物。第二馏出物含有52.2％的长链ω-3脂肪酸(样品M3)。
表2中示出了比较例1的样品分析。
表2：比较例1的样品分析
Figure BDA0000114427410000121
比较例2(US 5,130,061)
根据US 5,130,061公开的方法来由鲑鱼油制备EPA和DHA的乙酯浓缩物。
在2000ml锥形瓶中混合300g比较例1中使用的鲑鱼油和200g 5％的硫酸无水乙醇溶液。对混合物进行回流并用氮气吹扫8小时。在减压下通过蒸馏除去过量的乙醇，同时将反应混合物冷却至室温。蒸馏残余物用400ml己烷稀释并用500ml水清洗。强烈摇动该非均相混合物。在分液漏斗中将水相与己烷相分离，并重复用水清洗己烷相，直至水相的pH为中性。通过使经清洗的己烷提取物经过硅胶柱来纯化该提取物。然后在至多10mbar和60℃的旋转蒸发器中蒸发纯化的己烷提取物。除去微量的溶剂，并将蒸发残余物供应到短程蒸馏塔KDL5 UIC中，其流速为1250ml/h，夹套温度为90℃，冷凝器温度为-4℃，辊速为350rpm且压力为4mbar。获得了含有27.9％长链(酯化的)ω-3脂肪酸的乙酯混合物(样品M4)。
将乙酯的混合物供应到短程蒸馏塔KDL5UIC中，其流速为100ml/h，夹套温度为65℃，冷凝器温度为4℃，辊速为350rpm且压力为0.005mbar；获得第一馏出物和第一残余物。对第一残余物在温度为85℃进行第二步骤的短程蒸馏，获得第二馏出物和第二残余物。第二馏出物含有51.6％的长链(酯化的)脂肪酸(样品M5)。
表3中示出了比较例2的样品分析。
表3：比较例2的样品分析
Figure BDA0000114427410000131
实施例1
制备鲑鱼油的EPA和DHA的乙酯的浓缩物。
将300g比较例1中使用的鲑鱼油、150g乙醇和150g 28％的氢氧化钠蒸馏水溶液放入2000ml锥形瓶中。对混合物进行回流并用氮气吹扫1小时，使得鲑鱼油充分皂化。
将皂化的混合物放入3000ml分液漏斗中，并向漏斗中加入150g乙醇、150g蒸馏水和900g己烷。强烈摇动所得的混合物并静置沉降。分离上层己烷相，下层水相用700ml己烷提取三次以上。在减压下于旋转蒸发器中使己烷提取物脱除溶剂。
通过加入200g 20％的盐酸水溶液使水相酸化。所得的有机物用多份50％的乙醇水溶液清洗至pH为4～5，然后将其在10mbar和60℃的旋转蒸发器中蒸发。获得了含有29.6％长链ω-3脂肪酸的脂肪酸混合物(样品M6)。
将脂肪酸混合物与100g 1.0％硫酸无水乙醇溶液混合并回流2小时。在混合物达到恒定酸值时，视为反应完成。将反应后的混合物用40g 10％碳酸钠蒸馏水溶液中和，然后用多份40g蒸馏水清洗。然后，将混合物在10mbar和60℃的旋转蒸发器中蒸发。除去微量的溶剂，并将蒸发残余物供应到短程蒸馏塔KDL5 UIC中，其流速为1250ml/h，夹套温度为90℃，冷凝器温度为-4℃，辊速为350rpm且压力为4mbar。获得了含有30.9％长链ω-3脂肪酸的乙酯混合物(样品M7)。
将乙酯混合物供应到短程蒸馏塔KDL5 UIC中，其流速为100ml/h，夹套温度为65℃，冷凝器温度为4℃，辊速为350rpm且压力为0.005mbar；获得第一馏出物和第一残余物。将第一残余物在85℃的温度下于短程蒸馏塔中再次进行蒸馏，获得第二馏出物和第二残余物。第二馏出物含有52.3％的长链ω-3脂肪酸(样品M8)。
表4中示出了实施例1的样品分析。
表4：实施例1的样品分析
实施例2
由沙丁鱼油制备EPA和DHA的乙酯的浓缩物。
使用Totox值为45的沙丁鱼油重复实施例1。表5示出了样品分析。
表5：实施例2的样品分析
  沙丁鱼油   脂肪酸   乙酯   第二馏出物
  EPA   16.1   16.3   16   30.1
  DHA   6.2   6.1   6.2   15.4
  总ω-3   24.1   24.2   23.4   48.2
  PCB，ppb   104.6   41.6   44.1   18.5
  作为二氧杂芑的PCB，ppt   3.2   0.3   0.4   0.6
  二氧杂芑+呋喃，ppt   2.1   0.3   0.3   0.4
  过氧化物，meq/kg   10.7   3.5   3.6   0.1
  茴香胺   23.6   1.9   1.8   0.1
  Totox   45   8.9   9.0   0.2
  重金属
  砷，ppb   980   345   330   ＜100
实施例3
由鲭鱼油制备EPA和DHA的乙酯的浓缩物。
使用Totox值为33的茄克鲭鱼油重复实施例1。表6示出了样品的结果。
表6：实施例3的样品分析
  茄克鲭鱼油   脂肪酸   乙酯   第二馏出物
  EPA   5.4   5.4   5.1   15.7
  DHA   16.8   16.9   16.3   32.2
  总ω-3   24.4   24.6   22.6   50.1
  PCB，ppb   91   26   27   18
  作为二氧杂芑的PCB，ppt   3.7   0.9   1.0   1.1
  二氧杂芑+呋喃，ppt   3.1   0.5   0.5   0.4
  过氧化物，meq/kg   9.2   4.1   3.8   0.3
  茴香胺   14.6   1.1   1.1   0.2
  Totox   33   9.3   8.7   0.8
  重金属
  砷，ppb   890   210   196   ＜100
实施例4
在200升反应器中由沙丁鱼油制备EPA和DHA的乙酯的浓缩物。
在200升带折流板、夹套和涡轮搅拌的不锈钢反应器中装入15kg乙醇、15kg18.7％的氢氧化钠水溶液和15kg特征如表7所示的沙丁鱼油(样品M10)。将混合物加热至55℃1小时，然后冷却至45℃。然后加入45kg己烷并搅拌10分钟。将混合物静置沉降15分钟，并将有机相与水相分离。使用同一工序提取水相两次。收集己烷提取物并在减压下脱除溶剂。将水相或精制相在25℃的温度用28kg 10％的盐酸溶液进行酸化，并搅拌该混合物5分钟。将酸化的混合物静置沉降15分钟，以分离水相和有机相。有机相在取出后用10kg 50％的乙醇水溶液清洗至pH5。经清洗的有机相进行过滤以分离出悬浮固体。经清洗和过滤的有机相用己烷稀释至20重量％，并转移至150升的设置有锚式搅拌器和冷却夹套的第二反应器，并冷却至-25℃。-25℃的冷却混合物在袋滤器中经过10微米的聚酯筛网进行过滤。将所得滤液装入上述200升反应器中，并在55℃和200mbar的压力下加热。脱除溶剂的脂肪酸的混合物在80℃与20kg脲溶于55kg乙醇的溶液接触。搅拌该混合物以与脲形成络合物，然后将其冷却至15℃。通过过滤分离析出的固体，并获得不含固体的滤液。将不含固体的滤液冷却至1℃，进行过滤以获得第二不含固体的滤液。将第二不含固体的滤液与20kg己烷和溶解于50kg水中的3kg盐酸混合，搅拌并静置沉降。分离出酸性水相，并用5kg水清洗有机相直至pH为中性。有机相在80℃和5mbar下脱除溶剂。获得了2.3kg含有77.2％ω-3脂肪酸的脂肪酸混合物(样品M11)。
然后，将溶解于10kg乙醇中的40g硫酸装入反应器中，并在80℃加热。随后，将反应器冷却至40℃，并加入10kg己烷以及溶解于5kg水中的70g碳酸钠。将混合物搅拌5分钟，然后在沉降后将水相与有机相分离。用5kg水清洗有机相，并在80℃和50mbar下脱除溶剂。获得了2.5kg含有70.9％ω-3脂肪酸的脂肪酸乙酯的混合物(样品M12)。
除去上述乙酯中的微量溶剂，并将混合物供应到短程蒸馏塔KDL5UIC，其流速为1250ml/h，夹套温度为80℃，冷凝器温度为-5℃，辊速为350rpm且压力为4mbar。将经蒸馏的乙酯混合物供应到短程蒸馏塔KDL5 UIC，其流速为90ml/h，夹套温度为85℃，冷凝器温度为4℃，辊速为350rpm且压力为0.005mbar，获得第一馏出物和第一残余物。
在70℃和减压下将第一残余物与1％的Tonsil混合30分钟，并进行过滤，获得纯化的滤液，将该滤液在98℃的温度下进行第二步骤的短程蒸馏，获得第二馏出物和第二残余物。第二馏出物含有86.2％的长链ω-3脂肪酸。将第二馏出物冷却至-25℃保持12小时然后进行过滤。将所得滤液供应到温度为100℃的除臭柱，其使用130℃的氮气在15mbar的压力下进行除臭。获得了经除臭的长链ω-3脂肪酸的乙酯的浓缩物(样品M13)，并向其中加入浓度为2550ppm的生育酚酯、抗坏血酸棕榈酸盐和迷迭香提取物的混合物。
表7中示出了实施例4的样品分析。
表7：实施例4的样品分析
Figure BDA0000114427410000171
实施例5
在200升反应器中由鲭鱼油制备EPA和DHA的乙酯的浓缩物。
在200升带折流板、夹套和涡轮搅拌的不锈钢反应器中装入15kg乙醇、15kg17.4％的氢氧化钠水溶液和15kg特征如表8所示的实施例3的茄克鲭鱼油。将混合物在75℃加热1小时，然后冷却至45℃。接下来，加入45kg己烷并搅拌10分钟。将混合物静置沉降15分钟，并将有机相与水相分离。使用同一工序提取水相两次。将水相或精制相在25℃的温度下用26kg 10％的盐酸溶液进行酸化，并搅拌5分钟。将酸化混合物静置沉降15分钟，然后将水相与有机相分离。有机相用10kg 50％的乙醇水溶液清洗直至pH5。经清洗的有机相与溶解于10kg乙醇中的100g硫酸混合，并加热蒸馏出溶剂的混合物直至温度达到80℃。随后，将反应器冷却至40℃，加入溶解于5kg水中的350g碳酸钠，并搅拌10分钟。分离出水相。用5kg水清洗有机相，并在80℃和50mbar下脱除溶剂。获得了14.6kg含有24.7％ω-3脂肪酸的脂肪酸乙酯的混合物(样品M14)。
除去上述乙酯中的微量溶剂，并将混合物供应到短程蒸馏塔KDL5UIC，其流速为1250ml/h，夹套温度为80℃，冷凝器温度为-5℃，辊速为350rpm且压力为4mbar。将经蒸馏的乙酯混合物供应到短程蒸馏塔KDL5 UIC，其流速为90ml/h，夹套温度为85℃，冷凝器温度为4℃，辊速为350rpm且压力为0.005mbar，获得第一馏出物和第一残余物。
随后，将第一残余物在96℃的温度下进行第二短程蒸馏，获得第二馏出物和第二残余物。第二馏出物含有51.2％的长链ω-3脂肪酸(样品M15)。最后，将第二馏出物与2000ppm的生育酚乙酸酯(Grindox Toco 70，Danisco)混合。
表8中示出了实施例5的样品分析。
表8：实施例5的样品分析
实施例6
实施例2和3的浓缩物中的EPA的顺式/反式异构体。
在10℃将1克实施例2的第二馏出物用氢氧化钾的含水甲醇溶液皂化24小时。然后，将皂化的混合物在10℃用1％的盐酸进行酸化。酸化的混合物用石油醚提取三次。收集石油醚提取物，用20％的甲醇水溶液清洗，并将经清洗的提取物在20℃和5mbar的旋转蒸发器中脱除溶剂。使用三氟化硼使残余物甲基化。获得了870mg长链ω-3脂肪酸的甲酯。以相似的方式制备实施例3的第二馏出物中的长链ω-3脂肪酸的甲酯样品。
类似地，使用上述技术制备实施例2的沙丁鱼油和实施例3的茄克鲭鱼油中的脂肪酸的甲酯。
将全顺式(5，8，11，14，17)二十碳五烯酸的甲酯标样注入安捷伦科技的气相色谱仪系列7890A中，所述色谱仪配有选择性质量检测器5975Cinert，使用100米SP 2560柱，具有0.25mm的内径和0.20微米的膜厚度。色谱程序为：初始温度140℃保持5分钟；以2℃/分钟的速率升温至240℃，并在240℃保持30分钟。注入器和检测器温度为250℃。使用特纯氦气作为载体。将标样的质谱储存在数据库中。
然后，将由实施例2和3的第二馏出物的样品制得的甲酯样品和由实施例2和3的原始油获得的甲酯样品注入色谱仪中。使用软件Chemstation对于每一个甲基化样品获得99％的“Match Quality”。另外，比较经色谱分析的全部甲酯的色谱图和光谱图，没有探测到与EPA异构化有关的新峰。
另外，根据AOCS Ce 1h-05的方法由16～22个碳原子确定脂肪酸的反式异构体的含量。结果如表9所示。可以看出，在实施例2和3的测试中，没有生成反式异构体，而且预料不到的是，最终产物中的所述异构体减少。
表9：实施例2和3的浓缩物中的反式脂肪酸的分析
Figure BDA0000114427410000191
实施例7
实施例2和3的脂肪酸的乙酯样品的感官评价和稳定性测定。
由训练有素的12名成员的小组评价器官感受性和稳定性。将要评价的样品以装于编有3个随机数字的小玻璃杯中并含有15ml样品的形式提供给各个成员。在上午约11:00在感官评价实验室中进行评价。
为了评定产品的感官特性，考虑了以下参数：外观、香味、味道、酸败度、额外味道和气味的有无。所述参数的测量量表为1分～9分，其中9分在味道的情况中表示“优异的、典型的、特别宜人的”，1分表示“奇怪的、不宜人的、恶臭的”。在酸败度的情况中，标准为5分范围，其中5分是指“无酸败”，1分是指“严重酸败”。
表10示出了新鲜样品(实施例5(A))中的脂肪酸的乙酯样品M15和同一样品在室温下储存29周后在器官感受性评定中获得的平均结果。样品中没有加入味道、气味或外观掩盖剂。
表10：实施例7的器官感受性评价和稳定性的结果
Figure BDA0000114427410000201
外观：分数7.5，表明外观“良好”。
香味：获得了7.6的得分，品质为“良好”。
味道：关于味道，样品的分数为7.1，表明“良好”。
酸败度：样品的分数为4.6，表明“酸败度低”。
可以看出，全部样品均具有可接受的器官感受性和稳定性。
实施例8
摄入样品的副作用。
为了比较由鱼油获得的EPA和DHA的不同浓缩物引起的副作用，将10名志愿者分成A和B两组，每组5人。
将900g酸奶与100克含有33g EPA和22g DHA的市售脂肪酸乙酯制剂混合(样品1)。另一方面，将100g实施例5的乙酯样品M15也与900g酸奶混合(样品2)。
A组的各个组员摄入150g样品1的酸奶混合物，B组的各个组员摄入150g样品2的酸奶混合物。摄入3小时后，A组的4名组员和B组的1名组员报告经历了胃反流。
一周后，如上所述，使用新制备的样品1和样品2对A组和B组的相同成员重复该测试，但此时对A组组员提供样品2，对B组组员提供样品1。摄入3小时后，A组没有组员经历胃反流，而B组的全部5名组员均报告经历了胃反流。
可以得出，根据本文公开的方法制得的EPA和DHA的浓缩物没有表现出通常与摄入鱼油衍生物相关的特征性副作用。
实施例9
在氧化条件下保存的样品的感官评价。
将装有20g实施例5的样品M15的直径为15cm的皮氏培养皿保存在45℃的强制对流的烘箱中6小时。然后，从烘箱中移出样品并使之冷却。
由5人小组评价样品。没有探测到鱼味。
用比较例1的样品M3重复该测试。小组注意到有酸败的鱼味。
用比较例2的样品M5重复该测试。同样，小组注意到有酸败的鱼味。
用实施例8中使用的33/22EPA/DHA的脂肪酸乙酯样品重复该测试。同样，小组注意到有酸败的鱼味。
实施例10
样品M15的氧化稳定性的测定。
利用Rancimat测试法测量一份实施例5的样品M15的氧化稳定性。80℃下的诱导时间为28.11±0.97小时。同时，对实施例8中使用的33/22乙酯样品进行Rancimat测试。80℃下的诱导时间为1.67±0.10小时。
实施例11
样品的质谱。
在与配有质量检测器的5975Cinert连接的HP7890色谱仪中通过GC-MS测定实施例4的己烷残余物样品。色谱报告表明样品中存在多于50种的浓度高于1000ppm的化合物，如表11所示。
表11：实施例4的己烷残余物的GC-MS分析
Figure BDA0000114427410000211
Figure BDA0000114427410000221
从表11所示的数据可以得出，所公开的方法能够除去海洋生物油中的一大类化合物，包括非ω-3脂肪酸的天然存在的化合物和污染物，这些化合物可能是许多鱼油浓缩物的副作用以及味道和气味的不良恢复的原因。

Claims (11)

1.一种用于由粗制或精制海洋生物油获得EPA和DHA的酯的浓缩物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a)在至多100℃的温度下使粗制或精制海洋生物油接触一种或多种碱和水，直至获得包含皂化的海洋生物油的混合物；
b)使皂化的所述混合物与一种或多种有机溶剂接触以形成精制相和提取相，所述精制相包含碱的脂肪酸盐；
c)使所述提取相与所述精制相分离；
d)混合所述精制相和酸的水溶液，以形成水相和包含脂肪酸的非水相；
e)使所述水相与所述非水相分离；
f)在至多150℃的温度下将经分离的所述非水相与醇和酯化催化剂混合，直至获得包含脂肪酸的酯的酯化混合物；
g)从所述酯化混合物中除去所述催化剂，以获得不含催化剂的酯化混合物；
h)将所述不含催化剂的酯化混合物脱除溶剂，以获得所述脂肪酸的酯；和
i)将所述脂肪酸的酯在短程蒸馏塔中于至多180℃的温度和小于1mbar的压力下进行蒸馏，以获得包含EPA和DHA的酯的浓缩物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤(a)中的所述碱选自由氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化镁和它们的混合物组成的组，并且碱与粗制或精制油的重量比为0.15:1，水与粗制或精制油的重量比为0.5:1～2:1。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤(a)的所述混合物包含乙醇，并且乙醇与粗制或精制油的重量比为0.5:1～2:1。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤(a)的所述混合物包含己烷，并且所述己烷与粗制或精制油的重量比为0.5:1～2:1。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤(a)的所述混合物包含一种或多种抗氧化剂，并且所述抗氧化剂与粗制或精制油的重量比小于1:100。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，将步骤(a)的所述混合物在1bar的压力和不高于100℃的温度下保持30分钟～120分钟的时间，以获得皂化的海洋生物油。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤(b)中的温度为20℃～60℃，压力为1bar，使用的溶剂选自由石油、戊烷、己烷、庚烷和辛烷组成的组，并且要反应的溶剂的重量比为1:1～5:1。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤(d)中的所述酸选自由硫酸、磷酸、乙酸、甲酸、三氯乙酸和碳酸组成的组，温度为20℃～70℃，压力为1bar，所述酸与步骤(a)的碱的化学计量比为1.05:1。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中，步骤(f)的所述醇选自由甲醇、乙醇和甘油组成的组，温度为30℃～80℃，压力为1bar，并且使酯化中的混合物在30℃～80℃的温度下保持60分钟～240分钟的时间，以形成所述酯化混合物。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，其中，将所述脂肪酸的酯在小于0.1mbar的压力和低于150℃的温度下进行蒸馏。
11.根据权利要求10的方法获得的EPA和DHA的酯的浓缩物，其特征在于，EPA和DHA的酯的总含量至少为所述浓缩物的40重量%，所述浓缩物中的反式异构体的含量等于或低于所述粗制或精制海洋生物油中反式异构体的含量，所述浓缩物具有中性的器官感受性和氧化稳定性，其多氯联苯含量低于90ng/g浓缩物，其二氧杂芑和呋喃的含量为至多2pg/g浓缩物。
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