CN102321692A

CN102321692A - 离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制备方法

Info

Publication number: CN102321692A
Application number: CN201110302227A
Authority: CN
Inventors: 王俊; 吴福安; 李晶; 张磊霞; 顾双双; 郭锡杰
Original assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Current assignee: Jiangsu University of Science and Technology
Priority date: 2011-09-27
Filing date: 2011-09-27
Publication date: 2012-01-18

Abstract

离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制备方法，在选择离子液体为反应介质中酶促合成咖啡酸苯乙酯，提高底物在反应介质中的溶解度，提高脂肪酶的热稳定性及其对底物的立体选择性。该方法操作简便，反应条件温和，产物得率大大提高，对环境友好，克服了传统脂肪酶催化合成效率低和底物溶解度低的缺点，有利于规模化制备咖啡酸苯乙酯。

Description

离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制备方法

技术领域

本发明涉及生化制药领域，具体涉及离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制备方法。

背景技术

咖啡酸苯乙酯，英文名称：Caffeic acid phenethyl ester(CAPE)，化学名称：2-苯乙基-3-(3，4-二羟苯基)-2-丙烯酸酯，分子式：C₁₇H₁₆O₄，分子量：284.31。咖啡酸苯乙酯是蜂胶、红景天等天然产物中的主要功能成分，经药理实验证明其能够阻断中性粒细胞中活性氧化物质的产生、阻断黄嘌呤氧化酶***、能够抑制机体内NO的增加，还能抑制肿瘤细胞增生(Biol.Pharm.Bull，2003，26(4)：487-491)，是国际上各大医药公司竞相开发的辅助药物或药物有效成分。

制备咖啡酸苯乙酯的方法主要有提取和化学合成两种方法(Journal of Biotechnology，2010，148：133-138)：(1)咖啡酸苯乙酯在自然界中的含量相当少，在咖啡酸苯乙酯含量最高的中国蜂胶中，其含量一般在5～25mg/g。直接从天然植物中提取的难度太大，且制得的咖啡酸苯乙酯的纯度低；(2)有机溶剂为反应介质、以传统的酸作为催化剂的酯化合成法具有反应副产物多、对设备的腐蚀性强、产品分离过程复杂以及易挥发溶剂气体对环境污染大等缺点(Journal of Molecular catalysis A：chemical，2005，234：107-110)。因此，急需寻求一种新型的反应介质及其催化剂来解决咖啡酸苯乙酯制备方法的以上技术缺陷。

与传统的催化剂相比，选择脂肪酶作为酯化合成咖啡酸苯乙酯的催化剂具有其得天独厚的优势：(1)脂肪酶对酯化反应具有专一性，避免了反应产生的副产物，使得反应产物的分离纯化得到简化；(2)由于酶具有高效性，能够大大提高酯化反应的速率，从而提高咖啡酸苯乙酯的得率；(3)脂肪酶催化化学反应的反应条件相对温和，对设备的腐蚀大大降低；(4)跟传统的以酸作为催化剂相比较，脂肪酶不会挥发，对环境友好等(ProcessBiochemistry，2009，44：1358-1365)。因此，以脂肪酶作为反应催化剂、以咖啡酸和苯乙醇直接酶法合成咖啡酸苯乙酯不失为一种高效的制备方法。然而，虽然这种制备方法具有上述优点，但是传统反应介质有机溶剂带来的诸如对底物溶解度不高、挥发性溶剂对环境污染大等问题并没有得到解决。

离子液体作为一种新型的反应介质，具有传统反应介质所不具备的一些优越特性。首先，离子液体的蒸汽压极低，难以挥发，对环境几乎没有污染；其次，离子液体具有优良的热稳定性，在反应需要的较高温度条件下仍然能搞保护酶的活性以及反应的顺利进行；再次，疏水作用的离子液体能够与反应形成的水形成两相，从而推动酯化反应向生成产物咖啡酸苯乙酯的方向进行；同时，还能够保证脂肪酶分子的空间结构正常分布，保证酶具有正常的活性；此外，离子液体的最大特点是具有可重塑性，即可以根据反应底物的极性以及疏水性来调节阴、阳离子的结合，从而最大限度的增大反应底物的溶解度以及互溶度，从而提高反应的速率(Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2010，65：68-72)。然而，以离子液体为反应介质的酶促合成咖啡酸苯乙酯尚未见报道。

因此，本专利旨在建立以离子液体为反应介质，以脂肪酶为催化剂，通过酯化合成的方法来制备咖啡酸苯乙酯。该方法操作简便，反应条件温和，产物得率高，对环境友好，从而可以克服传统的脂肪酶催化合成效率较低和底物溶解度较低的缺点，易于大量制备高纯度咖啡酸苯乙酯，为推动其在医药工业中的广泛应用具有十分重要的意义。

发明内容

技术问题：

为解决以上缺陷，本发明提供了一种在新型的反应介质——离子液体中由咖啡酸和苯乙醇酯化制备咖啡酸苯乙酯的方法，以有效提高底物浓度、提高产物收率以及缩短反应时间。

技术方案：

离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制备方法，按照摩尔比苯乙醇∶咖啡酸＝1～50∶1的比例配制反应体系，按照质量比脂肪酶∶咖啡酸＝1～200∶1的比例加入脂肪酶，按照体积比离子液体∶苯乙醇＝10～500∶1的比例加入离子液体，在反应温度10～100℃、振荡转速50～200rpm的条件下进行酯化反应10～150h。

上述方法中，还可以按照质量比抗氧化剂∶咖啡酸＝5～100∶1的比例加入抗氧化剂。

所述离子液体的阳、阴离子类型组合包括阳离子类型为[Bmim]、[Hmim]、[Nmim]、[TOMA]或[Omim]，阴离子类型为[PF₆]、[Tf₂N]、[BF₄]、[HSO₄]或[Cl]，上述阴、阳离子配合而成离子液体。

所述脂肪酶为微生物、动物、或植物来源的游离脂肪酶或固定化脂肪酶。

所述脂肪酶微生物来源为假丝酵母Candida sp.(Candida antarctica、Candida rugosa)、曲霉Aspergillus sp.(Aspergillus niger、Aspergillus oryzae)、青霉Penicillium sp.(Penicilliumcamemberti、Penicillium roqueforti)、根毛霉Rhizomucor sp.(Rhizomucor miehei)、嗜热真菌Thermomyces sp.(Thermomyces lanuginosus)、毛霉Mucor sp.(Mucor javanicus)、芽孢杆菌Bacillus sp.(Bacillus subtilis)、假单胞菌Pseudomonas sp.(Pseudomonas cepacia、Pseudomonas fluorescens)、色杆菌Chromobacterium sp.(Chromobacterium viscosum)、伯克氏菌Burkholderia sp.(Burkholderia cepacia)等。

所述脂肪酶动物来源为猪、狗、牛、羊、马、兔、鼠、鸡、鸭、鹅等动物胰脏组织。

所述脂肪酶植物来源为蓖麻、油菜、油茶、光皮树、黄连木、麻风树、文冠果等油料作物种子。

所述的抗氧化剂为BHT、AHT、抗坏血酸及其酯类或没食子酸及其酯类。

有益效果：

在酶促合成咖啡酸苯乙酯的体系中选择合适的离子液体作为反应介质来强化合成效率，该方法反应条件温和，产物得率高，对环境友好，克服了以有机溶剂为反应介质催化合成效率较低和底物溶解度较低的缺点，易于大量制备咖啡酸苯乙酯。此外，整个酶促反应工艺基本上无废弃物产生，无环境污染，具有非常良好的工业化应用前景，可以满足迅速发展的医药工业的需要。

附图说明

图1离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的反应式。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

检测酶促合成咖啡酸苯乙酯体系的高效液相色谱条件为：色谱柱采用250mm×4.6mm的Alltima^TM C₁₈柱，流动相为乙腈：冰醋酸(0.5％)(V∶V)＝50∶50，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为325nm，进样量为20μL。

其中，产物咖啡酸苯乙酯的转化率计算方法为：

实施例1

按照咖啡酸∶苯乙醇＝1∶1(摩尔比)的比例配制反应体系，按照咖啡酸∶脂肪酶＝1∶1的比例(质量比)加入催化剂猪胰脂酶，按照苯乙醇∶离子液体＝1∶1的比例(体积比)加入离子液体[Bmim][BF₄]，在反应温度10℃、振荡转速30rpm的条件下进行酯化反应10h。反应结束后，HPLC检测酶促合成咖啡酸苯乙酯的产物转化率为0.8％。

实施例2

按照咖啡酸∶苯乙醇＝1∶50(摩尔比)的比例配制反应体系，按照咖啡酸∶脂肪酶＝1∶200的比例(质量比)加入催化剂Bacillus subtilis的游离脂肪酶，按照苯乙醇∶离子液体＝1∶200的比例(体积比)加入离子液体[TOMA][Tf₂N]，在反应温度100℃、振荡转速250rpm的条件下进行酯化反应150h。反应结束后，HPLC检测酶促合成咖啡酸苯乙酯的产物转化率为8.8％。

实施例3

按照咖啡酸∶苯乙醇＝1∶10(摩尔比)的比例配制反应体系，按照咖啡酸∶脂肪酶＝1∶5的比例(质量比)加入催化剂Candida antarctica的固定化酶Novozym 435，按照苯乙醇∶离子液体＝1∶30的比例(体积比)加入离子液体[Bmim][PF₆]，在反应温度80℃、振荡转速120rpm的条件下进行酯化反应120h。反应结束后，HPLC检测酶促合成咖啡酸苯乙酯的产物转化率为44.5％。

实施例4

按照咖啡酸∶苯乙醇＝1∶1(摩尔比)的比例配制反应体系，按照咖啡酸∶脂肪酶＝1∶1的比例(质量比)加入催化剂油菜籽脂肪酶，按照苯乙醇∶离子液体＝1∶1的比例(体积比)加入离子液体[Hmim][Cl]，按照咖啡酸∶抗氧化剂＝1∶1的比例(质量比)加入抗氧化剂抗坏血酸，在反应温度10℃、振荡转速30rpm的条件下进行酯化反应10h。反应结束后，HPLC检测酶促合成咖啡酸苯乙酯的产物转化率为4.5％。

实施例5

按照咖啡酸∶苯乙醇＝1∶50(摩尔比)的比例配制反应体系，按照咖啡酸∶脂肪酶＝1∶200的比例(质量比)加入催化剂狗胰脂酶，按照苯乙醇∶离子液体＝1∶200的比例(体积比)加入离子液体[Bmim][PF₆]，按照咖啡酸∶抗氧化剂＝1∶100的比例(质量比)加入抗氧化剂AHT，在反应温度100℃、振荡转速250rpm的条件下进行酯化反应150h。反应结束后，HPLC检测酶促合成咖啡酸苯乙酯的产物转化率为12.4％。

实施例6

按照咖啡酸∶苯乙醇＝1∶10(摩尔比)的比例配制反应体系，按照咖啡酸∶脂肪酶＝1∶5的比例(质量比)加入催化剂Candida antarctica的固定化酶Novozym 435，按照苯乙醇∶离子液体＝1∶30的比例(体积比)加入离子液体[Bmim][Tf₂N]，按照咖啡酸∶抗氧化剂＝1∶5的比例(质量比)加入抗氧化剂BHT，在反应温度80℃、振荡转速120rpm的条件下进行酯化反应120h。反应结束后，HPLC检测酶促合成咖啡酸苯乙酯的产物转化率为72.2％。

Claims

1.离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制备方法，其特征在于：按照摩尔比苯乙醇∶咖啡酸＝1～50∶1的比例配制反应体系，按照质量比脂肪酶∶咖啡酸＝1～200∶1的比例加入脂肪酶，按照体积比离子液体∶苯乙醇＝10～500∶1的比例加入离子液体，在反应温度10～100℃、振荡转速50～200rpm的条件下进行酯化反应10～150h。

2.根据权利要求1所述离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制备方法，其特征在于按照质量比抗氧化剂∶咖啡酸＝5～100∶1的比例加入抗氧化剂。

3.根据权利要求1所述离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制备方法，其特征在于所述离子液体由下述阳离子和阴离子配合而成，其中阳离子类型为[Bmim]、[Hmim]、[Nmim]、[TOMA]或[Omim]，阴离子类型为[PF₆]、[Tf₂N]、[BF₄]、[HSO₄]或[Cl]。

4.根据权利要求1所述离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制备方法，其特征在于所述脂肪酶为微生物、动物或植物来源的游离脂肪酶及其固定化脂肪酶。

5.根据权利要求4所述离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制备方法，其特征在于所述脂肪酶微生物来源为假丝酵母Candida sp.、曲霉Aspergillus sp.、青霉Penicillium sp.、根毛霉Rhizomucor sp.、嗜热真菌Thermomyces sp.、毛霉Mucor sp.、芽孢杆菌Bacillus sp.、假单胞菌Pseudomonas sp.、色杆菌Chromobacterium sp.或伯克氏菌Burkholderia sp.。

6.根据权利要求4所述离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制备方法，其特征在于所述脂肪酶动物来源为猪、狗、牛、羊、马、兔、鼠、鸡、鸭或鹅的动物胰脏组织。

7.根据权利要求4所述离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制备方法，其特征在于所述脂肪酶植物来源为蓖麻、油菜、油茶、光皮树、黄连木、麻风树或文冠果的油料作物种子。

8.根据权利要求1所述离子液体中脂肪酶催化合成咖啡酸苯乙酯的制备方法，其特征在于所述的抗氧化剂为BHT、AHT、抗坏血酸及其酯类或没食子酸及其酯类。