CN101978990A

CN101978990A - 五味子提取物及其制备方法和应用

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Publication number: CN101978990A
Application number: CN 201010523429
Authority: CN
Inventors: 何蓉蓉; 张延延; 曹云峰; 穆瑛俊; 黄婷; 周鑫宏; 唐淑红; 王笑康; 李军; 张志强; 宋锦辉; 栗原博
Original assignee: 曹云峰
Current assignee: Liaoning Runsheng Kangtai Medical Laboratory Co Ltd
Priority date: 2010-09-30
Filing date: 2010-10-20
Publication date: 2011-02-23
Anticipated expiration: 2030-10-20
Also published as: CN101978990B

Abstract

本发明公开一种五味子提取物，其中总木脂素的重量含量在10％以上。本发明还公开一种制备五味子提取物的方法，包括如下步骤：取干燥的五味子，粉碎成10-60目的粗粉，采用亚临界萃取设备提取，萃取压力为0.2-3MPa，萃取温度为30-60℃，通入低级烷烃，萃取3-5次，每次30-100分钟，合并萃取液，静置后过滤，得到五味子提取物。本发明还公开五味子提取物或者含有所述五味子提取物的组合物在制备抗应激的药物和/或保健品中的应用。

Description

五味子提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种中药提取物，具体涉及一种五味子提取物及其制备方法和应用，属于中药技术领域。

背景技术

面对高科技、快节奏、日益加剧的竞争、生活不规律的重重压力，现代人经常处于身心疲劳的状态，而这种心理和生理上的反应就是应激反应。目前的应激(Stress)定义为：机体的不协调状态，或内环境稳态受到威胁，其主要特征为机体受到内外环境刺激后发生交感肾上腺髓质及垂体肾上腺皮质活性增加。机体在长期处于应激负荷状态下，为缓解应激原的压力，需要通过神经、内分泌及免疫***来调整机体的内环境稳定。在应激负荷作用下当机体出现代谢水平过剩反应时，将会影响组织器官的正常功能，从而引起病理过程及疾病发生。肝脏是机体中代谢的主要器官，容易受各种应激负荷的影响。此外，由应激导致的各种疾病或症状还包括焦虑、烦躁、免疫力下降等。

近年来，应激性疾病及生活习惯病日益增多，但缺乏有效的治疗手段和药物。随着对应激和应激性疾病研究的深入，为研究应激作用的机制，寻找有效的预防、延缓和消除应激性疾病的有效途径，一直是研究工作者的前沿课题。以调整机体内环境、养身治病为主的中药及健康食品作为研究治疗应激性疾病的方法，成为目前亟待解决的问题。

五味子，属木兰科植物，落叶木质藤本，其果实可以入药。其味酸甘而性温，偏于收敛固涩、止汗、止咳止遗，有补益肺肾之气、生津止渴、宁心安神之功效。现代药理研究证实，五味子主要有以下几个方面的作用：可以增强中枢神经***兴奋与抑制过程的平衡，改善人的智力活动，提高工作效率；可用于治疗神经衰弱，健忘症及延缓衰老；调节血压，对循环衰竭者升压作用颇为明显。可用于防止低血压症；具有强心作用，可使心肌收缩有力，舒张完全而显著；可用于治疗心肌收缩无力引起的心慌气短、困倦乏力；有明显的止咳、祛痰作用，可用于治疗呼吸***疾病；促进胆汁分泌，调节胃液分泌，可用于治疗消化液分泌失常引起的各种病变；双向调节糖的代谢，可用于治疗糖代谢紊乱引起的病变；改善视力、听力，扩大视野，可用于治疗目疾及听力异常；明显降低血清谷丙转氨酶的活性，有保肝的作用，可用于防治肝病。因此，五味子确系保健之佳品，治疗之良药。

目前五味子提取物在预防和/或治疗由应激导致的相关疾病中的应用尚未见报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明公开一种五味子提取物(Schisandra Chinensis Extract，SCE)。

本发明提供一种五味子提取物，所述提取物中五味子总木脂素的含量至少为10％；优选地，所述提取物中五味子总木脂素的含量至少为20％；更优选地，所述提取物中五味子总木脂素的含量至少为50％。

本发明的五味子提取物采用如下步骤制备得到：

取干燥的五味子，粉碎成10-60目的粗粉，采用亚临界萃取设备提取，萃取压力为0.2-3Mpa，萃取温度为30-60℃，通入低级烷烃或天然气，萃取3-5次，每次30-100分钟，合并萃取液，静置后过滤，得到五味子提取物。

其中，所述低级烷烃为C1-C18的烷烃；优选地，所述低级烷烃为甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、异丁烷、戊烷、正己烷、庚烷或辛烷；更优选地，所述低级烷烃为甲烷、丙烷、丁烷或异丁烷。

优选地，五味子提取物采用如下步骤制备得到：

取干燥的五味子，粉碎成20-50目的粗粉，采用亚临界萃取设备提取，萃取压力为0.7-2Mpa，萃取温度为30-40℃，通入低级烷烃，萃取3-4次，每次30-80分钟，合并萃取液，静置后过滤，将所得滤液吸附在D101非极性大孔吸附树脂上，分别用水、30％-90％乙醇梯度洗脱，收集90％乙醇洗脱液，减压浓缩，得到五味子提取物。

更优选地，五味子提取物采用如下步骤制备得到：

取干燥的五味子，粉碎成20目的粗粉，采用亚临界萃取设备提取，萃取压力为2Mpa，萃取温度为40℃，通入丁烷，萃取3次，每次40分钟，合并萃取液，静置后过滤，将所得滤液吸附在D101非极性大孔吸附树脂上，分别用水、30％乙醇、60％乙醇和90％乙醇梯度洗脱，收集90％乙醇洗脱液，减压浓缩，得到五味子提取物。

本发明还提供一种五味子提取物的制备方法，包括如下步骤：

优选地，五味子提取物的制备方法包括如下步骤：

更优选地，五味子提取物的制备方法包括如下步骤：

本发明的五味子提取物，其制备方法简单、设备成本低、能源消耗少、提取时间大大缩短，能实现工业化生产，易于推广，而且提取物中无溶剂残留、产品颜色纯正鲜艳，无需现有技术中复杂、繁琐的提取和纯化操作，是其他提取方法如醇提、水提醇沉、超临界萃取所无法比拟的。

本发明人在研究五味子提取物的过程中，意外地发现，其对应激导致的疾病或症状具有缓解和治疗的作用。

因此，本发明还提供由上述方法制备的五味子提取物或者含有所述五味子提取物的组合物在制备抗应激的药物和/或保健品中的应用。

优选地，所述应用为在制备预防和/或治疗应激性肝损伤的药物和/或保健品中的应用。

更优选地，所述应用为在制备预防和/或治疗应激性肝癌转移的药物和/或保健品中的应用。

更优选地，所述应用为在制备预防和/或治疗应激性焦虑的药物和/或保健品中的应用。

本发明的五味子提取物可以单独应用，加入适当的药用辅料，制成软胶囊、硬胶囊、片剂、颗粒剂、滴丸剂、水丸剂、蜜丸剂、口服液等各种口服制剂或保健品。

本发明的五味子提取物还可以与适量的枸杞子、决明子、葡萄籽或其提取物等组成中药组合物，加入适当的药用辅料，制成软胶囊、硬胶囊、片剂、颗粒剂、滴丸剂、水丸剂、蜜丸剂、口服液等各种口服制剂或保健品。

附图说明

图1为AAPH诱导的荧光衰减曲线；

图2示出SCE对应激小鼠肝组织SOD的mRNA表达的影响(注：代表小鼠肝中SOD1-3mRNA表达的RT-PCR分析。)；

图3示出SCE对应激小鼠肝组织GPX的mRNA表达的影响(注：代表小鼠肝中GPX mRNA表达的RT-PCR分析。)；

图4示出SCE对应激小鼠P815肝癌转移的影响(注：结果以每组7只动物的平均值±S.D表示。与P815对照组的显著性差异为^##P＜0.01，与应激+P815组的显著性差异为*P＜0.05，**P＜0.01。)；

图5示出SCE对应激小鼠的脾脏指数和脾细胞总数的影响(注：结果以每组7只动物的平均值±S.D表示。与正常对照组的显著性差异为^$$P＜0.01，与P815对照组的显著性差异为^##P＜0.01，与模型对照组的显著性差异为*P＜0.05，**P＜0.01。)；

图6示出T淋巴细胞流式亚群分析图(注：CD³⁺CD⁴⁺细胞为Th细胞，CD³⁺CD⁸⁺细胞为Tc细胞。)；

图7示出SCE对应激小鼠T淋巴细胞亚群的影响(注：结果以每组7只动物的平均值±S.D表示。与正常对照组的显著性差异为^$$P＜0.01，与P815对照组的显著性差异为^#P＜0.05，与模型对照组的显著性差异为*P＜0.05，**P＜0.01。)；

图8示出流式细胞术DiO/PI双染色法检测CTL活性；

图9示出SCE对应激小鼠CTL活性的影响(注：结果以每组7只动物的平均值±S.D表示。与P815对照组的显著性差异为^##P＜0.01，与应激+P815组的显著性差异为*P＜0.05，**P＜0.01)；

图10示出SCE对应激小鼠肝脏Fas/Fas-L mRAN表达的影响(注：(A)代表对小鼠肝脏Fas/Fas-L的mRNA表达的RT-PCR分析。(B)为小鼠脾细胞中Fas/Fas-L的PCR产物的光密度分析。结果以光密度的强度单位生成，表示为与内参18s的比率。数据代表以每组7只动物的平均值±S.E.。与模型对照小鼠的显著性差异为**P＜0.05)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

取北五味子，充分阴干，置于粉碎机打成20目粗粉，称取200kg，装入500kg亚临界萃取罐中，密封，当温度达到40℃，压力达到2Mpa时，通入丁烷，萃取40分钟，萃取3次，将3次萃取液合并，静置，过滤，得到五味子提取物，该提取物中总木脂素含量为12.0％。

实施例2

取北五味子，充分阴干，置于粉碎机打成40目粗粉，称取10kg，装入20kg亚临界萃取罐中，密封，当温度达到60℃，压力达到3Mpa时，通入丁烷，萃取40分钟，萃取3次，将3次萃取液合并，静置，过滤，得到五味子提取物，该提取物中总木脂素含量为15％。

实施例3

取南五味子，充分阴干，置于粉碎机打成10目粗粉，称取10kg，装入20kg亚临界萃取罐中，密封，当温度达到30℃，压力达到1.5Mpa时，通入丙烷，萃取80分钟，萃取4次，将4次萃取液合并，静置，过滤，得到五味子提取物，该提取物中总木脂素含量为10％。

实施例4

取北五味子，低温干燥，置于粉碎机打成50目粗粉，称取2kg，装入5kg亚临界萃取罐中，密封，当温度达到35℃，压力达到0.7Mpa时，通入异丁烷，萃取30分钟，萃取5次，将5次萃取液合并，静置，过滤，将所得滤液吸附在D101非极性大孔吸附树脂上，分别用水、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和90％乙醇梯度洗脱，收集90％乙醇洗脱液，减压浓缩，得到五味子提取物，该提取物中总木脂素含量为56％。

实施例5

取北五味子，低温干燥，置于粉碎机打成60目粗粉，称取2kg，装入5kg亚临界萃取罐中，密封，当温度达到40℃，压力达到0.2Mpa时，通入异丁烷，萃取100分钟，萃取3次，将3次萃取液合并，静置，过滤，将所得滤液吸附在D101非极性大孔吸附树脂上，分别用水、30％乙醇、60％乙醇和90％乙醇梯度洗脱，收集90％乙醇洗脱液，减压浓缩，得到五味子提取物，该提取物中总木脂素含量为52％。

实施例6

取实施例1制备的五味子提取物5kg，与植物油35kg充分混匀后，送入软胶囊包装机，得到软胶囊。

实施例7

取实施例1制备的五味子提取物5kg，加入槐花蜜制丸，干燥，用玉米朊包衣，得到蜜丸剂。

实施例8

取实施例2制备的五味子提取物10kg，与枸杞子粉末1kg混匀，加入少量水，泛丸、起模，反复加水润湿，上粉滚圆和筛选，保持丸粒的硬度和圆整度，使丸粒坚实、致密，然后用细粉盖面，干燥，包衣，打光，得到水丸剂。

实施例9

取实施例2制备的五味子提取物10kg，与决明子粉末0.8kg混匀，加淀粉溶液，制粒，压片、分装，得到片剂。

实施例10

取实施例5制备的五味子提取物5kg，与聚乙二醇600015kg充分混匀后，80℃下熔融，在二甲基硅油中冷却，滴制成丸，得到滴丸剂。

实验例1五味子提取物对应激性肝损伤的保护作用

本实验通过18h拘束负荷建立应激性肝损伤模型，分别用HPLC法测定血浆皮质酮含量、赖氏法测定小鼠血浆谷丙转氨酶(ALT)活性、硫代巴比妥酸法测定肝组织丙二醛(MDA)含量、比色法测定谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和超氧化物歧化酶(SOD)含量、荧光酶标仪测定抗氧化能力指数(ORAC)及RT-PCR法检测SOD mRNA、GPX mRNA和糖皮质激素受体GR的mRNA表达，确定了拘束应激与应激性肝损伤的关系以及五味子提取物对其的干预作用，从而确定了五味子总木脂素取物对应激性肝损伤的保护作用。

实验动物、动物分组及给药

清洁级雄性昆明(KM)小鼠，7周龄，体重在18g-22g，购自南方医科大学实验动物中心，许可证号SCXK(粤)：2006-0015。饲养温度(23±2)℃，照明时间12h/d(7:00-19:00)。小鼠饲养一周适应环境后进行实验。

将实验小鼠随机分成正常对照组(Normal Control)、应激模型组(Stress Model)、100及200mg/kg SCE组，每组7只，实验前称重标号。正常对照组和应激模型组(拘束负荷)均灌胃同体积蒸馏水，SCE(实施例1制备的五味子提取物)的浓度分别为10.0mg/mL及20.0mg/mL，每天1次。第4天应激模型组和SCE组小鼠灌胃30min后进行拘束应激实验。小鼠拘束装置为通风良好的50mL尖底聚丙烯塑料离心管，给以一次性拘束18h(14:00-8:00)，拘束期间小鼠不能进食饮水，正常对照组小鼠为非拘束禁食禁水小鼠。

灌胃液体量计算：小鼠体重在18g-22g之间，SCE 100mg/kg组，每次给药量在1.8mg-2.2mg之间，配置成浓度为10.0mg/mL的液体，每次给予液体量为0.18mL-0.22mL。SCE 200mg/kg组，每次给药量在3.6mg-4.4mg之间，配置成浓度为20.0mg/mL的液体，每次给予液体量为0.18mL-0.22mL。正常对照组和拘束负荷模型组均灌胃同体积0.18mL-0.22mL蒸馏水。

小鼠拘束结束后30min，在***麻醉下，心脏采血，打开胸腔，暴露心脏，用针头刺入右心室，吸取血液。并置于肝素处理过的离心管中以5,000r/min离心5min，分离血浆，用于测定ALT和血浆皮质酮。同时取新鲜肝组织，制成10％肝组织匀浆，12,000r/min离心15min后，轻轻吸取适量上清液进行测定。

实验数据以平均值±S.E.表示，采用SPSS软件，利用ANOVA检验和Dunnett’s检验进行统计学处理，P＜0.05有统计学意义。

1赖氏法测定血清ALT活性

1.1测定意义：

转氨酶在蛋白质代谢中，促使氨基转换的一种重要物质；广泛存在于肝脏、心肌、横纹肌、脑、肾、脾和血液中，尤以肝脏和心肌为多，当这些组织出现炎症或坏死时，大量转氨酶释放到血液中，其活力即显著增高。

1.2测定：

利用ALT在37℃及pH7.4条件下，作用于丙氨酸及α-酮戊二酸组成的底物，生成丙酮酸及谷氨酸。反应30min后，加入2，4-二硝基苯肼(DNPH)盐酸溶液，即终止反应。因DNPH与酮酸中羰基加成生成丙酮酸苯腙，苯腙在碱性条件下呈红棕色，在492nm下以比色法进行测定。

1.3SCE对应激负荷小鼠血清ALT水平的影响

如表1所示，正常对照组小鼠的ALT值为17.53±4.67IU/L，而应激模型组小鼠的ALT值为96.70±6.27IU/L，拘束负荷小鼠血清ALT水平明显升高(P＜0.01)，表明拘束负荷造成小鼠肝损伤。SCE低剂量组小鼠的ALT值为34.76±2.26IU/L，SCE高剂量组小鼠的ALT值为29.70±5.04IU/L，表明SCE能显著降低拘束负荷小鼠血清ALT水平(P＜0.01)。

表1SCE对拘束应激小鼠血浆ALT水平的影响

注：7周龄雄性KM小鼠被固定在拘束装置中18h，然后测定ALT活性。结果以每组7只动物的平均值±S.D表示。与正常对照组的显著性差异为^#P＜0.05和^##P＜0.01，与应激对照组的为*P＜0.05，**P＜0.01。

2HPLC法测定血浆皮质酮含量

2.1样品的采集和处理

取小鼠全血置于肝素处理过的离心管中，以5,000rpm离心5min分离血浆。取0.5mL血浆，向其中加入0.075mg/mLCortisol(内标)50μL振摇混匀；加入2mL乙酸乙酯振摇萃取，分离得到上层乙酸乙酯液，下层水液再用乙酸乙酯萃取一遍，合并乙酸乙酯液后用0.1mLNaOH洗一次，再用蒸馏水洗2次。乙酸乙酯液置于氮气下挥发吹干后加入100μL流动相(乙腈-水：38-72)溶解即得皮质酮分析样品溶液。-80℃冰箱冷冻保存待测。

2.2样品中皮质酮的HPLC-UV检测

采用HPLC内标法(内标物为Cortisol)测定血浆中皮质酮含量。检测条件为：紫外检测，检测波长为254nm；色谱柱：5C 18(Waters，4.6×150mm，5μm)；流动相：乙腈-水(38％-72％)；流速：1mL/min。

2.3SCE对应激负荷小鼠血浆皮质酮水平的影响

如表2所示，正常对照组小鼠血浆中皮质酮值为85.00±3.95ng/mL，而应激模型组小鼠血浆中皮质酮值为176.67±6.50ng/mL，表明拘束负荷诱发小鼠血浆皮质酮水平明显升高(P＜0.01)。SCE低高剂量组小鼠血浆中皮质酮值分别为98±3.95(P＜0.01)和91±4.95ng/mL(P＜0.05)，表明SCE有降低拘束负荷小鼠血浆皮质酮水平的作用。

表2SCE对拘束应激小鼠血浆皮质酮水平的影响

注：7周龄雄性KM小鼠被固定在拘束装置中18h，然后测定皮质酮活性。结果以每组7只动物的平均值±S.D表示。与正常对照组的显著性差异为^#P＜0.05和^##P＜0.01，与应激对照组的为*P＜0.05，**P＜0.01。

3TBARS法测定肝组织丙二醛(MDA)含量

3.1测定意义：

自由基易与体内多不饱和脂肪酸反应，引发脂质过氧化，生成脂质过氧化产物。脂质过氧化产物又通过一系列反映生成一些分解产物，这些分解产物中一些有害，一些无害，MDA是其中的有害产物之一，它和氧自由基一样能够引起细胞代谢功能障碍，甚至死亡。因此，通过测试MDA的量可了解机体内脂质过氧化的程度，间接反映细胞的损伤程度。

3.2测定：

利用过氧化脂质降解产物中的丙二醛(MDA)可与硫代巴比妥酸缩合形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰的性质，通过比色法进行测定，即硫代巴比妥酸反应物(ThiobarbituricAcid-Reactive Substances，TBARS)法。

3.3SCE对拘束负荷小鼠肝组织丙二醛(MDA)含量的影响

如表3所示，正常对照组小鼠1％肝匀浆中MDA值为4.65±1.20nmol/mgprot，而应激模型组小鼠肝脏MDA值为13.80±2.90nmol/mgprot，表明拘束负荷诱发小鼠肝脏脂质过氧产物MDA水平明显升高(P＜0.05)。SCE低高剂量组小鼠肝中MDA值分别为5.50±1.60和4.80±1.50nmol/mgprot(P＜0.05)，表明SCE有降低拘束负荷小鼠肝脏脂质过氧化程度的作用。

表3SCE对拘束应激小鼠肝组织丙二醛(MDA)含量的影响

注：7周龄雄性KM小鼠被固定在拘束装置中18h，然后测定MDA活性。结果以每组7只动物的平均值±S.D表示。与正常对照组的显著性差异为^#＜0.05和^##P＜0.01，与应激对照组的为*P＜0.05，**P＜0.01。

4抗氧化能力指数(ORAC)的测定

4.1测定原理

ORAC方法的特点在于能够提供稳定可控的自由基来源，适用于亲水性和亲脂性化合物。其原理为荧光物质荧光素二钠在485nm光激发下，发射527nm荧光，可以被能够释放过氧自由基的AAPH氧化而使荧光特性消失。当抗氧化剂存在时，可与荧光素二钠竞争氧化剂，减缓其荧光消退的速度。根据这一特性，可测定样品氧自由基清除活性。

4.2试剂配制及样品处理

75mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)由磷酸二氢钾和磷酸氢二钾配制，基于ORAC反应在75mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)环境中进行，荧光素二钠、AAPH和Trolox用配好的磷酸盐缓冲液溶解，并使反应体系中荧光素二钠和AAPH的终浓度分别为63nmol/L和12.8mmol/L。小鼠用***麻醉后心脏采血，并置于肝素处理过的离心管中以3000rpm离心5min分离血浆，按体积比10∶190加75mmol/L磷酸盐缓冲液将血浆样品稀释20倍，冷冻保存待测。

4.3SCE对拘束负荷小鼠肝组织抗氧化指数ORAC的影响

如图1所示，拘束应激负荷组小鼠肝脏肝组织抗氧化指数ORAC水平下降。如表4所示，正常对照组小鼠10％肝匀浆中ORAC值为59607.09±253.79U/mL，而应激模型组小鼠肝脏ORAC值为33266.77±348.30U/mL，表明拘束负荷诱发小鼠肝脏抗氧化能力指数ORAC水平明显降低(P＜0.01)。SCE低高剂量组小鼠肝脏ORAC值分别为43688.48±750.11(P＜0.05)和55633.03±773.6U/mL(P＜0.01)，表明SCE有提高拘束负荷小鼠肝脏抗氧化能力的作用。

表4SCE对拘束应激小鼠肝组织ORAC水平的影响

注：7周龄雄性KM小鼠被固定在拘束装置中18h，然后测定ORAC活性。结果以每组7只动物的平均值±S.D表示。与正常对照组的显著性差异为^#P＜0.05和^##P＜0.01，与应激对照组的为*P＜0.05，**P＜0.01。

5肝组织内超氧化物歧化酶(SOD)活性测定

超氧化物歧化酶(SOD)对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤。本实验通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应***产生超氧阴离子自由基，后者与氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现***，用普通酶标仪可以测定其吸光度。当被测样品中有SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可以测出样品中SOD的活性。实验将10％肝匀浆按试剂盒说明书测定肝脏淋巴细胞匀浆液SOD活性。

5.1SCE对拘束负荷小鼠肝组织SOD活性的影响

如表5所示，正常对照组小鼠的肝组织SOD为37.25±7.14U/mgprot，而应激模型组小鼠肝组织SOD为21.39±4.95U/mgprot，表明拘束负荷诱发小鼠肝组织SOD水平显著降低(P＜0.01)。SCE低剂量组小鼠的肝组织SOD为31.51±4.86U/mgprot，而SCE高剂量组小鼠的肝组织SOD为33.25±5.50U/mgprot，表明SCE高低剂量组均能显著提高拘束负荷小鼠肝组织SOD水平(P＜0.01)，且具有一定的量效关系。

表5SCE对拘束应激小鼠肝组织SOD活性的影响

注：7周龄雄性KM小鼠被固定在拘束装置中18h，然后测定SOD活性。结果以每组7只动物的平均值±S.D表示。与正常对照组的显著性差异为^#P＜0.05和^##P＜0.01，与应激对照组的为*P＜0.05，**P＜0.01。

6肝组织内谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性测定

GPX是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化物分解的酶，特异地催化还原型GSH对过氧化氢的还原反应。小鼠肝细胞中GPX活性采用试剂盒检测。测定原理为GPX促进过氧化氢与GSH反应生成H₂O及氧化型谷胱甘肽(GSSG)。GPX活性可用其酶促反应的速率来表示，测定酶促反应中GSH的消耗，可得出GPX活性。实验将10％肝匀浆按试剂盒说明书测定肝脏匀浆液GPX活性。

6.1SCE对拘束负荷小鼠肝组织内GPX活性的影响

如表6所示，正常对照组小鼠的肝组织GPX为944.41±83.74U/mgprot，而应激模型组小鼠肝组织GPX为514.33±81.31U/mgprot，表明拘束负荷诱发小鼠肝组织GPX水平显著降低(P＜0.01)。SCE低高剂量组小鼠的肝组织GPX分别为529.59±93.56和609.84±75.82U/mgprot，表明SCE高低剂量组均能不同程度提高拘束负荷小鼠肝组织GPX水平。

表6SCE对拘束应激小鼠肝组织内GPX活性的影响

7肝组织SOD、GPX、GR mRNA的表达测定

7.1RT-PCR引物的设计：

利用Primer 5.0引物设计软件设计合成引物，用于合成所需的SOD、GPX及糖皮质激素受体(GR)相关基因片段及内参18s(参见表7)，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。然后根据这几个基因序列的不同特点，进行RT-PCR扩增。

表7用于RT-PCR的引物序列

7.2SCE对拘束负荷小鼠肝组织SOD的mRNA表达的影响

目前已知的SOD主要分为三类，即胞质中Cu/Zn-SOD(即SOD1)、线粒体中的Mn-SOD(即SOD2)和细胞外的Ec-SOD(即SOD3)。本实验采用RT-PCR的方法检测了拘束负荷小鼠肝细胞内SOD mRNA表达水平(见图2)。结果如表8所示，与正常对照组小鼠相比，拘束应激组小鼠肝组织SOD1的mRNA表达明显降低(P＜0.01)。与拘束应激负荷组小鼠相比，SCE高剂量组小鼠肝组织的SOD1mRNA表达也明显增强(P＜0.05)。与正常对照组小鼠相比，拘束应激组小鼠肝组织SOD2的mRNA表达明显降低(P＜0.01)。与拘束应激负荷组小鼠相比，SCE高低剂量组小鼠肝组织的SOD2mRNA表达不明显，无统计学意义。与正常对照组小鼠相比，拘束应激组小鼠肝组织SOD3的mRNA表达变化不明显，故结果没列出。

表8SCE对拘束应激小鼠肝组织SOD1mRNA和SOD2mRNA表达的影响

注：小鼠肝脏中SOD1和SOD2mRNA表达的PCR产物的光密度分析。结果以光密度的强度单位生成，表示为SOD1或SOD2与内参18s的比率。与正常对照组的显著性差异为^#P＜0.05和^##P＜0.01，与应激对照组的为*P＜0.05，**P＜0.01。

7.3SCE对拘束负荷小鼠肝组织GPX的mRNA表达结果

本实验采用RT-PCR的方法检测了拘束负荷小鼠肝细胞内GPX mRNA表达水平(见图3)。结果如表9所示，与正常对照组小鼠相比，拘束应激组小鼠肝组织GPX的mRNA表达明显降低(P＜0.01)。与拘束应激负荷组小鼠相比，SCE高剂量组小鼠肝组织的GPx mRNA表达明显增强(P＜0.05)，而SCE低剂量组小鼠肝组织的GPx mRNA表达不明显，无统计学意义。

表9SCE对拘束应激小鼠肝组织GPX的mRNA表达的影响

注：小鼠肝脏中GPX mRNA表达的PCR产物的光密度分析。结果以光密度的强度单位生成，表示为GPX与内参18s的比率。与正常对照组的显著性差异为^#P＜0.05和^##P＜0.01，与应激对照组的为*P＜0.05，**P＜0.01。

7.4SCE对拘束负荷小鼠肝组织内糖皮质激素受体GR的mRNA表达的影响

结果如表10所示，与正常对照组小鼠相比，拘束应激组小鼠肝组织GR的mRNA表达明显降低(P＜0.01)。与拘束应激负荷组小鼠相比，SCE高低剂量组小鼠肝组织的GR mRNA表达均明显增强(P＜0.01)。

表10SCE对拘束应激小鼠肝组织内GR mRNA表达的影响

注：小鼠肝脏中GRmRNA表达的PCR产物的光密度分析。结果以光密度的强度单位生成，表示为GR与内参18s的比率。与正常对照组的显著性差异为^#P＜0.05和^##P＜0.01，与应激对照组的为*P＜0.05，**P＜0.01。

本发明实验结果显示，与正常对照组相比小鼠拘束负荷18h后血清ALT和皮质酮活性显著上升的，表明应激负荷引起小鼠肝脏损伤。SCE显著减少拘束负荷引起小鼠血清ALT活性的升高，表明SCE对应激性肝损伤有明显的保护作用。

本发明采用TBARS和ORAC方法分析小鼠肝组织的脂质过氧程度(MDA含量)和抗氧化能力指数(ORAC值)。实验结果显示，正常对照组小鼠1％肝匀浆中MDA值为4.65±1.20nmol/mgprot，而应激模型组小鼠肝脏MDA值为13.80±2.90nmol/mgprot，表明拘束负荷诱发小鼠肝脏脂质过氧产物MDA水平升高(P＜0.05)。SCE低高剂量组小鼠肝中MDA值分别为5.50±1.60和4.80±1.50nmol/mgprot(P＜0.05)，表明SCE有降低拘束负荷小鼠肝脏脂质过氧化程度的作用。正常对照组小鼠10％肝匀浆中ORAC值为59607.09±253.79U/mL，而应激模型组小鼠肝脏ORAC值为33266.77±348.30U/mL，表明拘束负荷诱发小鼠肝脏抗氧化能力指数ORAC水平明显降低(P＜0.01)。SCE低高剂量组小鼠肝脏ORAC值分别为43688.48±750.11(P＜0.05)和55633.03±773.6U/mL(P＜0.01)，表明SCE有提高拘束负荷小鼠肝脏抗氧化能力的作用。应激负荷小鼠肝组织的抗氧化能力指数水平显著降低，肝脏处于脂质过氧化损伤的状态，这一现象表明应激性肝损伤与肝组织内的自由基增加及内源性抗氧化能力消耗有关。SCE高低剂量给药组均能不同程度地缓解肝脏的脂质过氧化程度，同时提高肝脏抗氧化能力指数，表明SCE对小鼠应激性肝损伤的保护作用与缓解肝脏氧化损伤有关。

机体也存在着一个完整的抗氧化防御***，机体产生的自由基与抗氧化防御***处于相对平衡，使组织细胞免受氧化损伤。正常对照组小鼠的肝组织SOD为37.25±7.14U/mgprot，而应激模型组小鼠肝组织SOD为2139±4.95U/mgprot，表明拘束负荷诱发小鼠肝组织SOD水平显著降低(P＜0.01)。SCE低剂量组小鼠的肝组织SOD为31.51±4.86U/mgprot，而SCE高剂量组小鼠的肝组织SOD为33.25±5.50U/mgprot，表明SCE高低剂量组均能显著提高拘束负荷小鼠肝组织SOD水平(P＜0.01)，且具有一定的量效关系。正常对照组小鼠的肝组织GPX为944.41±83.74U/mgprot，而应激模型组小鼠肝组织GPX为514.33±81.31U/mgprot，表明拘束负荷诱发小鼠肝组织GPx水平显著降低(P＜0.01)。SCE高低剂量组小鼠的肝组织GPX分别为529.59±93.56和609.84±75.82U/mgprot，表明SCE高低剂量组均能不同程度提高拘束负荷小鼠肝组织GPX水平。同时，RT-PCR实验结果显示，与正常对照组小鼠相比，拘束应激组小鼠肝组织SOD1的mRNA表达明显降低(P＜0.01)。与拘束应激负荷组小鼠相比，SCE高剂量组小鼠肝组织的SOD1mRNA表达也明显增强(P＜0.05)。与正常对照组小鼠相比，拘束应激组小鼠肝组织GPX的mRNA表达明显降低(P＜0.01)。与拘束应激负荷组小鼠相比，SCE高剂量组小鼠肝组织的GPx mRNA表达明显增强(P＜0.05)。实验研究表明，SCE对缓解小鼠肝脏氧化损伤的作用，与SCE中的活性成分能提高肝脏自由基清除关键酶SOD和GPX的活性，同时提高这两个酶的mRNA表达水平有关。

此外，应激可通过下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axe，HPA)分泌GC，进而介导细胞内ROS的大量表达，是造成应激性肝损伤的重要原因之一。HPLC的方法检测血浆皮质酮含量研究结果显示，正常对照组小鼠血浆中皮质酮值为85.00±3.95ng/mL，而应激模型组小鼠血浆中皮质酮值为176.67±6.50ng/mL，表明拘束负荷诱发小鼠血浆皮质酮水平明显升高(P＜0.01)。SCE低高剂量组小鼠血浆中皮质酮值分别为98±3.95(P＜0.05)和91±4.95ng/mL(P＜0.01)，表明SCE有降低拘束负荷小鼠血浆皮质酮水平的作用。同时，采用RT-PCR的方法检测了拘束负荷小鼠肝细胞内GR mRNA表达水平研究显示，与正常对照组小鼠相比，拘束应激组小鼠肝组织GR的mRNA表达明显降低(P＜0.01)。与拘束应激负荷组小鼠相比，SCE高低剂量组小鼠肝组织的GR mRNA表达均明显增强(P＜0.01)。该研究结果表明SCE有较好的调节应激性GC增多的活性，表现出较好的抗应激作用。

综上所述，应激导致小鼠血浆丙氨酸氨基转移酶明显升高，诱发肝损伤发生，而五味子提取物对拘束负荷诱发小鼠氧化应激性肝损伤有明显的改善作用，其改善作用是通过清除体内自由基和防止脂质过氧化实现的。

实验例2五味子提取物对于应激性肝癌转移的抑制作用

本实验以DAB/2小鼠拘束应激负荷20h恢复后第3天，尾静脉注射P815肿瘤细胞株建立应激性癌转移动物模型，以肝脏的肿瘤转移克隆数为重点研究对象，分别检测肝癌转移克隆数的变化和小鼠脾脏免疫器官指数，流式细胞术方法检测T淋巴细胞亚群和CTL杀伤活性的变化，并采用RT-PCR的方法测定肝脏Fas、Fas-L的mRNA表达的变化。从而研究拘束应激与应激性肝癌转移的关系及五味子提取物的干预作用，来评价五味子提取物对应激性肝癌转移的保护作用及作用机制。

实验动物及给药

将DBA/2小鼠随机分为正常对照组、P815对照组、拘束应激模型组(P815+应激对照)、P815+拘束应激+100mg/kg SCE(SCE 100mg/kg)组、P815+拘束应激+200mg/kg SCE(SCE 200mg/kg)组给药，每组7只，其中SCE为实施例1制备的五味子提取物。实验组每天给药1次，连续给药17d后测定相关实验指标，正常对照组与模型组灌胃等容量空白水。除正常对照组外，其余各组实验第2天拘束应激20h，小鼠拘束装置为通风良好的50mL尖底聚丙烯塑料离心管，拘束期间小鼠不能进食饮水，正常对照组小鼠为非拘束禁食禁水小鼠。小鼠拘束后恢复的第3天尾静脉注射小鼠肥大细胞瘤p815细胞株(1×10⁴/0.1mLPBS)诱导肝癌转移。小鼠在接种肿瘤后的第12天给药后30min处死取肝，计算肝脏表面的肿瘤克隆个数后，肝脏匀浆测定肝脏的氧化与抗氧化能力的变化。取脾脏测定免疫器官指数，同时提取淋巴细胞测定脾脏淋巴细胞亚群及CTL细胞的杀伤活性变化。

小鼠应激性P815肝脏癌转移模型的建立：取对数生长期P815细胞，细胞计数板计数，调整细胞浓度为1.0×10⁵/mL备用。碘伏棉球消毒小鼠尾巴，用1mL注射器抽吸P815细胞悬液，与皮肤约成30度进针，针尖进入静脉时会有一瞬间通畅的感觉，进入后左右晃动针头，活动自如，则可注射，每只小鼠注射0.1mL(1.0×10⁴个细胞)，拔针时用棉球迅速堵住针孔防止液体外溢。

免疫器官指数＝免疫器官重量(g)/小鼠体重(g)×100％

1小鼠脾脏T淋巴细胞亚群分析

PBS溶液调整脾淋巴细胞浓度为5×10⁶细胞/mL。取流式细胞分析专用试管，每管加入细胞悬液100μL。每个样本制备2管，进行FITC，PE双色荧光抗体标记。第1管加入2μL PE标记抗CD3的抗体和1μL FITC标记抗CD4的抗体，第2管加2μL PE标记抗CD3的抗体和3μLPE标记抗CD8的抗体。室温闭光孵育20min后各管加入500μL PBS溶液，振荡混匀后分析，记录各管的CD³⁺％，CD³⁺CD⁴⁺％，CD³⁺CD⁸⁺％。

2DiO/PI双染色法检测小鼠脾脏CTL杀伤活性

实验采用DiO标记的靶细胞被杀伤破损时染料PI进入细胞标记细胞核，根据效靶细胞大小和DiO染色差异，可在流式分析结果FL1/FS图中区分靶细胞群，进而研究靶细胞死亡情况，计算CTL杀伤活性。实验步骤为5％FCS-RPMI 1640培养液将脾淋巴细胞调整至1×10⁶，5×10⁵，2.5×10⁵及1.25×10⁵个细胞每100μl的浓度后，以100μl/well分别添加到96孔圆底培养板中作为CTL杀伤效应细胞。用5％FCS-RPMI 1640培养液调整P815细胞浓度至10⁶细胞/mL，添加DiO(10μL/mL)，在37℃5％CO₂条件下孵育15min后，用培养液洗涤两次，用上述培养液调整细胞浓度至10⁴/100μl作为CTL靶细胞，以100μl/孔添加到效应细胞中(效∶靶细胞比分别为100∶1，50∶1，25∶1及12.5∶1)。P815靶细胞自然死亡率以10⁴/100μl靶细胞内添加100μL培养液作为对照组。37℃、5％CO₂培养3h后，每孔加入500mg/L的PI 8μL，继续孵育1h后取出，将培养板置于冰上终止杀伤反应，避光保存用于流式细胞仪检测。将培养板中各孔细胞轻轻吹起，并将待测细胞悬液转入流式分析管后添加500μL PBS溶液，用流式细胞仪对每个样本中的1,000个靶细胞作CTL杀伤活性的检测分析。CTL杀伤活性用CTL细胞对P815靶细胞的细胞毒性来表示，并通过下式计算：

计算出10％细胞毒性时的CTL的杀伤活性：LU₁₀(细胞毒性为10％时所需要的效应细胞数目)所需要的脾脏细胞数为单位来定量表示。此外，本实验还计算了整个脾脏全部细胞所具有的CTL细胞杀伤活性(LU₁₀/脾(见下式)。

3TBARS法测定肝脏丙二醛(MDA)含量

根据MDA试剂盒(南京建城生物试剂有限公司)说明书测定肝匀浆中的MDA含量。反应原理为，过氧化脂质降解产物中的MDA与硫代巴比妥酸(TBA)缩合，形成红色产物，在532nm处有最大吸收峰。具体操作见试剂盒说明书。

4肝脏抗氧化能力指数(ORAC)的测定

其原理为荧光物质荧光素二钠在485nm光激发下，发射527nm荧光，可以被能够释放过氧自由基的AAPH氧化而使荧光特性消失。当抗氧化剂存在时，可与荧光素二钠竞争氧化剂，减缓其荧光消退的速度。根据这一特性，可测定样品氧自由基清除活性。

在96孔板中加入20μL磷酸盐缓冲液，再加处理好的5％肝组织匀浆液20μL，接着依次加入AAPH 140μL和缓冲液20μL，加入荧光素二钠20μL启动反应，迅速将96孔板置于荧光酶标仪(预先设置温度37℃)中，开始测定，每2min测定一个点，共测定2h。

5肝脏组织中的Fas-L和Fas mRNA基因表达的测定

5.1RT-PCR引物设计

利用Primer 5.0引物设计软件设计合成引物，用于合成所需的Fas和Fas-L相关基因片段及内参18s(表11)，引物由美国Invitrogen(上海)英骏生物技术有限公司合成。然后根据这5个基因序列的不同特点，进行RT-PCR扩增。

表11用于RT-PCR的引物序列

5.2脾细胞总RNA的提取

收集脾脏淋巴细胞约5×10⁷个，离心去除培养基，加入2mL细胞裂解液Trizol试剂，用1mL枪头反复吹打直到裂解液中无明显沉淀，室温静置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。裂解液中加入氯仿(每1mLTrizol中加入0.2mLCHCl₃)，用力上下振荡15s得粉红色浑浊液，无分层现象，室温静置3min。4℃12,000r/min离心15min，离心管内液体分上中下三层，小心取出无色上清(约60％)，加入等体积异丙醇，轻轻摇匀室温静置10min。4℃12,000r/min离心15min，小心去上清，沿壁加入75％乙醇1mL，轻匀，静置2min。4℃12,000r/min离心5min，吸取上清，室温干燥沉淀2-5min。30-50μL无RNAase水溶解RNA沉淀，待完全溶解后于-20℃保存。琼脂糖凝胶电泳参照《分子克隆实验指南》的方法进行，胶浓度为0.8％，检测RNA质量。取RNA样品稀释100倍，在260nm和280nm测OD₂₆₀/OD₂₈₀比值以判断RNA纯度及浓度。

5.3cDNA第一链的合成

cDNA的合成，按照TIANGEN公司TIANScriptM-MLV试剂盒提供的实验方法操作(见表12)加入上述合成的RNA模板，合成cDNA第一链。

表12cDNA第一链合成的方法

5.4RT-PCR扩增反应(25μL体系)

按照表13所示组分进行添加以上合成好的cDNA为模板，并加入表11中的特异引物对，在PCR仪上进行PCR反应。

将上述反应混合物在冰上混匀，放入PCR仪，步骤1：94℃×5min；步骤2：94℃×30s→55℃×40s→72℃×50s(35个循环)；步骤3：72℃×7min。PCR反应结束后取出-20℃保存，用于电泳检测。

表13PCR反应过程

实验数据以平均值±S.E.表示，采用SPSS13.0软件，利用ANOVA检验和Dunnett’s检验进行统计学处理，P＜0.05有统计学意义。

实验结果

1SCE对应激负荷小鼠肝脏癌转移的影响

如图4A、B所示，DBA/2小鼠尾静脉注射P815肿瘤细胞后12天，小鼠全部成活，在肝脏出现大量的肿瘤克隆泡，在脾脏和肺脏也有少量转移，本发明以肝脏的肿瘤转移克隆数为重点研究对象。如所图4C示，正常对照组小鼠肝脏癌转移克隆数为10.80±3.72个，而应激模型组小鼠肝脏癌转移克隆数为31.40±4.90，表明拘束负荷诱发小鼠肝脏癌转移程度明显升高(P＜0.01)。如表14所示，SCE低高剂量组小鼠肝脏癌转移克隆数分别为26.40±4.81(P＜0.05)和18.40±3.723个(P＜0.01)，表明SCE对应激诱发的P815细胞的肝癌转移有显著的抑制作用。

表14SCE对应激负荷小鼠P815肝脏癌转移的影响

注：注射P815细胞后24小时内，7周龄雄性DBA/2小鼠被固定在拘束装置中20h。结果以每组7只动物的平均值±S.D表示。与P815对照组的显著性差异为^#P＜0.05和^##P＜0.01，与P815+应激对照组的为*P＜0.05，**P＜0.01。

2SCE对应激负荷小鼠免疫器官指数的影响

如表15所示，与正常对照组相比，P815对照组小鼠脾脏指数明显增加(P＜0.01)。与P815对照组相比，应激模型组脾脏指数下降(P＜0.05)。与应激模型组相比，SCE 100及200mg/kg组小鼠脾脏指数均增高(P＜0.05)。

表15SCE对应激负荷小鼠脾指数的影响

注：结果以每组7只动物的平均值±S.D表示。与正常对照组的显著性差异为^$$P＜0.01和^#P＜0.05，与P815+应激对照组的为*P＜0.05，**P＜0.01。

3SCE对应激负荷小鼠脾脏淋巴细胞数的影响

如图5所示，正常对照组相比，P815对照组小鼠脾细胞总数增加(P＜0.01)。如表16所示，与P815对照组相比，应激模型组脾细胞总数明显下降(P＜0.01)。与应激模型组相比，SCE 100及200mg/kg组小鼠脾细胞总数均显著增高(P＜0.01)。

表16SCE对应激负荷小鼠脾脏细胞数的影响

注：结果以每组7只动物的平均值±S.D表示。与正常对照组的显著性差异为^$$P＜0.01和^##P＜0.01，与P815+应激对照组的为**P＜0.01。

4SCE对应激负荷小鼠脾脏T淋巴细胞亚群的影响

图6为脾淋巴细胞样本流式亚群分析图，A图中D2区为CD3⁺CD4⁺细胞，B图中D2区为CD3⁺CD8⁺细胞，D1和D2区合起来代表CD3⁺细胞群。如图7所示，与正常对照组相比，P815对照组小鼠脾脏淋巴细胞Th(CD3⁺CD4⁺)亚群和Tc(CD3⁺CD8⁺)亚群的比例显著下降(P＜0.01)，表明P815瘤细胞接种12天后杀伤性T淋巴细胞比例明显下降。应激模型组和P815对照组相比，Tc(CD3⁺CD8⁺)淋巴细胞的比例变化不显著，但拘束应激使小鼠脾脏Th(CD4⁺CD3⁺)淋巴细胞总数显著减少(P＜0.05)。如表17所示，与应激模型组相比，100及200mg/kg口服SCE明显升高小鼠脾脏T淋巴细胞中的Th比例(P＜0.05)，结果表明SCE主要通过提高Th(CD3⁺CD4⁺)亚群的比例来实现免疫提高的作用。

表17SCE对应激负荷小鼠T淋巴细胞亚群的影响

注：结果以每组7只动物的平均值±S.D表示。与正常对照组的显著性差异为^$$P＜0.01、^#P＜0.05和^##P＜0.01，与P815+应激对照组的为*P＜0.05和**P＜0.01。

5SCE对应激负荷小鼠脾脏CTL细胞杀伤活性的影响

以流式细胞术DiO/PI双染色法检测脾脏细胞CTL杀伤活性，见图8。结果如图9所示，正常对照组未受P815肿瘤细胞的致敏，故未检测到CTL对P815细胞的杀伤活性。如表18所示，与P815对照组小鼠脾脏的CTL活性相比，拘束应激显著降低小鼠脾脏CTL活性LU₁₀/脾(P＜0.01)。与应激模型组相比，100及200mg/kg口服给药SCE后的小鼠脾脏CTL活性LU₁₀/脾均有不同程度的上升(P＜0.05)。

表18SCE对应激负荷小鼠脾脏CTL细胞活性的影响

注：结果以每组7只动物的平均值±S.D表示。与正常对照组的显著性差异为^##P＜0.01，与P815+应激对照组的为*P＜0.05和**P＜0.01。

6SCE对应激负荷小鼠肝脏MDA水平的影响

如表19所示，与正常对照组相比，P815对照组小鼠肝脏MDA含量增加(P＜0.01)。与P815对照组相比，应激模型组肝脏MDA含量增加更为明显(P＜0.01)。与应激模型组相比，SCE 100及200mg/kg组小鼠肝脏MDA含量均下降(P＜0.05)。

表19SCE对应激负荷小鼠肝脏MDA水平的影响

注：结果以每组7只动物的平均值±S.D表示。与正常对照组的显著性差异为^$$P＜0.01和^##P ＜0.01，与P815+应激对照组的为*P＜0.05和**P＜0.01。

7SCE对应激负荷小鼠肝脏ORAC水平的影响

如表20所示，与正常对照组相比，P815对照组小鼠肝脏ORAC水平下降(P＜0.05)。与P815对照组相比，应激模型组肝脏和血清ORAC水平均下降更为明显(P＜0.05)。与应激模型组相比，SCE 200mg/kg组小鼠肝脏ORAC水平显著上升(P＜0.05)，SCE 100和200mg/kg组小鼠血清ORAC水平上升明显，表明SCE能提高机体抗氧化能力水平。

表20SCE对应激负荷小鼠肝脏和血清ORAC水平的影响

注：结果以每组7只动物的平均值±S.D表示。与正常对照组的显著性差异为^$$P＜0.01和^##P＜0.01，与P815+应激对照组的为*P＜0.05和**P＜0.01。

8SCE对应激负荷小鼠肝脏Fas/Fas-L mRAN表达水平的影响

如图10所示，与P815对照组相比，应激模型组肝脏Fas/Fas-L mRAN表达水平明显下降(P＜0.01)。与应激模型组相比，SCE 100和200mg/kg组小鼠肝脏Fas/Fas-L mRAN表达水平均明显上升。

实验例3五味子提取物对应激性焦虑的抑制作用

分组与给药

将动物随机分为空白对照组、应激模型组、DZP阳性组、SCE(100mg/kg)和SCE(200mg/kg)共5组，每组10只，其中SCE为实施例1制备的五味子提取物。每只小鼠用苦味酸按头、四肢、尾巴等部位做好标记。

药物剂量与给药方式

根据临床成人拟用药剂量通过体表面积折算，以及前期预试验确定本实验研究剂量为：小鼠SCE低剂量100mg/kg、SCE高剂量200mg/kg。阳性对照药：***(安定，DZP)，剂量0.65mg/kg，经研钵粉碎后，用生理盐水配制成浓度为0.065mg/ml的混悬液，4℃保存，使用前混摇均匀。给药途径为灌胃给药，小鼠给药0.2mL/10g。DZP和SCE高低剂量组小鼠连续10天灌胃给药，正常对照组和模型组给予同体积蒸馏水，每天1次。实验过程中对动物的处置均符合动物伦理学标准。

模型制备

给药第7天模型组、DZP组和SCE高低剂量组灌胃给药30min后进行拘束应激。采用拘束应激建立小鼠焦虑模型。使用改造为通风良好50mL尖底聚丙烯塑料离心管。小鼠给予一次性拘束负荷18h(15:00-09:00)不能进食饮水，正常对照组小鼠为非拘束禁食禁水小鼠。拘束18h后将小鼠释放，恢复半天，模型组、DZP组和SCE高低剂量组小鼠灌胃给药30min后再次进行拘束应激18h(15:00-9:00)，此步重复两次。直到第10天根据空白对照组、应激模型组、***阳性组、SCE低剂量组和高剂量组依序放出小鼠，于中午12点进行行为学检测。

明暗穿梭箱(Light-Dark Transition Test)行为学测试

实验室内光线昏暗并保持恒亮，室温保持在21℃，安静。测试箱放置于实验室一角周围。测试于12:00～17:00之间进行，避免时辰因素的干扰。各组动物依分组顺序进行测试。

避暗实验仪器代替明暗箱进行行为测定。实验装置包括相连的明暗2个小箱组成。为1个11.5cm×11.5cm×30cm的动物笼，1/2为暗箱，1/2为明箱，中间有一块11.3cm×28.5cm的有洞隔板将明箱和暗箱隔开，暗箱外壁表面漆成黑色不通电，明箱上方装有日光灯。测试时，将小鼠置于明箱中央，背朝暗箱，释放后开始记录5min内小鼠总穿箱次数、明箱穿入次数和明箱滞留时间(s)，以此作为评价药物抗焦虑作用的指标。

数据记录采用***CoulArray色谱工作站和SPSS13.0软件进行分析，数据用均数±标准差(平均值±S.D)表示，组间数据比较是否有显著差异用t检验分析，P＜0.05有统计学差异。

实验结果

1SCE对拘束应激小鼠的抗焦虑影响

明暗箱测试结果显示，空白对照组小鼠的总穿梭次数为23.33±6.80，明箱穿入次数为11.67±3.50及明箱滞留时间为191.96±18.95s，而应激模型组小鼠总穿梭次数(8.00±5.10)、明箱穿入次数(3.83±2.48)明显较空白模型组低(P＜0.01)，小鼠在明箱的滞留时间(76.03±60.99s)也显著降低(P＜0.01)，表示应激模型小鼠焦虑水平高；阳性药DZP组均能明显提高应激小鼠总穿箱次数和明箱穿入次数(21.33±4.46和10.5±2.17，P＜0.01)，同时增加应激小鼠在明箱的停留时间(164.86±60.17，P＜0.05)，减轻应激致小鼠焦虑程度。

与模型组比较，SCE高低剂量组均能显著增加应激小鼠的总穿箱次数(19.00±9.96和16.17±6.27，P＜0.05)、明箱穿入次数(9.33±5.09和8.00±3.22，P＜0.05)和明箱停留时间(159.59±64.69和229.31±17.21，P＜0.05)，其中高剂量组更为明显(P＜0.01)。见表21：

表21SCE对拘束负荷小鼠明暗箱行为的影响(平均值±S.D，n＝8)

注：结果以每组8只动物的平均值±S.D表示。与正常对照组的显著性差异为^#P＜0.05，^##P＜0.01，与应激对照组的为*P＜0.05和**P＜0.01。

2SCE对拘束应激致焦虑模型小鼠大脑皮层神经递质水平的影响

2.1SCE对小鼠大脑皮层内神经递质(NE)水平结果

与对照组比较，应激模型组小鼠大脑皮层中NE水平在拘束应激后明显增加，其中对照组大脑皮层NE含量262.34±24.57ng/g，模型组309.88±8.50ng/g，与对照组相比P＜0.01，表明应激状态下NE释放增多可诱发小鼠产生焦虑；与模型组比较，DZP阳性组小鼠大脑皮层中NE水平则显著降低(282.03±27.80ng/g，P＜0.05)，具有治疗作用。

SCE高低剂量组均能明显降低应激小鼠大脑皮层中NE水平，其中SCE低剂量组为276.73±28.86ng/g，与模型组相比P＜0.05，而SCE高剂量组为246.50±22.01ng/g，与模型相比P＜0.01，说明SCE通过降低NE水平发挥抗焦虑作用。实验结果见表22：

表22SCE对应激小鼠大脑皮层NE水平的影响(平均值±S.D，n＝8)

2.2SCE对小鼠大脑皮层内神经递质DA水平结果

与对照组比较，应激模型组小鼠大脑皮层中DA水平在拘束应激后明显增加，其中对照组大脑皮层DA含量1097.55±49.24ng/g，模型组1158.76±14.67ng/g，与对照组相比P＜0.05，表明DA参与应激致焦虑的发生；与模型组比较，DZP阳性组小鼠大脑皮层中DA水平则显著降低(929.94±56.71ng/g，P＜0.01)，说明具有治疗作用。

SCE高低剂量组均能降低应激小鼠大脑皮层中DA水平，其中SCE高剂量组(1015.66±83.08ng/g)作用较显著，与模型相比P＜0.01，发挥了显著地抗焦虑作用；而SCE低剂量组(1131.81±53.40ng/g)与模型相比无统计学差异。实验结果见表23：

表23SCE对应激小鼠大脑皮层DA水平的影响(平均值±S.D，n＝8)

2.3SCE对小鼠大脑皮层内神经递质5-HT水平结果：

急性拘束应激后，对小鼠大脑皮层5-HT水平的结果显示，对照组5-HT含量在大脑皮层中为374.10±45.58ng/g，而模型组含量为426.51±17.06ng/g，与对照组相比，P＜0.05，表明了5-HT的释放增多与焦虑有关。而DZP阳性组小鼠大脑皮层内5-HT含量373.36±25.37ng/g，与模型组比较能降低应激小鼠大脑皮层DA含量，且P＜0.01，说明其可通过降低5-HT发挥治疗作用。

与应激模型组比较，SCE高低剂量组均能显著降低小鼠大脑皮层内5-HT含量(362.10±29.58ng/g和336.16±27.05ng/g)，且具有统计学差异(P＜0.01)，说明SCE发挥了抗焦虑作用。实验结果见表24：

表24SCE对应激小鼠大脑皮层5-HT水平的影响(平均值±S.D，n＝8)

采用实施例2-10制备的五味子提取物或含有五味子提取物的组合物同法进行实验例1-3的实验。结果表明：本发明制备的五味子提取物或含有五味子提取物的组合物均具有抗应激性肝损伤、抗应激性肝癌转移和抗应激性焦虑的作用，说明本发明的五味子提取物能够预防和/或治疗由应激导致的相关疾病。通过对各指标的综合评价，以实施例1抗应激的效果为最优。

Claims

1.一种五味子提取物，其特征在于，所述提取物中五味子总木脂素的重量含量至少为10％。

2.根据权利要求1所述的五味子提取物，其特征在于，所述提取物采用如下步骤制备：

取干燥的五味子，粉碎成10-60目的粗粉，采用亚临界萃取设备提取，萃取压力为0.2-3Mpa，萃取温度为30-60℃，通入低级烷烃，萃取3-5次，每次30-100分钟，合并萃取液，静置后过滤，得到五味子提取物；其中，所述低级烷烃为C1-C18的烷烃。

3.根据权利要求1或2所述的五味子提取物，其特征在于，所述提取物中五味子总木脂素的重量含量至少为50％。

4.根据权利要求3所述的五味子提取物，其特征在于，所述提取物采用如下步骤制备：

5.一种制备五味子提取物的方法，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.权利要求1-4任一项所述的五味子提取物或者含有所述五味子提取物的组合物在制备抗应激的药物和/或保健品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其为在制备预防和/或治疗应激性肝损伤的药物和/或保健品中的应用。

9.根据权利要求7所述的应用，其为在制备预防和/或治疗应激性肝癌转移的药物和/或保健品中的应用。

10.根据权利要求7所述的应用，其为在制备预防和/或治疗应激性焦虑的药物和/或保健品中的应用。