CN101580554B - 金线莲多糖及其在制药中的应用和金线莲多糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种金线莲多糖制品、其制备方法及其医药用途，金线莲多糖是从金线莲中提取出来，其分子量为1000与80000道尔顿之间，固态呈灰白色或白色。该制品可开发成降血糖、降血脂药物及保健品，其制备方法可靠易行，适合大规模生产，不污染环境，成本低。
Description
技术领域
本发明涉及金线莲多糖，具体来说涉及这种多糖以及制备方法和其医药用途。
背景技术
金线莲别名金蚕、金石松、树草莲等，是兰科开唇兰属的植物花叶开唇兰的全草，味甘、性平，具有清热凉血、除湿解毒的功效，可治疗肺结核咯血、糖尿病、肾炎、膀胱炎、重症肌无力、遗精、风湿性及类风湿性关节炎等症。
金线莲富含有多糖、微量元素、强心苷类、氨基酸、有机酸、甾体化合物、黄酮类化合物及生物碱等多种有效成分。金线莲的总糖含量为32％以上，其中还原糖含量为7％左右，寡糖含量为11％左右，多糖含量为14％左右。近年来研究表明，金线莲的水溶性多糖具有重要生理活性，比如消炎功效。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种金线莲多糖。
本发明的第二个目的还在于提供一种金线莲多糖的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供本发明涉及的金线莲多糖的医药用途。
本发明提供一种金线莲多糖，是从兰科开唇兰属多年生草本植物金线莲中提取出来，其分子量为1000～80000道尔顿，固态呈白色或灰白色。
本发明的金线莲多糖由下述方法制备：
A.水提将金线莲药材粉碎，加水提取，取提取液；
B.醇沉将步骤A中获得的提取液经过过滤后用乙醇进行醇沉，分离出沉淀物得金线莲粗多糖；
C.沉淀将金线莲粗多糖溶于水后，过滤，滤液用碱调pH值至9.0～14.0，然后再向滤液中加入季铵盐进行沉淀，静置，离心，抽滤，取滤液；
D.醇沉向步骤C中抽滤得到的滤液加入乙醇进行醇沉，取沉淀物；
E.盐洗步骤D中的沉淀物用氯化物溶液溶解，调节pH值至3.0～7.0，静置，离心，抽滤，取滤液；
F.精制将步骤E中得到的滤液经过醇沉精制或者用大孔树脂柱床精制得水溶液；
G.醇沉向步骤F中得到的水溶液中加入乙醇进行醇沉，取沉淀物经干燥得金线莲多糖。
在上述的制备方法中，步骤A的水提过程可以采用40℃～100℃的水浸泡30min以上，过滤后滤渣在40℃～100℃加水再提取一次，提取时间为30min以上，滤取两次提取液。
在所述的步骤B、D和G中醇沉，可以采用体积浓度为95％的乙醇进行醇沉，并经过静置、离心后分离出沉淀物。
所述的步骤B、D、G中醇沉后醇的最终体积浓度为30％～95％。
所述的步骤C中的季铵盐可以选用十六烷基三甲铵溴化物及其氢氧化物、十六烷基吡啶、碘化N-三甲基壳聚糖季铵盐或壳聚糖羟丙基三甲基氯化铵。
所述的步骤C中调pH值用的碱可以为氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸氢钠或氨水等。
所述的步骤E中的氯化物可以为氯化钠或氯化钾。
所述的步骤E中调pH值用的酸为盐酸、磷酸、柠檬酸或硫酸等。
所述的步骤F中用的大孔树脂是AB-8型、X-5型、H107型、S-8型、D3520型、D4006型、D4020型、NKA-9型、XAD-2型、XAD-3型、HP型、SIP1300型、SIP1400型、HPD100型、HPD300型、HPD600型、M3型、ABD-4型、DM-130型、D101型、D201型、D301型、1300-型、1300-66型、100型、500型或者600型大孔树脂。
所述的步骤F中的醇沉精制是将步骤E中的滤液浓缩至粗金线莲多糖重量的3～12倍后，加入体积浓度为95％的乙醇，使得溶液中乙醇体积含量达到30％～95％，沉淀出金线莲多糖，再将金线莲多糖用3～12倍量的水加热溶解形成水溶液。
所述步骤F中的大孔树脂床精制是将步骤E中的滤液上大孔树脂柱床，并用水洗脱至流出液无色透明，合并流出液，浓缩，过滤，得水溶液。
还提供了本发明的金线莲多糖在制备降血糖、降血脂、保肝药物中的应用。
本发明采用现代科学方法，对所述的金线莲多糖进行分离、提纯，所制得的金线莲多糖产品安全无毒，制备工艺可靠，原料易得，反应条件温和，收率高，纯度好，环保，稳定性好，对制备设备及场所要求也很低，适合于大规模工业化生产。
根据药理、药效学研究的结果表明，本发明所制得的金线莲多糖产品对心血管***具有明显的作用，可开发成降血糖、降血脂、保肝类药物。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细描述，以助于理解本发明的内容。
实施例1：大孔树脂预处理
本发明所用大孔树脂型号有AB-8型、X-5型、H107型、S-8型、D3520型、D4006型、D4020型、NKA-9型、XAD-2型、XAD-3型、HP型、SIP1300型、SIP1400型、HPD100型、HPD300型、HPD600型、M3型、ABD-4型、DM-130型、D101型、D201型、D301型、1300-型、1300-66型、100型、500型或者600型大孔树脂。这些型号的大孔树脂处理原理和步骤很相似，所以在下面的实施例中以X-5型大孔树脂为例来简单介绍：
树脂的预处理：以水或乙醇溶胀过夜，湿法装柱，以乙醇或丙酮洗脱，至回收后无白色沉淀或浑浊即可，然后用水洗至无醇味，交替洗脱2～3次。也可用酸、碱浸，然后再水洗至中性。
树脂的再生：非吸附性杂质一般用水洗除去；吸附性杂质可用一定浓度的酸或碱液除去(NaOH或HCl)。保存时加入一定量的乙醇。
实施例2：金线莲多糖制备
取金线莲药材，粉碎，取金线莲粉1.0kg，加水10.0L，80℃加热浸泡提取，提取时间为3.0小时，降温，过滤，得滤液①；滤渣加水8.0L，80℃加热提取，提取时间为2.0小时，降温，过滤，得滤液②，合并两次滤液得滤液15.5L。在此步骤中为了提取充分，水温低时需要适当延长提取时间。
滤液浓缩至7.0L，过滤，得滤液6.7L。将滤液离心，得上清液6.0L，在上清液中加入95％乙醇(v％，以下乙醇浓度均指体积浓度)，使溶液中的乙醇浓度达到70％，静置，离心，取沉淀，沉淀用体积浓度为95％的乙醇和丙酮各洗两次，真空干燥，得金线莲粗多糖242.31g。
将200.00g的金线莲粗多糖溶于2.0L的水，过滤，滤液用10.0mol/L的NaOH溶液调pH值至12.5，然后再向滤液中加入质量浓度为5％的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶液，使溶液中的CTAB浓度达到1.5％，静置，离心，得滤液2.3L。滤液加入95％乙醇，使溶液中的乙醇浓度达到70％，静置，离心，取沉淀，沉淀用1.0L质量浓度为5％的NaCl溶液溶解，再用质量浓度为38％的盐酸溶液调节pH值至5.5，静置，离心，过滤，得滤液0.8L。
将滤液上大孔树脂柱床，并用水洗脱至流出液无色透明，得流出液4.4L，浓缩至1.0L，过滤，得滤液0.8L。滤液加入95％乙醇，使溶液中的乙醇浓度达到70％，静置，离心，取沉淀，沉淀用95％的乙醇和丙酮各洗两次，真空干燥，得金线莲多糖4.62g。
检验结果：
1.多糖鉴别：苯酚-硫酸试剂反应(阳性)
2.性状：白色粉末
2.多糖含量：92.94％(用苯酚-硫酸法测定)
3.多糖分子量测定：28961道尔顿(参考2005年药典二部附录VH)。
实施例3：金线莲多糖制备
取金线莲药材，粉碎，取金线莲粉1.0kg，加水12.0L，90℃加热提取，提取时间为4.0小时，降温，过滤，得滤液①；滤渣加水10.0L，90℃加热提取，提取时间为3.0小时，降温，过滤，得滤液②，合并两次滤液得滤液17.0L。
滤液浓缩至7.8L，过滤，得滤液7.3L。将滤液离心，得上清液6.8L，在上清液中加入95％乙醇，使溶液中的乙醇浓度达到60％，静置，离心，取沉淀，沉淀用95％的乙醇和丙酮各洗两次，真空干燥，得金线莲粗多糖254.22g。
将200.00g的金线莲粗多糖溶于3.0L的水，过滤，滤液用10.0mol/L的NaOH溶液调pH值至13.0，然后再向滤液中加入5％的CTAB溶液，使溶液中的CTAB浓度达到1.5％，静置，离心，得滤液2.8L。滤液加入95％乙醇，使溶液中的乙醇浓度达到60％，静置，离心，取沉淀，沉淀用1.2L质量浓度为5％的Nacl溶液溶解，再用38％的盐酸溶液调节pH值至5.0，静置，离心，过滤，得滤液1.0L。
将滤液上大孔树脂柱床，并用水洗脱至流出液无色透明，得流出液5.0L，浓缩至1.2L，过滤，得滤液1.0L。滤液加入95％乙醇，使溶液中的乙醇浓度达到60％，静置，离心，取沉淀，沉淀用95％的乙醇和丙酮各洗两次，真空干燥，得金线莲多糖4.55g。
检验结果：
1.多糖鉴别：苯酚-硫酸试剂反应(阳性)
2.性状：白色粉末
2.多糖含量：90.23％(用苯酚-硫酸法测定)
3.多糖分子量测定：27698道尔顿(参考2005年药典二部附录VH)。
实施例4：金线莲多糖制备
取金线莲药材，粉碎，取金线莲粉1.0kg，加水10.0L，80℃加热浸泡提取，提取时间为3.0小时，降温，过滤，得滤液9.0L；滤渣加水8.0L，80℃加热提取，提取时间为2.0小时，降温，过滤，得滤液7.0L，合并两次滤液得滤液16.0L。在此步骤中为了提取充分，水温低时需要适当延长提取时间。
滤液浓缩至7.0L，过滤，得滤液6.5L。将滤液离心，得上清液6.0L，在上清液中加入95％乙醇(v％，以下乙醇浓度均指体积浓度)，使溶液中的乙醇浓度达到70％，静置，离心，取沉淀，沉淀用体积浓度为95％的乙醇和丙酮各洗两次，真空干燥，得金线莲粗多糖253.63g。
将200.00g的金线莲粗多糖溶于2.0L的水，过滤，滤液用10.0mol/L的NaOH溶液调pH值至12.5，然后再向滤液中加入质量浓度为5％的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶液，使溶液中的CTAB浓度达到1.5％，静置，离心，得滤液2.5L。滤液加入95％乙醇，使溶液中的乙醇浓度达到70％，静置，离心，取沉淀，沉淀用1.2L质量浓度为5％的NaCl溶液溶解，再用质量浓度为38％的盐酸溶液调节pH值至5.5，静置，离心，过滤，得滤液1.1L。
将滤液浓缩至0.7L，加入95％乙醇，使得溶液中乙醇含量达到70％，静置，离心，取沉淀。沉淀用1.0L水加热溶解，再加入95％乙醇，使得溶液中乙醇含量达到70％，静置，离心，取沉淀。沉淀用1.0L水加热溶解，再加入95％乙醇，使得溶液中乙醇含量达到70％，静置，离心，取沉淀，沉淀用95％的乙醇和丙酮各洗两次，真空干燥，得金线莲多糖4.61g。
检验结果：
1.多糖鉴别：苯酚-硫酸试剂反应(阳性)
2.性状：灰白色粉末
2.多糖含量：91.61％(用苯酚-硫酸法测定)
3.多糖分子量测定：31722道尔顿(参考2005年药典二部附录VH)。
实验例：
药效试验结果
A、金线莲多糖降低小鼠血糖的作用
取小鼠随机分成5组，给药组分别为金线莲多糖(取实施例2制得的金线莲多糖，性状为白色粉末、多糖含量为92.94％、多糖分子量为28961道尔顿)80、160、240mg/kg；对照组为生理盐水，连续4d，在末次给药前动物禁食2h，给药后3h眼眶后静脉丛取血，用葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖含量，结果见表1，按统计学处理，表明金线莲多糖160mg/kg和240mg/kg连续给药4d后血糖水平明显低于对照组。
表1金线莲多糖降低小鼠血糖的作用
注：与正常对照组比较*P＜0.05，*P＜0.01
B、金线莲多糖预防小鼠高脂血症的作用
取昆明种小鼠若干，随机分成6组，如表2与表3。连续灌胃给药10天，空白组给予生理盐水，其他组分别给予相应的药物。以末次给药1小时后腹腔注射蛋黄乳0.5ml/25g。空白组腹腔注射0.5ml的生理盐水。20小时后眼眶取血(禁食不禁水12小时)，低温离心2500转/分钟，取上清血清测量TC和TG两项指标。
表2金线莲多糖预防小鼠的高胆固醇血症的作用
实验结果表明，剂量为0.240g/kg的金线莲多糖组和辛伐他汀组作用相当，所以金线莲多糖对对预防小鼠的高胆固醇血症有非常显著的效果。
表3金线莲多糖预防小鼠甘油三脂的作用
实验结果表明，剂量为0.240g/kg的金线莲多糖组和辛伐他汀组作用相当，所以金线莲多糖对对预防小鼠的甘油三脂有非常显著的效果。
C、金线莲多糖的护肝作用
取小鼠50只，随机分为空白组、模型组、金线莲多糖低、中、高剂量组。各样品组小鼠每日灌胃给药受试样品，空白组和模型组均灌胃等体积蒸馏水，连续30天。于试验第31天将各组动物隔夜禁食16小时，对照组和个样品组一次空腹注射给予0.1％CCl40.1mL/10g体重，空白组腹腔注射等体积蓖麻油，各样品组继续给予受试物。采血前禁食12h，24h后动物眼眶取血。用全自动生化分析仪测ALT、AST，并摘取肝脏，用10％甲醛溶液固定，做病理切片检查。
表4金线莲多糖的护肝作用
表5试验小鼠病理组织学检查结果
表6试验小鼠病理组织学检查结果
从表4中可以看出金线莲多糖具有护肝的作用，同时表5和表6也能体现金线莲多糖具有明显的护肝作用。
Claims (11)
1.一种金线莲多糖的制备方法，所述金线莲多糖是从兰科开唇兰属多年生草本植物金线莲中提取出来，其分子量1000～80000道尔顿，固态呈白色或灰色，制备方法包括如下过程：
A.水提 将金线莲药材粉碎，加水提取，取提取液；
B.醇沉 将步骤A中得到的提取液经过过滤后用乙醇进行醇沉，分离出沉淀物得金线莲粗多糖；
C.沉淀 将金线莲粗多糖溶于水后，过滤，滤液用碱调pH值至9.0～14.0，然后再向滤液中加入季铵盐进行沉淀，静置，离心，抽滤，取滤液；
D.醇沉 向步骤C中抽滤得到的滤液加入乙醇进行醇沉，取沉淀物；
E.盐洗 步骤D中的沉淀物用氯化物溶液溶解，调节pH值至3.0～7.0，静置，离心，抽滤，取滤液；
F.精制 将步骤E中得到的滤液经过醇沉精制或者用大孔树脂柱床精制得水溶液；
G.醇沉 向步骤F中得到的水溶液中加入乙醇进行醇沉，取沉淀物经干燥得金线莲多糖。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤A中的水提过程是采用40℃～100℃的水浸泡30min以上，过滤后滤渣在40℃～100℃加水再提取一次，提取时间为30min以上，滤取两次提取液。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在所述的步骤B、D和G中的醇沉，是采用体积浓度为95％的乙醇进行醇沉，并经过静置、离心后分离出沉淀物，醇沉后醇的最终体积浓度为30％～95％。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤C中的季铵盐选用十六烷基三甲铵溴化物及其氢氧化物、十六烷基吡啶、碘化N-三甲基壳聚糖季铵盐或壳聚糖羟丙基三甲基氯化铵。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤E中的氯化物为氯化钠或氯化钾。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤F中用的大孔树脂是AB-8型、X-5型、H107型、S-8型、D3520型、D4006型、D4020型、NKA-9型、XAD-2型、XAD-3型、HP型、SIP1300型、SIP1400型、HPD100型、HPD300型、HPD600型、M3型、ABD-4型、DM-130型、D101型、D201型、D301型、1300-型、1300-66型、100型、500型或者600型大孔树脂。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤F中的醇沉精制是将步骤E中滤液浓缩至粗金线莲多糖重量的3～12倍后，加入体积浓度为95％的乙醇，使得溶液中乙醇体积含量达到30％～95％，沉淀出金线莲多糖，再将金线莲多糖用3～12倍重量的水加热溶解形成水溶液。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤F中的大孔树脂床精制是将步骤E中的滤液上大孔树脂柱床，并用水洗脱至流出液无色透明，合并流出液，浓缩，过滤，得水溶液。
9.一种权利要求1-8中之一所述方法制备的金线莲多糖，其分子量为1000～80000道尔顿，固态呈白色或灰白色。
10.一种权利要求9所述的金线莲多糖在制备降血脂的药物中的应用。
11.一种权利要求9所述的金线莲多糖在制备保肝药物中的应用。
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