CN101542288A

CN101542288A - 鉴别trpv2的调节剂的组合物和方法

Info

Publication number: CN101542288A
Application number: CNA2006800496068A
Authority: CN
Inventors: N·秦; Y·刘; C·M·弗洛尔斯; T·哈钦森; M·P·尼佩尔
Original assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Current assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Priority date: 2005-10-31
Filing date: 2006-10-30
Publication date: 2009-09-23
Also published as: US20070105086A1; JP2009513159A; US7575882B2; EP1952160B1; US20090275649A1; DE602006021223D1; WO2007053526A1; EP1952160A1; ATE504836T1; AU2006308914A1

Abstract

现在已经发现，某些***素特异性地激活TRPV2通道活性。基于该发现，提供了用于筛选、鉴别和表征增加或降低TRPV2的生物活性的化合物的新组合物和方法。

Description

鉴别TRPV2的调节剂的组合物和方法

与相关申请的交叉参考

本申请要求享有2005年10月31日提交的申请号60/731,686和2006年3月15日提交的申请号60/782,656的优先权，其所有内容在这里引作参考。

发明领域

本发明涉及热受体离子通道蛋白的调节。具体地，本发明涉及用于筛选、鉴别和表征增加或降低TRPV2的生物活性的化合物的组合物和方法。

背景

在哺乳动物中，热、机械或化学刺激触发的疼痛感觉是有用的警告和保护***。相当大努力已经付诸于阐明神经元组织中热和冷感觉的检测、转导和传递所涉及的生化机理。热刺激激活位于感觉神经元(例如从背根神经节(DRG)和三叉神经节(TG)衍生出的那些)上的专门受体。当这些刺激是在有害范围内(即，非常热或冷)时，它们激活称作伤害性感受器(感知疼痛的神经元)的感觉神经元亚群上的某些热受体亚型。激活后，热受体(例如，离子通道)将有害刺激转换成电信号，它沿着感觉神经元传播至脊髓，在这里它传达给脑，最后导致疼痛感。因此，这些热受体代表着开发用于治疗各种疼痛状况的药物的非常有前途的靶。

已经鉴别出具有从有害热至有害冷的广范围温度敏感性的几种温度激活的受体。这些温度激活的受体属于非选择性阳离子通道的瞬时型感受器电势(TRP)家族，它们在秀丽隐杆线虫(C.elegans)和黑腹果蝇(D.melanogaster)中参与机械-和渗透调节。几种这样的温度激活的受体(包括TRPV1和TRPV2)牵涉于有害热感觉(Caterina等人，1997，Nature，389：816；和Caterina等人，1999，Nature 398：436)。TRPV1是热-TRP家族的最广泛表征的成员，由中等热(约43℃)、辣椒碱、质子和某些内源性***素(endocannabinoid)例如花生四烯酸乙醇酰胺(anandamide)和2-AG激活。普遍认为，TRPV1促成损伤后的急性热伤害感受和痛觉过敏(Clapham，Nature.2003，426(6966)：517-24)。

TRPV2也称作VRL-1，已经被视作有害温度(＞52℃)的感受器，它可能介导“第一”疼痛，即有害刺激引起的快速的、急性的、且剧烈的疼痛(Caterina等人，1999，同上；Story等人，Cell，2003，112：819-829，和其中的文献)。TRPV2在结构上与TRPV1最密切相关(在蛋白水平约50％序列同一性)。TRPV2在感觉神经节的中等直径至大直径的神经元中表达，以及在脑、脊髓、脾和肺中以更低的水平表达。此外，TRPV2在损伤后在交感神经节后神经元中未调节，这暗示着TRPV2在交感神经介导的疼痛中的潜在作用(Gaudet等人，Brain Res.2004，1017(1-2)：155-62)。因而，TRPV2的调节可能潜在地具有许多治疗用途。

尽管在TRPV2调节中具有巨大利益，但仍然必须开发出用于筛选、鉴别和表征TRPV2调节剂的***。这部分地归因于缺乏已知的、且尤其选择性的TRPV2激动剂以及在高温环境中测定这些通道的技术困难。一般而言，TRPV2不对已知的TRPV1激动剂作出响应(Benham等人，2003，Cell Calcium 33：479-487)。但是，最近的研究报道，硼酸2-氨基乙氧基二苯酯(2-APB)(即一种非选择性TRP调节剂)能激活TRPV1、TRPV2和TRPV3(Hu等人(2004)，J.Biol.Chem.，279：35741-8)，尽管其它人没有观察到2-APB对TRPV2的激活(Chung等人(2004)，JNeurosci.24：5177-82)。

在克服上述挑战的努力中，本发明提供了用于筛选、鉴别和表征TRPV2激动剂的新组合物和方法。

概述

现在已经发现，某些***素特异性地激活TRPV2通道活性。

在一个总方面，本发明提供了鉴别降低TRPV2的生物活性的化合物的方法，其包含下述步骤：a)在***素激活TRPV2的条件下，使TRPV2多肽接触能激活TRPV2活性的***素；b)使TRPV2多肽接触实验化合物；c)在有***素和实验化合物存在下，测量TRPV2的生物活性；d)重复步骤a)；e)在有***素、但是没有实验化合物存在下，测量TRPV2的生物活性；和f)对比从步骤c)测得的TRPV2活性和从步骤e)测得的TRPV2活性；从而当从步骤c)测得的TRPV2活性小于从步骤e)测得的TRPV2活性时，鉴别出降低TRPV2的生物活性的化合物。

在另一个总方面，本发明提供了鉴别增加TRPV2的生物活性的化合物的方法，其包含下述步骤：a)获得定义复合物的三维结构的原子坐标，所述复合物包含与能激活TRPV2的***素相互作用的TRPV2；b)阐明TRPV2和相互作用***素之间的结构关系；c)基于该结构关系，设计***素的结构类似物；d)合成该结构类似物；和e)测定该结构类似物改变TRPV2的生物活性的程度，从而鉴别增加TRPV2的生物活性的化合物。

本发明的另一个总方面是，增加TRPV2的生物活性的方法，其包含使TRPV2接触能激活TRPV2活性的***素的步骤。

本发明还提供了刺激受试者的有害热感觉的方法，其包含给受试者施用包含有效量的能激活TRPV2活性的***素的药物组合物，从而刺激受试者的有害热感觉。

从下述公开内容、包括本发明的详述和它的优选实施方案和所附的权利要求书，将明白本发明的其它方面、特征和优点。

附图说明

图1显示了在***属(Cannabis)中存在的***素亚类(Thakur等人，Life Sci.2005 Oct 17，印刷物之前的电子出版物)。

图2显示了Δ9-THC从它的前体的非酶促形成(Thakur等人，同上)。

图3显示了2种代表性内源性***素的结构(Thakur等人，同上)。

图4显示了FLIPR测定中Δ9-THC对大鼠TRPV2的浓度依赖性激活。

图5解释了全细胞膜片钳研究中得出的Δ9-THC对大鼠和人TRPV2的激活和随后的钌红对Δ9-THC-激活的电流的阻断。

图6显示了Δ⁹-THC激活的从HEK293细胞重组表达的TRPV2的缺失突变：(A)N-末端缺失突变体；和(B)C-末端缺失突变体。

图7解释了从HEK293细胞重组表达的人和大鼠TRPV2嵌合体的激活：(A)所述嵌合体从细胞个别表达；和(B)当它们从细胞共表达时，RRH和HRR的互补效应。

详述

本文所引的全部出版物都并入本文作为参考。除非另有定义，在本文中使用的全部技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员一般理解的相同的含义。

本文使用的术语“包含”、“含有”、“具有”和“包括”都以其开放的，而非限制性的意义使用。

下面是有时在本说明书中使用的缩写：

2-AG＝2-花生四烯酸甘油(arachidonylglycerol)

AEA＝花生四烯酸乙醇酰胺＝N-花生四烯酸乙醇胺(N-arachidonylethanolamine)

bp＝碱基对

cDNA＝互补DNA

Ca²⁺＝钙

Δ⁹-THC＝Δ-9-四氢***酚

DRG＝背根神经节

FLIPR＝荧光成像平板读数器

kb＝千碱基；1000碱基对

PAGE＝聚丙烯酰胺凝胶电泳

PCR＝聚合酶链反应

SDS＝十二烷基硫酸钠

TG＝三叉神经节

TRPV2＝瞬时型感受器电势阳离子通道，亚家族V，成员2

本文使用的术语“TRPV2的生物活性”是指如根据标准技术，体内或体外测得的TRPV2蛋白发挥的活性。这样的活性可以是直接活性，例如TRPV2结合配体的能力，例如***素或其类似物。所述活性可以是TRPV2形成的离子通道的传导性。所述活性也可以是细胞生理学的功能变化，例如细胞的钙动员或伤害性响应。TRPV2的生物活性可以是间接活性，例如TRPV2通过与一种或超过一种其它蛋白或其它分子的相互作用介导的信号转导活性。

“结合亲和力”指2个或更多个分子实体彼此结合或相互作用的能力。所述结合可以来自一个或多个化学键的形成，其导致2个相互作用实体的连续的且稳定的接近。所述结合也可以仅仅基于物理亲和力，这在共同定位(co-localizing)2个相互作用实体方面同样有效。物理亲和力和化学键的实例包括，但不限于，电荷差异造成的力、疏水性、氢键、范德瓦尔斯力、离子力、共价键和它们的组合。相互作用实体之间的接近状态可以是瞬时的或永久的，可逆的或不可逆的。在任何情况下，与2个实体的天然随机运动造成的接触形成对照且可以区分开。

“***素”包括激活***素受体的各种化合物中的任一种或所述化合物的结构类似物。

在一个实施方案中，“***素”包括草本***素，最初从植物***(Cannabis sativa L)提取的一类化合物或其代谢物。***是最古老的已知药用植物之一，且已经广泛研究了它的植物化学。该植物生物合成共483种已经鉴别出的化学实体，它们属于不同的化学类别(EISohly，2002，见：F.Grotenhermen和E.Russo，编，Cannabis and Cannabinoids，Haworth Press，Binghamton(2002)，pp.27-36.)，其中***素是已知仅存在于该植物中的最有特色的化合物类别。存在66种已知的植物-衍生的***素(Thakur等人，Life Sci.2005 Oct 17，印刷物之前的电子出版物)。其中最普遍的是四氢***酚(THC)、***二酚(CBD)和***酚(CBN)。第二最丰富的***素是***萜酚(CBG)、***环萜酚(CBC)和cannabinodiol(CBND)。

图1显示了在***中存在的***素亚类的代表性结构。大多数***素含有21个碳原子，但是附着到芳族环上的C-3侧链的长度存在一些变化。在最常见的同系物中，正戊基侧链被替换为正丙基(De Zeeuw等人，Science.1972，175：778-779)；和Vree等人，Journal of Pharmacyand Pharmacology.1972，24：7-12)。这些类似物使用后缀“varin”来命名，且例如命名为THCV、CBDV或CBNV。也存在具有1个(Vree等人，1972，同上)和4个(Smith，1997，Journal of Forensic Sciences 42(1997)，pp.610-618)碳的***素，但是是次要组分。经典的***素(CC)是携带苯并吡喃部分的ABC三环萜类化合物，且其不溶于水，但是可溶于脂质、醇、和其它非极性有机溶剂(Thakur等人，2005，同上)。这些酚衍生物是更水溶性的，因为它们在强碱性条件下形成酚盐。

“***素”的一个具体实例是Δ-9-四氢***酚(Δ-9-THC，Δ⁹-THC)，***(***)的关键心理活性成分(Gaoni和Mechoulam 1964，Journal ofthe American Chemical Society 86(1964)，pp.1646-1647)。如图2所示，通过保藏或抽烟过程中光或热的作用或在碱性条件下，通过它的非心理活性的前体Δ⁹-THCA的脱羧作用，形成Δ⁹-THC。Δ⁹-THCA通过充分确立的包含几种具体酶的作用的途径生物合成。

已经发现，Δ⁹-THC与2种已知的***素(CB)受体相互作用：CB1(Devane等人，1988，Molecular Pharmacology 34(1988)，pp.605-613；Gerard等人，1990，Nucleic Acids Research 18(1990)，p.7142；Gerard等人，1991，Biochemical Journal 279(1991)，pp.129-134；和Matsuda等人，1990，Nature 346(1990)，pp.561-564.)和CB2(Munro等人，1993，Nature 365(1993)，pp.61-65)。2种***素受体属于G-蛋白偶联的受体超家族，并生成广谱生理效应(Grotenhermen，2002，见：R.Grotenhermen和E.Russo，编，Cannabis and Cannabinoids，HaworthPress，Binghamton(2002)，pp.123-142)，包括止吐、增强食欲、止痛、和降低眼内压。在动物内发现特异性***素受体最终导致内源性***素的搜索和鉴别。

因而，术语“***素”也包括内源性***素。术语“内源性***素”指***素受体的配体，其中所述配体在动物身体内内源地生成。示例性内源性***素包括，但不限于，N-花生四烯酸乙醇胺(AEA，花生四烯酸乙醇酰胺)和2-花生四烯酸甘油(2-AG)，它们的结构如图3所示。显实花生四烯酸乙醇酰胺以适度亲和力(K_i＝61nM)结合CB1受体，对CB2受体具有低亲和力(K_i＝1930nM)(Lin等人，1998，Journal ofMedicinal Chemistry 41(1998)，pp.5353-5361)，且在用于表征***素活性的生化和药理学测试中起部分激动剂的作用。已经报道，花生四烯酸乙醇酰胺也可以结合和激活TRPV1(Di Marzo等人，Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 2002；66：377-91)。2-AG微弱地结合CB1(K_i＝472nM)和CB2(K_i＝1400nM)受体(Mechoulam等人，1995，Biochemical Pharmacology 50(1995)，pp.83-90)。2-AG分离自肠和脑组织，且以AEA(3)的约170-倍的浓度存在于脑中(Stella等人，1997，Nature 388(1997)，pp.773-778)。

在另一个实施方案中，术语“***素”涵盖了通过化学合成生产且天然不存在的合成***素。合成的***素可以基于草本***素或内源性***素的结构来合成。合成的***素在通过制备***素分子的***增量修饰来测定***素化合物的结构和活性之间的关系的实验中是特别有用的。示例性合成***素包括屈***酚(合成的THC)、***隆和激活***素受体的任何其它合成化合物或该化合物的结构类似物。

“能激活TRPV2活性的***素”指能结合TRPV2通道，且在没有其它刺激下，表现出TRPV2通道的传导性比基线增加了至少10％的任何***素。本领域技术人员可以实验地测定***素是否能激活TRPV2活性。在有些实施方案中，“能激活TRPV2活性的***素”是，在结合TRPV2通道后，导致通道的传导性比基线增加了至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的***素。“能激活TRPV2活性的***素”包括，但不限于，Δ⁹-四氢***酚、***酚、***二酚***隆、CP55940、HU210和2-AG。令人感兴趣地，测试的其它内源性***素，花生四烯酸乙醇酰胺，表现出对TRPV2的无或最小激活作用(表2，下文的实施例4)。

“***素受体”或“CB受体”各自指起***素的特异性受体作用的蛋白。“CB受体”可以是CB1受体或CB2受体。

CB1受体已经主要在脑中、尤其在基底神经节和边缘***(包括海马)中检测到。它们也在其它组织中发现，例如小脑和男性和女性生殖***。CB1受体似乎负责***的精神愉快的和抗惊厥的作用。CB1可以(1)与GenBank蛋白ID：NP_057167(人CB1受体的较长同工型)或NP_149421(人CB1受体的较短同工型)所述的人CB1受体具有大于约70％氨基酸序列同一性；或(2)结合抗体，例如，针对GenBank蛋白ID NP_057167或NP_149421所述的人CB1受体产生的多克隆或单克隆抗体。在有些实施方案中，所述CB1受体与GenBank蛋白IDNP_057167或NP_149421所述的人CB1受体具有大于约75、80、85、90或95％氨基酸序列同一性。CB1受体包括动物中的CB1受体的直向同源物，所述动物包括人、大鼠、小鼠、猪、狗和猴等。CB1受体也包括CB1受体的结构和功能多态。“多态”指在群体的个体中的特定遗传基因座处的遗传变体的集合。CB1受体包括来自人(GenBank蛋白ID NP_057167或NP_149421)、大鼠(GenBank蛋白ID：NP_036916)或小鼠(GenBank蛋白ID：NP_031752)等的CB1受体的结构和功能多态。

CB2受体已经在免疫***中几乎排它地检测到，在外周血细胞中具有最大密度。CB2受体似乎负责抗炎和可能的其它治疗。CB2可以(1)与GenBank蛋白ID：NP_001832所述的人CB2受体具有大于约70％氨基酸序列同一性；或(2)结合抗体，例如，针对GenBank蛋白IDNP_001832所述的人CB2受体产生的多克隆或单克隆抗体。在有些实施方案中，所述CB2受体与GenBank蛋白ID NP_001832所述的人CB2受体具有大于约75、80、85、90或95％氨基酸序列同一性。CB2受体包括动物中的CB2受体的直向同源物，所述动物包括人、大鼠、小鼠、猪、狗和猴等。CB2受体也包括CB2受体的结构和功能多态。CB2受体包括来自人(GenBank蛋白ID NP_001832)、大鼠(GenBank蛋白ID：NP_065418)、小鼠(GenBank蛋白ID：NP_034054)等的CB2受体的结构和功能多态。

“细胞”指适合检测方法的灵敏度的至少一个细胞或多个细胞。细胞可以存在于培养的细胞培养物中。细胞也可以存在于它的天然环境中，例如生物组织或流体。适用于本发明的细胞可以是细菌细胞，但是优选真核细胞，且最优选哺乳动物细胞。

“增加TRPV2通道的传导性的化合物”包括导致穿过TRPV2通道的离子的增加的通过的任何化合物。在一个实施方案中，这样的化合物是TRPV2通道激动剂，其结合TRPV2通道以增加它的传导性。这样的化合物触发、启动、传播、或以其他方式增强通道传导性。在另一个实施方案中，这样的化合物是正变构调节剂，其在不同于激动剂-结合位点的变构位点与TRPV2通道相互作用，并增强通道对激动剂的响应。

“降低TRPV2通道的传导性的化合物”包括导致穿过TRPV2通道的离子的减少的通过的任何化合物。在一个实施方案中，这样的化合物是TRPV2通道拮抗剂，其结合TRPV2通道来以竞争性或非竞争性方式对抗、减少或限制激动剂的作用。在另一个实施方案中，这样的化合物是负变构调节剂，其在不同于激动剂或拮抗剂-结合位点的变构位点与TRPV2通道相互作用，并降低通道对激动剂的响应。在另一个实施方案中，这样的化合物是在没有任何其它化合物(例如激动剂)存在下结合TRPV2通道并降低通道的传导性的反向激动剂。

“核苷酸序列”指单链或双链形式的聚合物中脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸残基的排列。核酸序列可以由下述碱基的天然核苷酸组成：胸苷、腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶；分别缩写为T、A、C、G和U，和/或所述天然核苷酸的合成类似物。

“分离的”核酸分子是这样的，它基本上与核酸的天然来源中存在的至少一种其它核酸分子分离，或当化学合成所述核酸分子时，它基本上不含有至少一种化学前体或其它化学药品。“分离的”核酸分子也可以是，例如，基本上不含有在该核酸的来源生物的基因组DNA中在5′和3′末端天然侧接该核酸分子的至少一个核苷酸序列的核酸分子。当存在小于约30％、20％、10％或5％(按干重计)的其它核酸分子或其它化学药品(在本文中也称作“污染核酸分子”或“污染化学药品”)时，在核酸分子的制剂中核酸分子“基本上分离于”或“基本上不含有”其它核酸分子或其它化学药品。

分离的核酸分子包括，但不限于，独立于其它序列的分离的核酸分子(例如，通过PCR或限制性内切核酸酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)，以及整合入载体、自主复制质粒、病毒(例如，反转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)中，或整合入原核生物或真核生物的基因组DNA中的核酸分子。另外，分离的核酸分子可以包括作为杂交体或融合核酸分子的部分的核酸分子。分离的核酸分子可以是通过下述方式产生的核酸序列：(i)体外扩增，通过例如聚合酶链反应(PCR)；(ii)合成，通过例如化学合成；(iii)通过克隆重组生产；或(iv)纯化，如通过切割和电泳或层析分离。

术语“寡核苷酸”或“寡物(oligo)”指相对短长度的单链DNA或RNA序列，例如，小于100个残基长。对于许多方法，长度是约16-25个核苷酸的寡核苷酸是有用的，尽管有时可以使用大于约25个核苷酸的更长的寡核苷酸。有些寡核苷酸可以用作合成互补核酸链的“引物”。例如，DNA引物可以与互补核酸序列杂交，以在使用DNA聚合酶的反应中引发互补DNA链的合成。寡核苷酸也可以用于在几种核酸检测方法中杂交，例如，在RNA印迹或原位杂交中。

术语“多肽”、“蛋白”和“肽”在本文中互换地用于指氨基酸链，其中氨基酸残基通过肽键或修饰的肽键相连。氨基酸链可以是大于2个氨基酸的任意长度。除非另有说明，术语“多肽”、“蛋白”和“肽”也包括它们的各种修饰形式。这些修饰形式可以是天然存在的修饰形式或化学修饰形式。修饰形式的实例包括，但不限于，糖基化形式、磷酸化形式、豆蔻酰化形式、棕榈酰化形式、核糖基化形式、乙酰化形式、遍在蛋白化形式等。修饰也包括分子内交联和与各种部分(例如脂质、黄素、生物素、聚乙二醇或其衍生物等)的共价附着。另外，修饰也可以包括环化、分支和交联。此外，在多肽中也可以包含由基因密码子编码的20个常规氨基酸以外的氨基酸。

“分离的蛋白”是这样的，它基本上与蛋白的天然来源中存在的至少一种其它蛋白分离，或当化学合成所述蛋白时，它基本上不含有至少一种化学前体或其它化学药品。当存在小于约30％、20％、10％或5％(按干重计)的其它蛋白或其它化学药品(在本文中也称作“污染蛋白”或“污染化学药品”)时，在蛋白的制剂中蛋白“基本上分离于”或“基本上不含有”其它蛋白或其它化学药品。

分离的蛋白可以具有几种不同的物理形式。分离的蛋白可以作为全长新生的或未加工的多肽，或者作为部分加工的多肽或作为加工的多肽的组合存在。全长新生多肽可通过导致形成全长新生多肽片段的特异性蛋白酶剪切事件进行翻译后修饰。片段或物理结合的片段可以具有与全长多肽相关的生物活性；但是，与个别片段相关的生物活性程度可以有变化。

分离的多肽可以是非天然存在的多肽。例如，“分离的多肽”可以是“杂种多肽”。“分离的多肽”也可以是通过氨基酸的添加或缺失或置换从天然存在的多肽衍生的多肽。分离的多肽也可以是“纯化的多肽”，后者在本文中用于指基本上均质的制剂中基本上不含有其它细胞组分、其它多肽、病毒材料或培养基的特定多肽，或当化学合成所述多肽时，基本上不含有化学前体或与化学合成有关的副产物。“纯化的多肽”可以通过标准的纯化技术，或通过化学合成，从天然或重组宿主细胞得到，如技术人员显而易见的。

“重组体”指已使用分子生物学技术修饰得与其天然状态有些不同的核酸、由核酸编码的蛋白、细胞或病毒颗粒。例如，重组细胞可以含有在天然(非重组)形式的细胞中未发现的核苷酸序列，或者可以表达在不同情况下异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因。重组细胞还可以含有发现于天然形式细胞中的基因，其中所述基因通过人工方法修饰并再导入细胞中。该术语还包括含内源核酸的细胞，所述内源核酸已被修饰，但没有从细胞中去除核酸；这种修饰包括例如通过基因置换和位点特异性突变获得的修饰。

“重组宿主细胞”是其中已导入重组DNA序列的细胞。可使用任何合适的方法将重组DNA序列导入到宿主细胞中，包括例如电穿孔、磷酸钙沉淀、显微注射、转化、生物射弹和病毒感染。重组DNA可整合或不整合(共价连接)入构成细胞基因组的染色体DNA中。例如，重组DNA可保持在游离型元件如质粒上。或者，就稳定转化或转染的细胞而言，重组DNA已整合入染色体中，以便其通过染色体复制由子细胞遗传。这种稳定性由稳定转化或转染的细胞确立包括含外源DNA的子细胞群体的细胞系或克隆的能力来证实。重组宿主细胞可为原核细胞或真核细胞，包括细菌如大肠杆菌(E.coli)，真菌细胞如酵母，哺乳动物细胞如人、牛、猪、猴或啮齿类动物起源的细胞系，以及昆虫细胞，如果蝇(Drosophila)和蚕来源的细胞系。还要理解的是，术语“重组宿主细胞”不仅指具体的所指细胞，而且指此细胞的子代或潜在子代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而在随后世代中发生，所以这种子代实际上可能与亲代细胞不相同，但仍包括在本文使用的术语范围内。

如本领域已知的，“序列同一性或相似性”是2个或更多个多肽序列或2个或更多个多核苷酸序列之间的关系，如通过对比序列所测得的。本文使用的“同一性”在2个或更多个核酸序列或2个或更多个多肽序列之间的关系上下文中，分别指当最佳地比对和分析序列时相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。为了对比查询的序列和例如氨基酸序列SEQ ID NO：2的目的，将查询的序列最佳地与SEQ ID NO：2比对，且得到在整个SEQ ID NO：2长度上最好的局部比对。

分析可以手工进行，或使用序列对比算法进行。关于序列对比，通常一个序列用作参照序列，查询的序列与其对比。当使用序列对比算法时，将实验和参照序列输入计算机中，如果必要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。

可通过例如使用Needleman&Wunsch，J MoL Biol.，48：443(1970)的同源性比对算法进行待比较序列的最佳比对。执行Needleman&Wunsch分析的软件可通过Institut Pasteur(France)生物软件站点：http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/needle.html公开获得。NEEDLE程序使用Needleman-Wunsch全局比对算法来获得两个序列在考虑其全长时的最佳比对(包括缺口)。同一性根据报告的比对区(包括长度中的任何缺口)内两个序列之间的相同匹配百分比计算。还提供相似性得分，其中相似性计算为报告的比对区(包括长度中的任何缺口)内两个序列之间的匹配百分比。标准比较使用EBLOSUM62矩阵(对于蛋白序列)和EDNAFULL矩阵(对于核苷酸序列)。缺口开放罚分是在生成缺口时减去的分数；默认设置使用10.0的缺口开放罚分。对于缺口延伸，将罚分加至缺口中各个碱基或残基的标准缺口罚分；默认设置是0.5。

杂交也可用作指示两个多核苷酸彼此基本相同的测试。共有高度同一性的多核苷酸在严格杂交条件下将彼此杂交。“严格杂交条件”具有本领域已知的含义，如在Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1989)中所描述的。示例性的严格杂交条件包括在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中于约45℃杂交，接着在0.2x SSC和0.1％SDS中在50-65℃进行1次或多次洗涤，这取决于杂交多核苷酸共有互补性的长度。

“TRPV2”、“瞬时型感受器电势阳离子通道，亚家族V，成员2”、“VRL”、“VRL1”、“VRL-1”或“香草素受体-样蛋白1”各自指形成离子通道即TRPV2通道的蛋白，所述通道可以被高温和/或低渗透性激活，并在感觉神经节中转导热响应。TRPV2通道也可以被某些化合物激活。激活的TRPV2通道门控穿过该通道的Ca²⁺和其它阳离子(例如，Na⁺)的流入量，从而导致膜去极化。TRPV2蛋白可以(1)与SEQ ID NO：2(GenBank蛋白ID：NP_057197)所述的人TRPV2(hTRPV2)蛋白具有大于约70％氨基酸序列同一性；或(2)结合抗体，例如，针对SEQ ID NO：2所述的hTRPV2蛋白产生的多克隆或单克隆抗体。在有些实施方案中，TRPV2与SEQ ID NO：2具有大于约75、80、85、90或95％氨基酸序列同一性。TRPV2包括动物中TRPV2的直向同源物，所述动物包括人、大鼠、小鼠、猪、狗和猴等。TRPV2也包括TRPV2的结构和功能多态。TRPV2包括来自人、大鼠(GenBank蛋白ID：NP_058903，SEQ ID NO：4)、小鼠(GenBank蛋白ID：NP_035836，SEQ ID NO：6)等的TRPV2的结构和功能多态。例如，发现向大鼠TRPV2 C-末端的末端添加血凝素A(HA)附加表位不改变通道性质；且缺乏大鼠TRPV2的N-末端20、32和65和C-末端11、23或32个氨基酸残基的大鼠TRPV2-HA缺失突变体仍然在它们对约53℃的升高的温度、低渗透性、Δ9-THC或2-APB的响应中有活性。因此，TRPV2也包括野生型TRPV2的维持TRPV2的生物活性的缺失或修饰，例如由SEQ IDNO：7-14的氨基酸序列组成的大鼠TRPV2的缺失突变体。此外，TRPV2也包括不同动物的TRPV2之间的嵌合体。例如，发现大鼠和人TRPV2之间的嵌合体(SEQ ID NO：16)，称作RHR(即大鼠1-392/人391-646/大鼠647-761)也在对约53℃的温度升高、Δ9-THC和对2-APB的响应中有活性。另外，TRPV2还包括通过组合2个或更多个TRPV2亚基形成的有活性的离子通道，所述TRPV2亚基本身是无活性的或低活性的。例如，TRPV2可以是通过共表达嵌合体RRH(大鼠1-392/大鼠393-646/人647-764)和HRR(人1-390/大鼠393-646/大鼠647-761)形成的有活性的离子通道。

“TRPV2激活温度”是在没有其它刺激的情况下，TRPV2通道的传导性与基线相比表现出至少10％增加时的温度。本领域技术人员可以实验测定TRPV2通道的激活温度。在有些实施方案中，“TRPV2激活温度”是TRPV2通道的传导性与基线相比表现出至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％增加时的温度。“TRPV2激活温度”通常大于约52℃。在有些实施方案中，TRPV2激活温度是约52℃-55℃或55℃-60℃。

“TRPV2非激活温度”在“TRPV2激活温度”范围之外的温度。示例性的TRPV2非激活温度是室温(约22℃)或低于约52℃的任意温度。

“载体”指其中可以或已经***异源核酸的核酸分子。有些载体可以导入宿主细胞中，从而允许复制载体或表达由该载体或构建体编码的蛋白。载体通常具有选择标记，例如，编码允许抗药性的蛋白的基因，复制起点序列，和允许***异源序列的多克隆位点。载体通常是基于质粒的，并用小写字母“p”和后面的字母和/或数字组合来命名。本文公开的起始质粒在商业上得到，在无限制的基础上公开得到，或可以使用本领域已知的程序从可得到的质粒来构建。可以根据本发明使用的许多质粒和其它克隆和表达载体是众所周知的，且本领域技术人员可容易地得到。此外，技术人员可以容易地构建任意数目的适用于本发明的其它质粒。技术人员从本公开内容中，将容易地明白本发明中这些质粒以及其它载体的性质、构建和使用。

“序列”是指聚合物中单体出现的线性次序，例如，多肽中氨基酸的次序或多核苷酸中核苷酸的次序。

在实践本发明时，使用分子生物学、微生物学和重组DNA中的许多常规技术。这些技术是众所周知的，且解释于例如，Current Protocolsin Molecular Biology，Vols.I，II，和III，F.M.Ausubel，编(1997)；和Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(2001)。

在本发明中发现，一组***素能激活TRPV2活性、但是不激活TRPV1活性。因而，本发明提供了调节TRPV2的生物活性的新方法，和鉴别调节TRPV2的生物活性的化合物的新方法。

在一个实施方案中，在本发明中使用的TRPV2存在于细胞中。所述细胞可以内源地或重组地表达TRPV2。一种示例性的TRPV2内源细胞是背根神经节(DRG)神经元或三叉神经元。TRPV2的内源细胞的其它实例包括，但不限于，肠固有的神经元、血管平滑肌细胞和人肝胚细胞瘤(HepG2)。

技术人员将明白，为了表达TRPV2的目的，在本发明中可以使用任何重组表达方法。通常，可以将编码TRPV2的核酸导入合适的宿主细胞中。在本发明中可以使用的示例性核酸分子包括来自人(SEQ ID：1，GenBank登记号：NM_016113)、小鼠(SEQ ID NO：5，GenBank登记号：NM_011706)或大鼠(SEQ ID NO：3 GenBank登记号：NM_017207)的编码全长TRPV2的cDNA。

通常，将核酸、优选地以DNA形式整合入载体中，以形成能一旦导入宿主细胞就指导相互作用蛋白成员的生产的表达载体。许多类型的载体可以用于本发明。获知本公开内容的技术人员应明白构建用于本发明目的的表达载体的方法。(通常参见，Current Protocols inMolecular Biology，Vol.2，Ed.Ausubel，等人，Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience，Ch.13，1988；Glover，DNA Cloning，Vol.II，IRLPress，Wash.，D.C.，Ch.3，1986；Bitter，等人，Methods in Enzymology153：516-544(1987)；The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces，Eds.Strathern等人，Cold Spring Harbor Press，Vols.I和II，1982；和Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Press，1989.)

通常，表达载体包括具有启动子的表达盒，所述启动子可操作地连接到编码相互作用蛋白成员的DNA上。所述启动子可以是天然启动子，即在天然存在的细胞中发现的负责在该细胞中表达相互作用蛋白成员的启动子。或者，所述表达盒可以是嵌合表达盒，即，具有不是在天然存在的细胞中负责表达相互作用蛋白成员的天然启动子的异源启动子。表达载体还可以包括用于在宿主细胞中复制载体的DNA复制起点。优选地，表达载体也包括用于在例如大肠杆菌中扩增载体的复制起点，和用于仅选择和维持携带表达载体的那些宿主细胞的选择标记。

通过本领域已知的任何技术，例如，通过直接DNA转化、显微注射、电穿孔、病毒感染、脂转染、基因枪等，可以将这样构建的表达载体导入宿主细胞中。目标蛋白的表达可以是瞬时的或稳定的。表达载体可以以染色体外状态维持在宿主细胞中，即，作为自我复制的质粒或病毒。或者，通过常规技术例如稳定细胞系的选择或位点特异性的重组，可以将表达载体整合入宿主细胞的染色体中。在稳定的细胞系中，至少表达载体的表达盒部分被整合入宿主细胞的染色体中。

可以将载体构建体设计成适合在各种宿主细胞中表达，包括但不限于细菌、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物和人细胞。制备用于在不同宿主细胞中表达的表达载体的方法应是技术人员显而易见的。如下文的实施例1所述，大鼠和人TRPV2已经成功地在HEK293中表达。

使用上述的重组方法，也可以容易地表达TRPV2的同源物和片段。例如，为了表达蛋白片段，可以选择整合入表达载体中的DNA片段，从而使它仅仅编码该蛋白片段。同样，使用编码杂种蛋白的重组DNA，可以表达特定的杂种蛋白。类似地，同源物蛋白可以从编码该同源物蛋白的DNA序列表达。通过使用重组DNA技术操作编码天然蛋白的序列，可以得到编码同源物的DNA序列。为此，可以使用本领域普遍已知的技术，进行随机的或定点诱变。为了制备蛋白衍生物，例如，可以通过定点DNA诱变，以预定的方式改变天然相互作用蛋白成员的氨基酸序列，以生成或去除共有序列。

在其它实施方案中，TRPV2提供在细胞膜中。膜制剂可以从天然宿主细胞分离，例如DRG或TG细胞，它在它的细胞表面表达TRPV2。膜制剂也可以从重组宿主细胞分离，例如CHO、HEK293或COS细胞，它在它的细胞表面重组表达TRPV2。膜制剂还可以从生物膜制备，例如表达TRPV2通道的组织膜、质膜、细胞膜、或内部细胞器膜。分离和制备生物膜制剂的方法是本领域技术人员已知的。例如，这样的方法可以包括下述步骤：机械或酶法破坏组织或细胞，离心以分离膜和其它组分，且将膜片段或小泡重新悬浮于合适的缓冲溶液中。或者，含有膜的制剂也可以源自人工膜。纯化的TRPV2蛋白可以重构进脂双层中，以形成人工膜小泡(参见Chen等人，1996，J.Gen.Physiol.108：237-250)。这类膜小泡可以是对目标通道非常特异性的，从而避免了污染其它通道的问题。例如，这样的人工膜可以包括电极，含有离子通道且形成离子库(reservoir)的脂质膜与该电极相连。本领域技术人员已知制备人工膜小泡的方法。

在有些优选的实施方案中，膜可以在受控条件下破裂，从而产生细胞膜的部分和/或膜小泡。在有些实施方案中，细胞膜部分和/或小泡可以为本发明的测定和方法提供更容易的形式，因为在测定过程中不太关心细胞裂解和/或剪切。细胞膜可以源自组织和/或培养的细胞。这样的破裂细胞膜和使它们稳定化的方法是本领域已知的。处理组织以得到细胞膜的方法是本领域已知的。

优选地，在本发明的测定中使用人TRPV2。任选地，在本发明的测定中使用来自其它物种例如大鼠或小鼠、优选哺乳动物物种的TRPV2直向同源物。

可使用常规的实验室形式或在适合高通量的测定中，实施化合物鉴别方法。术语“高通量”指的是一种测定设计，该设计允许容易地同时和/或快速连续地筛选众多样品，且可包括用于自动操作的能力。高通量测定的另一个所需的特征是测定的设计，其被最优化，以减少试剂的使用，或者使操作的数目最小化以完成所需的分析。测定形式的例子包括96孔或384孔板、悬浮液滴和用于液体处理实验的“芯片上的实验室(lab on a chip)”微通道芯片。本领域技术人员都知道，随着塑料模具和液体处理装置的小型化的进展，或随着改进的测定装置的设计，使用本发明的设计可以处理更大数目的样品。

在本发明的筛选测定中，可以筛选任何实验化合物，以选择本发明的蛋白复合物的调节剂。术语“选择”化合物意在包括(a)从以前不知道是蛋白复合物或其相互作用蛋白成员的调节剂组中选择化合物；和(b)测试已知能结合或调节蛋白复合物或其相互作用蛋白成员的功能和活性的化合物。两类化合物在本文中总称为“实验化合物”或“候选化合物”。候选化合物包括许多化学类别，包括但不限于，小有机或无机化合物，天然的或合成的分子，例如抗体，蛋白或其片段，反义核苷酸，干扰RNA(iRNA)和核酶，和它们的衍生物，模拟物和类似物。优选地，它们是小有机化合物，即，分子量不大于10,000道尔顿、更优选小于5,000道尔顿的那些。优选地，实验化合物以本领域已知的库形式提供，例如，化学合成库(通常参见，Gordan等人J.Med.Chem.，37：1385-1401(1994))，重组表达库(例如，噬菌体展示库)，和基于体外翻译的库(例如，核糖体展示库)。

候选化合物含有与多肽进行结构相互作用所必需的功能性化学基团，且通常至少包括胺、羰基、羟基或羧基，优选至少两个功能性化学基团，且更优选至少三个功能性化学基团。该候选化合物可包含环状碳结构或杂环结构和/或芳族或多芳族(polyaromatic)结构，它们被一个或多个上述官能团取代。候选化合物也可以是生物分子，例如肽、糖、脂肪酸、固醇、类异戊二烯、嘌呤、嘧啶或如上所述的衍生物或结构类似物，或者它们的组合等。当该化合物是核酸时，该化合物通常是DNA或RNA分子，虽然具有非天然键或亚单位的改性核酸也是预期的。

从包括合成或天然化合物库的广泛来源中得到候选化合物。例如有许多手段用来随机和定向合成各式各样的有机化合物和生物分子，包括表达随机化的寡核苷酸、合成有机组合库、随机肽的噬菌体展示库等。使用现有技术中已知的组合库方法中的许多方法中的任何一种，包括生物库、可空间平行寻址的固相或液相库、需要去褶合的合成库方法、“一珠一化合物”库法和使用亲和层析选择的合成库方法等也可以得到候选化合物(Lam(1997)Anticancer Drug Des，12：145)。另外，以细菌、真菌、植物和动物提取物形式存在的天然化合物库是可以获得或容易制备的。此外，天然和合成制备的库和化合物通过传统的化学、物理和生物化学的手段可很容易改性。

再有，可以对已知的药理学试剂进行定向的或随机的化学改性，例如酰基化、烷基化、酯化、酰胺化等，以生产该试剂的结构类似物。候选化合物可随机地选择，或者可基于与TRPV2活性的功能结合和/或对其进行调节的现有化合物。因此，候选试剂的来源是一个或超过一个基于使TRPV2通道传导性增大或减小的一种或超过一种已知化合物的分子库，其中所述化合物的结构在分子的一个或多个位置上被改变，以含有更多或更少的化学部分或不同的化学部分。生成类似物活化剂/抑制剂库时，对该分子进行的结构改变可以是定向的、随机的、或者定向和随机置换和/或添加的组合。在制备组合库中，本领域普通技术人员基于现有的化合物，可以容易地制备出这样的库。

许多其它试剂也可以包含在混合物中。它们包括诸如盐、缓冲剂、中性蛋白(例如，清蛋白)、去污剂等的试剂，它们可以用于促进最佳的蛋白-蛋白和/或蛋白-核酸结合。这样的试剂还可以减少反应组分的非特异性或背景相互作用。也可以使用提高测定效率的其它试剂，例如核酸酶抑制剂、抗微生物剂等。

在现有技术中能够见到合成分子库的方法的例子，例如见：Zuckermann等人(1994).J Med.Chem.37：2678。化合物库可存在于溶液中(例如Houghten(1992)Biotechniques 13：412-421)，或在珠(Lam(1991)Nature 354：82-84)、芯片(Fodor(1993)Nature 364：555-556)、细菌(美国专利号5,223,409)、孢子(专利号5,571,698)、质粒(Cull等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：1865-1869)或噬菌体(见例如Scott和Smith(1990)Science 249：386-390)上。

可以测试选择的化合物降低TRPV2的通道传导性的能力，或它们降低TRPV2与能激活TRPV2的***素的结合活性的能力。在测试过程中，可以在能激活TRPV2的***素之前、之后或同时向TRPV2添加实验化合物。另外，可以在疼痛或炎症等的动物模型中测试化合物。

通常，进行对照测定，其中在没有实验化合物存在下，进行上述筛选测定。然后将该测定的结果与在有实验化合物存在下得到的结果相对比。

可以在体外测定中筛选实验化合物，以鉴别能结合TRPV2的化合物。为此，使实验化合物接触TRPV2，接触条件和时间足以允许发生实验化合物和TRPV2之间的特异性相互作用，从而导致化合物与TRPV2的结合，并形成复合物。随后，检测结合事件。

在一个具体的实施方案中，将TRPV2固定化在固体支持体(例如蛋白微芯片)上或细胞表面或膜上。例如，使用非中和抗体，即能结合复合物、但是基本上不影响它的生物活性的抗体，可以将蛋白复合物直接固定化在微芯片基质例如载玻片上或多孔板上。使标记有可检测标记的***素接触固定化的TRPV2。实验化合物可以接触固定化的TRPV2蛋白，以允许在标准的结合测定条件下发生结合。为了鉴别结合TRPV2的化合物，人们可以测量与TRPV2结合或从TRPV2解离的可检测标记。与标记的***素竞争结合TRPV2的实验化合物，将导致更少的TRPV2与***素结合，从而导致更少的与TRPV2结合的标记。

在一个实施方案中，还可以评价实验化合物增加或降低TRPV2通道的离子传导性的能力。本领域技术人员已知测量TRPV2通道传导性的方法，例如，通过细胞去极化/超极化或细胞内钙离子水平的增加。使用钙离子-敏感的荧光指示剂，例如钙离子-敏感的荧光染料，可以评估细胞内钙的水平。合适的钙离子-敏感的荧光染料包括，例如，quin-2(参见，例如，Tsien等人，J Cell BioL，94：325，1982)、fura-2(参见，例如，Grynkiewicz等人，J BioL Chem.，260：3440，1985)、fluo-3(参见，例如，Kao等人，J BioL-43Chem.，264：8179，1989)和rhod-2(参见，例如，Tsien等人，J Biol.Chem.，Abstract 89a，1987)。合适的钙离子-敏感的荧光染料可从例如Invitrogen(Molecular Probes Products，Eugene，OR)商业上得到。也可以使用荧光计或具有荧光灯和检测器的流式细胞仪来监控细胞荧光。FLIPR测定已经常规地用于测量离子传导性。

TRPV2阳离子通道的功能是，不仅运输二价阳离子，例如，Ca²⁺，而且运输单价阳离子，例如，Na⁺或K⁺。因此，也可以进行测定单价阳离子的运输的变化的测定，以测量TRPV2通道的传导性。Na⁺-和K⁺-敏感的染料是本领域已知的，且可从例如Invitrogen(Molecular ProbesProducts，Eugene，OR)商业上得到。

通过电生理学技术例如膜片钳，也可以测量TRPV2通道的传导性。膜片钳技术常规地用于研究细胞、细胞膜和分离的组织中的电活性。它包含在微量移液管和质膜之间形成电紧密的、高电阻的密封。然后可以测量流过质膜内的个别离子通道的电流。该技术的不同变形允许将质膜的不同表面暴露于沐浴介质中。4种最常见的变形包括细胞-附着的、内面向外式、外面向外式、和全细胞膜片钳。

膜片钳方法常与电压钳一起使用，所述电压钳控制跨膜的电压并测量电流。例如，在全细胞膜片钳的情况下，在电压钳方法过程中，将微电极***细胞中，且通过该电极注入电流，以便将细胞膜电势维持在某个预定的水平。膜片钳方法也可以用于电流-钳构型中，其中控制电流，并测量膜电势。

在另一个实施方案中，可以通过施用给活动物来进一步评价实验化合物。这可以用于确立对于确立给药方案重要的功效、毒性和其它药理学参数。例如，可以将化合物施用给狗，以检查化合物在狗中的各种药理学方面。狗测定对于鉴别和确立在人类中的给药方案是特别有益的，因为与大鼠或小鼠相比，狗、尤其大品种的重量与人类更接近，且因此为估计人类给药提供了更合适的动物模型。

也可以将化合物施用给动物，来评估化合物改变伤害性过程的能力。存在各种疼痛动物模型。例如，神经损伤的大鼠脊神经结扎(SNL)模型是神经病疼痛模型(Kim和Chung，Pain，50：355-363，1992)。

其它合适的疼痛动物模型可以与本文的教导结合使用。经常研究的神经病疼痛的啮齿类动物模型包括慢性缩窄性损伤(CCI)或Bennett模型；神经瘤或轴索显微外科术(axotomy)模型；和部分坐骨神经横断或Seltzer模型(Shir等人，Neurosci.Lett.，115：62-67，1990)。示例性神经病疼痛模型包括几种外伤性神经损伤制剂(Bennett等人，Pain33：87-107，1988；Decosterd等人，Pain 87：149-58，2000；Kim等人，Pain 50：355-363，1992；Shir等人，Neurosci Lett 115：62-7，1990)，神经炎症模型(Chacur等人，Pain 94：231-44，2001；Milligan等人，Brain Res 861：105-16，2000)、糖尿病性神经病(Calcutt等人，Br JPharmacol 122：1478-82，1997)、病毒诱发的神经病(Fleetwood-Walker等人，J Gen Virol 80：2433-6，1999)、长春新碱神经病(Aley等人，Neuroscience 73：259-65，1996；Nozaki-Taguchi等人，Pain 93：69-76，2001)、和紫杉醇神经病(Cavaletti等人，Exp Neurol 133：64-72，1995)、以及急性伤害性模型和炎症模型(Brennan，T.J.等人Pain 64：493，1996；D’Amour，F.E.和Smith，D.L.J Pharmacol 72：74-79，1941；Eddy，N.B.等人J Pharmacol Exp Ther 98：121，1950；Haffner，F.DtschMed Wochenschr 55：731，1929；Hargreaves，K.等人Pain 32：77-88，1988；Hunskaar，S.等人J Neurosci Meth 14：69，1985；Randall，L.O.和Selitto，J.J.Arch.Int.Pharmacodyn 111：409-419，1957；Siegmund，E.等人Proc Soc Exp Bio Med 95：729，1957)。

某些***素激活TRPV2的发现，也提供了鉴别增加TRPV2的生物活性的其它化合物的新方法。这些方法可以基于合理的药物设计。基于合理的药物设计，可以生产***素的结构类似物或模拟物，其目的是提高药物效价、功效和稳定性，和降低副作用。本领域已知的合理药物设计的方法可以用于本发明中。参见，例如，Hodgson等人，Bio/Technology，9：19-21(1991)；美国专利号5,800,998和5,891,628，它们都在本文中引作参考。

分子建模程序可以用于确定小分子是否可以装配进TRPV2多肽的功能相关的部分，例如，活性部位。关于分子建模的基本信息，提供在，例如，M.Schlecht，Molecular Modeling on the PC，1998，John Wiley&Sons；Gans等人，Fundamental Principals of Molecular Modeling，1996，Plenum Pub.Corp.；N.C.Cohen(editor)，Guidebook on MolecularModeling in Drug Design，1996，Academic Press；和W.B.Smith，Introduction to Theoretical Organic Chemistry and Molecular Modeling，1996。提供了关于分子建模的详细信息的美国专利包括美国专利号6,093,573；6,080,576；5,612,894；和5,583,973。

可以用于分子建模研究的程序包括，例如，GRID(Goodford，P.J.，“A Computational Procedure for Determining Energetically FavorableBinding Sites on Biologically Important Macromolecules”J.Med.Chem.，28，pp.849-857，1985)，可从Oxford University，Oxford，UK获得；MCSS(Miranker，A.和M.Karplus，“Functionality Maps of BindingSites：A Multiple Copy Simultaneous Search Method.”Proteins：Structure，Function and Genetics，11，pp.29-34，1991)，可从MolecularSimulations，Burlington，Mass.获得；AUTODOCK(Goodsell，D.S.和A.J.Olsen，“Automated Docking of Substrates to Proteins by SimulatedAnnealing”Proteins：Structure.Function，and Genetics，8，pp.195-202，1990)；可从Scripps Research Institute，La Jolla，Calif.获得；和DOCK(Kuntz，I.D.等人，“A Geometric Approach to Macromolecule-LigandInteractions”J.Mol.Biol.，161，pp.269-288，1982)，可从Universityof California，San Francisco，CA获得。

在这方面，得到关于TRPV2-***素复合物的结构信息。优选地，可以得到定义复合物的三维结构的原子座标。例如，使用各种生物物理学技术，包括，例如，X-射线晶体学、NMR、计算机建模、质谱分析法等，可以研究相互作用的TRPV2-***素复合物。同样地，也可以从由相互作用蛋白和启动或稳定该蛋白的相互作用的化合物形成的蛋白复合物获得结构信息。通过X-射线晶体学、NMR等获得这样的原子座标的方法是本领域已知的，且结构生物学领域的技术人员应明白它们在本发明的靶蛋白或蛋白复合物中的应用。参见Smyth和Martin，Mol.Pathol.，53：8-14(2000)；Oakley和Wilce，Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.，27(3)：145-151(2000)；Ferentz和Wagner，Q.Rev.Biophys.，33：29-65(2000)；Hicks，Curr.Med.Chem.，8(6)：627-650(2001)；和Roberts，Curr.Opin.Biotechnol.，10：42-47(1999)。

对于TRPV2-***素相互作用关键的***素域、残基或部分，构成***素的活性区域，称作它的“药效团”。一旦已阐明药效团，就可以通过建模过程确立结构模型，所述建模过程可能整合来自NMR分析、X-射线衍射数据、丙氨酸扫描、光谱技术等的数据。包括计算分析(例如，分子建模和模拟退火)、相似性作图等的各种技术，都可以用于该建模过程。参见例如，Perry等人，见OSAR：QuantitativeStructure-Activity Relationships in Drug Design，pp.189-193，Alan R.Liss，Inc.，1989；Rotivinen等人，Acta Pharmaceutical Fennica，97：159-166(1988)；Lewis等人，Proc.R.Soc.Lond.，236：125-140(1989)；McKinaly等人，Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol.，29：111-122(1989)。可从Polygen Corporation，Waltham，Mass.商业得到的分子建模***包括，CHARMm程序，它执行能量最低化和分子动力学功能，和QUANTA程序，它执行分子结构的构建、图形建模和分析。这些程序允许分子的相互作用构建、修饰和可视化。其它计算机建模程序也可以从BioDesign，Inc.(Pasadena，Calif.)、Hypercube，Inc.(Cambridge，Ontario)和Allelix，Inc.(Mississauga，Ontario，加拿大)得到。

可以基于确立的模型形成模板。然后可以通过将各种化学基团或部分连接到该模板上，设计各种化合物。也可以替换模板的各个部分。另外，在肽先导化合物的情况下，可以环化肽或其模拟物，例如，通过将N-末端和C-末端连接到一起，以增加它的稳定性。进一步测试这些合理设计的化合物。以该方式，可以开发出具有提高的效价/功效和降低的副作用的药理学上可接受的和稳定的化合物。根据本发明鉴别的化合物可以掺入适合施用给个体的药物制剂中。

另外，也可以在虚拟筛选中使用定义靶蛋白或蛋白复合物的三维结构的结构模型或原子座标，以选择能激活TRPV2的化合物。使用原子座标的基于计算机的虚拟筛选的各种方法通常是本领域已知的。例如，美国专利号5,798,247(它在本文中引作参考)公开了通过测定有机化合物与靶蛋白内的结合腔的结合位点之间的结合相互作用，鉴别化合物(具体地，白细胞介素转变酶抑制剂)的方法。结合位点由原子座标来定义。

可以测试基于合理的药物设计或虚拟筛选而设计或选择的化合物的调节(干扰或强化)本发明的蛋白复合物内相互作用配偶体之间的相互作用的能力。另外，可以在上述的TRPV2通道传导性测定或动物模型中进一步测试化合物。

根据上述公开的方法选择所需的化合物后，本发明的方法进一步提供了选择的化合物的生产。可以生产化合物用于其它实验研究，或用于治疗用途。在本发明的筛选方法中鉴别出的化合物可以制成治疗或预防上有效的药物，用于预防或改善由TRPV2造成的或与TRPV2有关的疾病、病症或症状，例如疼痛或炎症等。

实施例1

大鼠和人TRPV2在HEK293细胞中的表达

将编码全长大鼠TRPV2的cDNA片段亚克隆进pCI-neo(Promega，Madison，WI)哺乳动物表达载体。然后根据销售商的规程，使用FuGene6转染试剂(Roche，Indianapolis，IN)，将表达构建体转染进HEK293细胞。通过在有400μg/ml G418存在下的生长，选择稳定的细胞系。分离和纯化单个的G418抗性克隆。通过蛋白印迹分析，使用抗-大鼠TRPV2特异性的抗体(Chemicon，Temecula，CA)、Ca²⁺成像测定(FLIPR)和全细胞膜片钳分析，证实大鼠TRPV2在这些细胞中的稳定表达。

将编码全长人TRPV2的cDNA片段亚克隆进pCI-neo或pcDNA3哺乳动物表达载体。然后根据销售商的规程，使用FuGene6转染试剂(Roche，Indianapolis，IN)，将表达构建体转染进HEK293细胞。在补加了10％胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM中培养表达TRPV2的HEK293细胞48-72小时，且评价瞬时表达和/或活性，或给药400μg/ml G418以选择稳定转染的表达TRPV2的细胞克隆。将细胞维持在37℃和5％CO₂。

实施例2

用Δ ⁹ -四氢***酚(Δ ⁹ -THC)激活TRPV2

为了搜索TRPV2的药理学激活剂，测试了Δ⁹-THC，从***衍生的***的主要心理活性成分。以5×10³细胞/孔的浓度，将表达大鼠TRPV2的HEK293细胞接种进384-孔板中，且在37℃温育过夜。次日，给细胞装载缓冲液和钙染料3(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)，终体积为50μl，且在37℃/5％CO₂温育30分钟，随后在室温温育另外30分钟。在加入实验化合物之前、期间和之后，通过荧光平板读数器(FLIPR)测量荧光强度。

如图4A所示，加入100μM Δ⁹-THC(实线)、但是不加缓冲剂(点线)，造成表达大鼠TRPV2的HEK293细胞内的细胞内Ca²⁺显著升高。相反，在相同浓度的Δ⁹-THC(短划线)，在未转染的HEK293细胞中没有观察到显著的细胞内Ca²⁺升高，表明细胞内Ca²⁺的升高由大鼠TRPV2介导。Δ⁹-THC对大鼠TRPV2的激活是剂量依赖性的，EC₅₀值是15.7uM，且Hill斜率是1.04(图4B)。

为了进一步证实Δ⁹-THC对TRPV2的作用，进行了全细胞膜片钳研究。胞外溶液含有(以mM为单位)：NaCl，132；CaCl，1.8；KCl，5.4；MgCl₂，0.8；HEPES，10；葡萄糖，10；pH＝7.4。用于填充记录移液管的细胞内溶液含有(以mM为单位)：CsCl，145；EGTA，5；HEPES，10；葡萄糖，5；pH＝7.4。在将人TRPV2瞬时转染进HEK293细胞后2-3天，或在将稳定表达大鼠TRPV2的HEK293细胞铺平板到盖玻片上后1-2天，使用常规全细胞膜片钳技术进行记录。通过膜片钳放大器放大电流，且在2kHz(Axopatch 200B)过滤，使用Digidata1322A在10kHz取样，且用pClamp 9.0获取和分析(所有仪器均购自MolecularDevices，CA)。每5秒给予一次600ms电压斜升，从-100mV至+60mV。电压斜升之间的保持电势是-100mV。通过重力供料灌注***，将细胞外溶液以0.5ml/分钟应用于细胞。所有实验都在22℃进行。

如图5B所示，应用100μM Δ⁹-THC后，在超极化的和去极化的膜电势，表达rTRPV2的HEK293细胞中全细胞电流幅度(灰实线)与对照(黑点线)相比有显著增加。但是，该效果在去极化的电势更显著。相同浓度的Δ⁹-THC在未转染的HEK293细胞中没有引起超过对照水平的电流(数据未显示)。Δ⁹-THC-激活的电流具有接近0mV的逆转电位，指示着该通道的相对非选择性的(至少对于在这些实验中使用的阳离子)性质。也在人TRPV2中观察到由Δ⁹-THC诱发的类似效应(图5A)。此外，大鼠和人TRPV2中Δ⁹-THC-激活的电流受到10μM钌红(RR)的显著抑制(黑线)，所述钌红(RR)是一种非选择性TRP通道抑制剂。总之，这些结果表明，Δ⁹-THC激活这些细胞中由TRPV2介导的电流。

实施例3

其它***素激活TRPV2

为了进一步研究***素对TRPV2的激活，在FLIPR钙动员测定中使用100μM化合物浓度(花生四烯酸乙醇酰胺除外，它是120μM)，测试了几种不同类型的***素，如使用表达大鼠TRPV2的HEK293细胞评价的。将所有数据标准化成为100μMΔ9-THC观察到的数据。测试的化合物包括：非心理活性的***组分(***二酚和***酚)；THC的合成类似物(***隆、CP 55,940、HU210、HU211、HU-308、HU331、11-羟基-Δ9-THC和O-1821)；几种内源性***素(花生四烯酸乙醇酰胺、2-花生四烯酸-甘油(2-AG)和它们的类似物棕榈酰乙醇胺(PEA))；***素转运阻断剂(AM404)；其它合成的***素受体激动剂(WIN55，212-2、WIN55，212-3、JWH015、JWH133、O-1918和CAY10429)；和非选择性激动剂，2-APB。在表1中显示了这些化合物激活大鼠TRPV2的能力。数据表明，TRPV2可以被超过一类***素激活。

表1.***素对大鼠TRPV2的激活

实施例4

Δ ⁹ -THC选择性地激活TRPV2

还在FLIRP测定中，针对表达人TRPV1和犬TRPM8的HEK293细胞，测试了选定数目的***素。如表2所总结的，Δ⁹-THC(240μM)和***酚(600μM)没有表现出TRPV1的显著激活，而花生四烯酸乙醇酰胺、2-AG和AM404激活了TRPV1，这与以前的报道相一致。这些***素都没有表现出对TRPM8的激动剂作用。

表2.***素对TRP通道的激活

	TRPV1	TRPV2	TRPM8
	TRPV1	TRPV2	TRPM8	Δ⁹-THC(240μM)	-	+	-
***酚(600μM)	-	+	-	Δ⁹-THC(240μM)	-	+	-
***酚(600μM)	-	+	-	花生四烯酸乙醇酰胺(120μM)	+	-	-
2-AG(120μM)	+	+	-	花生四烯酸乙醇酰胺(120μM)	+	-	-
2-AG(120μM)	+	+	-	AM404(120μM)	+	-	-

实施例5

***素激活TRPV2的缺失突变体

构建TRPV2缺失突变体，并测试由Δ⁹-THC、2-APB和高温刺激的激活。该实施例的方法可以用于构建和测试任何类型的TRPV2缺失突变体，包括，但不限于，在TRPV2的N-末端、在TRPV2的C-末端和/或在TRPV2的任何其它位置缺失一个或多个氨基酸残基的突变体。

使用大鼠TRPV2cDNA作为模板，通过PCR扩增编码缺失突变体的DNA分子。对于氨基-末端缺失，PCR扩增使用一系列与C-末端反向引物配对的编码起始甲硫氨酸的N-末端正向引物，它们与匹配具有在残基G21(突变体N20，SEQ ID NO：11)、P33(N32，SEQ ID NO：12)、A66(N65，SEQ ID NO：13)和V84(N83，SEQ ID NO：14)处的所需起始的邻近区域的序列符合读框。同时对于羧基-末端缺失，扩增使用正向N-末端引物，它们与一系列在残基R706(C51，SEQ ID NO：7)、P729(C32，SEQ ID NO：8)、P738(C23，SEQ ID NO：9)和E750(C11，SEQ ID NO：10)处结束的具有在可读框末端的符合读框终止密码子的C-末端反向引物配对。PCR扩增和纯化后，将编码缺失突变体的DNA分子亚克隆进pCI-neo哺乳动物表达载体，且通过DNA测序证实构建体。编码各种TRPV2缺失突变体的DNA分子包含下述核苷酸序列：SEQ ID NO：18(N20)、SEQ ID NO：19(N32)、SEQ ID NO：20(N65)、SEQ ID NO：21(N83)、SEQ ID NO：22(C51)、SEQ ID NO：23(C32)、SEQ ID NO：24(C23)和SEQ ID NO：25(C11)。

然后按照生产商的说明书，使用Fugene 6试剂(Roche)，将缺失突变构建体转染进HEK293细胞。在转染后24小时，收获细胞，并重新铺平板于补加了10％胎牛血清、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素和的新鲜DMEM培养基中。分别以每孔约40,000和10,000细胞的密度，将细胞分配到聚-D-赖氨酸包被的96-或384-孔板上。在转染后约48小时，使用从生产商得到的规程，从测定板取出培养基，并替换为钙3染料缓冲剂(Molecular Devices)。使用Δ⁹-THC或2-APB或升高温度的缓冲液触发钙动员，并使用FLIPR或FLEX STATION仪器来测量。

发现缺乏N-末端20、33、66个或缺乏C-末端11、23、或32个氨基酸残基的大鼠TRPV2缺失突变体仍然在它们对Δ⁹-THC(图6)、2-APB和约53℃的升高的温度的响应中是有活性的(数据未显示)。

实施例6

TRPV2嵌合体的激活

还制备了大鼠和人TRPV2s之间的域交换嵌合体，并测试了Δ⁹-THC、2-APB和高温刺激的激活。该实施例的方法可以用于构建和测试任何类型的TRPV2嵌合体，包括，但不限于，来自不同动物的TRPV2s之间的域交换嵌合体，和TRPV2与其它TRPV通道如TRPV1和TRPV3之间的嵌合体。

基于TRPV2的预测拓扑结构和基本序列特征，将TRPV2分成3种主要域：1)氨基-末端细胞内域；2)跨膜域；和3)羧基-末端细胞内域。对于嵌合体，每个域可以是大鼠(R)或人(H)起源的。在本文中构建和测试了3种大鼠和人TRPV2嵌合体。RRH(SEQ ID NO：15)是包含大鼠1-392氨基酸、大鼠393-646氨基酸和人647-764氨基酸的嵌合体。RHR(SEQ ID NO：16)是包含大鼠1-392、人391-646和大鼠647-761的嵌合体。HRR(SEQ ID NO：17)是包含人1-390、大鼠393-646和大鼠647-761的嵌合体。

通过融合PCR，得到编码3种大鼠和人TRPV2嵌合体的DNA分子。首先，使用大鼠或人TRPV2 cDNA作为模板，使用含有与待连接的其它物种域重叠的符合读框序列的合成引物DNA，通过PCR扩增编码所需TRPV2域的DNA分子。PCR扩增和纯化后，组合来自人和大鼠的编码所需TRPV2域的DNA分子，并用作融合PCR的模板，其中使用匹配全长TRPV2嵌合体的编码序列的5’和3’末端序列的引物DNA。编码各种TRPV2嵌合体的DNA分子包含下述核苷酸序列：SEQID NO：26(RRH)、SEQ ID NO：27(RHR)和SEQ ID NO：28(HRR)。

然后将编码TRPV2嵌合体的DNA分子亚克隆进哺乳动物表达载体，pCI-neo，且通过DNA测序证实得到的构建体。将嵌合体在HEK293细胞中瞬时表达，且还如实施例5所述测试它们对多种刺激物的响应。

嵌合体RHR对Δ⁹-THC的添加是完全响应性的(图7A)。尽管分别表达嵌合体RRH或HRR的HEK细胞分别是活性较低的或无活性的，但共表达2种嵌合体(RRH+HHR)的细胞对Δ⁹-THC是完全响应性的(图7B)。观察到上述嵌合体对2-APB刺激的类似响应(数据未显示)。共表达2种无活性的突变体的功能获得研究表明，有功能的TRPV2通道是多个亚基的复合物，且有些关键的功能域以反式、而不是顺式起作用。

序列表

<110>Johnson and Johnson Pharmaceutical Research&Development，L.L.C.

<120>鉴别TRPV2的调节剂的组合物和方法

<130>ORT-

<160>10

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2295

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

atgacctcac cctccagctc tccagttttc aggttggaga cattagatgg aggccaagaa 60

gatggctctg aggcggacag aggaaagctg gattttggga gcgggctgcc tcccatggag 120

tcacagttcc agggcgagga ccggaaattc gcccctcaga taagagtcaa cctcaactac 180

cgaaagggaa caggtgccag tcagccggat ccaaaccgat ttgaccgaga tcggctcttc 240

aatgcggtct cccggggtgt ccccgaggat ctggctggac ttccagagta cctgagcaag 300

accagcaagt acctcaccga ctcggaatac acagagggct ccacaggtaa gacgtgcctg 360

atgaaggctg tgctgaacct taaggacgga gtcaatgcct gcattctgcc actgctgcag 420

atcgacaggg actctggcaa tcctcagccc ctggtaaatg cccagtgcac agatgactat 480

taccgaggcc acagcgctct gcacatcgcc attgagaaga ggagtctgca gtgtgtgaag 540

ctcctggtgg agaatggggc caatgtgcat gcccgggcct gcggccgctt cttccagaag 600

ggccaaggga cttgctttta tttcggtgag ctacccctct ctttggccgc ttgcaccaag 660

cagtgggatg tggtaagcta cctcctggag aacccacacc agcccgccag cctgcaggcc 720

actgactccc agggcaacac agtcctgcat gccctagtga tgatctcgga caactcagct 780

gagaacattg cactggtgac cagcatgtat gatgggctcc tccaagctgg ggcccgcctc 840

tgccctaccg tgcagcttga ggacatccgc aacctgcagg atctcacgcc tctgaagctg 900

gccgccaagg agggcaagat cgagattttc aggcacatcc tgcagcggga gttttcagga 960

ctgagccacc tttcccgaaa gttcaccgag tggtgctatg ggcctgtccg ggtgtcgctg 1020

tatgacctgg cttctgtgga cagctgtgag gagaactcag tgctggagat cattgccttt 1080

cattgcaaga gcccgcaccg acaccgaatg gtcgttttgg agcccctgaa caaactgctg 1140

caggcgaaat gggatctgct catccccaag ttcttcttaa acttcctgtg taatctgatc 1200

tacatgttca tcttcaccgc tgttgcctac catcagccta ccctgaagaa gcaggccgcc 1260

cctcacctga aagcggaggt tggaaactcc atgctgctga cgggccacat ccttatcctg 1320

ctagggggga tctacctcct cgtgggccag ctgtggtact tctggcggcg ccacgtgttc 1380

atctggatct cgttcataga cagctacttt gaaatcctct tcctgttcca ggccctgctc 1440

acagtggtgt cccaggtgct gtgtttcctg gccatcgagt ggtacctgcc cctgcttgtg 1500

tctgcgctgg tgctgggctg gctgaacctg ctttactata cacgtggctt ccagcacaca 1560

ggcatctaca gtgtcatgat ccagaaggtc atcctgcggg acctgctgcg cttccttctg 1620

atctacttag tcttcctttt cggcttcgct gtagccctgg tgagcctgag ccaggaggct 1680

tggcgccccg aagctcctac aggccccaat gccacagagt cagtgcagcc catggaggga 1740

caggaggacg agggcaacgg ggcccagtac aggggtatcc tggaagcctc cttggagctc 1800

ttcaaattca ccatcggcat gggcgagctg gccttccagg agcagctgca cttccgcggc 1860

atggtgctgc tgctgctgct ggcctacgtg ctgctcacct acatcctgct gctcaacatg 1920

ctcatcgccc tcatgagcga gaccgtcaac agtgtcgcca ctgacagctg gagcatctgg 1980

aagctgcaga aagccatctc tgtcctggag atggagaatg gctattggtg gtgcaggaag 2040

aagcagcggg caggtgtgat gctgaccgtt ggcactaagc cagatggcag ccccgatgag 2100

cgctggtgct tcagggtgga ggaggtgaac tgggcttcat gggagcagac gctgcctacg 2160

ctgtgtgagg acccgtcagg ggcaggtgtc cctcgaactc tcgagaaccc tgtcctggct 2220

tcccctccca aggaggatga ggatggtgcc tctgaggaaa actatgtgcc cgtccagctc 2280

ctccagtcca actga 2295

<210>2

<211>764

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Thr Ser Pro Ser Ser Ser Pro Val Phe Arg Leu Glu Thr Leu Asp

1 5 10 15

Gly Gly Gln Glu Asp Gly Ser Glu Ala Asp Arg Gly Lys Leu Asp Phe

20 25 30

Gly Ser Gly Leu Pro Pro Met Glu Ser Gln Phe Gln Gly Glu Asp Arg

35 40 45

Lys Phe Ala Pro Gln Ile Arg Val Asn Leu Asn Tyr Arg Lys Gly Thr

50 55 60

Gly Ala Ser Gln Pro Asp Pro Asn Arg Phe Asp Arg Asp Arg Leu Phe

65 70 75 80

Asn Ala Val Ser Arg Gly Val Pro Glu Asp Leu Ala Gly Leu Pro Glu

85 90 95

Tyr Leu Ser Lys Thr Ser Lys Tyr Leu Thr Asp Ser Glu Tyr Thr Glu

100 105 110

Gly Ser Thr Gly Lys Thr Cys Leu Met Lys Ala Val Leu Asn Leu Lys

115 120 125

Asp Gly Val Asn Ala Cys Ile Leu Pro Leu Leu Gln Ile Asp Arg Asp

130 135 140

Ser Gly Asn Pro Gln Pro Leu Val Asn Ala Gln Cys Thr Asp Asp Tyr

145 150 155 160

Tyr Arg Gly His Ser Ala Leu His Ile Ala Ile Glu Lys Arg Ser Leu

165 170 175

Gln Cys Val Lys Leu Leu Val Glu Asn Gly Ala Asn Val His Ala Arg

180 185 190

Ala Cys Gly Arg Phe Phe Gln Lys Gly Gln Gly Thr Cys Phe Tyr Phe

195 200 205

Gly Glu Leu Pro Leu Ser Leu Ala Ala Cys Thr Lys Gln Trp Asp Val

210 215 220

Val Ser Tyr Leu Leu Glu Asn Pro His Gln Pro Ala Ser Leu Gln Ala

225 230 235 240

Thr Asp Ser Gln Gly Asn Thr Val Leu His Ala Leu Val Met Ile Ser

245 250 255

Asp Asn Ser Ala Glu Asn Ile Ala Leu Val Thr Ser Met Tyr Asp Gly

260 265 270

Leu Leu Gln Ala Gly Ala Arg Leu Cys Pro Thr Val Gln Leu Glu Asp

275 280 285

Ile Arg Asn Leu Gln Asp Leu Thr Pro Leu Lys Leu Ala Ala Lys Glu

290 295 300

Gly Lys Ile Glu Ile Phe Arg His Ile Leu Gln Arg Glu Phe Ser Gly

305 310 315 320

Leu Ser His Leu Ser Arg Lys Phe Thr Glu Trp Cys Tyr Gly Pro Val

325 330 335

Arg Val Ser Leu Tyr Asp Leu Ala Ser Val Asp Ser Cys Glu Glu Asn

340 345 350

Ser Val Leu Glu Ile Ile Ala Phe His Cys Lys Ser Pro His Arg His

355 360 365

Arg Met Val Val Leu Glu Pro Leu Asn Lys Leu Leu Gln Ala Lys Trp

370 375 380

Asp Leu Leu Ile Pro Lys Phe Phe Leu Asn Phe Leu Cys Asn Leu Ile

385 390 395 400

Tyr Met Phe Ile Phe Thr Ala Val Ala Tyr His Gln Pro Thr Leu Lys

405 410 415

Lys Gln Ala Ala Pro His Leu Lys Ala Glu Val Gly Asn Ser Met Leu

420 425 430

Leu Thr Gly His Ile Leu Ile Leu Leu Gly Gly Ile Tyr Leu Leu Val

435 440 445

Gly Gln Leu Trp Tyr Phe Trp Arg Arg His Val Phe Ile Trp Ile Ser

450 455 460

Phe Ile Asp Ser Tyr Phe Glu Ile Leu Phe Leu Phe Gln Ala Leu Leu

465 470 475 480

Thr Val Val Ser Gln Val Leu Cys Phe Leu Ala Ile Glu Trp Tyr Leu

485 490 495

Pro Leu Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Gly Trp Leu Asn Leu Leu Tyr

500 505 510

Tyr Thr Arg Gly Phe Gln His Thr Gly Ile Tyr Ser Val Met Ile Gln

515 520 525

Lys Val Ile Leu Arg Asp Leu Leu Arg Phe Leu Leu Ile Tyr Leu Val

530 535 540

Phe Leu Phe Gly Phe Ala Val Ala Leu Val Ser Leu Ser Gln Glu Ala

545 550 555 560

Trp Arg Pro Glu Ala Pro Thr Gly Pro Asn Ala Thr Glu Ser Val Gln

565 570 575

Pro Met Glu Gly Gln Glu Asp Glu Gly Asn Gly Ala Gln Tyr Arg Gly

580 585 590

Ile Leu Glu Ala Ser Leu Glu Leu Phe Lys Phe Thr Ile Gly Met Gly

595 600 605

Glu Leu Ala Phe Gln Glu Gln Leu His Phe Arg Gly Met Val Leu Leu

610 615 620

Leu Leu Leu Ala Tyr Val Leu Leu Thr Tyr Ile Leu Leu Leu Asn Met

625 630 635 640

Leu Ile Ala Leu Met Ser Glu Thr Val Asn Ser Val Ala Thr Asp Ser

645 650 655

Trp Ser Ile Trp Lys Leu Gln Lys Ala Ile Ser Val Leu Glu Met Glu

660 665 670

Asn Gly Tyr Trp Trp Cys Arg Lys Lys Gln Arg Ala Gly Val Met Leu

675 680 685

Thr Val Gly Thr Lys Pro Asp Gly Ser Pro Asp Glu Arg Trp Cys Phe

690 695 700

Arg Val Glu Glu Val Asn Trp Ala Ser Trp Glu Gln Thr Leu Pro Thr

705 710 715 720

Leu Cys Glu Asp Pro Ser Gly Ala Gly Val Pro Arg Thr Leu Glu Asn

725 730 735

Pro Val Leu Ala Ser Pro Pro Lys Glu Asp Glu Asp Gly Ala Ser Glu

740 745 750

Glu Asn Tyr Val Pro Val Gln Leu Leu Gln Ser Asn

755 760

<210>3

<211>2286

<212>DNA

<213>大鼠(Rattus norvegicus)

<400>3

atgacttcag cctccagccc cccagctttc aggctggaga cttccgatgg agatgaagag 60

ggcaatgctg aggtgaacaa ggggaagcag gaaccgcccc ccatggagtc accattccag 120

agggaggacc ggaattcctc ccctcagatc aaagtgaacc tcaacttcat aaagagacct 180

cctaaaaaca cttctgctcc cagccagcag gagccagatc ggtttgaccg tgaccgactc 240

ttcagtgtgg tctcccgggg tgtccccgag gaactgactg gactgctaga atacctgcgc 300

tggaacagca agtacctcac tgactctgca tacacagaag gctccactgg aaagacgtgc 360

ctgatgaagg ctgtgctgaa ccttcaggat ggggtcaatg cctgcatcat gccgctgctg 420

cagattgaca aggattccgg caatcccaag cccctcgtca atgcccagtg catcgatgag 480

ttctaccaag gccacagtgc gctgcacatc gccatagaga agaggagcct gcagtgcgtg 540

aagctgctgg tagagaatgg agcggatgtt cacctccgag cctgtggccg cttcttccaa 600

aagcaccaag gaacttgttt ctattttgga gagctacctc tttctctggc tgcgtgcacc 660

aagcagtggg atgtggtgac ctacctcctg gagaacccac accagccggc cagcctggag 720

gccaccgact ccctgggcaa cacagtcctg catgctctgg taatgattgc agataactcg 780

cctgagaaca gtgccctggt gatccacatg tacgacgggc ttctacaaat gggggcgcgc 840

ctctgcccca ctgtgcagct tgaggaaatc tccaaccacc aaggcctcac acccctgaaa 900

ctagccgcca aggaaggcaa aatcgagatt ttcaggcaca ttctgcagcg ggaattctca 960

ggaccgtacc agcccctttc ccgaaagttt actgagtggt gttacggtcc tgtgcgggta 1020

tcgctgtacg acctgtcctc tgtggacagc tgggaaaaga actcggtgct ggagatcatc 1080

gcttttcatt gcaagagccc gaaccggcac cgcatggtgg ttttagaacc actgaacaag 1140

cttctgcagg agaaatggga tcggctcgtc tcaagattct tcttcaactt cgcctgctac 1200

ttggtctaca tgttcatctt caccgtcgtt gcctaccacc agccttccct ggatcagcca 1260

gccatcccct catcaaaagc gacttttggg gaatccatgc tgctgctggg ccacattctg 1320

atcctgcttg ggggtattta cctcttactg ggccagctgt ggtacttttg gcggcggcgc 1380

ctgttcatct ggatctcatt catggacagc tactttgaaa tcctctttct ccttcaggct 1440

ctgctcacag tgctgtccca ggtgctgcgc ttcatggaga ctgaatggta cctacccctg 1500

ctagtgttat ccctagtgct gggctggctg aacctgcttt actacacacg gggctttcag 1560

cacacaggca tctacagtgt catgatccag aaggtcatcc ttcgagacct gctccgtttc 1620

ctgctggtct acctggtctt ccttttcggc tttgctgtag ccctagtaag cttgagcaga 1680

gaggcccgaa gtcccaaagc ccctgaagat aacaactcca cagtgacgga acagcccacg 1740

gtgggccagg aggaggagcc agctccatat cggagcattc tggatgcctc cctagagctg 1800

ttcaagttca ccattggtat gggggagctg gctttccagg aacagctgcg ttttcgtggg 1860

gtggtcctgc tgttgctgtt ggcctacgtc cttctcacct acgtcctgct gctcaacatg 1920

ctcattgctc tcatgagcga aactgtcaac cacgttgctg acaacagctg gagcatctgg 1980

aagttgcaga aagccatctc tgtcttggag atggagaatg gttactggtg gtgccggagg 2040

aagaaacatc gtgaagggag gctgctgaaa gtcggcacca ggggggatgg tacccctgat 2100

gagcgctggt gcttcagggt ggaggaagta aattgggttg cttgggagaa gactcttccc 2160

accttatctg aggatccatc agggccaggc atcactggta ataaaaagaa cccaacctct 2220

aaaccgggga agaacagtgc ctcagaggaa gaccatctgc cccttcaggt cctccagtcc 2280

ccctga 2286

<210>4

<211>761

<212>PRT

<213>大鼠(Rattus norvegicus)

<400>4

Met Thr Ser Ala Ser Ser Pro Pro Ala Phe Arg Leu Glu Thr Ser Asp

1 5 10 15

Gly Asp Glu Glu Gly Asn Ala Glu Val Asn Lys Gly Lys Gln Glu Pro

20 25 30

Pro Pro Met Glu Ser Pro Phe Gln Arg Glu Asp Arg Asn Ser Ser Pro

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Pro Val Arg Val Ser Leu Tyr Asp Leu Ser Ser Val Asp Ser Trp Glu

340 345 350

Lys Asn Ser Val Leu Glu Ile Ile Ala Phe His Cys Lys Ser Pro Asn

355 360 365

Arg His Arg Met Val Val Leu Glu Pro Leu Asn Lys Leu Leu Gln Glu

370 375 380

Lys Trp Asp Arg Leu Val Ser Arg Phe Phe Phe Asn Phe Ala Cys Tyr

385 390 395 400

Leu Val Tyr Met Phe Ile Phe Thr Val Val Ala Tyr His Gln Pro Ser

405 410 415

Leu Asp Gln Pro Ala Ile Pro Ser Ser Lys Ala Thr Phe Gly Glu Ser

420 425 430

Met Leu Leu Leu Gly His Ile Leu Ile Leu Leu Gly Gly Ile Tyr Leu

435 440 445

Leu Leu Gly Gln Leu Trp Tyr Phe Trp Arg Arg Arg Leu Phe Ile Trp

450 455 460

Ile Ser Phe Met Asp Ser Tyr Phe Glu Ile Leu Phe Leu Leu Gln Ala

465 470 475 480

Leu Leu Thr Val Leu Ser Gln Val Leu Arg Phe Met Glu Thr Glu Trp

485 490 495

Tyr Leu Pro Leu Leu Val Leu Ser Leu Val Leu Gly Trp Leu Asn Leu

500 505 510

Leu Tyr Tyr Thr Arg Gly Phe Gln His Thr Gly Ile Tyr Ser Val Met

515 520 525

Ile Gln Lys Val Ile Leu Arg Asp Leu Leu Arg Phe Leu Leu Val Tyr

530 535 540

Leu Val Phe Leu Phe Gly Phe Ala Val Ala Leu Val Ser Leu Ser Arg

545 550 555 560

Glu Ala Arg Ser Pro Lys Ala Pro Glu Asp Asn Asn Ser Thr Val Thr

565 570 575

Glu Gln Pro Thr Val Gly Gln Glu Glu Glu Pro Ala Pro Tyr Arg Ser

580 585 590

Ile Leu Asp Ala Ser Leu Glu Leu Phe Lys Phe Thr Ile Gly Met Gly

595 600 605

Glu Leu Ala Phe Gln Glu Gln Leu Arg Phe Arg Gly Val Val Leu Leu

610 615 620

Leu Leu Leu Ala Tyr Val Leu Leu Thr Tyr Val Leu Leu Leu Asn Met

625 630 635 640

Leu Ile Ala Leu Met Ser Glu Thr Val Asn His Val Ala Asp Asn Ser

645 650 655

Trp Ser Ile Trp Lys Leu Gln Lys Ala Ile Ser Val Leu Glu Met Glu

660 665 670

Asn Gly Tyr Trp Trp Cys Arg Arg Lys Lys His Arg Glu Gly Arg Leu

675 680 685

Leu Lys Val Gly Thr Arg Gly Asp Gly Thr Pro Asp Glu Arg Trp Cys

690 695 700

Phe Arg Val Glu Glu Val Asn Trp Ala Ala Trp Glu Lys Thr Leu Pro

705 710 715 720

Thr Leu Ser Glu Asp Pro Ser Gly Pro Gly Ile Thr Gly Asn Lys Lys

725 730 735

Asn Pro

<210>10

<211>750

<212>PRT

<213>大鼠(Rattus norvegicus)

<400>10

Met Thr Ser Ala Ser Ser Pro Pro Ala Phe Arg Leu Glu Thr Ser Asp

1 5 10 15

Gly Asp Glu Glu Gly Asn Ala Glu Val Asn Lys Gly Lys Gln Glu Pro

20 25 30

Pro Pro Met Glu Ser Pro Phe Gln Arg Glu Asp Arg Asn Ser Ser Pro

35 40 45

Gln Ile Lys Val Asn Leu Asn Phe Ile Lys Arg Pro Pro Lys Asn Thr

50 55 60

Ser Ala Pro Ser Gln Gln Glu Pro Asp Arg Phe Asp Arg Asp Arg Leu

65 70 75 80

Phe Ser Val Val Ser Arg Gly Val Pro Glu Glu Leu Thr Gly Leu Leu

85 90 95

Glu Tyr Leu Arg Trp Asn Ser Lys Tyr Leu Thr Asp Ser Ala Tyr Thr

100 105 110

Glu Gly Ser Thr Gly Lys Thr Cys Leu Met Lys Ala Val Leu Asn Leu

115 120 125

Gln Asp Gly Val Asn Ala Cys Ile Met Pro Leu Leu Gln Ile Asp Lys

130 135 140

Asp Ser Gly Asn Pro Lys Pro Leu Val Asn Ala Gln Cys Thr Asp Glu

145 150 155 160

Phe Tyr Gln Gly His Ser Ala Leu His Ile Ala Ile Glu Lys Arg Ser

165 170 175

Leu Gln Cys Val Lys Leu Leu Val Glu Asn Gly Ala Asp Val His Leu

180 185 190

Arg Ala Cys Gly Arg Phe Phe Gln Lys His Gln Gly Thr Cys Phe Tyr

195 200 205

Phe Gly Glu Leu Pro Leu Ser Leu Ala Ala Cys Thr Lys Gln Trp Asp

210 215 220

Val Val Thr Tyr Leu Leu Glu Asn Pro His Gln Pro Ala Ser Leu Glu

225 230 235 240

Ala Thr Asp Ser Leu Gly Asn Thr Val Leu His Ala Leu Val Met Ile

245 250 255

Ala Asp Asn Ser Pro Glu Asn Ser Ala Leu Val Ile His Met Tyr Asp

260 265 270

Gly Leu Leu Gln Met Gly Ala Arg Leu Cys Pro Thr Val Gln Leu Glu

275 280 285

Glu Ile Ser Asn His Gln Gly Leu Thr Pro Leu Lys Leu Ala Ala Lys

290 295 300

Glu Gly Lys Ile Glu Ile Phe Arg His Ile Leu Gln Arg Glu Phe Ser

305 310 315 320

Gly Pro Tyr Gln Pro Leu Ser Arg Lys Phe Thr Glu Trp Cys Tyr Gly

325 330 335

Pro Val Arg Val Ser Leu Tyr Asp Leu Ser Ser Val Asp Ser Trp Glu

340 345 350

Lys Asn Ser Val Leu Glu Ile Ile Ala Phe His Cys Lys Ser Pro Asn

355 360 365

Arg His Arg Met Val Val Leu Glu Pro Leu Asn Lys Leu Leu Gln Glu

370 375 380

Lys Trp Asp Arg Leu Val Ser Arg Phe Phe Phe Asn Phe Ala Cys Tyr

385 390 395 400

Leu Val Tyr Met Phe Ile Phe Thr Val Val Ala Tyr His Gln Pro Ser

405 410 415

Leu Asp Gln Pro Ala Ile Pro Ser Ser Lys Ala Thr Phe Gly Glu Ser

420 425 430

Met Leu Leu Leu Gly His Ile Leu Ile Leu Leu Gly Gly Ile Tyr Leu

435 440 445

Leu Leu Gly Gln Leu Trp Tyr Phe Trp Arg Arg Arg Leu Phe Ile Trp

450 455 460

Ile Ser Phe Met Asp Ser Tyr Phe Glu Ile Leu Phe Leu Leu Gln Ala

465 470 475 480

Leu Leu Thr Val Leu Ser Gln Val Leu Arg Phe Met Glu Thr Glu Trp

485 490 495

Tyr Leu Pro Leu Leu Val Leu Ser Leu Val Leu Gly Trp Leu Asn Leu

500 505 510

Leu Tyr Tyr Thr Arg Gly Phe Gln His Thr Gly Ile Tyr Ser Val Met

515 520 525

Ile Gln Lys Val Ile Leu Arg Asp Leu Leu Arg Phe Leu Leu Val Tyr

530 535 540

Leu Val Phe Leu Phe Gly Phe Ala Val Ala Leu Val Ser Leu Ser Arg

545 550 555 560

Glu Ala Arg Ser Pro Lys Ala Pro Glu Asp Asn Asn Ser Thr Val Thr

565 570 575

Glu Gln Pro Thr Val Gly Gln Glu Glu Glu Pro Ala Pro Tyr Arg Ser

580 585 590

Ile Leu Asp Ala Ser Leu Glu Leu Phe Lys Phe Thr Ile Gly Met Gly

595 600 605

Glu Leu Ala Phe Gln Glu Gln Leu Arg Phe Arg Gly Val Val Leu Leu

610 615 620

Leu Leu Leu Ala Tyr Val Leu Leu Thr Tyr Val Leu Leu Leu Asn Met

625 630 635 640

Leu Ile Ala Leu Met Ser Glu Thr Val Asn His Val Ala Asp Asn Ser

645 650 655

Trp Ser Ile Trp Lys Leu Gln Lys Ala Ile Ser Val Leu Glu Met Glu

660 665 670

Asn Gly Tyr Trp Trp Cys Arg Arg Lys Lys His Arg Glu Gly Arg Leu

675 680 685

Leu Lys Val Gly Thr Arg Gly Asp Gly Thr Pro Asp Glu Arg Trp Cys

690 695 700

Phe Arg Val Glu Glu Val Asn Trp Ala Ala Trp Glu Lys Thr Leu Pro

705 710 715 720

Thr Leu Ser Glu Asp Pro Ser Gly Pro Gly Ile Thr Gly Asn Lys Lys

725 730 735

Asn Pro Thr Ser Lys Pro Gly Lys Asn Ser Ala Ser Glu Glu

740 745 750

Claims

1.鉴别降低TRPV2的生物活性的化合物的方法，其包含下述步骤：

a.在***素激活TRPV2的条件下，使TRPV2多肽接触能激活TRPV2活性的***素；

b.使TRPV2多肽接触实验化合物；

c.在有***素和实验化合物存在下，测量TRPV2的生物活性；

d.重复步骤a)；

e.在有***素、但是没有实验化合物存在下，测量TRPV2的生物活性；和

f.对比从步骤c)测得的TRPV2活性和从步骤e)测得的TRPV2活性；从而当从步骤c)测得的TRPV2活性小于从步骤e)测得的TRPV2活性时，鉴别出降低TRPV2的生物活性的化合物。

2.权利要求1的方法，其中步骤a)在步骤b)之前进行。

3.权利要求1的方法，其中步骤a)在步骤b)之后进行。

4.权利要求1的方法，其中步骤a)和b)同时进行。

5.权利要求1的方法，其中所述TRPV2与分离的膜相结合。

6.权利要求1的方法，其中所述TRPV2存在于细胞中。

7.权利要求6的方法，其中所述细胞是神经元。

8.权利要求7的方法，其中所述神经元是背根神经节神经元。

9.权利要求1的方法，其中所述TRPV2具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16的氨基酸序列。

10.权利要求1的方法，其中所述TRPV2从含有TRPV2基因的表达载体的细胞重组表达。

11.权利要求10的方法，其中所述表达载体包含编码具有SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16的氨基酸序列的TRPV2的核苷酸序列。

12.权利要求1的方法，其中将TRPV2的生物活性测量为进入表达TRPV2的细胞中的钙流入量。

13.权利要求1的方法，其中通过膜片钳方法测量TRPV2的生物活性。

14.权利要求1的方法，其中通过Ca动员测定测量TRPV2的生物活性。

15.权利要求1的方法，其中将TRPV2的生物活性测量为它对能激活TRPV2活性的***素的结合亲和力。

16.权利要求1的方法，其中所述***素选自：Δ⁹-四氢***酚、11-羟基-Δ⁹-四氢***酚、***酚、***二酚、O-1821、***隆、CP55940、2-AG、和HU210、HU211、HU308、和HU331。

17.权利要求1的方法，还包含在TRPV2的激活温度测定实验物改变TRPV2的生物活性的程度的步骤。

18.权利要求1的方法，还包含下述步骤

a.给动物施用实验化合物；和

b.测定实验化合物改变动物的伤害性反应的程度。

19.鉴别增加TRPV2的生物活性的化合物的方法，其包含下述步骤：

a.获得定义复合物的三维结构的原子坐标，所述复合物包含与能激活TRPV2的***素相互作用的TRPV2；

b.阐明TRPV2和相互作用***素之间的结构关系；

c.基于该结构关系，设计***素的结构类似物；

d.合成该结构类似物；

e.测定该结构类似物改变TRPV2的生物活性的程度，从而鉴别增加TRPV2的生物活性的化合物。

20.权利要求19的方法，其中将TRPV2的生物活性测定为进入表达TRPV2的细胞中的钙流入量。

21.权利要求19的方法，其中通过膜片钳方法测量TRPV2的生物活性。

22.权利要求19的方法，其中通过Ca动员测定测量TRPV2的生物活性。

23.权利要求19的方法，其中将TRPV2的生物活性测定为它对能激活TRPV2活性的***素的结合亲和力。

24.增加TRPV2的生物活性的方法，其包含使TRPV2接触能激活TRPV2活性的***素的步骤。

25.权利要求24的方法，其中所述TRPV2与分离的膜相结合。

26.权利要求24的方法，其中所述TRPV2存在于细胞中。

27.权利要求26的方法，其中所述细胞是神经元。

28.权利要求24的方法，其中所述***素选自：Δ⁹-四氢***酚、11-羟基-Δ⁹-四氢***酚、***酚、***二酚、O-1821、***隆、CP55940、2-AG、和HU210、HU211、HU308、和HU331。

29.刺激受试者的有害热感觉的方法，其包含给受试者施用包含有效量的能激活TRPV2活性的***素的药物组合物，从而刺激受试者的有害热感觉。

30.权利要求29的方法，其中所述受试者是人。

31.权利要求29的方法，其中所述***素选自：Δ⁹-四氢***酚、11-羟基-Δ⁹-四氢***酚、***酚、***二酚、O-1821、***隆、CP55940、2-AG、和HU210、HU211、HU308、和HU331。

32.分离的多肽，其基本上由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQID NO：17的氨基酸序列组成。

33.分离的核酸分子，其编码基本上由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的氨基酸序列组成的多肽。

34.权利要求33的分离的核酸分子，其基本上由SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28的核苷酸序列组成。

35.表达载体，其包含编码基本上由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的氨基酸序列组成的多肽的核苷酸序列。

36.重组细胞，其包含权利要求35的表达载体。

37.生产基本上由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17的氨基酸序列组成的多肽的方法，其包含在使细胞生产多肽的条件下培养权利要求36的细胞的步骤。